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Immunology and Infection

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लीशमैनिया के फागोसाइटोसिस की जांच करना

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62459
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)
* These authors contributed equally

Summary

लीशमैनिया संक्रमण में फागोसाइटोसिस से जुड़े तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है। यहां, हम मेजबान कोशिकाओं के साथ लीशमैनिया बातचीत के दौरान होने वाली शुरुआती घटनाओं का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।

Abstract

फागोसाइटोसिस एक ऑर्केस्ट्रेटेड प्रक्रिया है जिसमें अलग-अलग चरण शामिल हैं: मान्यता, बाध्यकारी और आंतरिककरण। पेशेवर फागोसाइट्स फागोसाइटोसिस द्वारा लीशमैनिया परजीवी लेते हैं, जिसमें कई मेजबान सेल रिसेप्टर्स द्वारा परजीवी सतहों पर लिगेंड को पहचानना शामिल है। मैक्रोफेज झिल्ली के लिए लीशमैनिया का बंधन पूरक रिसेप्टर प्रकार 1 (सीआर 1) और पूरक रिसेप्टर प्रकार 3 (सीआर 3) और पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स के माध्यम से होता है। लिपोफॉस्फोग्लाइकन (एलपीजी) और 63 केडीए ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी 63) मैक्रोफेज-लीशमैनिया इंटरैक्शन में शामिल मुख्य लिगेंड हैं। मेजबान सेल रिसेप्टर्स द्वारा परजीवी लिगेंड की प्रारंभिक मान्यता के बाद, परजीवी आंतरिक हो जाते हैं, जीवित रहते हैं, और परजीवी रिक्तिकाओं के भीतर गुणा करते हैं। लीशमैनिया-प्रेरित रिक्तिकाओं की परिपक्वता प्रक्रिया में इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं से अणुओं का अधिग्रहण शामिल है, जिसमें मोनोमेरिक जी प्रोटीन रब 5 और रब 7, लाइसोसोमल जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (एलएएमपी -1), लाइसोसोमल जुड़े झिल्ली प्रोटीन 2 (एलएएमपी -2), और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 1 ए /

यहां, हम कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मेजबान कोशिकाओं के साथ लीशमैनिया इंटरैक्शन के दौरान होने वाली शुरुआती घटनाओं का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, जिसमें (i) बाध्यकारी (ii) आंतरिककरण, और (iii) फागोसोम परिपक्वता शामिल है। संक्रमण के परिणाम के इन निर्धारकों के आसपास के ज्ञान के शरीर को जोड़कर, हम लीशमैनिया संक्रमण के रोगजनन की समझ में सुधार करने और उपन्यास कीमोथेरेप्यूटिक लक्ष्यों के लिए अंतिम खोज का समर्थन करने की उम्मीद करते हैं।

Introduction

लीशमैनियासिस जीनस लीशमैनिया के प्रोटोजोआ परजीवी के कारण एक उपेक्षित उष्णकटिबंधीय बीमारी है, जिसके परिणामस्वरूप कशेरुक मेजबान में नैदानिक अभिव्यक्तियों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम होता है, जिसमें त्वचीय लीशमैनियासिस, म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस और आंत लीशमैनियासिस1 शामिल हैं। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) का अनुमान है कि एक अरब से अधिक लोग जोखिम में हैं, प्रति वर्ष दस लाख से अधिक नए मामलेसामने आते हैं।

लीशमैनिया एसपीपी इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोअन हैं जो मेजबान कोशिकाओं के अंदर जीवित रहते हैं, जिनमें मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाएंशामिल हैं 3. लीशमैनिया-मैक्रोफेज इंटरैक्शन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें कई मेजबान सेल रिसेप्टर्स और परजीवी लिगेंड या तो प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से या पूरक रिसेप्टर्स 4,5 को शामिल करते हुए ऑप्सोनाइजेशन द्वारा शामिल होते हैं। शास्त्रीय सतह रिसेप्टर्स, जैसे सीआर 1, सीआर 3, मैनोज-फ्यूकोस, फाइब्रोनेक्टिन, टोल-जैसे और मेहतर रिसेप्टर्स, मैक्रोफेज 6,7,8 के लिए परजीवी लगाव की मध्यस्थता करते हैं। ये रिसेप्टर्स लीशमैनिया की सतह पर अणुओं को पहचानते हैं, जिसमें 63 केडीए ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी 63) और ग्लाइकोलिपिड लिपोफॉस्फोग्लाइकन (एलपीजी) 9 शामिल हैं। ये प्रोमास्टिगोट्स की सतह पर सबसे प्रचुर मात्रा में अणु हैं और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विध्वंस में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, स्तनधारी कोशिकाओं में परजीवी संक्रमण की स्थापना के पक्ष में10. परजीवी सतह लिगेंड मैक्रोफेज रिसेप्टर्स से बांधने के बाद, एफ-एक्टिन स्तनधारी कोशिका सतहों पर जमा होता है, परजीवी के आसपास के रूप में वे फागोसाइटोस्ड होते हैं। इसके बाद, यह परजीवी-प्रेरित डिब्बे के गठन की ओर जाता है जिसे पैरासिटोफोरस रिक्तिका (पीवी) कहा जाता है, जो फागोलिसोसोमल विशेषताओं को प्रस्तुत करता है11. एक बार इन फागोलिसोसोम के अंदर, परजीवी जीवित रहने और गुणा के लिए आवश्यक कई परिवर्तनों से गुजरते हैं3.

पीवी का बायोजेनेसिस एक अत्यधिक विनियमित झिल्ली तस्करी प्रक्रिया है जो इस रोगज़नक़ के इंट्रासेल्युलर अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है12. इस डिब्बे का गठन मेजबान एंडोसाइटिक मार्ग के फागोसोम और डिब्बों के बीच अनुक्रमिक संलयन घटनाओं के परिणामस्वरूप होता है। शास्त्रीय कोशिका जीव विज्ञान अध्ययनों से पता चला है कि पीवी की परिपक्वता में मोनोमेरिक जी प्रोटीन रब 5 और रब 7 प्रोटीन का अधिग्रहण शामिल है, जो मुख्य रूप से क्रमशः प्रारंभिक और देर से एंडोसोम परिपक्वता से जुड़ेहैं। इसके अलावा, ये डिब्बे लाइसोसोम से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 और 2 (एलएएमपी 1, एलएएमपी 2), लाइसोसोमल झिल्ली के प्रमुख प्रोटीन घटक और सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े प्रोटीन 1 ए / स्पष्ट समानता के बावजूद, पीवी गठन15,16 के कैनेटीक्स और इन डिब्बों की आकृति विज्ञान लीशमैनिया प्रजातियों के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, एल मैक्सिकना या एल अमेज़ॅनेंसिस के कारण संक्रमण बड़ी संख्या में परजीवी वाले बड़े डिब्बों के गठन को प्रेरित करता है17. इसके विपरीत, अन्य प्रजातियां, जैसे कि एल ब्राजीलिएंसिस तथा एल शिशु, छोटे रिक्तिकाएं बनाते हैं जिनमें आमतौर पर प्रत्येक रिक्तिका18 में केवल एक या दो परजीवी होते हैं।

मेजबान सेल-लीशमैनिया इंटरैक्शन के आसपास के इस ज्ञान के बावजूद, मेजबान रिसेप्टर्स और परजीवी लिगेंड के बीच संपर्क से शुरू होने वाली प्रारंभिक घटनाओं को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। इन घटनाओं को परजीवी संक्रमण के परिणाम के निर्धारक के रूप में जाना जाता है और परजीवी प्रजातियों पर निर्भर हैं, परजीवी को पहचानने के लिए भर्ती किए गए मेजबान सेल रिसेप्टर्स के प्रकार और मैक्रोफेज सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता19,20। इसलिए, लीशमैनिया-प्रेरित पीवी के बायोजेनेसिस में शामिल अणुओं की पहचान करना और संक्रमण की स्थापना और परिणाम में इन अणुओं द्वारा निभाई गई भूमिका (ओं) को निर्धारित करना आवश्यक है। यहां, हम लीशमैनिया के फागोसाइटोसिस के दौरान होने वाली प्रारंभिक घटनाओं की निगरानी की एक विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें बाध्यकारी, आंतरिककरण, फागोसोम गठन और परिपक्वता शामिल है। यह काम विभिन्न लीशमैनिया प्रजातियों द्वारा प्रेरित पीवी के गठन में पीएलसी, एक्ट, रब 5, रब 7 और एलसी 3 की भागीदारी को स्पष्ट करने में सहायता कर सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग पीवी परिपक्वता में शामिल अन्य प्रोटीन की भागीदारी की जांच करने के लिए किया जा सकता है। भविष्य के अध्ययन लीशमैनिया-होस्ट सेल इंटरैक्शन में शामिल तंत्र के आसपास के ज्ञान का विस्तार करेंगे और उपन्यास कीमोथेरेप्यूटिक रणनीतियों के डिजाइन में योगदान देंगे।

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Protocol

राष्ट्रीय अनुसंधान आचार समितियों (आईडी: 94648218.8.0000.0040) द्वारा प्रक्रियाओं के अनुमोदन के बाद स्वस्थ दाताओं से कोशिकाएं प्राप्त की गईं।

1. सेल संस्कृतियों

  1. मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज
    नोट: मैक्रोफेज में इन विट्रो भेदभाव के लिए मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए, स्वस्थ दाताओं से रक्त एकत्र करें और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को शुद्ध करें जैसा किडी।
    1. परिधीय रक्त (50 एमएल) एकत्र करने के बाद, इसे हेपरिनाइज्ड ट्यूब में डालें और फिर कमरे के तापमान पर फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) में रक्त 1: 1 को पतला करें। धीरे-धीरे पतला हेपरिनाइज्ड रक्त को पहले वितरित घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर रखें।
    2. हेमोलिसिस से बचने के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 252 × ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें।
      नोट: ढाल परतों के मिश्रण से बचने के लिए अपकेंद्रित्र ब्रेक-ऑफ सेट करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, असंतत ढाल परतें नीचे से ऊपर तक बनती हैं: एरिथ्रोसाइट्स, घनत्व ढाल माध्यम, पीबीएमसी रिंग और प्लाज्मा।
    3. घनत्व ढाल माध्यम और प्लाज्मा परतों के बीच स्थित पीबीएमसी अंगूठी को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और अतिरिक्त घनत्व ढाल माध्यम को धोने के लिए पीबीएस से भरें।
    4. एक बार कोशिकाओं को धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 190 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    5. पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल में सतह पर तैरनेवाला और पुन: निलंबित गोली को त्यागें।
    6. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) के 500 एमएल में कोशिकाओं और प्लेट 2 × 106 कोशिकाओं की गणना करें 25 एमएम एन-[2-हाइड्रॉक्सीथाइल] पिपराज़ीन-एन'-[2-एथेन सल्फोनिक एसिड] (एचईपीईएस), 2 जी / आसंजन द्वारा।
  2. टीएचपी -1 संस्कृतियां
    1. 75सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क में पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 10 एमएल में 2 × 10 5 कोशिकाओं की एकाग्रता पर टीएचपी -1 सेल लाइन बढ़ाएं।
    2. 7 दिनों के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में सेल संस्कृतियों को बनाए रखें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 720 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और पूर्ण आरपीएमआई माध्यम में गोली को फिर से निलंबित कर दिया।
    4. एक न्यूबॉयर कक्ष में कोशिकाओं की गणना करें।
    5. मैक्रोफेज में टीएचपी 1 कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देने के लिए 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 एनएम फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) युक्त पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 500 μL में अच्छी तरह से2 × 10 5 कोशिकाओं की एकाग्रता पर 13 मिमी ग्लास कवरलिप्स पर प्लेट कोशिकाएं।
    6. तीन दिनों के बाद, पीएमए युक्त माध्यम को हटाने के लिए 0.9% एनएसीएल समाधान के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
    7. प्रयोग शुरू करने से पहले एक अतिरिक्त 2 दिनों के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर पीएमए मुक्त पूर्ण आरपीएमआई माध्यम में विभेदित टीएचपी -1 कोशिकाओं सेते हैं।

2. परजीवी संस्कृतियों और सेलट्रैकर लाल धुंधला

नोट: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से परजीवी की कल्पना करने के लिए, सेलट्रैकर रेड फ्लोरोसेंट डाई (सीएमटीपीएक्स) का उपयोग करके धुंधला प्रदर्शन करें। वैकल्पिक रूप से, कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सहित अन्य मार्करों का उपयोग निर्माता निर्देशों या प्रोमास्टिगोट्स के अनुसार जीएफपी, आरएफपी या अन्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन को व्यक्त करने के अनुसार किया जा सकता है। कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले परजीवी 7 से अधिक मार्गों के प्रोमास्टिगोट एक्सेनिक संस्कृति से प्राप्त विकास के स्थिर चरण में हैं।

  1. लीशमैनिया एसपीपी बढ़ो। एमएल जेंटामाइसिन और10% एफबीएस के साथ पूरक श्नाइडर के माध्यम के 5 एमएल वाले सेल कल्चर फ्लास्क में प्रति 1,000 μL माध्यम पर 1 x 10 5 परजीवी पर प्रोमास्टिगोट्स।
  2. 24 डिग्री सेल्सियस पर जैव रासायनिक ऑक्सीजन मांग (बीओडी) में परजीवी एक्सेनिक संस्कृतियों को इनक्यूबेट करने के बाद, न्यूबॉयर कक्ष में दैनिक गिनती करें। 5 दिनों के लिए परजीवी रूप (पतली, लम्बी) और गतिशीलता की जांच करें। परजीवी को विकास के स्थिर चरण में माना जाता है जब 8 घंटे के अंतराल के साथ लगातार दो गिनती समान मात्रा में प्रदर्शित होती है।
  3. विकास के स्थिर चरण तक पहुंचने पर, प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 1 μM CMTPX के साथ 0.9% एनएसीएल समाधान के 4 एमएल में परजीवी सेते हैं।
  4. 1: 1 अनुपात में एफबीएस जोड़ें और अतिरिक्त 1 मिनट के लिए परजीवी निलंबन सेते हैं।
  5. पीबीएस के साथ तीन बार परजीवी धोएं, इसके बाद 10 मिनट के लिए 1,781 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
  6. आरपीएमआई पूर्ण माध्यम के 1,000 μL में परजीवी गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. न्यूबॉयर कक्ष में परजीवी की गणना करें।

3. मैक्रोफेज के लिए लीशमैनिया बाध्यकारी का आकलन

  1. बीज 2 × 105 टीएचपी -1 कोशिकाएं या मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज 13 मिमी ग्लास कवरलिप्स के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट पर प्रति अच्छी तरह से पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 500 μL में।
  2. 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की खेती करें।
  3. 0.9% एनएसीएल समाधान के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण आरपीएमआई माध्यम में सेते हैं।
  4. अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 10: 1 अनुपात में एएल पीटरसन22 द्वारा वर्णित स्थिर चरण प्रोमास्टिगोट्स जोड़ें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस के तहत 5 मिनट के लिए 720 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  5. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. किसी भी गैर-आंतरिक प्रोमास्टिगोट्स को हटाने के लिए 0.9% एनएसीएल समाधान के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  7. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में कोशिकाओं को ठीक करें।
  8. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 15 एमएम एनएच4सीएल के साथ कवरलिप्स सेते हैं।
  9. पीबीएस 0.15% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ तीन बार धोएं। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान (पीबीएस में 3% बीएसए) के साथ सेते हैं।
  10. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.15% पीबीएस-सैपोनिन के साथ पारगम्य करें।
  11. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए फालोइडिन (पतला 1: 1,200) जोड़ें और प्रकाश से बचाएं।
  12. माउंटिंग मीडिया का उपयोग करके कवरलिप्स माउंट करें।
  13. 1.4 उद्देश्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से छवियों को प्राप्त करें×/

4. मैक्रोफेज द्वारा लीशमैनिया फागोसाइटोसिस का आकलन

  1. बीज 2 × 105 टीएचपी -1 कोशिकाएं या मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज 13 मिमी ग्लास कवरलिप्स के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट पर प्रति अच्छी तरह से पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 500 μL में।
  2. 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर24 घंटे के लिए कोशिकाओं की खेती करें।
  3. 0.9% एनएसीएल समाधान में दो बार कोशिकाओं को धोलें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 24-अच्छी तरह से प्लेट में पूर्ण आरपीएमआई माध्यम में सेते हैं।
  4. पीटरसन22 द्वारा 10: 1 (परजीवी: मेजबान सेल) अनुपात में वर्णित स्थिर चरण लीशमैनिया एसपीपी जोड़ें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस के तहत 10 मिनट के लिए 720 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  5. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
  6. किसी भी गैर-आंतरिक प्रोमास्टिगोट्स को हटाने के लिए 0.9% एनएसीएल समाधान के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  7. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरक आरपीएमआई माध्यम में कोशिकाओं सेते हैं।
  8. 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  9. पसंदीदा बढ़ते मीडिया का उपयोग करके कवरलिप्स माउंट करें।
  10. 1.4 उद्देश्य का उपयोग करके प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत यादृच्छिक क्षेत्रों में 400 से कम कोशिकाओं की गणना ×/

5. लीशमैनिया-प्रेरित रिक्तिका परिपक्वता का मूल्यांकन

नोट: टीएचपी -1 सेल अभिकर्मक एमबी मेस, बी विटिग और एस लोरकोव्स्की 23 द्वारा वर्णित के रूप में किया जाना चाहिए। यहां हम न्यूनतम संशोधनों के साथ इस प्रोटोकॉल को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं। न्यूक्लियोफेक्शन एक विशिष्ट अभिकर्मक विधि है जिसके लिए न्यूक्लियोफेक्टर की आवश्यकता होती है। एक वैकल्पिक विधि के रूप में, कोशिकाओं को लिपोफेक्टामाइन24 और लेंटिवायरस पारगमन25 का उपयोग करके ट्रांसफेक्ट किया जा सकता है।

  1. लीशमैनिया-प्रेरित पीवी के बायोजेनेसिस की जांच करने के लिए, पीएलसी 26,27, एक्ट 26,27, रब 5 28,29,30 या रब 7 28,29,31 प्लास्मिड के साथ ट्रांसफेक्ट टीएचपी 1 कोशिकाएं।
    नोट: इस पद्धति का उपयोग ऊपर सूचीबद्ध लोगों की तुलना में अन्य जीनों के साथ टीएचपी -1 कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है।
  2. एमएल पीएमए और50 μM 2-मर्कैप्टोइथेनॉल के साथ पूरक 10 मिलीलीटर पूर्ण आरपीएमआई माध्यम युक्त 75 सेमी² टिशू कल्चर फ्लास्क में 1.5 x 10 7 पर बीज टीएचपी -1 कोशिकाएं 48 घंटे के लिए।
  3. 0.9% एनएसीएल समाधान में एक बार कोशिकाओं को धो लें।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक गैर-एंजाइमी सेल पृथक्करण समाधान और अपकेंद्रित्र (250 × ग्राम) का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें।
  5. आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल में टीएचपी -1 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और न्यूबॉयर कक्ष में गिनती करें।
  6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 250 × ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र टीएचपी -1 कोशिकाएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. न्यूक्लियोफेक्टर समाधान के 100 μL में 2 × 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ब्याज के प्रोटीन के लिए प्लास्मिड कोडिंग के 0.5 μg के साथ सेते हैं, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया गया है।
  8. न्यूक्लियोफेक्टर क्यूवेट में टीएचपी -1 कोशिकाओं और न्यूक्लिक एसिड युक्त निलंबन को स्थानांतरित करें।
  9. न्यूक्लियोफेक्टर प्रोग्राम वाई -001 का उपयोग करके ट्रांसफेक्ट टीएचपी 1 कोशिकाएं।
  10. अभिकर्मक के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर 500 μL आरपीएमआई माध्यम में ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं (2x106) और बीज को पुनर्प्राप्त करें (4 कुओं /
  11. 0.5, 2, 4, 6, 12 और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण आरपीएमआई माध्यम में टीएचपी -1 कोशिकाओं सेते हैं।
  12. चरण 3.13 और 3.13 दोहराएँ।

6. लीशमैनिया एसपीपी पीवी के लिए एलसी 3 की भर्ती का मूल्यांकन

नोट: ऑटोफैगिक झिल्ली मार्कर एलसी 3 का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि फागोसोम ऑटोफैगिक विशेषताएं पेश करते हैं या नहीं। लीशमैनिया-प्रेरित पीवी के लिए एलसी 3 भर्ती का मूल्यांकन एंटी-एलसी 3 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलेबलिंग कोशिकाओं द्वारा संक्रमण के दौरान किया जा सकता है, जैसा कि पहले सी मैट32 और बीआरएस डायस33 द्वारा वर्णित किया गया था।

  1. बीज 2 × 105 टीएचपी -1 कोशिकाएं या 500 μL में मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज 13 मिमी ग्लास कवरलिप्स के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट पर आरपीएमआई माध्यम पूरा करते हैं।
  2. 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर24 घंटे के लिए कोशिकाओं की खेती करें।
  3. 0.9% एनएसीएल समाधान में दो बार कोशिकाओं को धोलें और पूर्ण आरपीएमआई माध्यम में सेते हैं।
  4. 10: 1 (परजीवी: मेजबान कोशिकाओं) अनुपात में एएल पीटरसन22 द्वारा वर्णित स्थिर चरण लीशमैनिया एसपीपी प्रोमास्टिगोट्स जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस के तहत 5 मिनट के लिए 720 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाएं।
  5. 30 मिनट या 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। फिर दो बार धोएं और संक्रमण के शुरुआती चरणों में लीशमैनिया-प्रेरित पीवी झिल्ली के लिए एलसी 3 भर्ती का मूल्यांकन करने के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, संक्रमण के बाद के चरणों में पीवी झिल्ली के लिए एलसी 3 भर्ती का आकलन करने के लिए, किसी भी गैर-आंतरिक प्रोमास्टिगोट्स को हटाने के लिए संक्रमण के 4 घंटे में दो बार एक और मैक्रोफेज समूह धोएं। एक अतिरिक्त 12 घंटे और 24 घंटे के लिए पूर्ण आरपीएमआई माध्यम में संक्रमित कोशिकाओं सेते हैं, अंत में दो बार धोने और ठीक करने के लिए।
      नोट: फिक्स्ड कोशिकाओं को लेबलिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस या 0.9% एनएसीएल समाधान में रखा जा सकता है।
  6. साथ ही कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100, 1% बीएसए, 20% सामान्य बकरी सीरम, 6% गैर-वसा सूखे दूध और 50% एफबीएस में निश्चित कोशिकाओं को अवरुद्ध और पारगम्य बनाएं।
  7. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए पीबीएस में पतला विरोधी एलसी 3 एंटीबॉडी (1: 200) के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
    नोट: इम्यूनोस्टेनिंग के नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं के एक समूह को प्राथमिक एंटीबॉडी मूल के जानवर से इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए उपयोग की जाने वाली एकाग्रता के बराबर एकाग्रता में ऊष्मायन किया जाना चाहिए।
  8. कमरे के तापमान पर 0.9% एनएसीएल समाधान के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो लें।
  9. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एलेक्साफ्लोर 488-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (1: 500) या पसंदीदा फ्लोरोसेंट-डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
  10. कमरे के तापमान पर 0.9% एनएसीएल समाधान के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो लें।
  11. पसंदीदा बढ़ते मीडिया का उपयोग करके कवरलिप्स माउंट करें।
  12. 1.4 उद्देश्य का उपयोग करके कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से छवियों को प्राप्त करें।

7. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण और फिजी मात्रा का ठहराव

नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करना एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जाना चाहिए। एक बेहतर रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचने के लिए, तेल-विसर्जन 63x उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।

  1. कमरे के तापमान पर 13 मिमी ग्लास कवरलिप्स छोड़ दें और अधिग्रहण से कम से कम 30 मिनट पहले उन्हें प्रकाश से बचाएं।
  2. एक शोषक ऊतक के साथ कवरलिप्स को साफ करें।
  3. उद्देश्य में विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें और स्लाइड जोड़ें।
  4. उद्देश्य को तब तक ले जाएं जब तक कि तेल स्लाइड को स्पर्श न करे।
  5. निरीक्षण और माइक्रोस्कोप पर ध्यान समायोजित करें और तेल के साथ विकल्प 63x उद्देश्य का चयन करें।
  6. लीका कार्यक्रम खोलें और 488, 552 और 405 तरंग दैर्ध्य में लेजर को समायोजित करें।
  7. छवि रिज़ॉल्यूशन 1,024 x 1,024 का चयन करें।
  8. लाइव बटन पर क्लिक करें, जेड स्टैक सेट करें, और प्रारंभ विकल्प दबाएं। फिर, इसे फिर से करें और अंत बटन दबाएं। हम अच्छे संकल्पों के साथ कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए टुकड़ा मोटाई के लिए 20 μm की सलाह देते हैं।
  9. छवि अधिग्रहण के लिए प्रतीक्षा करें, और उसके बाद लीका उपकरण में विकल्प "अधिकतम प्रोजेक्शन" का चयन करें।
  10. प्रयोग सहेजें।
  11. लिफ या टिफ प्रारूप छवियों को कंप्यूटर पर निर्यात करें और फिजी प्रोग्राम खोलें।
  12. प्रयोग खोलें और हाइपर स्टैक के साथ दृश्य स्टैक सेट करें। फिर व्यक्तिगत रूप से खुली फ़ाइलों का चयन करें और टाइल्स सिलाई करें।
  13. फिजी टूलबार में मुक्त हाथों के उपकरण का चयन करें और हाथ से सेल का सावधानीपूर्वक पता लगाएं।
  14. विश्लेषण बटन दबाएं और प्रतिदीप्ति तीव्रता की कल्पना करने के लिए मापें।
  15. इस प्रक्रिया को प्रति समूह प्रत्येक कक्ष में दोहराएँ.
  16. माप सहेजें और उन्हें स्प्रेडशीट संपादक में निर्यात करें।
  17. इस डेटा को सांख्यिकीय विश्लेषण कार्यक्रम में जोड़ें और सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण और ग्राफिक्स के लिए, एक सांख्यिकीय विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करें।

  1. प्रोग्राम खोलें।
  2. प्राप्त डेटा डालें और सामान्यता मापदंडों का परीक्षण करें।
  3. सामान्य वितरण वाले डेटा के लिए, छात्र टी-टेस्ट का उपयोग करें और नॉनपैरामीट्रिक परीक्षणों के लिए, मान-व्हिटनी परीक्षण।
  4. पी-मान 0.05 से कम होने पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर वाले डेटा पर विचार करें।
  5. केंद्रीय प्रवृत्ति उपायों (माध्य या माध्यिका) और भिन्नता उपायों के साथ डेटा का प्रतिनिधित्व करने वाले ग्राफिक्स तैयार करें।

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Representative Results

इस रिपोर्ट का उद्देश्य एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल या सीएल के एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल रूप को प्रस्तुत करने वाले रोगियों से पृथक एल ब्राजीलिएंसिस के फागोसाइटोसिस के दौरान होने वाली शुरुआती घटनाओं का मूल्यांकन करना है कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हमने परजीवी के फागोसाइटोसिस से जुड़ी मुख्य घटनाओं की जांच की: बाध्यकारी, आंतरिककरण और फागोसोम परिपक्वता। हमने पहले मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल या एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल बाइंडिंग और फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन किया। डेटा से पता चलता है कि एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल और एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल दोनों समान रूप से मैक्रोफेज (चित्रा 1) से बंधते हैं। इसके अलावा, मेजबान कोशिकाओं (चित्रा 2) द्वारा एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल और एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल फागोसाइटोसिस के बारे में कोई अंतर नहीं देखा गया था। अंत में, हमने संक्रमित कोशिकाओं में एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल या एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल द्वारा प्रेरित पीवी के लिए एलसी 3 की भर्ती की तुलना की। संक्रमण के 30 मिनट, 4 और 12 घंटे के बाद, हमने एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल और एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल-संक्रमित मैक्रोफेज (चित्रा 3) में एलसी 3 सजाए गए पीवी के समान प्रतिशत देखे। इन प्रतिनिधि परिणामों से पता चला है कि एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल और एल ब्राजीलियन्सिस-डीएल इसी तरह एलसी 3 भर्ती के विषय में पीवी के बाध्यकारी, फागोसाइटोसिस और बायोजेनेसिस के दौरान मैक्रोफेज के साथ बातचीत करते हैं।

पीएलसी-जीएफपी, रब 5-जीएफपी, रब 7-जीएफपी प्लास्मिड के साथ कुशलतापूर्वक ट्रांसफेक्टेड टीएचपी -1 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने वाली सूक्ष्म छवियों को चित्रा 4 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्र 1. "मानव मैक्रोफेज के लिए एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल और एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल बाध्यकारी का मूल्यांकन"। मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से संक्रमित थे एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल- या एल। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के बाद, बंधन का आकलन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। ब्राजीलियन्सिस-डीएल (सीएमटीपीएक्स, लाल के साथ लेबल) मैक्रोफेज (फालोइडिन, हरे रंग के साथ लेबल) के लिए बाध्यकारी। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, सेल नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ लेबल किया गया था। तीर लीशमैनिया-मैक्रोफेज बाइंडिंग को दर्शाते हैं। (बी) मैक्रोफेज के लिए बाध्यकारी लीशमैनिया का प्रतिशत। प्रति समूह कुल 30 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। डेटा क्विंटुप्लिकेट (अप्रकाशित टी परीक्षण, पी > 0.05) में किए गए एक प्रयोग के प्रत्येक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. "मानव मैक्रोफेज द्वारा एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल और एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन"। मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल या एल ब्राजीलियन्सिस-डीएल के साथ ऊष्मायन किया गया था, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 1 घंटे था। कोशिकाओं को तब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कुल 400 कोशिकाओं की गिनती करके विश्लेषण किया गया था। (ए) एल ब्राजीलिएंसिस-एलसीएल या एल ब्राजीलियन्सिस-डीएल से संक्रमित मानव मैक्रोफेज की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, सेल नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ लेबल किया गया था। तीर लीशमैनिया परजीवी नाभिक को दर्शाते हैं। (बी) लीशमैनिया फागोसाइटोसिस का प्रतिशत। हलकों ट्रिप्लिकेट (अप्रकाशित टी परीक्षण, पी > 0.05) में किए गए एक प्रयोग के प्रत्येक प्रतिकृति से डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. मैक्रोफेज में एल ब्राजीलिएंसी एस-एलसीएल या एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल द्वारा प्रेरित पीवी के लिए एलसी 3 भर्ती का आकलन। मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज संक्रमित थे और फिर 30 मिनट, 4 और 12 घंटे के लिए एंटी-एलसी 3 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था (ए) एल ब्राजीलिएंसी एस-एलसीएल या एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल-संक्रमितमैक्रोफेज की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को एंटी-एलसी 3 के साथ लेबल किया गया था, इसके बाद माध्यमिक एंटी-खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर 488 (हरा) के लिए संयुग्मित था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, सेल नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ लेबल किया गया था; (बी) एलसी 3-द्वितीय के साथ सजाए गए एल ब्राजीलिएंसी एस-एलसीएल या एल ब्राजीलिएंसिस-डीएल-प्रेरित पीवी का प्रतिशत। प्रति समूह कुल 30 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। हलकों का विश्लेषण प्रत्येक यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्र (अप्रकाशित टी परीक्षण, पी > 0.05) के अनुरूप है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. पीएलसी, रब 5 या रब 7 व्यक्त करने वाली टीएचपी -1 कोशिकाएं। मैक्रोफेज में अंतर करने के बाद, टीएचपी -1 कोशिकाओं को जीएफपी फ्लोरोसेंट जांच के साथ युग्मित ब्याज के प्रत्येक जीन के साथ न्यूक्लियोफेक्शन के अधीन किया गया था: पीएलसी, रब 5 और रब 7। इसके बाद, इन कोशिकाओं को तय किया गया था, नाभिक को डीएपीआई (नीले) के साथ दाग दिया गया था और 63x / 1.4 उद्देश्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

लीशमैनिया-मैक्रोफेज इंटरैक्शन एक जटिल प्रक्रिया है और इसमें कई चरण शामिल हैं जो रोग के विकास को प्रभावित कर सकते हैं5. अनऑप्सोनाइज्ड लीशमैनिया और मेजबान कोशिकाओं की बातचीत में शामिल तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जो लीशमैनिया संक्रमण के शुरुआती से देर के चरणों तक फागोसाइटोसिस का आकलन करने के लिए कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को नियोजित करता है। इम्यूनोलेबलिंग और फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित कोशिका जीव विज्ञान तंत्र की जांच करने के लिए दो या दो से अधिक फ्लोरोफोरस को शामिल करने वाली प्रतिदीप्ति तकनीकों का उपयोग, हमें कई प्रोटीनों के स्थान का विश्लेषण करने की अनुमति देता है, साथ ही साथ सेल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। इन विधियों द्वारा पेश किए गए फायदे उन्हें रोगज़नक़-मेजबान सेल इंटरैक्शन34 की निगरानी के लिए सबसे अच्छा उपकरण बनाते हैं।

विभिन्न कणों को शामिल करने वाली फागोसाइटिक प्रक्रिया को बेहतर ढंग से समझने के लिए, आणविक स्तर35 पर इस अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया का विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है। कॉन्फोकल-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग दशकों से किया गया है और आंतरिक कणों की संख्या के निर्धारण के माध्यम से फागोसाइटोसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण दिखाया गया है, या मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत34 के शुरुआती चरणों में शामिल होने के लिए जाने जाने वाले प्रोटीन के प्रकार। वर्तमान अध्ययन ने विभिन्न नैदानिक रूपों (एलसीएल और डीएल) वाले रोगियों से पृथक एल ब्राजीलियन्सिस के फागोसाइटोसिस के दौरान होने वाली घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के उपयोग का प्रस्ताव दिया। यह तकनीक हमें पीएलसी, एक्ट, रब 5 और रब 7 सहित विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है, और बाद में विभिन्न संक्रमण परिणामों से संबंधित तत्वों की पहचान करने के लिए लीशमैनिया आइसोलेट्स के फागोसाइटोसिस में इन प्रोटीनों की भागीदारी का मूल्यांकन करती है।

वर्तमान अध्ययन ने संक्रमण के शुरुआती चरणों में एल ब्राजीलिएंसिस फागोसाइटोसिस का आकलन करने के लिए प्राथमिक मैक्रोफेज और टीएचपी 1 कोशिकाओं को नियोजित किया। वर्तमान में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य फागोसाइट्स द्वारा लीशमैनिया एसपीपी में फागोसाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें डेंड्राइटिक कोशिकाएं, मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज सेल-लाइनें और मानव परिधीय रक्त से प्राप्त न्यूट्रोफिल शामिल हैं। परजीवी आंतरिककरण प्रक्रिया के दौरान, एफ-एक्टिन में एक गतिशील परिवर्तन कोशिका झिल्ली की सतह पर होता है11. फिर हमने फागोसाइटोसिस36 के एक विशिष्ट मार्कर का उपयोग करके कोशिका झिल्ली में स्थित प्रोटीन को लेबल किया, जैसे कि फ्लोरोसेंट पीएलसी, जिसने हमें मेजबान कोशिकाओं के लिए लीशमैनिया के बाध्यकारी चरण का निरीक्षण करने की अनुमति दी, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ धुंधला परजीवी, जैसे कि सीएमटीपीएक्स या सीएसएफई, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मेजबान कोशिकाओं के लिए परजीवी बंधन का आकलन करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। यह ध्यान देने योग्य है कि इस परख को सावधानीपूर्वक निष्पादन की आवश्यकता होती है: मैं) कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर धोने के समाधान का उपयोग करके धीरे-धीरे कवरलिप्स धोएं, अन्यथा, नमूने क्षतिग्रस्त हो सकते हैं; ii) अभिकर्मक कमजोर पड़ने को ठीक से तैयार करें; और iii) प्रकाश से नमूनों की रक्षा34.

इष्टतम लेजर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए कॉन्फ़िगर किया गया एक कंफोकल माइक्रोस्कोप एक उच्च गुणवत्ता वाली नमूना छवि प्राप्त करने में सक्षम है। लेबल वाली कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में हफ्तों तक संग्रहीत किया जा सकता है या विश्लेषण के समय तक जमे हुए किया जा सकता है। फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक्सपोजर और उच्च तीव्रता लेजर बीम के लंबे समय तक सीमित है, जो नमूनों को नुकसान पहुंचा सकता है, और, कुछ मामलों में, छवियों35,37 में पृष्ठभूमि का पता लगाने के उच्च स्तर का कारण बनता है।

वर्तमान अध्ययन में, लीशमैनिया एसपीपी के फागोसाइटोसिस का पालन करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग करने के बजाय, हमने संक्रमण के कई शुरुआती समय (30 मिनट, 4 घंटे और 12 घंटे) में कोशिकाओं को ठीक करके एक गतिज अध्ययन किया। यह माना जाना चाहिए कि लाइव इमेजिंग कुछ फायदे प्रदान करता है, जैसे कि फागोसाइटोसिस सहित असंख्य सेलुलर प्रक्रियाओं की स्थानिक और लौकिक गतिशीलता का विश्लेषण करने की क्षमता, और उन विवरणों को कैप्चर करना जो स्थिर छवियों में अवलोकन योग्य नहीं हैं34. हालांकि, लाइव इमेजिंग के लिए आवश्यक है कि कोशिकाएं पूरी प्रयोग प्रक्रिया में स्वस्थ हों, जिसमें सूक्ष्म कक्ष में तापमान, पीएच और ऑक्सीजन की स्थिति को नियंत्रित करना शामिल है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह दुनिया भर की कई प्रयोगशालाओं में मज़बूती से नहीं किया जा सकता है।

वर्णित न्यूक्लियोफेक्शन प्रोटोकॉल ने टीएचपी -1 कोशिकाओं के अभिकर्मक में प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है, जैसा कि पहले एमबी मेस, बी विटिग और एस लोरकोव्स्की 23 द्वारा रिपोर्ट किया गया था। इस प्रक्रिया में, सेल क्षति या सेल व्यवहार्यता में नुकसान से बचने के लिए कोशिकाओं को धीरे-धीरे अलग करना महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव के आधार पर, हम अभिकर्मक करने से पहले प्लेटों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक गैर-एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण समाधान का उपयोग करने की सलाह देते हैं। मूल प्रोटोकॉल23 के लेखकों का कहना है कि इस प्रक्रिया की मुख्य सीमाएं न्यूक्लियोफेक्शन प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के निलंबन में होने की आवश्यकता है, और तथ्य यह है कि अपर्याप्त टुकड़ी तनाव पैदा कर सकती है। इन सीमाओं के बावजूद, प्रोटोकॉल विश्वसनीय अभिकर्मक के लिए अनुमति देता है, सेल व्यवहार्यता खोने के बिना 90% सफल अभिकर्मक दर तक पहुंचता है।

पीएलसी, एक्ट, रब 5 और रब 7 सहित एंडोसाइटिक मार्करों के एक सेट का उपयोग करके पीवी का लक्षण वर्णन, लीशमैनिया फागोसाइटोसिस की हमारी समझ में सुधार करने के लिए आवश्यक है। पीवी बायोजेनेसिस में भाग लेने वाले नए प्रोटीन की पहचान करना और इन डिब्बों को व्यापक रूप से चिह्नित करना लीशमैनिया एसपीपी संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज प्रतिक्रिया में अंतर को स्पष्ट कर सकता है। लीशमैनिया संक्रमण परिणाम के आसपास के ज्ञान के शरीर में हमारे परिणामों का योगदान निस्संदेह लीशमैनिया संक्रमण के रोगजनन की हमारी समझ को आगे बढ़ाएगा और उपन्यास कीमोथेरेप्यूटिक लक्ष्यों के लिए अंतिम खोज का समर्थन करेगा। यह ध्यान देने योग्य है कि इस तकनीक को अन्य प्रकार के अध्ययनों तक भी बढ़ाया जा सकता है, जिसमें कई प्रकार की कोशिकाओं38,39 द्वारा बैक्टीरिया, खमीर या मनका संलग्नता द्वारा संक्रमण शामिल है।

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Disclosures

अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह या विश्लेषण, प्रकाशित करने के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित संघर्ष के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

हम सहायता के लिए गोंकालो मोनिज़ इंस्टीट्यूट, फियोक्रूज़ बाहिया, ब्राजील और माइक्रोस्कोपी विभाग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को इनोवा-फियोक्रूज नंबर 79700287000 द्वारा समर्थित किया गया था, पीएसटीवी सीएनपीक्यू (305235 / 2019-2) से अनुसंधान में उत्पादकता के लिए अनुदान रखता है। प्लास्मिड कृपया मौरिसियो टेरेबिज़निक, टोरंटो विश्वविद्यालय, सीए द्वारा प्रदान किए गए थे। लेखक अंग्रेजी भाषा संशोधन और पांडुलिपि कॉपीएडिटिंग सहायता के लिए एंड्रिस के वाल्टर को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 173
कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके <em>लीशमैनिया</em> के फागोसाइटोसिस की जांच करना
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Paixão, A. R., Dias, B. R. S.,… More

Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

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