Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersøke fagocytose av Leishmania ved hjelp av konfokal mikroskopi

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62459
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)
* These authors contributed equally

Summary

Mekanismen forbundet med fagocytose ved Leishmania-infeksjon er fortsatt dårlig forstått. Her beskriver vi metoder for å evaluere de tidlige hendelsene som oppstår under Leishmania-interaksjon med vertscellene.

Abstract

Fagocytose er en orkestrert prosess som involverer forskjellige trinn: anerkjennelse, binding og internalisering. Profesjonelle fagocytter tar opp Leishmania-parasitter ved fagocytose, bestående av å gjenkjenne ligander på parasittoverflater av flere vertscellereseptorer. Binding av Leishmania til makrofagmembraner skjer gjennom komplementreseptortype 1 (CR1) og komplementreseptor type 3 (CR3) og mønstergjenkjenningsreseptorer. Lipofosfoglykan (LPG) og 63 kDa glykoprotein (gp63) er de viktigste ligandene som er involvert i makrofag-Leishmania-interaksjoner . Etter den første anerkjennelsen av parasittligander av vertscellereseptorer, blir parasitter internalisert, overlever og multipliserer innenfor parasitoforøse vakuoler. Modningsprosessen av Leishmani-induserte vakuoler innebærer oppkjøp av molekyler fra intracellulære vesikler, inkludert monomer G-protein Rab 5 og Rab 7, lysosomalt assosiert membranprotein 1 (LAMP-1), lysosomalt assosiert membranprotein 2 (LAMP-2) og mikrotubuliassosiert protein 1A / 1B-lettkjede 3 (LC3).

Her beskriver vi metoder for å evaluere de tidlige hendelsene som oppstår under Leishmania-interaksjon med vertscellene ved hjelp av konfokal mikroskopi, inkludert (i) bindende (ii) internalisering og (iii) fagosommodning. Ved å legge til kunnskapsgrunnlaget rundt disse determinantene for infeksjonsutfall, håper vi å forbedre forståelsen av patogenesen av Leishmania-infeksjon og støtte det eventuelle søket etter nye kjemoterapeutiske mål.

Introduction

Leishmaniasis er en forsømt tropisk sykdom forårsaket av protozoa parasitter av slekten Leishmania, noe som resulterer i et bredt spekter av kliniske manifestasjoner i vertebratverten, inkludert kutan leishmaniasis, mukokutan leishmaniasis og visceral leishmaniasis1. Verdens helseorganisasjon (WHO) anslår at over en milliard mennesker er i faresonen, med mer enn en million nye tilfeller rapportert per år2.

Leishmania spp. er obligatoriske intracellulære protozoer som overlever inne i vertsceller, inkludert monocytter, makrofager og dendrittiske celler3. Leishmania-makrofaginteraksjon er en kompleks prosess som involverer flere vertscellereseptorer og parasittligander enten gjennom direkte interaksjon eller ved opsonisering som involverer komplementreseptorer 4,5. Klassiske overflatereseptorer, som CR1, CR3, mannose-fucose, fibronektin, tolllignende og scavenger reseptorer, formidler parasittfeste til makrofager 6,7,8. Disse reseptorene gjenkjenner molekyler på overflaten av Leishmania, inkludert 63 kDa glykoprotein (gp63) og glykolipid lipofosfoglykan (LPG)9. Dette er de mest tallrike molekylene på overflaten av promastigoter og spiller en viktig rolle i undergravingen av vertsimmunrespons, og favoriserer etableringen av parasittinfeksjon i pattedyrceller10. Etter at parasittoverflateligander binder seg til makrofagreseptorer, akkumuleres F-aktin på pattedyrcelleoverflater, som omgir parasitter når de fagocytoseres. Deretter fører dette til dannelsen av et parasittindusert rom kalt parasitophorøs vakuol (PV), som presenterer fagolysosomale egenskaper11. En gang inne i disse fagolysosomene gjennomgår parasitter flere endringer som er avgjørende for overlevelse og multiplikasjon3.

Biogenesen av PVs er en sterkt regulert membranhandelsprosess som er kritisk for den intracellulære overlevelsen av dette patogenet12. Dannelsen av dette rommet skyldes sekvensielle fusjonshendelser mellom fagosomer og rom i vertens endocytiske vei. Klassiske cellebiologiske studier har vist at modning av PVer innebærer oppkjøp av monomere G-protein Rab 5 og Rab 7 proteiner, som hovedsakelig er assosiert med henholdsvis tidlig og sen endosommodning, henholdsvis13. I tillegg får disse rommene lysosomassosierte membranproteiner 1 og 2 (LAMP 1, LAMP 2), de viktigste proteinbestanddelene i lysosomalmembranen og mikrotubuliassosiert protein 1A / 1B-lyskjede 3 (LC3), en autofagosommarkør14. Til tross for tilsynelatende likheter, varierer kinetikken til PV-dannelse15,16 og morfologien til disse rommene avhengig av Leishmania-arter. For eksempel induserer infeksjon forårsaket av L. mexicana eller L. amazonensis dannelsen av store rom som inneholder et stort antall parasitter17. Derimot danner andre arter, som L. braziliensis og L. infantum, mindre vakuoler som normalt bare inneholder en eller to parasitter i hver vacuole18.

Til tross for denne kunnskapen rundt vertscelle-Leishmania-interaksjon, har de første hendelsene utløst av kontakt mellom vertsreseptorer og parasittligander ikke blitt fullstendig belyst. Disse hendelsene er kjent for å være determinanter for utfallet av parasittinfeksjon og er avhengige av parasittarter, typen vertscellereseptorer rekruttert for å gjenkjenne parasitter og aktiveringen av makrofagsignalveier19,20. Derfor er det viktig å identifisere molekylene som er involvert i biogenesen av Leishmania-induserte PV-er og bestemme rollen (e) som disse molekylene spiller i infeksjonsetablering og utfall. Her beskriver vi en metode for å overvåke tidlige hendelser under fagocytose av Leishmania, inkludert binding, internalisering, fagosomdannelse og modning. Dette arbeidet kan bidra til å avklare deltakelsen av PLC, Akt, Rab5, Rab7 og LC3 i dannelsen av PVer indusert av forskjellige Leishmania-arter. Det er viktig at denne protokollen kan brukes til å undersøke deltakelsen av andre proteiner involvert i PV-modning. Fremtidige studier vil utvide kunnskapen om mekanismer involvert i Leishmania-vertscelleinteraksjon og bidra til utformingen av nye kjemoterapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Celler ble innhentet fra friske donorer etter godkjenning av prosedyrer fra de nasjonale forskningsetiske komiteene (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Cellekulturer

  1. Humane monocyttavledede makrofager
    MERK: For å oppnå humane monocyttavledede makrofager for in vitro-differensiering i makrofager, samle blod fra friske givere og rense mononukleære celler i perifert blod (PBMC) som beskrevet av D. English og B. R. Andersen21.
    1. Etter å ha samlet perifert blod (50 ml), hell det i et heparinisert rør og fortynn deretter blodet 1: 1 i en fosfatbufferløsning (PBS) ved romtemperatur. Plasser forsiktig fortynnet heparinisert blod på toppen av tidligere distribuert tetthetsgradientmedium.
    2. Sentrifuge rørene ved 252 × g i 30 minutter ved 24 °C for å unngå hemolyse.
      MERK: Still sentrifugeavbrytning for å unngå blanding av gradientlag. Etter sentrifugering dannes diskontinuerlige gradientlag fra bunnen til toppen: erytrocytter, tetthetsgradientmedium, PBMC-ring og plasma.
    3. Overfør PBMC-ringen, som ligger mellom tetthetsgradientmediet og plasmalagene, til et nytt rør og fyll med PBS for å vaske ut overflødig tetthetsgradientmedium.
    4. Vask cellene én gang og sentrifugen ved 190 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    5. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml komplett RPMI-medium.
    6. Tell cellene og plate 2 × 106 celler i 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplert med 25 mM N-[2-hydroksyetyl] piperazin-N′-[2-etan sulfonsyre] (HEPES), 2 g / L natriumbikarbonat, 2 mM glutamin, 20 g / ml ciprofloxacin og 10% inaktivert Fetal Bovine Serum (FBS) (komplett RPMI medium) i 7 dager ved 37 ° C under 5% CO2 i en 24-brønns plate for å tillate monocytter å differensiere til makrofager ved vedheft.
  2. THP-1 kulturer
    1. Vokse THP-1 cellelinje i en konsentrasjon på 2 × 105 celler i 10 ml komplett RPMI-medium i 75 cm2 kulturkolbe.
    2. Oppretthold cellekulturer i en inkubator ved 37 °C under 5 % CO2 i 7 dager.
    3. Sentrifugeceller ved 720 × g i 10 minutter ved 4 °C og resuspenderer pelleten i komplett RPMI-medium.
    4. Tell celler i et Neubauer-kammer.
    5. Plateceller på 13 mm glassduker i en konsentrasjon på 2 × 10 5 celler per brønn i 500 μL komplett RPMI-medium inneholdende 100 nM phorbol myristatacetat (PMA) ved 37 °C under5 % CO2 for å muliggjøre differensiering av THP1-celler i makrofager.
    6. Etter tre dager, vask to ganger celler med 0,9% NaCl-oppløsning for å fjerne medium som inneholder PMA.
    7. Inkuber differensierte THP-1-celler i PMA-fritt komplett RPMI-medium ved 37 °C under 5 % CO 2 i ytterligere2 dager før eksperimentering starter.

2. Parasittkulturer og CellTracker Red-farging

MERK: For å visualisere parasitter gjennom fluorescensmikroskopi, utfør farging ved hjelp av CellTracker Red fluorescerende fargestoff (CMTPX). Alternativt kan andre markører, inkludert karboksyfluorescein, brukes i samsvar med produsentens instruksjoner eller promastigoter som konstitutivt uttrykker GFP, RFP eller andre fluorescerende reportergener. Parasitter som brukes til å infisere celler er de i stasjonær vekstfase oppnådd fra en promastigote axenisk kultur på ikke mer enn 7 passasjer.

  1. Vokse Leishmania spp. promastigoter ved 1 x 10 5 parasitter per 1000 μL medium i en cellekulturflaske som inneholder5 ml Schneiders medium supplert med 50 μg / ml gentamicin og 10% FBS.
  2. Etter inkubering av parasittaksekulturer i et biokjemisk oksygenbehov (B.O.D.) ved 24 °C, utfør daglig telling i et Neubauer-kammer. Sjekk for parasittform (tynn, langstrakt) og mobilitet i 5 dager. Parasitter vurderes i stasjonær vekstfase når to påfølgende tellinger med 8 timers intervall viser lignende mengder.
  3. Når du når den stasjonære vekstfasen, inkuberer parasittene i 4 ml 0,9% NaCl-løsning med 1 μM CMTPX i 15 minutter ved 37 ° C under 5% CO2 unngå kontakt med lys.
  4. Tilsett FBS på en 1: 1-andel og inkuber parasittsuspensjon i ytterligere 1 min.
  5. Vask parasitter tre ganger med PBS, etterfulgt av sentrifugering ved 1.781 × g i 10 minutter.
  6. Ressuspend parasittpellet i 1,000 μL RPMI komplett medium.
  7. Tell parasitter i et Neubauer-kammer.

3. Vurdering av Leishmania-binding til makrofager

  1. Frø 2 × 105 THP-1-celler eller humane monocyttavledede makrofager i 500 μL komplett RPMI-medium per brønn på en 24-brønnsplate med 13 mm glassdeksler.
  2. Dyrk celler ved 37 °C under 5 % CO2 i 24 timer.
  3. Vask cellene to ganger med 0,9% NaCl-oppløsning og inkuber i komplett RPMI-medium ved 4 °C i 10 minutter.
  4. Tilsett promastigoter i stasjonær fase som beskrevet av A. L. Petersen22 i forholdet 10:1 til brønnplater, og sentrifuger deretter ved 720 × g i 5 minutter under 4 °C.
  5. Inkuber ved 4 °C i 5 minutter.
  6. Vask cellene to ganger med 0,9% NaCl-løsning for å fjerne eventuelle ikke-internaliserte promastigoter.
  7. Fest cellene i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
  8. Inkuber dekslene med 15 mM NH4Cl i 15 minutter ved romtemperatur.
  9. Vask tre ganger med PBS 0,15% bovint serumalbumin (BSA). Inkuber med blokkeringsløsning (3% BSA i PBS) i 1 time ved romtemperatur.
  10. Vask tre ganger med PBS og permeabiliser deretter med 0,15% PBS-Saponin i 15 minutter ved romtemperatur.
  11. Tilsett phalloidin (fortynnet 1: 1,200) i 1 time ved romtemperatur og beskytt mot lys.
  12. Monter deksler ved hjelp av monteringsmedier.
  13. Skaff bilder via et konfokalt fluorescensmikroskop ved hjelp av et 63× / 1.4-mål.

4. Vurdering av Leishmaniafagocytose ved makrofager

  1. Frø 2 × 105 THP-1-celler eller humane monocyttavledede makrofager i 500 μL komplett RPMI-medium per brønn på en 24-brønnsplate med 13 mm glassdeksler.
  2. Dyrk celler i 24 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
  3. Vask cellene to ganger i 0,9 % NaCl-oppløsning og rug i komplett RPMI-medium i 24-brønnsplate ved 4 °C i 10 minutter.
  4. Legg til stasjonær fase Leishmania spp. som beskrevet av A. L. Petersen22 i forholdet 10: 1 (parasitt: vertscelle), og sentrifuger deretter ved 720 × g i 10 minutter under 4 ° C.
  5. Inkuber celler ved 4 °C i 5 min.
  6. Vask cellene to ganger med 0,9% NaCl-løsning for å fjerne eventuelle ikke-internaliserte promastigoter.
  7. Inkuber cellene i supplert RPMI-medium ved 37 °C i 1 time.
  8. Fest cellene med 4% paraformaldehyd i 15 minutter.
  9. Monter deksler ved hjelp av foretrukne monteringsmedier.
  10. Telle ikke mindre enn 400 celler i tilfeldige felt under et fluorescensmikroskop ved hjelp av et 100× / 1,4 mål.

5. Evaluering av Leishmania-indusert vakuolmodning

MERK: THP-1 celletransfeksjon skal utføres som beskrevet av M. B. Maess, B. Wittig og S. Lorkowski 23. Her oppsummerer vi denne protokollen, med minimale modifikasjoner. Nukleofektion er en spesifikk transfeksjonsmetode som krever en nukleofektor. Som en alternativ metode kan celler transfekteres ved hjelp av lipofectamin24 og lentivirustransduksjon25.

  1. For å undersøke biogenesen av Leishmania-indusert PV, transfekt THP1-celler med PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 eller Rab 728,29,31 plasmider.
    MERK: Denne metoden kan brukes til å transfektere THP-1-celler med andre gener enn de som er nevnt ovenfor.
  2. Frø THP-1-celler ved 1,5 x 107 i 75 cm² vevskulturflasker som inneholder 10 ml komplett RPMI-medium supplert med 100 ng / ml PMA og 50 μM 2-merkaptoetanol i 48 timer.
  3. Vask celler en gang i 0,9% NaCl-løsning.
  4. Løsne celler ved hjelp av en ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning og sentrifuge (250 × g) i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Resuspender THP-1-celler i 1 ml RPMI-medium og utfør tellinger i et Neubauer-kammer.
  6. Sentrifuge THP-1-celler igjen ved 250 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten.
  7. Resuspend 2 × 106 celler i 100 μL Nucleofector-oppløsning og inkuber med 0,5 μg av plasmidkodingen for proteinet av interesse, merket med et fluorescerende protein.
  8. Overfør suspensjonen som inneholder THP-1-celler og nukleinsyre til Nucleofector kyvetten.
  9. Transfekt THP1-celler ved hjelp av Nucleofector Program Y-001.
  10. Gjenopprett de transfiserte cellene (2x106) og frøet i 500 μL RPMI medium på 24-brønnsplater med 13 mm glassdeksler (4 brønner / transfeksjon).
  11. Inkuber THP-1-celler i komplett RPMI-medium ved 37 °C i 0,5, 2, 4, 6, 12 og 24 timer.
  12. Gjenta trinn 3.13 og 3.13.

6. Evaluering av rekruttering av LC3 til Leishmania spp.

MERK: Den autofagiske membranmarkøren LC3 kan brukes til å undersøke om fagosomer presenterer autofagiske egenskaper. LC3-rekruttering til Leishmania-induserte PV-er kan vurderes under infeksjon av immunmerkingsceller med anti-LC3-antistoffet, som tidligere beskrevet av C. Matte32 og B. R. S. Dias33.

  1. Frø 2 × 105 THP-1-celler eller humane monocyttavledede makrofager i 500 μL komplett RPMI-medium på en 24-brønns plate med 13 mm glassbelegg.
  2. Dyrk celler i 24 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
  3. Vask celler to ganger i 0,9% NaCl-løsning og inkuber i komplett RPMI-medium.
  4. Legg til stasjonær fase Leishmania spp. promastigotes som beskrevet av A. L. Petersen22 ved et 10: 1 (parasitt: vertsceller) forhold og sentrifugeceller ved 720 × g i 5 minutter under 4 ° C.
  5. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter eller 4 timer. Vask deretter to ganger og fest cellene for å evaluere LC3-rekrutteringen til Leishmania-induserte PV-membraner i de tidlige stadiene av infeksjonen.
    1. Alternativt, for å vurdere LC3-rekruttering til PV-membraner i senere stadier av infeksjon, vask to ganger en annen makrofaggruppe ved 4 timers infeksjon for å fjerne eventuelle ikke-internaliserte promastigoter. Inkuber infiserte celler i komplett RPMI-medium i ytterligere 12 timer og 24 timer, for til slutt å vaske to ganger og fikse.
      MERK: Faste celler kan oppbevares i PBS eller 0,9% NaCl-løsning ved 4 ° C til merking.
  6. Samtidig blokkere og permeabilisere de faste cellene i 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% normalt geiteserum, 6% fettfri tørr melk og 50% FBS i 20 minutter ved romtemperatur.
  7. Inkuber cellene med anti-LC3 antistoff (1: 200) fortynnet i PBS i 2 timer ved romtemperatur.
    MERK: Som en negativ kontroll av immunostaining, bør en gruppe celler inkuberes med immunoglobulin G (IgG) fra dyret av primær antistoff opprinnelse i en konsentrasjon tilsvarende den som brukes for det primære antistoffet.
  8. Vask cellene tre ganger med 0,9% NaCl-oppløsning ved romtemperatur.
  9. Inkuber cellene med AlexaFluor 488-konjugert geit anti-kanin IgG (1:500) eller de foretrukne fluorescerende fargestoffkonjugerte sekundære antistoffene i 1 time ved romtemperatur.
  10. Vask cellene tre ganger med 0,9% NaCl-oppløsning ved romtemperatur.
  11. Monter deksler ved hjelp av foretrukne monteringsmedier.
  12. Skaff bilder via konfokal fluorescensmikroskop ved hjelp av et 63x / 1.4-mål.

7. Confocal mikroskopi oppkjøp og Fiji kvantifisering

MERK: Innhenting av immunfluorescensbilder bør utføres ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. For å oppnå en bedre oppløsning, bruk en olje-nedsenking 63x objektivlinse.

  1. La 13 mm glassdekslene ligge i romtemperatur og beskytt dem mot lyset minst 30 minutter før anskaffelsen.
  2. Rengjør dekslene med et absorberende vev.
  3. Legg til en dråpe nedsenkningsolje til målet og legg til lysbildet.
  4. Flytt målet opp til oljen berører lysbildet.
  5. Observer og juster fokuset på mikroskopet og velg alternativet 63x mål med olje.
  6. Åpne Leica-programmet og juster laserne i bølgelengdene 488, 552 og 405.
  7. Velg bildeoppløsningen 1,024 x 1,024.
  8. Klikk på Live-knappen , still inn Z-stakken og trykk på Start-alternativet . Gjør det igjen og trykk på Slutt knapp. Vi anbefaler 20 μm for skivetykkelse for å få konfokale bilder med gode oppløsninger.
  9. Vent på bildeopptaket, og velg deretter alternativet "Maksimal projeksjon" i Leica-verktøyene.
  10. Lagre eksperimentet.
  11. Eksporter bildene i LIF- eller TIFF-format til en datamaskin og åpne FIJI-programmet.
  12. Åpne eksperimentet og angi visningsstakken med hyperstakken. Velg deretter åpne filer individuelt og sy fliser.
  13. Velg verktøyet for frie hender i Fiji-verktøylinjen og spor cellen nøye for hånd.
  14. Trykk på Analyser-knappen og mål for å visualisere fluorescensintensiteten.
  15. Gjenta denne prosessen til hver celle per gruppe.
  16. Lagre målingene og eksporter dem til et regnearkredigeringsprogram.
  17. Legg disse dataene til et statistisk analyseprogram og gjør den statistiske analysen.

8. Statistisk analyse

MERK: For dataanalyse og grafikk, bruk et statistisk analyseprogram.

  1. Åpne programmet.
  2. Sett inn de oppnådde dataene og test normalitetsparametrene.
  3. For data med normalfordeling, bruk Student t-test og for ikke-parametriske tester, Mann-Whitney test.
  4. Vurder data med statistisk signifikant forskjell når p-verdien er mindre enn 0,05.
  5. Klargjør grafikk som representerer dataene, med sentrale tendensmål (gjennomsnitt eller median) og variasjonsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne rapporten tar sikte på å evaluere de tidlige hendelsene som oppstår under fagocytose av L. braziliensis isolert fra pasienter med L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL-form av CL. Ved hjelp av konfokal mikroskopi undersøkte vi de viktigste hendelsene knyttet til parasittenes fagocytose: binding, internalisering og fagosommodning. Vi evaluerte først L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL-bindingen og fagocytose ved human monocytt-avledede makrofager. Dataene viser at både L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL på samme måte binder seg til makrofager (figur 1). Det ble heller ikke observert forskjeller vedrørende L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL fagocytose av vertsceller (figur 2). Til slutt sammenlignet vi rekrutteringen av LC3 med PVene indusert av L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL i infiserte celler. Etter 30 min, 4 og 12 timers infeksjon observerte vi tilsvarende andeler av LC3-dekorerte PV-er i L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL-infiserte makrofager (figur 3). Disse representative resultatene viste at L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL på samme måte interagerer med makrofager under binding, fagocytose og biogenese av PVer, angående LC3-rekruttering.

Mikroskopiske bilder som representerer THP-1-celler effektivt transfisert med PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP-plasmider er vist i figur 4.

Figure 1
Figur 1. Evaluering av L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL binding til humane makrofager. Humane monocyttavledede makrofager var infisert med L. braziliensis-LCL- eller L. braziliensis-DL. Etter 10 minutter ved 4 °C ble bindingen vurdert ved konfokalmikroskopi. (A) Konfokale mikroskopibilder av L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL (merket med CMTPX, rød) binding til makrofager (merket med phalloidin, grønn). For konfokal mikroskopi ble cellekjerner merket med DAPI (blå). Piler viser Leishmania-makrofagbinding. (B) Prosentandel av Leishmania som binder seg til makrofagene. Totalt 30 celler per gruppe ble analysert. Data representerer hver replikasjon av ett eksperiment utført i femdoble (uparet t-test, p > 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Evaluering av L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL fagocytose ved humane makrofager. Humane monocyttavledede makrofager ble inkubert med L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL i 10 minutter ved 4 °C etterfulgt av ytterligere 1 time ved 37 °C. Cellene ble deretter analysert ved fluorescensmikroskopi ved å telle totalt 400 celler. (A) Konfokale mikroskopibilder av humane makrofager infisert av L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL. For konfokal mikroskopi ble cellekjerner merket med DAPI (blå). Piler skildrer Leishmania parasitter kjerner. (B) Prosentandel av Leishmania fagocytose. Sirkler representerer data fra hver replikasjon av ett eksperiment utført i tre eksemplarer (uparet t-test, p > 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Vurdering av LC3-rekruttering til PVer indusert av L. braziliensi s-LCL eller L. braziliensis-DL i makrofager. Humane monocyttavledede makrofager ble infisert og deretter farget med anti-LC3-antistoff i 30 min, 4 og 12 timer. (A) Konfokale mikroskopibilder av L. braziliensi s-LCL eller L. braziliensis-DL-infiserte makrofager merket med anti-LC3 etterfulgt av det sekundære antikanin-IgG-antistoffet konjugert til Alexa Fluor 488 (grønt). For konfokal mikroskopi ble cellekjerner merket med DAPI (blå); (B) Prosentandel av L. braziliensi s-LCL eller L. braziliensis-DL-induserte PV-er dekorert med LC3-II. Totalt 30 celler per gruppe ble analysert. Sirklene tilsvarer hvert tilfeldig valgt felt som analyseres (uparet t-test, p > 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. THP-1-celler som uttrykker PLC, Rab5 eller Rab7. Etter differensiering i makrofager ble THP-1-celler utsatt for nukleofektion med hvert gen av interesse koblet til GFP-fluorescerende prober: PLC, Rab5 og Rab7. Deretter ble disse cellene fikset, hadde kjernen farget med DAPI (blå) og ble observert under et konfokalt mikroskop ved hjelp av et 63x / 1,4 mål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Leishmania-makrofag interaksjon er en kompleks prosess og involverer flere trinn som kan påvirke sykdomsutvikling5. For bedre å forstå mekanismene som er involvert i samspillet mellom uopsonisert Leishmania og vertsceller, har vi beskrevet en protokoll som benytter konfokal fluorescensmikroskopi for å vurdere fagocytose fra tidlige til sene stadier av Leishmania-infeksjon . Bruken av fluorescensteknikker som involverer to eller flere fluoroforer for å undersøke cellebiologiske mekanismer, inkludert immunmerking og ekspresjon av fluorescerende merkede proteiner, tillater oss å analysere plasseringen av flere proteiner, samt samtidig evaluere cellemorfologi. Fordelene som tilbys av disse metodene gjør dem til de beste verktøyene for å overvåke patogen-vertscelleinteraksjon34.

For bedre å forstå fagocytprosessen som involverer forskjellige partikler, er det avgjørende å analysere denne svært dynamiske prosessen på molekylært nivå35. Konfokal-fluorescensmikroskopi har blitt brukt i flere tiår til dette formål og har vist seg å være et utmerket verktøy for kvantifisering av fagocytose gjennom bestemmelse av antall internaliserte partikler, eller hvilke typer proteiner som er kjent for å være involvert i tidlige stadier av vertspatogeninteraksjon34. Denne studien foreslo bruk av konfokal mikroskopi for å analysere hendelser som oppstår under fagocytose av L. braziliensis isolert fra pasienter med forskjellige kliniske former (LCL og DL). Denne teknikken gjør det mulig for oss å studere celler som uttrykker spesifikke fluorescerende proteiner, inkludert PLC, Akt, Rab 5 og Rab 7, og deretter evaluere deltakelsen av disse proteinene i fagocytose av Leishmania-isolater for å identifisere elementer som er relevante for forskjellige infeksjonsutfall.

Denne studien benyttet primære makrofager og THP1-celler for å vurdere L. braziliensis fagocytose i tidlige stadier av infeksjon. Den for tiden beskrevne protokollen kan også brukes til å studere fagocytose i Leishmania spp. av andre fagocytter, inkludert dendrittiske celler, monocytter, makrofagcellelinjer og nøytrofiler avledet fra humant perifert blod. Under parasittens internaliseringsprosess skjer en dynamisk forandring i F-aktin ved cellemembranoverflaten11. Vi merket deretter proteiner lokalisert i cellemembranen ved hjelp av en spesifikk markør for fagocytose36, for eksempel fluorescerende PLC, som tillot oss å observere bindingsstadiet av Leishmania til vertsceller, som vist i figur 4. Farging av parasitter med fluorescerende markører, som CMTPX eller CSFE, er også avgjørende for å vurdere parasittbinding til vertsceller ved immunfluorescens. Det er verdt å merke seg at denne analysen krever forsiktig utførelse: i) vask deksler forsiktig ved bruk av vaskeløsninger ved romtemperatur (25 ° C), ellers kan prøver bli skadet; ii) forberede reagensfortynninger nøyaktig; og iii) beskytte prøvene mot lys34.

Et konfokalt mikroskop konfigurert til den optimale laserspenningsbølgelengden er i stand til å oppnå et prøvebilde av høy kvalitet. Merkede celler kan lagres i flere uker i mørket ved 4 °C eller fryses ned til analysetidspunktet. Bruken av konfokal mikroskopi for å evaluere fagocytose er begrenset av lengre eksponeringstider og laserstråler med høy intensitet, noe som kan skade prøver, og i noen tilfeller føre til høye nivåer av bakgrunnsdeteksjon i bilder35,37.

I denne studien, i stedet for å bruke levende bildebehandling for å følge fagocytose av Leishmania spp., utførte vi en kinetisk studie ved å fikse celler på flere tidlige infeksjonstider (30 min, 4 timer og 12 timer). Det må vurderes at levende bildebehandling gir noen fordeler, for eksempel potensialet til å analysere den romlige og tidsmessige dynamikken til utallige cellulære prosesser, inkludert fagocytose, og fange detaljer som ikke kan observeres i statiske bilder34. Levende avbildning krever imidlertid at cellene er sunne gjennom hele eksperimenteringsprosessen, inkludert kontroll av temperatur, pH og oksygenforhold i et mikroskopisk kammer. Det er viktig å merke seg at dette ikke kan utføres pålitelig på flere laboratorier rundt om i verden.

Nukleofektionprotokollen som er beskrevet, har vist effekt i transfeksjonen av THP-1-celler, som tidligere rapportert av M. B. Maess, B. Wittig og S. Lorkowski 23. I denne prosessen er det avgjørende å forsiktig løsne celler for å unngå celleskader eller tap i cellens levedyktighet. Basert på vår erfaring anbefaler vi å bruke en ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning for å løsne celler fra plater før transfeksjon utføres. Forfatterne av den opprinnelige protokollen23 sier at hovedbegrensningene i denne prosedyren er behovet for at celler skal være i suspensjon under nukleofektionprosessen, og det faktum at utilstrekkelig løsrivelse kan forårsake stress. Til tross for disse begrensningene tillater protokollen pålitelig transfeksjon, og når en 90% vellykket transfeksjonshastighet uten å miste cellens levedyktighet.

Karakteriseringen av PVer ved hjelp av et sett med endocytiske markører, inkludert PLC, Akt, Rab5 og Rab7, er avgjørende for å forbedre vår forståelse av Leishmania-fagocytose. Identifisering av nye proteiner som deltar i PV-biogenese og omfattende karakterisering av disse rommene, kan avklare forskjeller i makrofagrespons under Leishmania spp.-infeksjon. Bidraget av våre resultater til kunnskapsgrunnlaget rundt Leishmania-infeksjonsutfall vil utvilsomt fremme vår forståelse av patogenesen av Leishmania-infeksjon og støtte det eventuelle søket etter nye kjemoterapeutiske mål. Det er verdt å merke seg at denne teknikken også kan utvides til andre typer studier, inkludert infeksjon av bakterier, gjær eller perleoppslukning av mange typer celler38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling eller analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet. Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Gonçalo Moniz-instituttet, Fiocruz Bahia, Brasil og mikroskopiavdelingen for hjelp. Dette arbeidet ble støttet av INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, PSTV har et stipend for produktivitet i forskning fra CNPq (305235/2019-2). Plasmider ble vennlig levert av Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. Forfatterne vil gjerne takke Andris K. Walter for engelskspråklig revisjon og manuskriptredigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 173
Undersøke fagocytose av <em>Leishmania</em> ved hjelp av konfokal mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paixão, A. R., Dias, B. R. S.,… More

Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter