Summary
Intestinal epitel ger inte bara näringsupptag utan skydd mot skadliga ämnen. Den apikala mest epiteliella intercellulära korsningen, dvs den snäva korsningen, reglerar paracellulär lösning och jongenomsläpplighet. Här beskrivs ett protokoll för beredning av slemhinnan ark och bedömning av jon selektivitet av snäva korsningar med Ussing kammarteknik.
Abstract
Ussings kammarteknik uppfanns först av den danske forskaren Hans Ussing 1951 för att studera den transcellulära transporten av natrium över grodskinn. Sedan dess har denna teknik tillämpats på många olika vävnader för att studera de fysiologiska parametrarna för transport över membran. Ussing-kammarmetoden är att föredra framför andra metoder eftersom inhemsk vävnad kan användas, vilket gör den mer tillämplig på vad som händer in vivo. Men eftersom inhemsk vävnad används är genomströmningen låg, tiden är begränsad och vävnadsberedning kräver skicklighet och träning. Dessa kammare har använts för att studera specifika transportörproteiner i olika vävnader, förstå sjukdomspatofysiologi som i cystisk fibros, studera läkemedelstransport och upptag, och särskilt bidragit till förståelsen av näringstransport i tarmen. Med tanke på hela epitelial transport processen av en vävnad, inte bara transepithelial vägar, men också paracellulära vägar är viktigt. Snäva korsningar är en viktig determinant för vävnad specifika paracellulära permeabilitet över tarmen. I den här artikeln kommer Ussing-kammartekniken att användas för att bedöma paracellulär permselektivitet hos joner genom att mäta transepithelial resistans och utspädningspotentialer.
Introduction
Ussing-kamernmetoden utvecklades först av den danske forskaren Hans Ussing. Ussing använde den först för att mäta kortslutningsströmmen för natriumtransport över grodskinn efter att det observerades att NaCl kunde transporteras över huden mot en brant koncentrationsgradient1. Hans system bestod av grodskinnet monterat mellan två kammare med tillgång till vardera sidan av huden. Varje kammare innehöll Ringers lösning som cirkulerade och luftades. Två smala agarringsbroar som ligger nära huden och anslutna till mättade KCl-calomelelektroder mätte den potentiella skillnaden enligt en potentiator. Ett andra par agarringsbroar var placerade i motsatt ände av varje kammare ansluten till bägare med mättad KCl mättad med AgCl för att applicera en elektromotorisk kraft som tillhandahålls av ett batteri. En potentiell avdelare användes för att justera spänningen så att den potentiella skillnaden över huden förblev noll, vilket skapade kortslutningsförhållanden. En mikroamperemätare var också ansluten för att avläsa strömmen som passerar genom huden (se figuren i ref.1 för originalkammardesign).
Under de senaste 70 åren har denna teknik tillämpats på många olika vävnader, särskilt tarmvävnad, för att studera närings- och jontransport. Till exempel studerades mekanismen för kolera-inducerad diarré av montering kanin ileum i dessa kamrar, och det konstaterades att kolera toxin-inducerad diarré medieras av cAMP2. Dessutom användes dessa kammare också för att studera mekanismen bakom glukostransport via Na+-Glukos cotransporter 1 (SGLT1)3. Vårt labb fokuserar på transcellulär och paracellulär transport i intestinala epitelceller. Med hjälp av Ussing-kammarmetoden bedömdes peptidtransport hos Claudin 15 knockout möss, som har nedsatt paracellulär natriumtransport, med hjälp av Ussing kammare för att mäta absorptionen av nonhydrolyzable dipeptide glycylsarcosin. Det konstaterades att luminal Na + homeostas är viktigt för proton-kopplade peptid transport4. Dessutom användes dessa kamrar också för att undersöka anjonutsöndring i murine cecum som svar på submucosal aktivering av proteinas aktiverad receptor 1 av serin proteas trypsin5.
Ussing kammare har också nyligen använts för att bedöma paracellulära vägar i epitelial vävnad. Paracellulära vägar regleras av snäva korsningar, som är komplex av proteiner som bildas vid den punkt där två eller flera celler möts6. Barriärfunktionen och jonselektiviteten (oavsett om anjoner eller katjoner selektivt kan passera genom den snäva korsningen) bestäms av närvaron av claudin-familjeproteiner; vissa av dem fungerar som barriärer (claudin 3 och 7), anjonporer (claudin 10a) eller katjonporer (claudin 2, 10b och 15)7. Andra metoder har använts för att bedöma den paracellulära vägen, såsom oral sondmatning av FITC åtföljd av blodplasma FITC-koncentration8 eller EDTA-Cr9; Dessa tekniker är dock av lägre upplösning och kan inte bedöma jons selektivitet eller en specifik del av tarmkanalen. Ussing-kammare kan dock användas för att bedöma utspädningspotentialen hos måljoner och därmed bestämma jonsämheten hos de trånga korsningarna. Till exempel, med NaCl, kan selektiviteten hos de täta korsningarna för Na+ och Cl- beräknas genom att späda ena sidan av membranet (vanligtvis slemhinnan) och mäta förändringen i transepithelial potentiell skillnad. De relativa permeabilitiesna av Na+ och Cl- kan uppskattas av Goldman-Hodgkin-Katz likställande10 och selektiviteten av den snäva föreningspunkten kan uppskattas med hjälp av Kimizuka-Koketsu-ekvationen11. Dessa kammare har därför fördelen att mäta vävnadens elektrofysiologiska parametrar och ger därför mer information om passagen av joner genom de snäva korsningarna än andra metoder med lägre upplösning.
Ussing-kammarmetoden är inte bara begränsad till tarmkanalen, även om den används i stor utsträckning i studier om tarmarna, den har många andra tillämpningar också. Till exempel har dessa kammare använts för att studera cystisk fibros, och specifikt kloridkanalen cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR)12. Cystisk fibros orsakas av en mutation i CFTR13, vilket resulterar i nedsatt klorid sekretor och vätsketransport av respiratoriska epitelceller, och ett resulterande tjockare, torrare slemhinnor lager14. Studie av luftvägarna epitelial CFTR har utförts med dessa kammare för att inte bara förstå sjukdomen, men för att upptäcka sätt att behandla sjukdomen. Till exempel hos patienter med sällsynta mutationer som orsakar cystisk fibros har analys av patientens respiratoriska epitelceller använts för att testa terapier som Orkambi och en förstärkare co-therapy15.
Ussing kammare har också använts för att studera vägar av läkemedelsleverans, såsom med mänsklig biopsivävnad för att studera läkemedelsupptag och farmakokinetik16. Intestinalt upptag är inte den enda vägen för läkemedelsleverans. Dessa kammare har också använts för att studera nasala drug delivery system17. Läkemedelsleveransstudier med Ussing-kammare har också utförts för ögat. I kanin hornhinnan genomfördes permeabilitets- och upptagsstudier med Labrasol, ett läkemedel som är utformat för att öka absorptionen av läkemedel över vävnader18. En annan studie undersökte effekten av bensylalkoniumklorid på transskleral läkemedelsleverans i kanin sclera19.
Ussing-kammarmetoden är användbar eftersom inhemsk vävnad kan användas. Som sådan är det att föredra framför in vitro-modeller som Caco-2-cellinjer. Tekniken kräver dock skicklighet och tid att förbereda prover, så den är inte lämplig för applikationer med hög genomströmning. De elektrofysiologiska egenskaperna hos cellmonoskikt kan studeras med hjälp av cellodlingsinsatser i dessa kammare. Nya upptäckter har möjliggjort kultur av organoider som är miniorgan som odlas i kultur från skörden av epitel- eller endotelstamceller20. Organoidkultur kan manipuleras för att odlas i en monolayer, vilket gör det möjligt att montera organoider i en Ussing-kammare21. Organoider av olika epitelial och endotelvävnader kan studeras, vilket sänker antalet djur som krävs, eftersom organoid kultur kan upprätthållas på lång sikt. Detta kommer också att öka genomströmningen eftersom tidskrävande och mödosamma vävnadsavstötnings- och förberedelsesteg inte kommer att behövas. I framtiden kommer Ussings kammarstudier att fortsätta att vara mycket användbara för att studera vävnadstransport och de kommer att vara särskilt viktiga inom området personlig medicin.
Följande protokoll visar tillämpningen av Ussing-kammarmetoden för att bedöma permselektivitet och barriärfunktion hos de täta korsningarna i tunntarmen hos Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) möss och vilda typ (WT) kontroller genom att mäta utspädningspotentialen hos NaCl. Snäva korsningar (TJ) bildas vid den punkt där två eller flera celler möts i epitel- och endotelvävnad. Bicellulära snäva korsningar (bTJ), särskilt claudin familjen proteiner som finns inom bTJ, tros bestämma barriär funktion och permselectivity av TJ7. Cldn15-/- möss har en mega tunntarmen22 och minskad näringsupptagsförmåga på grund av förlusten av intestinal Na + återvinning som sker via claudin 154,23,24. Cldn15-/- möss har försämrat Na+ homeostas, vilket gör dem till en intressant modell för att studera TJ: s permselektivitet. Följande protokoll bedömer TJ:s permeabilitet till NaCl genom att mäta utspädningspotentialen hos NaCl (PNa/PCl) i mellersta tunntarmen. Kortfattat kan den förändring i membranpotentialskillnaden som uppstår genom utspädning av ena sidan av membranet (M-sidan eller S-sidan, båda mäts i nedanstående protokoll) användas för att beräkna permeabiliteten hos Na+ (PNa) och Cl- (PCl), och utspädningspotentialen (PNa/PCl) kommer att visa om den täta korsningen har en katisk eller anjonisk selektivitet.
Experimenten i detta protokoll utfördes med hjälp av en anpassad Ussing-kammare (figur 1A), som består av två halvor, mellan vilka tarmberedningen monteras vertikalt, spänningsklämmaförstärkare, elektrisk inspelare, elektroder, saltbryggor, Ringers lösning, HEPES-buffert (150 mM NaCl), utspädd HEPES-buffert (75 mM NaCl), tarmberedning (för detaljer om utrustning se tabellen över material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som användes i dessa experiment hölls i djurvårdsanläggningen vid Universitetet i Shizuoka och experimenten utfördes i enlighet med de riktlinjer för djurforskning som fastställts av University of Shizuoka. Alla experiment utfördes med godkännande från Animal Care and Use Committee vid University of Shizuoka (Tillstånd #205272 och #656-2303).
1. Beredning av NaCl elektroder
OBS: Elektroderna som används i dessa experiment består av koncentrerade NaCl eller KCl. KCl/calomelelektroderna köps kommersiellt. Innan experimentet påbörjas, se till att alla elektroder fylls till toppen med koncentrerad NaCl- eller KCl-lösning.
- Förbered små glasburkar med plastlock (volym 20 ml).
- Borra två hål i plastlocken, ett för NaCl saltbrygga (2,5 mm diameter) och det andra för silvertråd (1 mm diameter; Bild 1C, NaCl elektrod).
- Fyll glasburken med mättad NaCl-lösning (ca 15 ml, tills den är full).
- För in silvertråden (0,8 mm i diameter, 7 cm lång) i burken, men se till att tråddelen utanför burken kan anslutas via alligatorklämmor (liten storlek) till förstärkarsystemet.
- När de inte används, linda elektroderna och se till att hålen är täckta, med parafilm för att förhindra torkning.
2. Beredning av saltbroar
OBS: Förbered saltbroar minst en dag före experimentet för att ge tillräckligt med tid för att stelna. Saltbroar kan användas upprepade gånger men användning efter 2 månader rekommenderas inte.
- NaCl saltbroar
- Förbered #7 polyetylrör (ytterdiameter 2,3 mm, innerdiameter 1,3 mm), 19 G nål och låsliknande spruta, 200 ml 1 M NaCl-lösning, 2 g agar, förseglingsbar plastbehållare för saltbroförvaring.
- Förbered lämpligt antal saltbroar genom att skära slangar till den storlek som krävs för ussingkammarens uppsättning (varje kammare kräver två saltbroar).
- Innan du injicerar agar, gör en U-form med rören och placera dem i en bägare med varmt vatten (för att skapa en enkel form för att ställa in saltbroar).
- Gör 200 ml 1 M NaCl genom att lösa upp 11.688 g NaCl i 200 ml i avjoniserat vatten.
- Dela 1 M NaCl i 100 ml portioner: Gör 100 ml 2% agar i 1 M NaCl (blanda 2 g agar i NaCl, värm i mikrovågsugn för att lösa upp).
- Fyll sprutan med en 19 G nål och låsspruta med 1 M NaCl/agarlösning. Börja försiktigt utvisa lösningen droppe för droppe och för sedan in nålen i ena änden av röret och fyll tills blandningen kommer ut från andra sidan.
- Dra långsamt tillbaka nålen medan du fortfarande uttrycker lösningen och upprepa tills alla nödvändiga saltbroar har gjorts. (Om lösningen stelnar i sprutan eller nålen, värm den kort i varmt vatten tills lösningen kan uttryckas igen.)
- Kontrollera saltbroar för att säkerställa att det inte finns några bubblor och förvara i återstående 1 M NaCl-lösning i en förseglingsbar behållare.
- KCl saltbroar
OBS: Tunnare slangar används för KCl-agarbryggorna för att undvika ökningen av K+- koncentrationen i bufferten, eftersom saltbryggornas spetsar kan lösas upp och K+ kan läcka in i bufferten.- Förbered #3 polyetylrör (ytterdiameter 1,0 mm, innerdiameter 0,5 mm), 23 G nål- och låsspruta, 200 ml 1 M KCl-lösning, 2 g agar, förseglingsbar plastbehållare för förvaring av saltbroar.
- Förbered lämpligt antal saltbroar genom att skära slangen till den storlek som krävs för ussingkammarens uppsättning (varje kammare kräver två saltbroar).
- Gör 200 ml 1 M KCl genom att lösa upp 14,91 g KCl i 200 ml avjoniserat vatten.
- Dela upp i två 100 ml portioner: Gör 100 ml 2% agar i 1 M KCl (blanda 2 g agar i KCl, värm i en mikrovågsugn för att lösa upp).
- Använd en 23 G nål och låsspruta, injicera slangar med 2% agar 1 M KCl blandning (se till att rören är helt fyllda och det inte finns några bubblor) på samma sätt som med NaCl saltbroar.
- Kontrollera saltbroar för att säkerställa att det inte finns några bubblor och förvara i den återstående 1 M KCl-lösningen i en förseglingsbar behållare.
3. Beredning av Ringers lösning och HEPES-buffert
OBS: Beroende på vävnaden monterad i Ussing-kammaren kan komponenterna i Ringers lösning skilja sig åt. Recepten som presenteras här är specifika för små och stora tarmarna.
- Gör Ringers lösning fräsch på experimentdagen enligt tabell 1.
- Bubbla lösningen med 95% O2/5% CO2 för att ge O2 till vävnaden och en buffringskapacitet.
| Ringers lösning (tunntarmen) | Ringers lösning (tjocktarmen) |
| NaHCO3 – 21,0 mM | NaHCO3 – 21,0 mM |
| K2HPO4 – 2,4 mM | K2HPO4 – 2,4 mM |
| KH2PO4 – 0,6 mM | KH2PO4 – 0,6 mM |
| NaCl – 119,0 mM | NaCl – 119,0 mM |
| MgCl2 – 1,2 mM | MgCl2 – 1,2 mM |
| CaCl2 – 1,2 mM | CaCl2 – 1,2 mM |
| Indomethacin – 10 μM (Gör 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tillsätt 10 ml lager för 1 L av Ringers lösning) | Indomethacin – 10 μM (Gör 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tillsätt 10 ml lager för 1 L av Ringers lösning) |
| 1 mM glutamin (0,146 g/l) | 10 mM Glukos |
Tabell 1: Ringers lösningsrecept. För att göra Ringers lösning, blanda alla komponenter tillsammans med avjoniserat vatten. Ringers lösning görs bäst färsk före experiment. Förvaras i kylskåp eller på is tills den används. Gas med 95% O2/5% CO2 före användning.
- Gör HEPES-bufferten färsk på experimentdagen enligt beskrivningen i tabell 2 genom att blanda ingredienser i avjoniserat vatten.
- Justera inte till den slutliga buffertvolymen förrän efter pH-justering.
- Värm HEPES-bufferten till 37 °C och justera pH-värdet till 7,4 genom att långsamt tillsätta droppar med 1 M Tris-lösning under omrörning.
- Justera till den slutliga volymen genom att tillsätta lämplig mängd avjoniserat vatten.
| HEPES-buffert | Utspädning HEPES buffert |
| HEPES – 10 mM | HEPES – 10 mM |
| Glukos – 10 mM (Tjocktarmen) | Glukos – 10 mM (Tjocktarmen) |
| 1 mM glutamin (0,146 g/L) (Tunntarmen) | 1 mM glutamin (0,146 g/L) (Tunntarmen) |
| NaCl – 150 mM | NaCl – 75 mM + 150 mM mannitol (för att justera för osmolalitetsskillnader) |
| MgCl2 – 1 mM | MgCl2 – 1 mM |
| CaCl2 – 2 mM | CaCl2 – 2 mM |
| Indomethacin – 10 μM (Gör 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tillsätt 10 ml lager för 1 L av Ringer's Solution) | Indomethacin – 10 μM (Gör 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tillsätt 10 ml lager för 1 L av Ringer's Solution) |
| Justera till pH 7,40 (37°C) med 1 M Tris | |
Tabell 2: HEPES buffertrecept. Lös upp alla ingredienser i avjoniserat vatten för att göra HEPES-buffert och utspädning HEPES- buffert. Lösningarna måste justeras med 1 M Tris-lösning, så tillsätt inte full volym vatten (t.ex. när du gör 1 L, lös alla ingredienser i ca 800 ml vatten). Värm sedan lösningen till 37 °C, justera pH till 7,4 och justera sedan den slutliga volymen.
4. Ussing kammare setup
OBS: Ussing-kamrarna som används i detta protokoll är skräddarsydda kontinuerliga perfusionskammare. För att bedöma musens tarmbarriärfunktion eller näringsupptag rekommenderas kammare med en öppning med diametern 4 eller 5 mm25 (figur 1A-C).
- För att minska kanteffekten26 och hjälpa till att täta kamrarna, fäst 4 eller 5 mm hål stansad paraffinfilm (ca 4 cm2) innan du ställer in (figur 1B).
- Ställ in i öppna kretsförhållanden för utspädningspotentialmätning. Ställ in i aktuellt klämläge. Ställ in utgången som ström och ställ in strömpulsen till ±20 μA.
- Vid inställning i kortslutningsförhållanden för mätning av kortslutningsström och transmukosalt motstånd, ställ in i spänningsklämmaläge. Ställ in utgången som spänning och ställ in spänningspulsen på ±5 mV.
- Se till att 37 °C vatten cirkulerar i vattenmanteln.
- Fyll varje kammare med Ringers lösning eller HEPES-buffert (mängden beror på vilket system som används, kamrarna som används här kräver 5 ml för varje sida) och se till att det inte finns några läckor.
- Anslut saltbroar och elektroder.
- Se till att spänningen är 0 och stabil, pulsström för att säkerställa att saltbryggor och elektroder är korrekt inställda.
- Låt systemets och Ringers lösningstemperatur balansera i minst 20 minuter.
- Efter jämvikt, korrigera asymmetrisk spänningsskillnad mellan KCl-elektroder och kompensera för vätskemotstånd genom att ändra den till noll (kontrollera manualen för Ussing-kammarsystemet som används för att bestämma rätt sätt).
5. Dissekering av tarmvävnad
OBS: Alla djurförsök måste utföras enligt de regler som fastställts av landet och universitetet.
- Innan du tar tarmvävnaden, förbered färsk, iskall Ringers lösning och bubbla med 95% O2 och 5% CO2 i 15 min (steg 3).
- Bedöva möss enligt riktlinjer som styr användningen av djur i forskning. För detta experiment bedövades möss med 2-3% isofluran administreras av en bedövningsmedel. Kontrollera om det finns rätt anestesi genom att nypa tårna och se till att det inte finns något smärtsvar.
- Gör ett snitt i buken med sax från bäckenet till membranet; lokalisera magen och skära den pyloriska änden av magen.
- Greppa magdelen fäst vid tunntarmen med tång och dra försiktigt tunntarmen samtidigt som du skär bort de mesenteriära tillbehören. Var försiktig så att du inte skär eller skadar tarmvävnaden på något sätt.
- Fortsätt dissekera tarmarna hela vägen till anusen. För fullständigt avlägsnande av tjocktarmen, skär bäckenbenen för att avslöja den distala delen av tjocktarmen och ta försiktigt bort resten av tarmen genom att skära bort bilagorna.
- Mät tarmens längd och dela upp i önskade segment. För detta experiment delar du tunntarmen i tre segment och använder mittsegmentet.
- Placera de önskade segmenten i iskall, bubblande Ringers lösning; Öppna sedan varje segment längsgående genom att skära längs de mesenteriära tillbehören. Trimma bort fett och bindväv.
- Återför segmenten till den iskalla Ringers lösning och tvätta noggrant (även i den iskalla lösningen är syresättning av det luminala epitelet viktigt för att upprätthålla epitelfunktionen).
6. Strippa muskelskiktet och beredningen av tarmbladet
OBS: Avlägsnande av serosa (muskelskikt) är viktigt för transportstudier med hjälp av tarmarna. Om serosa kvarstår kan tarmvävnaden bli föremål för slumpmässiga muskelsammandragningar som förvränger elektrofysiologiska data, och transport kan hämmas. Otripped vävnad försämras snabbt när den monteras i Ussing-kamrar, eftersom serosa är en betydande diffusionsbarriär för substrat och syre. I vissa speciella fall kan det vara nödvändigt att behålla muskelskiktet, så beslutet är upp till forskaren och den experimentella designen. Tarmplåtarna kan beredas på två sätt beroende på vilket skikt som tas bort (figur 2). För detta experiment krävs slemhinnan och submukosala preparat (figur 2, 2: a panelen).
- Förbered dissekeringsplattor (10 cm i diameter) täckta med silikongummi, stift (små akupunkturnålar), 5 mm stansat filterpapper och parafilmrutor (2 cm x 2 cm; kanske inte behövs för andra system).
- Häll färsk, iskall, bubblad Ringers lösning i dissekeringsplattan (tillräckligt för att täcka vävnaden, ca 2-3 ml).
- Under ett stereomikroscope fäster du ändarna av tarmvävnad (slemhinnan ner).
- Använd fina tångar, dissekera trubbigt muskelskiktet från den underliggande slemhinnan.
- Var försiktig så att du inte river eller för in några hål i vävnaden.
- När muskelskiktet har tagits bort, skär en bit som är tillräckligt stor för en öppning med 5 mm diameter. Vid beredning av tunntarmen bör avlägsnande av serosa-muskelskiktet ske inom 10 min, eftersom luminal syresättning är svårt under dessa förhållanden.
- Våt 5 mm stansat filterpapper kvadrat i Ringers lösning och placera tarmvävnaden på den med slemhinnan ner, eftersom submukosala preparat spontant linda runt med slemhinnan sida utanför.
- Se till att öppningen är helt täckt av tarmvävnaden och att inga rynkor finns. Använd en svart bräda under preparatet för att undersöka om öppningen är helt täckt.
- Upprepa denna procedur för det erforderliga antalet slemhinnans preparat (i detta experiment krävs två preparat: ett preparat kommer att användas för att mäta utspädningspotentialen och det andra kommer att användas för att mäta elektriska parametrar vid baslinjen).
7. Montering av tarmpreparat i Ussing-kammare
OBS: Inställda beror på vilken typ av Ussing-kammarsystem och inspelningssystem som används.
- Sug ut Ringers lösning/HEPES-buffert från Ussings kammare.
- Demontera Ussing-kammaren och lägg filterpapperet med tarmberedningsslemhinnan ner på slemhinnans sidokammare och justera så att kammarens fönster överensstämmer med filterpapperets hål (Figur 1A, svart markering runt kammarfönstret är användbar för justering av preparaten).
- Placera försiktigt serosalsidans kammare på Mucosal sidokammare och stäng tätt men se till att tarmplåten inte har rört sig under anslutningen.
- Fyll snabbt på båda kamrarna med Ringers lösning eller HEPES-buffert och placera bubblande trollstavar (Ringers lösning: 95% O2/5% CO2; HEPES-buffert: 100% O2) i motsatt ände av kamrarna, bort från membranet (bubblande för nära preparatet kan påverka mätningarna).
- Återanslut saltbroar och kontrollera om spänningen är stabil och pulsströmmen för att säkerställa att anslutningarna är okej (bild 1C).
- Upprepa för varje tarmpreparat.
- Låt systemet balansera i ca 15 min. Om du använder ett inspelningssystem, låt konduktiven och Isc/membranets potentiella skillnad stabiliseras innan experimenten påbörjas.
8. Utspädningspotentialexperiment (öppna kretsförhållanden)
- Tvätta båda sidor av kammaren genom att suga HEPES-bufferten och tillsätt 5 ml färsk förvärmd HEPES-buffert på varje sida.
- Slå på inspelningssystemet. Ställ in räckvidden på 250 mV (systemet som används här förstärker utgångsspänningen 10x), ställer in markörpositioner och ställer in inspelningssystemet för att mäta.
- Vrid Ussings kamsystem till klämläge och börja mäta. När membranpotentialen har stabiliserats (~15-20 min) kan bedömningen påbörjas.
- Sug hepesbufferten från mucosalsidan och byt snabbt ut med 5 ml varm utspädning HEPES-buffert som innehåller 75 mM NaCl.
- När membranpotentialen har nått sin topp (5-10 min), ta bort utspädningsbufferten från sidan "Mucosal" och ersätt med HEPES-bufferten.
- Upprepa vid behov steg 3 för serosalsidan och tillsätt utspädnings-HEPES-bufferten på serosalsidan.
- För att säkerställa att vävnaden är livskraftig, tillsätt adenylatcyklasaktivatorn Forskolin (slutlig koncentration 10 μM) på serosalsidan.
- När den potentiella skillnaden i membranet har nått en topp och har börjat minska är experimentet över.
9. Mätning av transepithelial elektrisk ledning och baslinje Isc (kortslutningsförhållanden)
- Tvätta båda sidor av kammaren genom att suga ringerns lösning och tillsätt 5 ml färsk bubblad Ringers lösning på varje sida.
- Slå på inspelningssystemet. Ställ in räckvidden på 2,5 V (systemet som används här förstärker utgångsspänningen 10x), ställ in markörlägen och ställ in inspelningssystemet för att mäta.
- Vrid Ussings kammarsystem till klämläge och börja mäta; när Isc och ledning har stabiliserats (~ 15-20 min) kan baslinjemätningar erhållas.
- För att säkerställa att vävnaden är livskraftig, tillsätt adenylatcyklasaktivatorn Forskolin (slutlig koncentration 10 μM) på serosalsidan.
- När membranpotentialskillnaden har nått en topp och har börjat minska, görs experimentet.
10. Analysera resultat
- Beräkna transmukosal ledning från spänningsförändringen som svar på strömpulser enligt Ohms lag under öppna kretsar. Bestäm motsvarande kortslutningsström (Isc) från transmukosal spänning och ledning enligt Ohms lag.
- Använd utspädningspotentialen hos NaCl för att beräkna den relativa joniska selektiviteten (PNa/PCl) med Goldman-Hodgkin-Katz ekvation10.
- Uppskatta den absoluta selektiviteten hos den snäva korsningen för varje jon med hjälp av Kimizuka-Koketsu-ekvationen11.
- Beräkna PNa/PCl med hjälp av Goldman-Hodgkin-Katz ekvationen från utspädningspotentialer och bestäm absoluta permeabilities PNa och PCl från Kimizuka-Koketsu-ekvationen enligt Yu et al.10 enligt följande:
var, V: Utspädningspotential (mV). α: Aktivitetsförhållande. NaCl:s beräknade aktivitet i HEPES-bufferten dividerad med NaCl:s beräknade aktivitet i utspädningsbufferten för HEPES (För detta experiment beräknades den som 1,8966). e: Matematisk konstant, 2.71828; GM: Transmukosal ledning (mS/cm2). F: Faraday konstant (96.485.3329 C/mol); R: Gaskonstant (8.314 J/mol K); T: Temperatur (310,15 K)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten som visas i detta dokument är resultat som ingick i större projekt som har slutförts (se ref.4,23,24).
Transepithelial elektrisk ledning av tunntarmen minskar hos Cldn15-/- möss.
Transmukosal konduktivens baslinje (under kortslutningsförhållanden) i mitten av små tarmsegmentet i Cldn15-/- möss var lägre än den som mättes i möss av vild typ (figur 3A; 22,3 mS/cm2 respektive 48,7 mS/cm2 i möss av vildtyp( figur 3A; 22,3 mS/cm2 respektive 48,7 mS/cm2 i möss av typen Cldn15-/- respektive vilda möss). Kortslutningsströmmen (Isc) mättes också hos Cldn15-/- möss (figur 3B). Baslinjen Isc ökades (eftersom Na-beroende glutamin transport är uppreglerad, se referens23) i Cldn15-/- möss jämfört med kontroller (figur 3B; 36,0 μA/cm2 en 26,9 μA/cm2 i Cldn15-/- och vilda möss, respektive).
Utspädningspotentialen minskar hos Cldn15-/- möss
För att bedöma selektiviteten hos den lilla tarmslemhinnan till NaCl hos Cldn15-/- möss mättes utspädningspotentialen med en koncentrationsgradient (60 mmol/L NaCl på slemhinnan och 119 mmol/L NaCl på serosalsidan). Vid luminal NaCl utspädning observerades en positiv potentiell skillnad (9,2 mV) med avseende på serosal sida hos WT-möss (figur 3C). Denna positiva utspädningspotential minskade dock hos Cldn15-/- möss (figur 3C; 0, 8 mV). Den relativa permeabiliteten hos NaCl (PNa/PCl) beräknades enligt ovan och det konstaterades att det minskade hos Cldn15-/- möss, liknande den minskade potentiella skillnaden (figur 3D; 1,1 respektive 3, 5, Cldn15-/- respektive WT- möss). PNa/PCl > 0,7 innebär att Na+ och Cl- sprids via en katjonisk selektiv por (se figur 4 i ref.27). Från dessa data kan man säga att den katjoniska selektiviteten hos den mellersta tunntarmen i Cldn15-/- möss minskar. Detta överensstämmer med konduktivdata (figur 3A), som visar en minskning för Cldn15-/- möss, vilket innebär att de paracellulära vägarna har minskat.
Därefter beräknades de absoluta permeabilitiesna av Na+ (PNa) och Cl- (PCl) . PNa konstaterades vara minskat hos Cldn15-/- möss (figur 3E; 3,28 x 10-4 cm/s respektive 10,92 x 10-4 cm/s, Cldn15-/- respektive WT-möss); PCl verkade dock inte förändras (figur 3F), vilket visar att minskningen av den relativa permeabiliteten beror på en minskning av Na+:s permeabilitet. Detta resultat är vettigt eftersom Cldn15-/- möss har förlorat en Na + por i claudin 15, vilket innebär att de tillgängliga vägarna för Na + har minskat.
Bedömning av livskraft vid tarmpreparat
Slutligen, för att kontrollera livskraften av intestinala beredning, adenylat cyclase aktivator, forskolin, lades till den serosala sidan, som aktiverar CFTR klorid kanal, vilket resulterar i ökningar av kortslutningsström (Isc). Det finns ingen stor skillnad mellan Cldn15-/- och WT-möss (figur 3G; 341,5 μA/cm2 respektive 320,1 μA/cm2, Cldn15-/- respektive WT-möss). Eftersom tarmsegmenten svarade på serosal applicering av forskolin anses membranpreparatet vara livskraftigt.
Figur 1: Ussingskammare inrättad. (A) Ussingskammare består av två halvor och tarmberedningen monteras vertikalt. (B) Närbild av kammarens öppningar (5 mm), som har parafilm stansad med ett 5 mm hål fastsatt. C) Monterad apparat. Calomelelektrod används för potentiella differensmätningar, som är anslutna till kammaren via KCl saltbroar. Ag-AgCl elektrod används för Isc mätning, som passerar över slemhinnan preparatet och är ansluten till kamrarna via NaCl saltbroar. Vattenmanteln cirkulerar kontinuerligt vatten vid 37 °C som drivs av en vattenpump. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: H&E-fläckad representativ bild av en ussingkammare förberedelse från mus kolon. Den första panelen visar en hel tjocklek (ofläckad) förberedelse. Den andra panelen visar en slemhinnan och submukosala beredning (serosa-muskel lager har tagits bort). Den tredje panelen visar en slemhinnans förberedelse. Skalstrecket representerar 100 μm, förstoring 20x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekten av radering av claudin 15 på elektrofysiologiska parametrar. (A) Transmukosal resistans vid cldn15-/- och WT-möss (n = 2 respektive 11). (B) Kortslutningsström vid baslinjen (Isc) hos Cldn15-/- och WT-möss (n = 2 respektive 11). C) Utspädningspotentialen hos NaCl hos Cldn15-/- och WT-möss (n = 2 respektive 4). (D) Den relativa permeabiliteten hos NaCl hos Cldn15-/- och WT-möss (n = 2 respektive 4). De absoluta permeabilitiesna av Na+ (E) och Cl- (F) i Cldn15-/- och WT möss (n = 2 respektive 4). G) Forskolininducerad Isc-ökning för att mäta vävnadens livskraft hos Cldn15-/- och WT-möss (n = 2 respektive 7). Värden representerar medelvärdet ± SEM (i förekommande fall). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta experiment användes Ussing-kammare för att mäta de elektriska parametrarna vid baslinjen och utspädningspotentialen hos NaCl i tunntarmen hos Cldn15-/- och WT-möss. Det är mycket viktigt när man gör Ussing-kammarexperiment för att verifiera att membranberedningen som används i experimenten är livskraftig. Detta görs vanligtvis genom att tillsätta glukos eller adenylatcyklasaktivatorn forskolin och se om det finns en lämplig ökning av Isc (100-300 μA/cm2 hos möss). Ett annat sätt att bedöma om tarmpreparatet var acceptabelt för användning är genom att titta på vävnadens ledningsförmåga. Skadad vävnad kommer ofta att ha högre ledning än normalt (normal ledningsförmåga: ~ 20-60 mS/cm2 i mus), medan vävnad där muskelskiktet inte har tagits bort tillräckligt tenderar att ha en lägre ledning än normalt (figur 2). Det mest kritiska steget i alla Ussing-kammarprotokoll är vävnadsberedningen och att se till att det inte finns några skador på det. Dessutom, med tunntarmen, bör helst membranpreparat monteras i kamrarna inom 10 min från dissekering för att undvika nedbrytning av vävnaden. Efter montering av vävnaden är det inte en bra idé att försöka justera preparatet, eftersom skador kan uppstå. Under experimenten, när du tar bort bufferten från kamrarna eller justerar saltbryggorna eller bubblande trollstavar, undvik att röra tarmberedningen till varje pris. En annan viktig punkt för Ussings kammarexperiment är korrekt uppvärmning av kamrarna och tillräcklig bubblande av buffertlösningarna. Vid användning av Ringer-lösningen är bubblande med 95% O2/5% CO2 mycket viktigt för buffringssystemet. Dessutom kommer bubblande som är för svagt inte att blandas tillräckligt bra och om bubblan är för stark kan membranet och elektriska mätningar påverkas. Om det finns ett hål i tarmpreparatet kommer utspädningspotentialexperiment sannolikt inte att ha en stor membranpotentialskillnad (PD) efter en utspädning. Om PD är liten efter en utspädning kan det bero på ett hål i tarmpreparatet eller det kan indikera att vävnaden inte monterades ordentligt i kammaren.
När du utför ussingkammare experiment, ett antal saker kan gå fel. Oftast utvecklas en bubbla vid spetsen av en saltbro. När detta inträffar, om det är den tunna KCl saltbryggan som påverkas, kommer Isc eller membranet PD sannolikt att bli mycket oberäknelig och förstärkaren kan bli överladdad. I det här fallet stänger du först av klämläget. Nyp försiktigt saltbryggan med tång tills bubblan tas bort med tång. Var mycket försiktig så att du inte rör membranet när du gör detta. Om bubblan utvecklas vid spetsen av den tjockare NaCl-saltbron påverkas konduktivsmätningen. Proceduren för att ta bort bubblan är densamma. Det är mycket viktigt att övervaka registreringen av data för att säkerställa att det inte finns några avvikelser i uppgifterna. Dessutom är det viktigt att inse att parametrarna inte plötsligt kommer att förändras utan stimulans, så om dataregistreringen har plötsliga drastiska förändringar, kontrollera saltbryggorna och elektrodernas anslutningar.
Mätning av barriärfunktionen och jonskultiviteten hos de täta korsningarna är inte möjlig med andra vanliga metoder för att bedöma paracellulär permeabilitet. Ett vanligt protokoll för att uppskatta paracellulär permeabilitet är oral sondmatning av FITC och mätning av plasma FITC vid ett senare tillfälle8. Denna metod mäter den totala permeabiliteten i hela tarmkanalen till FITC. Dessutom transporteras FITC sannolikt via läckagevägarna. Paracellulär transport tros inkludera läckavägen och porvägen28. Läckvägen är en icke-selektiv lågkapacitetsväg för större laddade eller oladdade molekyler att passera genom de snäva korsningarna, medan porvägen är en selektiv, högkapacitetsväg som gör det möjligt för molekyler att passera baserat på deras storlek och laddning28. FITC och andra makromolekylära spårämnen kan bedöma läckvägen, men de avslöjar ingen information om jon- eller laddningss selektiviteten hos en vävnad. Oral sondmatning av FITC eller andra makromolekylära spårämnen ger inte heller information om var i tarmen läckandehet förekommer. Däremot kan metoden som presenteras här användas för att bedöma jonisk selektivitet hos ett visst vävnadssegment, och specifikt kan den uppskatta den relativa permeabiliteten hos specifika joner. Läckan hos en vävnad kan bedömas genom att mäta baslinjens ledningsförmåga, och i läckande vävnader som tunntarmen anses >90% av konduktan bero på bidraget från den paracellulära vägen29. Således ger den transepithelial resistiv mätningen information om mängden paracellulär jonrörelse, men det är inte specifikt och avslöjar inte om en vävnad har katjonisk eller anjonisk selektivitet. För att förstå permselektiviteten hos de täta korsningarna är mätning av utspädningspotential nödvändig. Här användes Cldn15-/- möss, som saknar paracellulära Na+ porbildande claudin 15. Genom att mäta membranpotentialskillnaden som svar på utspädning av NaCl kan jonisk selektivitet samt permeabilities av Na+ och Cl- beräknas. Som förväntat hade Cldn15-/- möss en minskad potentiell skillnad och minskade PNa/PCl (figur 3D) jämfört med WT-möss. Knockout av claudin 15 resulterar i en lägre katjonisk selektivitet (PNa/PCl) och minskad relativ permeabilitet av Na+ (PNa) (figur 3E). Dessutom minskade den elektriska ledningsförmågan vid baslinjen hos Cldn15-/- möss (figur 3A), vilket avslöjar att TJ har blivit tätare och barriärfunktionen har ökat.
Även om utspädningspotential är ett mycket användbart verktyg för att bedöma permselektiviteten hos de snäva korsningarna samt definiera claudinproteinernas roll, har den begränsningar. En stor begränsning av denna teknik är att det är ett genomsnitt av vävnaden. Inom den lilla intestinala epitelen finns det villi och krypter, och parametrarna som mäts med Ussing-kamrar bedömer inte bidraget från villi och krypta epitel separat. Detta kan vara en faktor vid bedömning av rollen av vissa selektivt uttryckta claudins, till exempel, claudin 2 anses också vara en katjonpor, men det uttrycks bara i krypterna24. En annan begränsning är att på grund av närvaron av flera olika claudinproteiner i de snäva korsningarna kan mätningarna inte specifikt hänföras till ett visst protein. Även om utspädningspotentialer har varit mycket användbara för att utforska rollerna för claudin familjeproteiner i exogena claudin uttrycker cellmodeller10,30. Slutligen använder Ussing-kammartekniker ex-vivo-vävnad, och detta protokoll använder tarmpreparat utan muskelskiktet, vilket innebär att villkoren inte är desamma som in vivo-förhållanden. Att förbereda tarmarna för Ussing-kammare kräver skicklighet och tid, så experiment i inhemsk vävnad är ofta svåra att slutföra framgångsrikt, är låga genomströmning och tar mycket tid.
Ussingkammaren är ett mycket viktigt verktyg som kan appliceras på många olika epitel- och endotelvävnader. En stor fördel är att den använder inhemsk vävnad, vilket är mycket mer tillförlitligt än cellinjemodeller, även om cellmonolayers och organoida monoskikt också kan bedömas i Ussing-kammare. Ussing kammare har bidragit till många stora fynd inom membranfysiologi, och de kommer att fortsätta att vara ett viktigt verktyg i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga potentiella intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av 17K00860 (till HH) och 19K20152 (till NI). WH vill uppmärksamma Otsuka Toshimi Scholarship Foundation för deras ekonomiska stöd från 2018-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3', 5'-AMP. American Journal of Physiology - Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology - Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, John Wiley & Sons, Inc. 1-19 (2017).
- Östh, K. The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery - Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , Uppsala University. Dissertation thesis (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al.
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
