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Immunology and Infection

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाना छद्म वायरस संक्रमण के उच्च थ्रूपुट फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करके एंटीबॉडी को बेअसर करना

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में स्पाइक ग्लाइकोप्रोटीन के साथ एक उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल वेसिकुलर स्टोमाइटिस वायरस छद्म द्वारा संक्रमण को बाधित करने के लिए convalescent सीरम नमूनों की क्षमता का मूल्यांकन करके सार्स-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी को मापने के लिए एक तेज और प्रभावी विधि की रूपरेखा तैयार की गई है ।

Abstract

चूंकि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) के कारण होने वाली COVID-19 महामारी विकसित होती जा रही है, इसलिए यह स्पष्ट हो गया है कि वायरस के खिलाफ एंटीबॉडी को बेअसर करने की उपस्थिति भविष्य के संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा प्रदान कर सकती है। इस प्रकार, प्रभावी COVID-19 टीकों के निर्माण और अनुवाद के रूप में एक अभूतपूर्व गति से जारी है, तेजी से और प्रभावी तरीकों के विकास के लिए सार्स-CoV-2 के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी को मापने के लिए तेजी से दोनों पहले संक्रमित और प्रतिरक्षित व्यक्तियों के लिए संक्रमण के खिलाफ दीर्घकालिक सुरक्षा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा । यह पत्र उन रोगियों से convalescent सीरम में एंटीबॉडी को बेअसर करने की उपस्थिति को मापने के लिए सार्स-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन के साथ वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस (वीएसवी) छद्मता का उपयोग करके एक उच्च थ्रूपुट प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो हाल ही में COVID-19 से बरामद हुए हैं । एक प्रतिकृति छद्मटाइप वायरस का उपयोग सार्स-सीओवी-2 हैंडलिंग के लिए आवश्यक रोकथाम स्तर 3 सुविधा की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिससे यह प्रोटोकॉल लगभग किसी भी रोकथाम स्तर 2 प्रयोगशाला के लिए सुलभ हो जाता है। एक 96-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग कई नमूनों के लिए 24 घंटे के एक छोटे बदलाव के समय के साथ एक ही समय में चलाने के लिए अनुमति देता है।

Introduction

दिसंबर 2019 में, एक नॉवल कोरोनावायरस की पहचान की गई थी, जिसे अब हम सार्स-सीओवी-2 के रूप में जानते हैं, जो कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19)1के कारक एजेंट हैं। सार्स-सीओवी-2 कोरोनाविराइडी परिवार से संबंधित एक बीटाकोरोनावायरस है। इन छा वायरस एक बड़े सकारात्मक भावना आरएनए जीनोम शामिल है और दोनों मनुष्यों और जानवरों में श्वसन और आंतों के संक्रमण के लिए जिंमेदार है2। मई 2021 तक विश्व स्तर पर COVID-19 के 157 मिलियन से अधिक मामले सामने आए हैं और 3.2 मिलियन से अधिक मौतेंहुई हैं। एक प्रभावी टीके का विकास दुनिया भर के शोधकर्ताओं का प्राथमिक लक्ष्य बन गया है जिसमें जांच के तहत कम से कम 77 प्रीक्लीनिकल टीके और वर्तमान में नैदानिक परीक्षण 4 से गुजर रहेहैं।

कोरोनावायरस स्पाइक प्रोटीन (एस), न्यूक्लियोकैप्सिड (एन), लिफाफा प्रोटीन (ई), और झिल्ली प्रोटीन (एम) सहित चार संरचनात्मक प्रोटीन को एन्कोड करता है। सार्स-सीओवी-2 के प्रवेश के लिए मेजबान रिसेप्टर, मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एचएसी2) के साथ एस के रिसेप्टर-बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी) की बातचीत की आवश्यकता होती है, और बाद में झिल्ली संलयन मेजबान सेलुलर सेरीन प्रोटीज, ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीज सेरीन 2(TMPRSS2)5,6,7,8,9, 10,10 द्वारा प्रोटियोलिटिक क्लीमेंट के बाद . सार्स-सीओवी के एस प्रोटीन के विनोदी इम्यूनोडोमिनेंस की पहले रिपोर्ट की गई है और अब सार्स-सीओवी-211, 12,13के लिए भी दिखाया गया है । दरअसल, एस के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को बेअसर सार्स-CoV रोगियों से convalescent सीरम में 24 महीने संक्रमण के बाद14का पता चला है, दीर्घकालिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला । एस प्रोटीन की पहचान एक आशाजनक टीके लक्ष्य के रूप में की गई है और इस प्रकार यह विकास15,16के तहत अधिकांश टीकों का एक प्रमुख घटक बन गया है ।

जबकि एंटीबॉडी को बेअसर करने का तेजी से पता लगाना वैक्सीन विकास का एक महत्वपूर्ण पहलू है, यह प्रभावित क्षेत्रों में संक्रमण और सेरो-महामारी विज्ञान निगरानी की दर पर प्रकाश भी डाल सकता है17। सरस-सीओवी-2 एस ग्लाइकोप्रोटीन के साथ एक प्रतिकृति-सक्षम वीएसवी छद्म रूप, जंगली प्रकार के वीएसवी ग्लाइकोप्रोटीन के स्थान पर, जैवसेफ्टी स्तर 2 सेटिंग्स में सार्स-सीओवी-2 संक्रमण का अध्ययन करने के लिए कृपया व्हेलन और सह-कार्यकर्ताओं द्वारा दान किया गया था18। वीएसवी एक्सप्रेसिंग स्पाइक (वीएसवी-एस) का उपयोग सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। जैसा कि वीएसवी-एस ने यहां उपयोग किया जाता है, संक्रमण की मात्रा निर्धारित करने के लिए 24 घंटे के भीतर ईजीएफपी फोसी का पता लगाया जा सकता है, जबकि पट्टिका गठन में 48 से 72 घंटे लग सकते हैं। संक्षेप यहां वीएसवी-एस-ईजीएफपी संक्रमण को बेअसर करने के लिए convalescent रोगी सीरम की क्षमता निर्धारित करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल है। इस विधि को अन्य संभावित चिकित्सीय से पूछताछ करने के लिए भी आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है जिसका उद्देश्य सार्स-सीओवी-2 एस प्रोटीन की मेजबानी-वायरल बातचीत को बाधित करना है।

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Protocol

1. सार्स-सीओवी-2 छद्म वायरस के उत्पादन और मात्राकरण के लिए चढ़ाना कोशिकाएं (दिन 1)

  1. ऊतक संस्कृति के लिए तैयारी
    1. वार्म 1x डल्बेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस); Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (वैकल्पिक); और लगभग 15 मिनट के लिए पानी के स्नान में 0.25% ट्राइप्सिन-एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) से 37 डिग्री सेल्सियस तक।
    2. 70% इथेनॉल के साथ एक ऊतक संस्कृति हुड को कीटाणुरहित करें, और आवश्यकतानुसार ऊतक संस्कृति हुड में ऊतक संस्कृति व्यंजन, पाश्चर पिपेट और सीरोलॉजिकल पिपेट रखें। पीबीएस, डीएमईएम, और पानी के स्नान से ट्रिपसिन निकालें, और ऊतक संस्कृति हुड में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें।
  2. चढ़ाना और कोशिकाओं को बनाए रखने
    1. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क या 15 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन में डीएमईएम (10% एफबीएस युक्त) में वेरो ई 6 कोशिकाएं उगाएं। जब कोशिकाएं 80-90% ढुलमुल होती हैं तो आवश्यकतानुसार कोशिकाओं को मार्ग करें।
    2. प्रत्येक डिश में 1x पीबीएस के 10 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और धीरे-धीरे 4-5 बार कमाल करें; पीबीएस को आकांक्षी करें। प्रत्येक डिश में ट्रिपसिन-ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें, यह सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को रॉक करें कि पूरी सतह कवर हो। कोशिकाओं को लगभग 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, या जब तक कोशिकाओं को अलग नहीं किया जाता है।
    3. ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए डीएमईएम (10% एफबीएस युक्त) के 7 एमएल जोड़ें, और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर बेंचटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करके ट्राइप्सिन को हटाने के लिए कोशिकाओं को स्पिन करें, सेल पेलेट को परेशान किए बिना मीडिया को एस्पिरेट करें, और डीएमईएम (जिसमें 10% एफबीएस युक्त) के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। यदि भविष्य के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, तो 1 मिलीएल को एक नए पकवान में रखें जिसमें 15 एमएल ताजा डीएमईएम (जिसमें 10% एफबीएस होते हैं)।
    4. एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और प्रत्येक 15 सेमी प्लेट में लगभग 1 ×10 7 कोशिकाओं को जोड़ें, और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि वे 100% कॉन्फ्लोटेंट (1-2 दिन) न हों।

2. वीएसवी-एस-ईजीएफपी छद्म वायरस तैयारी

  1. इंफ़ेक्शन
    1. संक्रमण की बहुलता पर कोशिकाओं को संक्रमित (एमओआई) 0.01 वीएसवी-एस-ईजीएफपी स्टॉक वायरस के साथ सीरम-मुक्त डीएमईएम के 12 एमएल में 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे केलिए, कभी-कभी प्लेटों को कमाल करते हैं। इनोकुलम को ताजा डीएमईएम (जिसमें 2% एफबीएस और 20 एमएम एचईपीई, पीएच 7.7) शामिल हैं, और 5% सीओ2के साथ 34 डिग्री सेल्सियस तक सेट एक इनक्यूबेटर में जाएं।
      नोट: सेल कल्चर में वीएसवी-एस-ईजीएफपी के प्रचार-प्रसार के लिए 34 डिग्री सेल्सियस का तापमान जरूरी है।
    2. व्यापक साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) और सेल टुकड़ी, लगभग 48 घंटे के बाद संक्रमण के अवलोकन पर सेल सुपरनेटेंट ले लीजिए। संक्रमण के बाद 24 घंटे से शुरू होने वाली संक्रमित कोशिकाओं द्वारा ईजीएफपी की व्यापक अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. संग्रह
    1. सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 × जी पर 5 मिनट के लिए बेंचटॉप सेंट्रलाइज का उपयोग करने वाले सुपरनेटेंट को अपकैंट्स। कई फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए सुपरनेट को अलीकोट करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. वीएसवी-एस-ईजीएफपी छद्म वायरस को टाइटरिंग करना

  1. वायरल टाइटर का निर्धारण करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने
    1. डीएमईएम (10% एफबीएस के साथ) में 6 × 105 कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व पर 6-अच्छी प्लेटों पर प्लेट वेरो ई 6 कोशिकाएं, और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: वेरो कोशिकाओं है कि TMPRSS2 और hACE2 ओवरएक्सप्रेस भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. सात माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में मीडिया के 900 माइक्रोन रखकर कोल्ड सीरम-फ्री डीएमईएम में वीएसवी-एस-ईजीएफपी वायरस की 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने की श्रृंखला स्थापित करें। 1 से 7 तक लेबल ट्यूब। पहले ट्यूब और भंवर संक्षेप में वायरल स्टॉक के 100 μL जोड़ें। ट्यूब 1 से ट्यूब 2 और भंवर के लिए पतला वायरस के 100 μL संक्षेप में स्थानांतरित; ट्यूब 7 तक जारी रखें।
    3. वेरो ई 6 कोशिकाओं वाले 6-अच्छी प्लेट के सभी कुओं से माध्यम को एस्पिरेट करें, और10-2 से 10-7तक 500 माइक्रोन के साथ बदलें। 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें, हर 15 मिनट में धीरे-धीरे कमाल करें।
    4. इनोकुलम को एस्पिरेट करें और ओवरले के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें 2x डीएमईएम और 6% कार्बोक्सीमिथाइल सेल्यूलोज (सीएमसी) का 1:1 मिश्रण होता है, 3% सीएमसी की अंतिम एकाग्रता, 10% एफबीएस के साथ पूरक; 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 34 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: संक्रमण चरण के दौरान 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ओवरले मिश्रण को प्री-गर्म करें। सीएमसी के स्थान पर 10% एफबीएस के साथ पूरक 2x डीएमईएम के साथ 1% का 1:1 मिश्रण का उपयोग किया जा सकता है। एगर उठे के साथ ओवरले करने के लिए, 1% एग्राज (डीएच2ओ में) उबालें और ठंडे 2x डीएमईएम के साथ मिलाएं। सुनिश्चित करें कि मिश्रण सेल मोनोलेयर (लगभग 37-40 डिग्री सेल्सियस) में जोड़ने से पहले एक उपयुक्त तापमान है। यदि एगर उठे का उपयोग ओवरले के लिए किया जाता है, तो कोशिकाओं को 3:1 मेथनॉल के 2 एमएल में इनक्यूबेटिंग करके तय किया जाना चाहिए: स्टेनिंग से कम से कम एक घंटे पहले एसिटिक एसिड।
  2. धुंधला और वायरल टाइटर की गणना
    1. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत क्रिस्टल वायलेट या ईजीएफपी के प्रत्यक्ष दृश्य के साथ धुंधला करके सजीले टुकड़े की कल्पना करें।
    2. प्लेटों को दागने के लिए, ओवरले को एस्पिरेट करें, पीबीएस के साथ एक बार धोएं, फिर प्रत्येक अच्छी तरह से 0.1% क्रिस्टल वायलेट (80% मेथनॉल और डीएच 2 ओ में) के2एमएल जोड़ें। डी-धुंधला करने से पहले कमरे के तापमान पर लगभग 20 मिनट के लिए एक प्लेट रॉकर पर रखें। क्रिस्टल वायलेट निकालें, और डीएच2ओ या पीबीएस का उपयोग करके प्रत्येक को दो बार धीरे-धीरे धोएं।
      नोट: धोने और धुंधला कदम धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से पक्ष की ओर धीरे से पाइपिंग द्वारा किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए सेल मोनोलेयर प्रक्रिया भर में बरकरार रहता है ।
    3. प्लेटों को सजीले टुकड़े गिनने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए सूखने दें। सुनिश्चित करें कि पट्टिका गिनती 20 से 200 सजीले टुकड़े युक्त कुओं से प्राप्त कर रहे हैं। प्रति एमएल पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) में वायरस के टिटर की गणना करने के लिए, संक्रमण की मात्रा के साथ अच्छी तरह से गिना जाने वाले कमजोर पड़ने वाले कारक को गुणा करें, और इस संख्या को संबंधित कुएं में मौजूद सजीले टुकड़े से विभाजित करें।
      Equation 1

4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी और convalescent रोगी सीरम द्वारा सार्स-CoV-2 छद्मवायरस के बेअसर की माप के लिए चढ़ाना कोशिकाओं (दिन 1)

  1. ऊतक संस्कृति के लिए तैयारी
    1. सेक्शन 1 में वर्णित मध्यम और ऊतक संस्कृति हुड तैयार करें। इसके अलावा, प्रति नमूना न्यूनतम 2 प्रतिकृति (यानी, प्रति 6 नमूनों में 1 प्लेट) को समायोजित करने के लिए 96 अच्छी प्लेटों की आवश्यक संख्या तैयार करें; यदि नमूना वॉल्यूम परमिट देता है तो अतिरिक्त प्रतिकृति जोड़ें।
  2. चढ़ाना और कोशिकाओं को बनाए रखने
    1. धारा 1 में वर्णित वेरो ई 6 कोशिकाओं को बढ़ाएं और बनाए रखें। 48 एच के बाद किए गए परख के लिए प्रति एमएल 105 कोशिकाओं के 2 × 10 5 कोशिकाओं (प्लेट 1.5 × 105 कोशिकाओं की एकाग्रता पर प्रति 96-अच्छी प्लेट प्रति सेल निलंबन के कम से कम 10 एमएल तैयार करें) यदि आवश्यक हो। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन का 100 माइक्रोल जोड़ें, और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर24घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: कोशिका निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं, और कोशिकाओं के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्लेट को धीरे-धीरे सभी दिशाओं में रॉक करें।

5. एंटीबॉडी या सीरम कमजोर पड़ने और संक्रमण (दिन 2)

नोट: इस प्रोटोकॉल को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी और रोगी सीरम दोनों द्वारा वीएसवी-एस-ईजीएफपी के बेअसर को मापने के साथ-साथ पूर्व-नैदानिक वैक्सीन विकास अध्ययनों के लिए जानवरों से एकत्र सीरम को मापने के लिए लागू किया जा सकता है। * रोगी/पशु सीरम नमूनों को संभालते समय सूचीबद्ध अतिरिक्त कदमों पर ध्यान दें ।

  1. धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला
    1. सीरम के नमूनों को पतला करने से पहले, गर्मी-पूरक को निष्क्रिय करने के लिए 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में प्रत्येक नमूने को निष्क्रिय करें। सुनिश्चित करें कि रोगी के नमूनों को संभालते समय आवश्यक सुरक्षा सावधानियां बरती जाएं; ऊतक संस्कृति हुड में केवल नमूना कंटेनर खोलें, और उचित रोकथाम स्तर सुनिश्चित करें 2 व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने जाते हैं।
    2. एक खाली ९६-अच्छी तरह से थाली (प्लेट 1) में कमजोर पड़ने श्रृंखला की स्थापना की ।
    3. 80 माइक्रोन में 96-वेल प्लेट की पंक्ति ए में सभी कमजोर पड़ने शुरू करें। * रोगी के नमूनों के लिए, सीरम-मुक्त डीएमईएम (1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ) के 72 माइक्रोन में सीरम के 8 माइक्रोन रखकर 10 में 1 पर कमजोर पड़ने की श्रृंखला शुरू करें।
      नोट: इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी को बेअसर करने की एकाग्रता निर्माता द्वारा भविष्यवाणी की गई गतिविधि पर निर्भर करेगी। सार्स-CoV-2 स्पाइक बेअसर एंटीबॉडी के लिए यहां इस्तेमाल किया (सामग्री की मेजदेखें), 5 μg/mL के साथ शुरू करने के लिए कम से ५०% बेअसर निरीक्षण ।
    4. सीरम मुक्त DMEM के ४० μL जोड़ें (1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ) पंक्तियों बी से जी के लिए, और ८० μL पंक्ति एच के लिए । पंक्ति एच में वायरस न जोड़ें, क्योंकि यह सेल-केवल नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
    5. 12-अच्छी तरह से मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, पंक्ति ए से पंक्ति बी मिक्स तक पतला सीरम या एंटीबॉडी के 40 माइक्रोन को मिलाएं और स्थानांतरित करें और पंक्ति एफ तक दोहराएं, पंक्ति एफ से 40 माइक्रोन को त्यागें। पंक्ति जी में सीरम न जोड़ें क्योंकि यह वायरस-केवल नियंत्रण पंक्ति का प्रतिनिधित्व करता है।
  2. संक्रमण और ओवरले
    1. एमओआई 0.05 (या 2000 फूएफयू) में प्रत्येक अच्छी तरह से इलाज करने के लिए पतला वीएसवी-एस-ईजीएफपी की उचित मात्रा तैयार करें। (इस गणना को पूरा करते समय, ध्यान रखें कि कुल 80 माइक्रोन मात्रा का केवल 60 माइक्रोन कोशिकाओं पर ले जाया जाएगा; इसलिए, 2000 फूएफयू को बनाए रखने के लिए वायरस की मात्रा को 1.33 तक गुणा करना सुनिश्चित करें)।
      नोट: के रूप में VSV-S-eGFP तापमान के प्रति संवेदनशील है, सुनिश्चित करें कि वायरल स्टॉक बर्फ पर रहते है जब भी उपयोग में नहीं है, और कई फ्रीज गल चक्र से बचने के रूप में titers दोहराया ठंड के बाद अलग होगा ।
    2. प्लेट 1 की पंक्तियों ए से जी में प्रत्येक अच्छी तरह से पतला वायरस के 40 माइक्रोन जोड़ें और 4-5 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेटर (प्लेट 2) से कोशिकाओं युक्त प्लेट को हटा दें, और ध्यान से सभी कुओं से मीडिया को आकांक्षी । प्लेट 1 से प्लेट 2 तक एंटीबॉडी/वायरस मिश्रण के 60 माइक्रोन को स्थानांतरित करें, और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, हर 20 मिनट में प्लेट को रॉक करतेहैं।
    4. 3% सीएमसी (10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ) की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएमईएम में सीएमसी युक्त ओवरले के 140 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर करें। इमेजिंग से पहले लगभग 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 34 डिग्री सेल्सियस के लिए एक इनक्यूबेटर सेट में प्लेट 2 रखें।
      नोट: संक्रमण चरण के दौरान 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ओवरले मिश्रण को प्री-गर्म करें।

6. इमेजिंग और मात्राकरण (दिन 3)

  1. एक स्वचालित फ्लोरोसेंट इमेजर का उपयोग करके इमेज प्लेटें (फ्लोरोसेइन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) फिल्टर या 488 एनएम की एक्सट्रेशन वेवलेंग के साथ एक वैकल्पिक फ़िल्टर का उपयोग करके)। एक प्रोटोकॉल बनाकर वायरल संक्रमण की मात्रा निर्धारित करें जो स्वचालित रूप से पहचानता है और व्यक्तिगत eGFP foci गिना जाता है। यदि कोई स्वचालित गणना सुविधा उपलब्ध नहीं है, तो EGFP foci की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल वीएसवी-एस-ईजीएफपी छद्म वायरस संक्रमण (eGFP फोसी के नुकसान से मात्रात्मक) के अवरोध के माध्यम से सार्स-सीओवी-2 एस प्रोटीन के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक तेजी से और प्रभावी विधि को रेखांकित करता है। चित्र 1में प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है । यह सिफारिश की जाती है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग हर बार परख की निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाए। यहां, हम आईजीजी नियंत्रण की तुलना में सार्स-सीओवी-2 स्पाइक आरबीडी के खिलाफ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बेअसर आईजीजी एंटीबॉडी का उपयोग करके एक कमजोर पड़ने की वक्रता प्रदर्शित करते हैं (दोनों एंटीबॉडी के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें; चित्रा 2)।

CONvalescent रोगी नमूनों लगभग तीन महीने के बाद सार्स-CoV-2 संक्रमण एकत्र किए गए थे, और छद्मवायरस बेअसर ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर निर्धारित किया गया था(चित्रा 3)। महत्वपूर्ण बात, स्वस्थ दाता सीरम का उपयोग करके न्यूनतम पृष्ठभूमि अवरोध देखा गया था। इसके अलावा, ध्यान दें, यह परख अस्पताल में भर्ती होने की आवश्यकता के आधार पर मामूली रोग के साथ उन बनाम उच्च लक्षण गंभीरता वाले रोगियों के बीच अलग करती है। अन्य रिपोर्टों के अनुरूप, हमने अपनी छोटी पलटन के भीतर देखा है कि अस्पताल में भर्ती रोगी उन लोगों की तुलना में बढ़ी हुई तटस्थ क्षमता प्रदर्शित करते हैं जिन्हें अस्पताल में भर्ती19,20की आवश्यकता नहीं थी । हालांकि यह हमेशा अस्पताल में भर्ती बनाम गैर अस्पताल में भर्ती रोगी नमूनों के लिए मामला नहीं हो सकता है, परख की क्षमता बेअसर की डिग्री अलग अंतर करने के लिए एक परिसंपत्ति है । ऐसे मामले भी हो सकते हैं जिनमें रोगी सीरम की बेअसर क्षमता यहां प्रदर्शित लोगों की तुलना में बहुत अधिक है। यदि आवश्यक हो, तो रोगी सीरम के शुरुआती कमजोर पड़ने को समायोजित किया जा सकता है, या अतिरिक्त कमजोर पड़ने के कदम एक अतिरिक्त प्लेट पर किए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:प्रोटोकॉल की रूपरेखा वीएसवी-एस-ईजीएफपी को संवेलसेंट सीरम द्वारा बेअसर करने का प्रदर्शन करती है। संक्षिप्त: वीएसवी = वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस; eGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; COVID-19 = कोरोनावायरस रोग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:सार्स-सीओवी-2 के खिलाफ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बेअसर एंटीबॉडी का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में आईजीजी के साथ सकारात्मक नियंत्रण के उदाहरण के रूप में किया गया है। वायरल संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबॉडी को बेअसर करने की क्षमता अलग-अलग होगी; यह निर्धारित करने के लिए खरीदे गए विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए उपलब्ध जानकारी को देखें कि कमजोर पड़ने की वक्र शुरू करने के लिए कौन सी एकाग्रता (नमूने ट्रिपलीकेट में चलाए गए थे, त्रुटि सलाखों ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं)। (A)प्रतिशत अवरोध की गणना(बी)फ्लोरोसेंट इमेजिंग के माध्यम से पाए गए ईजीएफपी फोसी की संख्या के आधार पर की गई है । संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; आईजीजी = इम्यूनोग्लोबुलिन; एसडी = मानक विचलन; eGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरबीडी = रिसेप्टर-बाध्यकारी डोमेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:वीएसवी-एस-ईजीएफपी को बेअसर करने के लिए रोगियों से convalescent सीरम की क्षमता लक्षणों की गंभीरता के आधार पर भिन्न होती है। रोगी सीरम नमूनों लगभग 3 महीने के बाद सार्स-CoV-2 संक्रमण एकत्र किए गए थे, और नियंत्रण नमूने असंक्रमित रोगियों से एकत्र किए गए थे (नमूने ट्रिपलीकेट में चलाए गए थे, त्रुटि सलाखों ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं) । (A)प्रतिशत अवरोध की गणना(बी)फ्लोरोसेंट इमेजिंग के माध्यम से पाए गए ईजीएफपी फोसी की संख्या के आधार पर की गई है । संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; एसडी = मानक विचलन; eGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित विधि को आवश्यकतानुसार अलग-अलग प्रयोगशाला वातावरण और संसाधनों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा एक रोकथाम स्तर 2 अंतरिक्ष और ऊतक संस्कृति हुड के लिए आवश्यकता है। सार्स-सीओवी-2 स्पाइक के साथ एक प्रतिकृति आरएनए वायरस का अनुप्रयोग, जैसे वीएसवी-एस-ईजीएफपी, सार्स-सीओवी-2 वायरस का एक विकट विकल्प है, जिसके लिए रोकथाम स्तर 3 कार्य क्षेत्र की आवश्यकता होती है, लेकिन कुछ समूहों के लिए एक सीमा रह सकती है। यहां वर्णित अन्य सभी कदम काफी लचीले हैं और लगभग किसी भी रोकथाम स्तर 2 प्रयोगशाला में किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, स्वचालित गणना सुविधा के साथ फ्लोरोसेंट इमेजर का उपयोग आवश्यक नहीं है। यहां उपयोग किए जाने वाले 96-अच्छी प्रारूप का मतलब है कि सबसे कम उद्देश्य (2x) का उपयोग करके लगभग पूरी अच्छी तरह से छवि बनाने के लिए केवल लगभग 4 क्षेत्रों को देखने की आवश्यकता है।

प्रत्येक कुएं के कई क्षेत्रों को छवि देने के लिए एक मैनुअल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है, और इमेजजे (मुफ्त सॉफ्टवेयर) का उपयोग ईजीएफपी फोसी को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हमने सीरम की सबसे कम मात्रा का उपयोग करने के साथ-साथ उपभोग्य उपयोग को न्यूनतम रखने के लिए 96-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करने के लिए चुना है। यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप अनुपलब्ध है, तो क्रिस्टल वायलेट निर्धारण और धुंधला (ऊपर वर्णित वायरल टाइटर प्रोटोकॉल के समान) के बाद पट्टिका गठन का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल को 6 या 12-अच्छी तरह से प्रारूप तक बढ़ाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करते समय ध्यान में रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार वीएसवी-एस-ईजीएफपी की तापमान संवेदनशीलता है। वीएसवी-एस-ईजीएफपी के साथ काम करते समय, वायरस को कई फ्रीज-गल चक्रों से बचने के लिए हमेशा छोटी मात्रा में अलीकोट करें, और जब भी संभव हो वायरस को बर्फ पर रखें। इसके अतिरिक्त, 24 घंटे के बाद मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता लगाया जा सकता है; हालांकि, हमने 20 से 28 घंटे पोस्ट संक्रमण पर इमेजिंग के बाद इसी तरह के परिणाम हासिल किए हैं।

सार्स-सीओवी-2 के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, जिनमें गोल्ड-स्टैंडर्ड एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) परख शामिल हैं, जो एस21,22के खिलाफ एंटीबॉडी की कुल मात्रा को मात्रा देता है। यहां, हमने रोगियों से convalescent सीरम में इम्यूनोडोमिनेंट सार्स-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन के खिलाफ विशेष रूप से बेअसर एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि रेखांकित की है । हमने 96-वेल प्रारूप के लिए सफलतापूर्वक अनुकूल होकर शास्त्रीय पट्टिका-कटौती बेअसर परीक्षण (पीआरएनटी) में सुधार किया है, जो छद्म वायरस संक्रमण के स्वचालित मात्राकरण द्वारा 24 घंटे के भीतर बड़ी संख्या में नमूनों में एंटीबॉडी को बेअसर करने का पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे अंतिम डेटा रिपोर्टों के त्वरित बदलाव की अनुमति मिलती है। सीरम के भीतर बेअसर एंटीबॉडी का पता लगाने के अलावा, इस विधि को अन्य चिकित्सीय रणनीतियों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसका उद्देश्य एचएईसी2 के साथ सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन इंटरैक्शन को सीधे रोकना है, जैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, रीकॉम्बिनेंटल घुलनशील एचएई 2, या प्रोटीज अवरोधक, वायरल प्रविष्टि23 को बाधित करने के लिए . कई सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन वेरिएंट के उद्भव के साथ, यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस विधि को यह निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है कि वायरस24के विभिन्न प्रकारों के साथ संक्रमण के बाद इसी तरह का बेअसर स्तर होता है या नहीं।

सार्स-सीओवी-2 के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उपलब्ध तरीकों के अन्य उदाहरणों में सीरम नमूनों की बेअसर क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए ELISAs, लेंटीवायरस-आधारित परख, और वाणिज्यिक किट शामिल हैं। जबकि आमतौर पर इस्तेमाल किया IgM-या IgG-बाध्यकारी ELISAs पिछले संक्रमण या प्रतिरक्षण को ट्रैक करने के लिए एंटीबॉडी एकाग्रता की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है, वे बाध्यकारी एंटीबॉडी ' बेअसर क्षमता25भेद करने में असमर्थ हैं । वीएसवी-एस-ईजीएफपी को दोहराने के विपरीत गैर-प्रतिकृति वायरल कणों का उपयोग करके, छद्म प्रकार के लेंटीवायरस-आधारित बेअसर परख में एक बेहतर सुरक्षा प्रोफ़ाइल होती है; हालांकि, यह टेस्टिंग क्षमता के मामले में एक बाधा बनाता है क्योंकि लेंटीवायरल टाइटर्स बहुत कम26,27हो जाते हैं । कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट हैं जो सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन (आरबीडी विशेष रूप से) के प्रतिस्पर्धी अवरोध के माध्यम से संक्रमण को अवरुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी की क्षमता को मापते हैं, जो convalescent सीरम (जैसे, CUSABIO, जेनस्क्रिप्ट, अबनोवा) के साथ इनक्यूबेशन के बाद hACE2 रिसेप्टर के साथ बाध्यकारी है। जबकि इन किटों में से कई में सम्मानित संवेदनशीलता और विशिष्टता है, वे अपेक्षाकृत महंगे भी होते हैं और इसलिए नमूनों की एक बड़ी मात्रा के लिए आदर्श नहीं होते हैं। यहां प्रदान किया गया प्रोटोकॉल तेज, विश्वसनीय और सस्ता है। इस उच्च थ्रूपुट विधि का उपयोग कई नमूनों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, 24 घंटे के भीतर एक मजबूत रीडआउट प्राप्त कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों को इस प्रकाशन से संबंधित कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है ।

Acknowledgments

हम उदारता से इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल VSV-S-eGFP वायरस प्रदान करने के लिए Whelan प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहते है (मामले एट अल २०२० में वर्णित) । हम रोगी रक्त नमूनों (आरईबी प्रोटोकॉल आईडी 20200371-01H) को इकट्ठा करने के लिए डीआरएस बिल कैमरन और जुथापोर्न काउअन (और टीम) को भी धन्यवाद देते हैं। लेखकों अनुसंधान, लेखकत्व के लिए निम्नलिखित वित्तीय सहायता की प्राप्ति 448323 का खुलासा, और/ जेपी एक क्लस्टर Mitacs फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है। टीएचए को सीआईएआर बैंटिंग फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम उन सभी व्यक्तियों को भी धन्यवाद देना चाहेंगे जिन्होंने इस अध्ययन के लिए भाग लिया और अपने रक्त नमूने दान किए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

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References

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