JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

Published: June 05, 2021
doi:
10.3791/62486
, , , , , ,
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology,University of Ottawa

Summary

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Abstract

Şiddetli akut solunum yolu sendromu Coronavirus 2’nin (SARS-CoV-2) neden olduğu COVID-19 pandemisi gelişmeye devam ederken, virüse karşı nötralize edici antikorların varlığının gelecekteki enfeksiyona karşı koruma sağlayabileceği ortaya çıktı. Bu nedenle, etkili COVID-19 aşılarının oluşturulması ve çevirisi benzeri görülmemiş bir hızda devam ettikçe, SARS-CoV-2’ye karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili yöntemlerin geliştirilmesi, hem daha önce enfekte olmuş hem de aşılanmış bireyler için enfeksiyona karşı uzun vadeli korumayı belirlemek için giderek daha önemli hale gelecektir. Bu makalede, COVID-19’dan yeni kurtulan hastalardan iyileşen serumda nötralize edici antikorların varlığını ölçmek için SARS-CoV-2 spike proteini ile sözde olarak yazılmış veziküler stomatit virüsü (VSV) kullanan yüksek verimli bir protokol açıklanmaktadır. Çoğaltıcı bir sözde virüs kullanımı, SARS-CoV-2 kullanımı için gerekli olan bir muhafaza seviyesi 3 tesisi için gerekliliği ortadan kaldırır ve bu protokolü hemen hemen her kapsama seviyesi 2 laboratuvarı için erişilebilir hale getirir. 96 kuyulu bir formatın kullanılması, birçok örneğin aynı anda 24 saat kısa bir geri dönüş süresiyle çalıştırılmasını sağlar.

Introduction

Aralık 2019’da, şimdi sars-CoV-2 olarak bildiğimiz, koronavirüs hastalığının etken maddesi 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2, Coronaviridae ailesine ait bir betakoronavirüstür. Bu zarflı virüsler büyük bir pozitif duyu RNA genomunu içerir ve hem insanlarda hem de hayvanlarda solunum ve bağırsak enfeksiyonlarından sorumludur2. Mayıs 2021 itibarıyla küresel olarak bildirilen 157 milyondan fazla COVID-19 vakası ve 3,2 milyondan fazla ölüm3. Etkili bir aşının geliştirilmesi, incelenmekte olan en az 77 klinik öncesi aşı ve şu anda klinik deneylerden geçen 90 ile dünya çapında araştırmacıların birincil hedefi haline gelmiştir4.

Koronavirüsler spike proteini (S), nükleocapsid (N), zarf proteini (E) ve membran proteini (M) dahil olmak üzere dört yapısal proteini kodlar. SARS-CoV-2’nin girişi, S’nin reseptör bağlayıcı etki alanının (RBD) konak reseptör ile etkileşimini gerektirir, insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (hACE2) ve konak hücresel serine proteaz, transmembran proteaz serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 tarafından proteolitik bölünmeyi takiben sonraki membran füzyonu . SARS-CoV’un S proteininin humoral immün hakimiyeti daha önce bildirilmiştir ve şimdi SARS-CoV-211 , 12,13için de gösterilmiştir. Gerçekten de, SARS-CoV hastalarından iyileşen serumda S’ye karşı nötralize edici antikor yanıtları tespit edilmiştir Enfeksiyon 14 ‘ ten24ay sonra , uzun süreli immün yanıttaki kritik rollerini vurgulamaktadır. S proteini umut verici bir aşı hedefi olarak tanımlanmıştır ve bu nedenle geliştirilmekte olan çoğu aşının önemli bir bileşeni haline gelmiştir15,16.

Nötralize edici antikorların hızlı tespiti aşı geliştirmenin kritik bir yönü olmakla birlikte, etkilenen bölgelerde enfeksiyon ve sero-epidemiyolojik gözetim oranına da ışık tutabilir17. Biyogüvenlik seviye 2 ayarlarında SARS-CoV-2 enfeksiyonunu incelemek için vahşi tip VSV glikoproteinin yerine SARS-CoV-2 S glikoprotein ile sözde replikasyon yetkin bir VSV, Whelan ve iş arkadaşları tarafından nazikça bağışlandı18. SARS-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikor yanıtını belirlemek için VSV ekspresying spike (VSV-S) kullanılacaktır. Burada kullanılan VSV-S aynı zamanda gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) ifade ettiği için, enfeksiyonu ölçmek için 24 saat içinde eGFP odakları tespit edilebilirken, plak oluşumu 48 ila 72 saat sürebilir. Burada özetlenen, iyileşen hasta serumunun VSV-S-eGFP enfeksiyonunu nötralize etme yeteneğini belirlemek için basit ve etkili bir protokoldür. Bu yöntem, SARS-CoV-2 S proteininin konak-viral etkileşimini bozmayı amaçlayan diğer potansiyel terapötikleri sorgulamak için de kolayca uyarlanabilir.

Protocol

1. SARS-CoV-2 psödovirüs üretimi ve niceliği için kaplama hücreleri (Gün 1) Doku kültürüne hazırlık Sıcak 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS); Dulbecco’nun Fetal Sığır Serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren Modifiye Kartal Orta (DMEM) (isteğe bağlı); ve yaklaşık 15 dakika boyunca bir su banyosunda% 0.25 tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ila 37 °C. Bir doku kültürü davlumbazını% 70 etanol ile dezenfekte edin ve doku kültürü yemekler…

Representative Results

Bu protokol, VSV-S-eGFP psödovirüs enfeksiyonunun inhibisyonu yoluyla SARS-CoV-2 S proteinine karşı nötralize edici antikorları tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir (tespit edilen eGFP odaklarının kaybı ile ölçülebilir). Şekil 1’de protokolün şematik bir gösterimi resmedilmiştir. Testin tutarlılığını sağlamak için test her çalıştırılmasında pozitif kontrol olarak piyasada bulunan bir antikorun kullanılması önerilir. Burada, bir Ig…

Discussion

Burada açıklanan yöntem, gerektiğinde farklı laboratuvar ortamlarına ve kaynaklarına uyacak şekilde uyarlanabilir. Daha da önemlisi, bu protokolün ana sınırlaması, bir muhafaza düzeyi 2 alan ve doku kültürü başlığı için gerekliliktir. VSV-S-eGFP gibi SARS-CoV-2 ani yükselişi ile sözde çoğaltıcı bir RNA virüsünün uygulanması, kontrol altına alma seviyesi 3 çalışma alanı gerektiren SARS-CoV-2 virüsüne zorlu bir alternatiftir, ancak bazı gruplar için bir sınırlama olarak kalabilir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Whelan laboratuvarına, bu protokolde kullanılan VSV-S-eGFP virüsünü cömertçe sağladığı için teşekkür ederiz (Case ve ark. 2020’de açıklanmıştır). Ayrıca Dr. Bill Cameron ve Juthaporn Cowan’a (ve ekibine) hasta kan örneklerini (REB protokol kimliği 20200371-01H) topladıkları için teşekkür ederiz. Yazarlar, bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayımlanması için aşağıdaki finansal desteğin alındığını açıklamalıdır: Bu çalışma, Ottawa Hastanesi Vakfı’nın cömert desteği ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri’nden (#448323) bir hibe ve COVID-19 Bilimi için Thistledown Vakfı’ndan C.S.I. T.R.J.’e hızlı bir hibe ile finanse edilmektedir. JP bir küme Mitacs bursu tarafından finanse edilir. T.A. bir CIHR Banting Bursu tarafından finanse edilir. Bu çalışma için katılan ve kan örneklerini bağışlayan tüm bireylere de teşekkür ederiz.

Materials

0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
  4. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

SARS-CoV-2Neutralizing AntibodiesHigh-throughputFluorescent ImagingPseudovirus InfectionVero E6 CellsVSV Spike EGFP PseudovirusViral Titer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image