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Immunology and Infection

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Abstract

À medida que a pandemia COVID-19 causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) continua a evoluir, tornou-se evidente que a presença de anticorpos neutralizantes contra o vírus pode fornecer proteção contra infecções futuras. Assim, à medida que a criação e tradução de vacinas eficazes COVID-19 continua em uma velocidade sem precedentes, o desenvolvimento de métodos rápidos e eficazes para medir anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 se tornará cada vez mais importante para determinar a proteção a longo prazo contra infecções para indivíduos previamente infectados e imunizados. Este artigo descreve um protocolo de alto rendimento usando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína de pico SARS-CoV-2 para medir a presença de anticorpos neutralizantes em soro convalescente de pacientes que se recuperaram recentemente do COVID-19. O uso de um vírus pseudotipado replicante elimina a necessidade de uma instalação de nível 3 de contenção necessária para o manuseio sars-cov-2, tornando este protocolo acessível a praticamente qualquer laboratório nível de contenção 2. O uso de um formato de 96 poços permite que muitas amostras sejam executadas ao mesmo tempo com um curto tempo de retorno de 24 horas.

Introduction

Em dezembro de 2019, foi identificado um novo coronavírus, que hoje conhecemos como SARS-CoV-2, o agente causador da doença coronavírus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 é um betacoronavírus pertencente à família Coronaviridae. Esses vírus envoltos compreendem um genoma de RNA de grande senso positivo e são responsáveis por infecções respiratórias e intestinais em humanos e animais2. Até maio de 2021, foram registrados mais de 157 milhões de casos notificados de COVID-19 globalmente e mais de 3,2 milhões de mortes3. O desenvolvimento de uma vacina eficaz tornou-se o objetivo principal de pesquisadores em todo o mundo com pelo menos 77 vacinas pré-clínicas sob investigação e 90 atualmente submetidas a testes clínicos4.

Coronavírus codificam quatro proteínas estruturais, incluindo a proteína do pico (S), nucleocapsid (N), proteína envelope (E) e a proteína da membrana (M). A entrada do SARS-CoV-2 requer interação do domínio receptor-vinculativo (RBD) de S com o receptor hospedeiro, enzima conversor de angiotensina humana 2 (hACE2), e posterior fusão de membrana seguindo o decote proteolítico por serina hospedeira, soro de protease transmembrana 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . A imunodominância humoral da proteína S do SARS-CoV foi relatada anteriormente e agora foi mostrada também para SARS-CoV-211,12,13. De fato, as respostas neutralizantes de anticorpos contra S foram detectadas em soro convalescente de pacientes sars-cov 24 meses após a infecção14, destacando seu papel crítico na resposta imune a longo prazo. A proteína S foi identificada como um alvo vacinal promissor e, portanto, tornou-se um componente-chave da maioria das vacinas em desenvolvimento15,16.

Embora a rápida detecção de anticorpos neutralizantes seja um aspecto crítico do desenvolvimento de vacinas, também pode lançar luz sobre a taxa de infecção e vigilância soro-epidemiológica nas áreas impactadas17. Um pseudotipado VSV competente para replicação com a glicoproteína SARS-CoV-2 S, no lugar da glicoproteína VSV do tipo selvagem, para estudar a infecção pelo SARS-CoV-2 em configurações de biossegurança nível 2 foi gentilmente doada por Whelan e colegas de trabalho18. O pico de expressão VSV (VSV-S) será utilizado para determinar a resposta neutralizante de anticorpos contra a proteína de pico SARS-CoV-2. Como o VSV-S usado aqui também expressa proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), os focos eGFP podem ser detectados dentro de 24 horas para quantificar a infecção, enquanto a formação de placas pode levar de 48 a 72 h. Resumido aqui está um protocolo simples e eficaz para determinar a capacidade do soro convalescente do paciente de neutralizar a infecção vsv-S-eGFP. Este método também pode ser facilmente adaptado para interrogar outras terapêuticas potenciais que visam interromper a interação hosmá-viral da proteína SARS-CoV-2 S.

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Protocol

1. Células de chapeamento (Dia 1) para a produção e quantificação do pseudovírus SARS-CoV-2

  1. Preparação para a cultura tecidual
    1. Salina Fosfato-Tampão-Tampão de Dulbecco (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (opcional); e 0,25% de ácido tetraáctico de tripca-etilenodiamina (EDTA) a 37 °C em banho-maria por aproximadamente 15 minutos.
    2. Desinfete uma capa de cultura tecidual com 70% de etanol, e coloque pratos de cultura tecidual, pipetas pasteur e pipetas sorológicas na capa da cultura tecidual conforme necessário. Remova PBS, DMEM e trypsin do banho de água, e desinfete com 70% de etanol antes de colocar na capa da cultura tecidual.
  2. Emplacando e mantendo células
    1. Cultivar células Vero E6 em DMEM (contendo 10% de FBS) em frascos de cultura tecidual T75 ou pratos de cultura tecidual de 15 cm em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2. Passagem as células conforme necessário quando as células são 80-90% confluentes.
    2. Lave as células adicionando 10 mL de 1x PBS a cada prato e balançando suavemente 4-5 vezes; aspirar o PBS. Adicione 3 mL de trypsin-EDTA em cada prato, balance a placa para garantir que toda a superfície esteja coberta. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por aproximadamente 5 minutos, ou até que as células se despem.
    3. Adicione 7 mL de DMEM (contendo 10% de FBS) para desativar a trippsina e resuspensar as células ao tubular várias vezes. Gire as células para remover a trippsina usando uma centrífuga de bancada a 500 × g por 5 minutos, aspire a mídia sem perturbar a pelota celular e resuspense as células em 10 mL de DMEM (contendo 10% de FBS). Se as células forem necessárias para experimentos futuros, coloque 1 mL em um novo prato contendo 15 mL de DMEM fresco (contendo 10% de FBS).
    4. Conte as células usando um contador celular automatizado ou hemótmetro, e adicione aproximadamente 1 ×10 7 células a cada placa de 15 cm, e incubar a 37 °C com 5% de CO2 até que sejam 100% confluentes (1-2 dias).

2. PREPARAÇÃO DE pseudovírus VSV-S-EGFP

  1. Infeção
    1. Infectar células na multiplicidade de infecção (MOI) 0,01 com vírus de estoque VSV-S-eGFP em 12 mL de DMEM sem soro por 1 h a 37 °C com 5% de CO2, ocasionalmente balançando as placas. Substitua o inóculo por DMEM fresco (contendo 2% de FBS e 20 mM HEPES, pH 7.7), e mude-se para uma incubadora definida para 34 °C com 5% de CO2.
      NOTA: É necessária uma temperatura de 34 °C para a propagação do VSV-S-eGFP na cultura celular.
    2. Coletar supernantes celulares após observação de efeito citopático extensivo (CPE) e descolamento celular, aproximadamente 48 h pós-infecção. Use um microscópio fluorescente para visualizar a expressão extensiva do eGFP por células infectadas a partir de 24 horas após a infecção.
  2. Coleção
    1. Centrifugar os supernacantes usando uma centrífuga de bancada por 5 min a 1.000 × g a 4 °C para remover os detritos celulares. Aliquot o supernatante para evitar múltiplos ciclos de congelamento e armazene a -80 °C.

3. Titering o pseudovírus VSV-S-eGFP

  1. Diluição em série para determinar o título viral
    1. Placa Vero E6 células em placas de 6 poços a uma densidade de semeadura de 6 ×10 5 células por poço em DMEM (com 10% de FBS), e incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Também podem ser utilizadas células Vero que superexpressam TMPRSS2 e hACE2.
    2. Configure uma série de diluição serial de 10 vezes do vírus VSV-S-eGFP no DMEM sem soro frio, colocando 900 μL de mídia em sete tubos de microcentrifuuga. Tubos de etiqueta de 1 a 7. Adicione 100 μL do estoque viral ao primeiro tubo e vórtice brevemente. Transferir 100 μL de vírus diluído do tubo 1 para o tubo 2 e vórtice brevemente; continuar até o tubo 7.
    3. Aspire o meio de todos os poços da placa de 6 poços contendo células Vero E6, e substitua por 500 μL de diluições 10-2 a 10-7. Incubar as placas por 45 min a 37 °C com 5% de CO2,balançando suavemente a cada 15 minutos.
    4. Aspire o inóculo e substitua por sobreposição contendo uma mistura de 1:1 de DMEM 2x e 6% de celulose carboximetil (CMC), concentração final de 3% CMC, suplementada com 10% de FBS; incubar a 34 °C com 5% de CO2 por 48 h.
      NOTA: Pré-aqueça a mistura de sobreposição em um banho de água de 37 °C durante 15 minutos durante a etapa de infecção. Uma mistura de 1:1 de 1% de agarose com 2x DMEM complementada com 10% de FBS pode ser usada no lugar de CMC. Para sobrepor com agarose, ferva 1% de agarose (em dH2O) e misture com DMEM frio de 2x. Certifique-se de que a mistura é uma temperatura adequada antes de adicionar à monocamada celular (aproximadamente 37-40 °C). Se a agarose for usada para a sobreposição, as células devem ser fixadas incubando em 2 mL de 3:1 metanol:ácido acético por pelo menos uma hora antes da coloração.
  2. Colorindo e calculando o título viral
    1. Visualize placas com coloração com violeta cristalina ou visualização direta de eGFP sob um microscópio fluorescente.
    2. Para colorir as placas, aspire a sobreposição, lave uma vez com PBS, depois adicione 2 mL de 0,1% de violeta cristalina (em 80% de metanol e dH2O) a cada poço. Coloque em um roqueiro de placas por aproximadamente 20 minutos em temperatura ambiente antes da des coloração. Remova o cristal violeta e lave suavemente cada poço duas vezes usando dH2O ou PBS.
      NOTA: As etapas de lavagem e coloração devem ser realizadas suavemente através da tubulação lentamente em direção ao lado de cada poço para garantir que a monocamada da célula permaneça intacta durante todo o procedimento.
    3. Deixe as placas secarem por pelo menos 1h antes de contar placas. Certifique-se de que as contagens de placas sejam obtidas de poços contendo de 20 a 200 placas. Para calcular o título do vírus em unidades formadoras de placas (PFU) por mL, multiplique o fator de diluição do poço contado com o volume de infecção, e divida esse número das placas presentes no poço respectivo.
      Equation 1

4. Células de chapeamento (Dia 1) para a medição da neutralização do pseudovírus SARS-CoV-2 por anticorpos comercialmente disponíveis e soro convalescente do paciente

  1. Preparação para a cultura tecidual
    1. Prepare a capa de cultura média e tecidual, conforme descrito na seção 1. Além disso, prepare o número necessário de 96 placas de poço para acomodar um mínimo de 2 réplicas por amostra (ou seja, 1 placa por 6 amostras); adicionar réplicas adicionais se o volume da amostra permitir.
  2. Emplacando e mantendo células
    1. Cresça e mantenha as células Vero E6 como descrito na seção 1. Prepare pelo menos 10 mL de suspensão celular por placa de 96 poços a uma concentração de 2 × 105 células por mL (placa 1,5 × 105 células por mL para ensaios realizados após 48h, se necessário). Adicione 100 μL de suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal, e incubar por 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Misture bem a suspensão da célula e balance cada placa suavemente em todas as direções para garantir a distribuição uniforme das células.

5. Diluições e infecções por anticorpos ou soros (Dia 2)

NOTA: Este protocolo pode ser aplicado para medir a neutralização do VSV-S-eGFP tanto por anticorpos disponíveis comercialmente quanto pelo soro do paciente, bem como pelo soro coletado de animais para estudos pré-clínicos de desenvolvimento de vacinas. *Tome nota das etapas adicionais listadas ao manusear amostras de soro de pacientes/animais.

  1. Série de diluição em série
    1. Antes de diluir amostras de soro, inativar o calor de cada amostra em um banho de água de 56 °C por 30 minutos para inativar o complemento. Certifique-se de que as precauções de segurança necessárias sejam tomadas ao manusear amostras do paciente; apenas abra recipientes de amostra quando na capa da cultura tecidual, e garanta que os equipamentos de proteção individual de nível 2 adequados sejam usados.
    2. Configure a série de diluição em uma placa vazia de 96 poços (Placa 1).
    3. Inicie todas as diluições na linha A da placa de 96-well em 80 μL. *Para amostras de pacientes, inicie a série de diluição em 1 em 10 colocando 8 μL de soro em 72 μL de DMEM sem soro (com penicilina/estreptomicina de 1%).
      NOTA: A concentração de anticorpos neutralizantes utilizados dependerá da atividade prevista pelo fabricante. Para o anticorpo neutralizador sars-CoV-2 spike utilizado aqui (ver a Tabela de Materiais), comece com 5 μg/mL para observar pelo menos 50% de neutralização.
    4. Adicione 40 μL de DMEM sem soro (com penicilina/estreptomicina de 1%) às linhas B a G e 80 μL à linha H. Não adicione vírus à linha H, pois serve como um controle somente para células.
    5. Usando uma pipeta multicanal de 12 poços, misture e transfira 40 μL de soro diluído ou anticorpo da linha A para a linha B. Misture e repita até a linha F, descarte 40 μL da linha F. Não adicione soro à linha G, pois representa a linha de controle somente para vírus.
  2. Infecção e sobreposição
    1. Prepare um volume apropriado de VSV-S-eGFP diluído para tratar cada poço em MOI 0.05 (ou 2000 pfu). (Ao completar este cálculo, tenha em mente que apenas 60 μL do volume total de 80 μL serão movidos para as células; portanto, certifique-se de multiplicar o volume do vírus por 1,33 para manter 2000 pfu).
      NOTA: Como o VSV-S-eGFP é sensível à temperatura, certifique-se de que os estoques virais permaneçam no gelo sempre que não estiver em uso e evite vários ciclos de congelamento, pois os títulos diferem após o congelamento repetido.
    2. Adicione 40 μL de vírus diluído a cada poço nas linhas A a G da Placa 1 e misture por pipetar para cima e para baixo 4-5 vezes. Incubar a placa por 1h a 37 °C com 5% de CO2.
    3. Remova a placa contendo células da incubadora (Placa 2) e aspire cuidadosamente a mídia de todos os poços. Transfira 60 μL de mistura anticorpo/vírus da Placa 1 para a Placa 2, e incubar por 1h a 37 °C com 5% de CO2, balançando a placa a cada 20 minutos.
    4. Cubra cada poço com 140 μL de sobreposição contendo CMC em DMEM para uma concentração final de 3% cmc (com 10% de FBS e 1% penicilina/estreptomicina). Coloque a placa 2 em uma incubadora definida para 34 °C com 5% de CO2 por aproximadamente 24 h antes da imagem.
      NOTA: Pré-aqueça a mistura de sobreposição em um banho de água de 37 °C durante 15 minutos durante a etapa de infecção.

6. Imagem e quantificação (Dia 3)

  1. Placas de imagem usando um imager fluorescente automatizado (usando um filtro isothiocianato fluoresceína (FITC) ou um filtro alternativo com um comprimento de onda de excitação de 488 nm). Quantifique a infecção viral criando um protocolo que identifica e conta automaticamente focos eGFP individuais. Se um recurso de contagem automática não estiver disponível, use o software ImageJ para quantificar o número de focos eGFP.

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Representative Results

Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para detectar anticorpos neutralizantes contra a proteína SARS-CoV-2 S através da inibição da infecção por pseudovírus VSV-S-eGFP (quantificável pela perda de focos eGFP detectados). Uma representação esquemática do protocolo é retratada na Figura 1. Recomenda-se que um anticorpo comercialmente disponível seja usado como um controle positivo cada vez que o ensaio é executado para garantir a consistência do ensaio. Aqui, demonstramos uma curva de diluição usando um anticorpo IgG neutralizante comercialmente disponível contra SARS-CoV-2 Spike RBD em comparação com um controle IgG (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre ambos os anticorpos; Figura 2).

Amostras de pacientes convalescentes foram coletadas aproximadamente três meses após a infecção pelo SARS-CoV-2, e a neutralização do pseudovírus foi determinada utilizando o método descrito acima(Figura 3). É importante ressaltar que a inibição mínima de fundo foi observada utilizando-se soro doador saudável. Além disso, nota-se que este ensaio distingue entre pacientes com alta gravidade dos sintomas versus aqueles com doença mais branda com base na necessidade de internação. De acordo com outros relatos, observamos em nossa pequena coorte que pacientes hospitalizados tendem a demonstrar maior capacidade de neutralização do que aqueles que não necessitaram de internação19,20. Embora isso nem sempre seja o caso de amostras de pacientes hospitalizados versus não hospitalizados, a capacidade do ensaio de diferenciar diferentes graus de neutralização é um trunfo. Também pode haver casos em que a capacidade neutralizante do soro do paciente é muito maior do que as demonstradas aqui. Se necessário, a diluição inicial do soro do paciente pode ser ajustada, ou etapas adicionais de diluição podem ser realizadas em uma placa adicional.

Figure 1
Figura 1: Esboço de protocolo demonstrando neutralização do VSV-S-eGFP por soro convalescente. Abreviaturas: VSV = vírus da estomatite vesicular; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; COVID-19 = doença coronavírus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Um anticorpo neutralizador comercialmente disponível contra SARS-CoV-2 tem sido usado como exemplo de um controle positivo ao lado do IgG como um controle negativo. A capacidade de neutralizar anticorpos para inibir infecções virais vai variar; consulte as informações disponíveis para o anticorpo específico adquirido para determinar qual concentração iniciar a curva de diluição (as amostras foram executadas em triplicado, as barras de erro representam ± SD). (A) A inibição percentual foi calculada com base no número de focos eGFP detectados via(B) imagem fluorescente. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; IgG = imunoglobulina; SD = desvio padrão; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; RBD = domínio de ligação de receptor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A capacidade do soro convalescente dos pacientes para neutralizar o VSV-S-eGFP varia dependendo da gravidade dos sintomas. Foram coletadas amostras de soro do paciente aproximadamente 3 meses após a infecção pelo SARS-CoV-2, e amostras de controle foram coletadas de pacientes não infectados (as amostras foram executadas em triplicado, as barras de erro representam ± SD). (A) A inibição percentual foi calculada com base no número de focos eGFP detectados via(B) imagem fluorescente. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; SD = desvio padrão; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O método aqui descrito pode ser adaptado para atender a diferentes ambientes e recursos de laboratório, conforme necessário. É importante ressaltar que a principal limitação deste protocolo é a necessidade de um espaço de contenção nível 2 e uma capa de cultura tecidual. A aplicação de um vírus RNA replicante pseudotipado com o pico SARS-CoV-2, como VSV-S-eGFP, é uma alternativa formidável ao vírus SARS-CoV-2, que requer uma área de trabalho nível 3 de contenção, mas pode permanecer uma limitação para alguns grupos. Todas as outras etapas descritas aqui são bastante flexíveis e podem ser realizadas em quase qualquer laboratório de nível 2 de contenção. Por exemplo, o uso de um imager fluorescente com um recurso de contagem automatizada não é necessário. O formato de 96 poços usado aqui significa que apenas aproximadamente 4 campos de visão são necessários para a imagem quase todo o poço usando o objetivo mais baixo disponível (2x).

Um microscópio fluorescente manual pode ser usado para imagem de vários campos de cada poço, e ImageJ (software livre) pode então ser usado para quantificar focos eGFP. Além disso, optamos por usar o formato de 96 poços para usar o menor volume de soro possível, bem como manter o uso consumível ao mínimo. Se um microscópio fluorescente não estiver disponível, este protocolo pode ser dimensionado até um formato de 6 ou 12 poços para detectar a formação de placas após fixação e coloração de violeta cristalina (semelhante ao protocolo de titer viral descrito acima). A consideração mais crítica a ter em mente ao executar este protocolo é a sensibilidade à temperatura do VSV-S-eGFP. Ao trabalhar com VSV-S-eGFP, sempre alíquota o vírus em pequenos volumes para evitar vários ciclos de congelamento e manter o vírus no gelo sempre que possível. Além disso, pode-se detectar sinal fluorescente robusto após 24 h; no entanto, adquirimos resultados semelhantes após a imagem em 20 a 28 h de infecção pós..

Existem vários métodos disponíveis para detectar a presença de anticorpos contra SARS-CoV-2, incluindo o ensaio de ensaio imunosorbente ligado à enzima padrão-ouro (ELISA), que quantifica a quantidade total de anticorpos contra S21,22. Aqui, delineamos um método rápido e confiável para detectar especificamente anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2 imunodominante em soro convalescente de pacientes. Melhoramos o teste clássico de neutralização de redução de placas (PRNT) adaptando-se com sucesso a um formato de 96 poços, que permite a detecção de anticorpos neutralizantes em um grande número de amostras dentro de 24 horas por quantificação automatizada da infecção por pseudovírus, permitindo uma rápida reviravolta nos relatórios finais de dados. Além de detectar anticorpos neutralizantes dentro do soro, este método pode ser adaptado para realizar a triagem de alto rendimento de outras estratégias terapêuticas, que visam inibir diretamente a interação proteica de pico SARS-CoV-2 com hACE2, como anticorpos monoclonais, hACE2 solúvel recombinante ou inibidores protease, para impedir a entrada viral23 . Com o surgimento de várias variantes de proteína de pico SARS-CoV-2, também é importante notar que este método pode ser aplicado para determinar se níveis de neutralização semelhantes ocorrem após a infecção com diferentes variantes do vírus24.

Outros exemplos de métodos disponíveis para detectar anticorpos contra SARS-CoV-2 incluem ELISAs, ensaios baseados em lentivírus e kits comerciais para avaliar a capacidade de neutralização de amostras de soro. Embora os ELISAs de ligação IgM ou IgG comumente utilizados sejam um método eficaz para determinar a presença de concentração de anticorpos para rastrear infecção ou imunização anterior, eles são incapazes de distinguir a capacidade de neutralização dos anticorpos de ligação25. Os ensaios de neutralização baseados em lentivírus pseudotipados têm um perfil de segurança melhorado, usando partículas virais não replicativas em vez de replicar VSV-S-eGFP; no entanto, isso cria uma barreira em termos de capacidade de teste, uma vez que os títulos lentiviral tendem a ser muito menores26,27. Existem vários kits comercialmente disponíveis que medem a capacidade dos anticorpos de bloquear a infecção através da inibição competitiva da proteína de pico SARS-CoV-2 (RBD especificamente) ligada ao receptor hACE2 após a incubação com soro convalescente (por exemplo, CUSABIO, GenScript, Abnova). Embora muitos desses kits tenham sensibilidade e especificidade respeitáveis, eles também tendem a ser relativamente caros e, portanto, não são ideais para um grande volume de amostras. O protocolo aqui fornecido é rápido, confiável e barato. Este método de alta produtividade pode ser usado para testar muitas amostras, alcançando uma leitura robusta dentro de 24 horas.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes relacionados a esta publicação.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao laboratório Whelan por fornecer generosamente o vírus VSV-S-eGFP usado neste protocolo (descrito no Case et al. 2020). Agradecemos também aos Drs. Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e equipe) pela coleta das amostras de sangue do paciente (ID do protocolo REB 20200371-01H). Os autores divulgam o recebimento do seguinte apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: Este trabalho foi financiado pelo generoso apoio da Fundação Hospitalar de Ottawa e uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (#448323) e uma Bolsa Rápida da Fundação Thistledown para a Ciência COVID-19 para c.S.I. T.R.J. é financiada por uma bolsa de pós-graduação de Ontário e uma bolsa mitacs de cluster. JP é financiado por uma bolsa mitacs cluster. A T.A. é financiada por uma Cihr Banting Fellowship. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Imunologia e Infecção Problema 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Pseudovírus Anticorpo Neutralizante vírus da estomatite vesicular glicoproteína de pico
Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus
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Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

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