Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Détection des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide de l’imagerie fluorescente à haut débit de l’infection à pseudovirus

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

Le protocole décrit ici décrit décrit une méthode rapide et efficace pour mesurer les anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 en évaluant la capacité des échantillons de sérum de convalescent à inhiber l’infection par un virus de la stomatite vésiculeuse marqué par une protéine fluorescente verte améliorée pseudotypée avec une glycoprotéine de pointe.

Abstract

Alors que la pandémie de COVID-19 causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) continue d’évoluer, il est devenu évident que la présence d’anticorps neutralisants contre le virus peut fournir une protection contre une infection future. Ainsi, alors que la création et la traduction de vaccins efficaces contre la COVID-19 se poursuivent à une vitesse sans précédent, le développement de méthodes rapides et efficaces pour mesurer les anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 deviendra de plus en plus important pour déterminer la protection à long terme contre l’infection des personnes précédemment infectées et immunisées. Cet article décrit un protocole à haut débit utilisant le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) pseudotypé avec la protéine de pointe sars-CoV-2 pour mesurer la présence d’anticorps neutralisants dans le sérum de convalescent de patients récemment guéris de la COVID-19. L’utilisation d’un virus pseudotypé répliquant élimine la nécessité d’une installation de niveau de confinement 3 requise pour la manipulation du SARS-CoV-2, ce qui rend ce protocole accessible à pratiquement n’importe quel laboratoire de niveau de confinement 2. L’utilisation d’un format de 96 puits permet d’exécuter de nombreux échantillons en même temps avec un court délai d’exécution de 24 h.

Introduction

En décembre 2019, un nouveau coronavirus a été identifié, que nous connaissons maintenant sous le nom de SARS-CoV-2, l’agent causal de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)1. Le SARS-CoV-2 est un bêtacoronavirus de la famille des Coronaviridae. Ces virus enveloppés comprennent un grand génome d’ARN à sens positif et sont responsables d’infections respiratoires et intestinales chez l’homme et l’animal2. En mai 2021, plus de 157 millions de cas de COVID-19 ont été signalés dans le monde et plus de 3,2 millions de décès3. Le développement d’un vaccin efficace est devenu l’objectif principal des chercheurs du monde entier avec au moins 77 vaccins précliniques à l’étude et 90 actuellement en cours d’essais cliniques4.

Les coronavirus codent quatre protéines structurelles, dont la protéine de pointe (S), la nucléocapside (N), la protéine d’enveloppe (E) et la protéine membranaire (M). L’entrée du SARS-CoV-2 nécessite une interaction du domaine de liaison au récepteur (RBD) de S avec le récepteur hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2), et la fusion membranaire ultérieure après clivage protéolytique par la sérine protéase cellulaire hôte, la sérine 2 (TMPRSS2) transmembranaire5,6,7,8,9,10 . L’immunodominance humorale de la protéine S du SARS-CoV a déjà été rapportée et a maintenant été démontrée également pour le SARS-CoV-211,12,13. En effet, des réponses d’anticorps neutralisants contre S ont été détectées dans le sérum de convalescence de patients atteints du SRAS-CoV 24 mois après l’infection14,soulignant leur rôle essentiel dans la réponse immunitaire à long terme. La protéine S a été identifiée comme une cible vaccinale prometteuse et est ainsi devenue un composant clé de la plupart des vaccins en cours de développement15,16.

Bien que la détection rapide des anticorps neutralisants soit un aspect critique de la mise au point d’un vaccin, elle peut également faire la lumière sur le taux d’infection et la surveillance séro-épidémiologique dans les zones touchées17. Un VSV compétent en réplication pseudotypé avec la glycoprotéine SARS-CoV-2 S, à la place de la glycoprotéine VSV de type sauvage, pour étudier l’infection par le SARS-CoV-2 dans des contextes de biosécurité de niveau 2 a été gentiment donné par Whelan et ses collègues18. Le pic d’expression vsV (VSV-S) sera utilisé pour déterminer la réponse des anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SARS-CoV-2. Comme le VSV-S utilisé ici exprime également la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), les foyers eGFP peuvent être détectés dans les 24 h pour quantifier l’infection, tandis que la formation de plaque peut prendre de 48 à 72 h. Résumé ici est un protocole simple et efficace pour déterminer la capacité du sérum de patient convalescent à neutraliser l’infection VSV-S-eGFP. Cette méthode peut également être facilement adaptée pour interroger d’autres thérapies potentielles qui visent à perturber l’interaction hôte-viral de la protéine SARS-CoV-2 S.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellules de placage (Jour 1) pour la production et la quantification du pseudovirus sars-CoV-2

  1. Préparation à la culture tissulaire
    1. Réchauffez 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco; Le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (facultatif); et 0,25 % d’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) à 37 °C au bain-marie pendant environ 15 min.
    2. Désinfectez une hotte de culture tissulaire avec de l’éthanol à 70 % et placez des boîtes de culture tissulaire, des pipettes Pasteur et des pipettes sérologiques dans la hotte de culture tissulaire au besoin. Retirer le PBS, le DMEM et la trypsine du bain-marie et désinfecter avec de l’éthanol à 70 % avant de le placer dans la hotte de culture tissulaire.
  2. Placage et maintien des cellules
    1. Cultiver des cellules Vero E6 dans du DMEM (contenant 10% de FBS) dans des flacons de culture tissulaire T75 ou des boîtes de culture tissulaire de 15 cm dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. Passer les cellules au besoin lorsque les cellules sont confluentes à 80-90%.
    2. Lavez les cellules en ajoutant 10 mL de 1x PBS à chaque plat et en berçant doucement 4 à 5 fois; aspirer le PBS. Ajouter 3 mL de trypsine-EDTA à chaque plat, bercer la plaque pour s’assurer que toute la surface est couverte. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant environ 5 min, ou jusqu’à ce que les cellules se se détachent.
    3. Ajouter 7 mL de DMEM (contenant 10% de FBS) pour désactiver la trypsine, et resuspendez les cellules en pipetant plusieurs fois. Faire tourner les cellules pour éliminer la trypsine à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à 500 × g pendant 5 min, aspirer le milieu sans perturber la pastille cellulaire et ressuspender les cellules dans 10 mL de DMEM (contenant 10% de FBS). Si des cellules sont nécessaires pour de futures expériences, placez 1 mL dans un nouveau plat contenant 15 mL de DMEM frais (contenant 10% de FBS).
    4. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre, ajoutez environ 1 ×10 7 cellules à chaque plaque de 15 cm et incubez à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 100 % (1-2 jours).

2. Préparation du pseudovirus VSV-S-EGFP

  1. Infection
    1. Infecter les cellules à multiplicité d’infection (MOI) 0,01 avec le virus vsV-S-eGFP dans 12 mL de DMEM sans sérum pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO2, en secouant parfois les plaques. Remplacez l’inoculum par du DMEM frais (contenant 2% de FBS et 20 mM de HEPES, pH 7,7) et passez à un incubateur réglé à 34 °C avec 5% de CO2.
      REMARQUE: Une température de 34 °C est requise pour la propagation du VSV-S-eGFP en culture cellulaire.
    2. Recueillir les surnageants cellulaires après l’observation d’un effet cytopathique étendu (EPC) et d’un décollement cellulaire, environ 48 heures après l’infection. Utilisez un microscope fluorescent pour visualiser l’expression étendue de l’eGFP par les cellules infectées à partir de 24 heures après l’infection.
  2. Collection
    1. Centrifuger les surnageants à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min à 1 000 × g à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Aliquotez le surnageant pour éviter de multiples cycles de gel-dégel et conservez-le à -80 °C.

3. Titrage du pseudovirus VSV-S-eGFP

  1. Dilution en série pour déterminer le titre viral
    1. Plaques de cellules Vero E6 sur plaques à 6 puits à une densité d’ensemencement de 6 ×10 à 5 cellules par puits dans le DMEM (avec 10% fbS), et incuber toute la nuit à 37 °C avec 5% de CO2.
      REMARQUE: Les cellules Vero qui surexpriment TMPRSS2 et hACE2 peuvent également être utilisées.
    2. Mettre en place une série de dilution en série 10 fois du virus VSV-S-eGFP dans le DMEM sans sérum du rhume en plaçant 900 μL de milieu dans sept tubes de microcentrifugation. Étiquetez les tubes de 1 à 7. Ajouter 100 μL de la souche virale au premier tube et vortex brièvement. Transférer 100 μL de virus dilué du tube 1 au tube 2 et vortex brièvement; continuer jusqu’au tube 7.
    3. Aspirer le milieu de tous les puits de la plaque de 6 puits contenant des cellules Vero E6, et remplacer par 500 μL de dilutions10-2 à 10-7 . Incuber les plaques pendant 45 min à 37 °C avec 5% de CO2,en berçant doucement toutes les 15 min.
    4. Aspirer l’inoculum et le remplacer par une superposition contenant un mélange 1:1 de 2x DMEM et 6% de carboxyméthylcellulose (CMC), concentration finale de 3% de CMC, complété par 10% fbS; incuber à 34 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h.
      REMARQUE: Préchauffez le mélange superposé dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes pendant l’étape d’infection. Un mélange 1:1 d’agarose à 1 % avec 2x DMEM complété par 10% de FBS peut être utilisé à la place de CMC. Pour superposer avec de l’agarose, faire bouillir 1% d’agarose (en dH2O)et mélanger avec 2x DMEM froid. Assurez-vous que le mélange est à une température appropriée avant d’ajouter à la monocouche de la cellule (environ 37-40 ° C). Si l’agarose est utilisé pour la superposition, les cellules doivent être fixées par incubation dans 2 mL de méthanol:acide acétique 3:1 pendant au moins une heure avant la coloration.
  2. Coloration et calcul du titre viral
    1. Visualisez les plaques en les colorant avec du violet cristallin ou en visualisant directement l’eGFP sous un microscope fluorescent.
    2. Pour tacher les plaques, aspirer la superposition, laver une fois avec du PBS, puis ajouter 2 mL de violet cristallin à 0,1% (dans 80% de méthanol et dH2O) à chaque puits. Placer sur une bascule à plaque pendant environ 20 minutes à température ambiante avant de détachant. Retirez le cristal violet et lavez doucement chaque puits deux fois à l’aide de dH2O ou PBS.
      REMARQUE: Les étapes de lavage et de coloration doivent être effectuées doucement en pipetant lentement vers le côté de chaque puits pour s’assurer que la monocouche cellulaire reste intacte tout au long de la procédure.
    3. Laisser sécher les plaques pendant au moins 1 h avant de compter les plaques. S’assurer que le nombre de plaques est obtenu à partir de puits contenant de 20 à 200 plaques. Pour calculer le titre du virus en unités formant de la plaque (PFU) par mL, multipliez le facteur de dilution du puits compté par le volume d’infection et divisez ce nombre des plaques présentes dans le puits respectif.
      Equation 1

4. Cellules de placage (Jour 1) pour la mesure de la neutralisation du pseudovirus SARS-CoV-2 par des anticorps disponibles dans le commerce et du sérum de patient convalescent

  1. Préparation à la culture tissulaire
    1. Préparer le milieu et la cagoule de culture tissulaire comme décrit à la rubrique 1. De plus, préparer le nombre nécessaire de 96 plaques de puits pour accueillir un minimum de 2 répétitions par échantillon (c.-à-d. 1 plaque pour 6 échantillons); ajouter des répétitions supplémentaires si le volume d’échantillon le permet.
  2. Placage et maintien des cellules
    1. Cultiver et entretenir les cellules Vero E6 comme décrit à la rubrique 1. Préparer au moins 10 mL de suspension cellulaire par plaque de 96 puits à une concentration de 2 × 105 cellules par mL (plaque de 1,5 × 105 cellules par mL pour les essais effectués après 48 h, si nécessaire). Ajouter 100 μL de suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal, et incuber pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE: Mélangez bien la suspension cellulaire et bercez doucement chaque plaque dans toutes les directions pour assurer une distribution uniforme des cellules.

5. Anticorps ou dilutions sériques et infections (Jour 2)

REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué pour mesurer la neutralisation du VSV-S-eGFP par les anticorps disponibles dans le commerce et le sérum du patient, ainsi que le sérum prélevé sur les animaux pour les études précliniques de développement de vaccins. *Prenez note des étapes supplémentaires énumérées lors de la manipulation d’échantillons de sérum de patients ou d’animaux.

  1. Série de dilution en série
    1. Avant de diluer les échantillons de sérum, inactiver la chaleur de chaque échantillon dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 min pour inactiver le complément. S’assurer que les précautions de sécurité nécessaires sont prises lors de la manipulation d’échantillons de patients; n’ouvrez les contenants d’échantillons que dans la hotte de culture tissulaire et assurez-vous que l’équipement de protection individuelle approprié de niveau de confinement 2 est porté.
    2. Installer la série de dilution dans une plaque vide de 96 puits (planche 1).
    3. Commencer toutes les dilutions dans la rangée A de la plaque de 96 puits dans 80 μL. *Pour les échantillons de patients, commencez la série de dilution à 1 sur 10 en plaçant 8 μL de sérum dans 72 μL de DMEM sans sérum (avec 1 % de pénicilline/streptomycine).
      REMARQUE: La concentration d’anticorps neutralisants utilisés dépendra de l’activité prédite par le fabricant. Pour l’anticorps neutralisant SARS-CoV-2 Spike utilisé ici (voir le tableau des matériaux),commencez par 5 μg/mL pour observer une neutralisation d’au moins 50 %.
    4. Ajouter 40 μL de DMEM sans sérum (avec 1 % de pénicilline/streptomycine) aux rangées B à G et 80 μL à la rangée H. N’ajoutez pas de virus à la ligne H, car il sert de contrôle cellulaire uniquement.
    5. À l’aide d’une pipette multicanal à 12 puits, mélanger et transférer 40 μL de sérum dilué ou d’anticorps de la rangée A à la rangée B. Mélanger et répéter jusqu’à la rangée F, jeter 40 μL de la rangée F. N’ajoutez pas de sérum à la ligne G car elle représente la ligne de contrôle du virus uniquement.
  2. Infection et superposition
    1. Préparer un volume approprié de VSV-S-eGFP dilué pour traiter chaque puits à MOI 0,05 (ou 2000 pfu). (Lorsque vous effectuez ce calcul, gardez à l’esprit que seulement 60 μL du volume total de 80 μL seront déplacés sur les cellules; par conséquent, assurez-vous de multiplier le volume du virus par 1,33 pour maintenir 2000 pfu).
      REMARQUE: Comme le VSV-S-eGFP est sensible à la température, assurez-vous que les stocks viraux restent sur la glace lorsqu’ils ne sont pas utilisés et évitez les cycles de gel-dégel multiples, car les titres diffèrent après une congélation répétée.
    2. Ajouter 40 μL de virus dilué à chaque puits dans les rangées A à G de la plaque 1 et mélanger en pipetant de haut en bas 4 à 5 fois. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C avec 5% de CO2.
    3. Retirez la plaque contenant les cellules de l’incubateur (planche 2) et aspirez soigneusement le milieu de tous les puits. Transférer 60 μL de mélange anticorps/virus de la plaque 1 à la plaque 2, et incuber pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO2,en berçant la plaque toutes les 20 minutes.
    4. Complétez chaque puits avec 140 μL de superposition contenant du CMC dans du DMEM pour une concentration finale de 3 % de CMC (avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine). Placer la plaque 2 dans un incubateur réglé à 34 °C avec 5 % de CO2 pendant environ 24 h avant l’imagerie.
      REMARQUE: Préchauffez le mélange superposé dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes pendant l’étape d’infection.

6. Imagerie et quantification (Jour 3)

  1. Plaques d’image utilisant un imageur fluorescent automatisé (utilisant un filtre à isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou un filtre alternatif avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm). Quantifier l’infection virale en créant un protocole qui identifie et compte automatiquement les foyers eGFP individuels. Si aucune fonction de comptage automatique n’est disponible, utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de foyers eGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour détecter les anticorps neutralisants contre la protéine SARS-CoV-2 S via l’inhibition de l’infection par le pseudovirus VSV-S-eGFP (quantifiable par la perte de foyers eGFP détectés). Une représentation schématique du protocole est représentée à la figure 1. Il est recommandé d’utiliser un anticorps disponible dans le commerce comme témoin positif chaque fois que le test est effectué pour assurer la cohérence du test. Ici, nous démontrons une courbe de dilution à l’aide d’un anticorps IgG neutralisant disponible dans le commerce contre le SARS-CoV-2 Spike RBD par rapport à un témoin IgG (voir la Table des matériaux pour plus de détails sur les deux anticorps; Figure 2).

Des échantillons de patients convalescents ont été prélevés environ trois mois après l’infection par le SRAS-CoV-2, et la neutralisation du pseudovirus a été déterminée à l’aide de la méthode décrite ci-dessus (Figure 3). Fait important, une inhibition de fond minimale a été observée en utilisant du sérum de donneur sain. En outre, il convient de noter que ce test fait la distinction entre les patients présentant une gravité élevée des symptômes et ceux présentant une maladie plus bénigne en fonction de la nécessité d’une hospitalisation. Conformément à d’autres rapports, nous avons observé au sein de notre petite cohorte que les patients hospitalisés ont tendance à démontrer une capacité de neutralisation accrue que ceux qui n’ont pas eu besoin d’hospitalisation19,20. Bien que ce ne soit pas toujours le cas pour les échantillons de patients hospitalisés par rapport aux échantillons de patients non hospitalisés, la capacité du test à différencier les différents degrés de neutralisation est un atout. Il peut également y avoir des cas dans lesquels la capacité neutralisante du sérum du patient est beaucoup plus élevée que celles démontrées ici. Si nécessaire, la dilution initiale du sérum du patient peut être ajustée ou des étapes de dilution supplémentaires peuvent être effectuées sur une plaque supplémentaire.

Figure 1
Figure 1: Schéma du protocole démontrant la neutralisation du VSV-S-eGFP par le sérum de convalescence. Abréviations: VSV = virus de la stomatite vésiculeuse; eGFP = protéine fluorescente verte améliorée; COVID-19 = maladie à coronavirus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Un anticorps neutralisant disponible dans le commerce contre le SARS-CoV-2 a été utilisé comme exemple de témoin positif aux côtés des IgG comme témoin négatif. La capacité des anticorps neutralisants à inhiber l’infection virale variera; se référer à l’information disponible pour l’anticorps spécifique acheté afin de déterminer quelle concentration commencer la courbe de dilution (les échantillons ont été exécutés en trois exemplaires, les barres d’erreur représentent ± ET). (A) Le pourcentage d’inhibition a été calculé en fonction du nombre de foyers eGFP détectés via (B) l’imagerie fluorescente. Abréviations : SARS-CoV-2 = coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 ; IgG = immunoglobuline; ET = écart-type; eGFP = protéine fluorescente verte améliorée; RBD = domaine de liaison aux récepteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: La capacité du sérum de convalescent des patients à neutraliser le VSV-S-eGFP varie en fonction de la gravité des symptômes. Des échantillons de sérum de patients ont été prélevés environ 3 mois après l’infection par le SRAS-CoV-2, et des échantillons de contrôle ont été prélevés sur des patients non infectés (les échantillons ont été exécutés en trois exemplaires, les barres d’erreur représentent ± SD). (A) Le pourcentage d’inhibition a été calculé en fonction du nombre de foyers eGFP détectés via (B) l’imagerie fluorescente. Abréviations : SARS-CoV-2 = coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 ; ET = écart-type; eGFP = protéine fluorescente verte améliorée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La méthode décrite ici peut être adaptée pour s’adapter à divers environnements et ressources de laboratoire, selon les besoins. Il est important de se tromper que la principale limite de ce protocole est la nécessité d’un espace de confinement de niveau 2 et d’une hotte de culture tissulaire. L’application d’un virus à ARN répliquant pseudotypé avec le pic SARS-CoV-2, tel que VSV-S-eGFP, est une alternative redoutable au virus SARS-CoV-2, qui nécessite une zone de travail de niveau de confinement 3, mais peut rester une limitation pour certains groupes. Toutes les autres étapes décrites ici sont assez flexibles et peuvent être effectuées dans presque tous les laboratoires de niveau de confinement 2. Par exemple, l’utilisation d’un imageur fluorescent avec une fonction de comptage automatisé n’est pas nécessaire. Le format 96 puits utilisé ici signifie que seulement environ 4 champs de vision sont nécessaires pour imager presque tout le puits en utilisant l’objectif le plus bas disponible (2x).

Un microscope fluorescent manuel peut être utilisé pour imager plusieurs champs de chaque puits, et ImageJ (logiciel libre) peut ensuite être utilisé pour quantifier les foyers eGFP. De plus, nous avons choisi d’utiliser le format 96 puits pour utiliser le plus faible volume de sérum possible et pour maintenir l’utilisation des consommables au minimum. Si un microscope fluorescent n’est pas disponible, ce protocole peut être mis à l’échelle jusqu’à un format de 6 ou 12 puits pour détecter la formation de plaque après la fixation et la coloration du violet cristallin (similaire au protocole de titre viral décrit ci-dessus). La considération la plus critique à garder à l’esprit lors de l’exécution de ce protocole est la sensibilité à la température de VSV-S-eGFP. Lorsque vous travaillez avec VSV-S-eGFP, aliquotez toujours le virus en petits volumes pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel et garder le virus sur la glace autant que possible. De plus, un signal fluorescent robuste peut être détecté après 24 heures; cependant, nous avons obtenu des résultats similaires après l’imagerie 20 à 28 h après l’infection.

Il existe plusieurs méthodes disponibles pour détecter la présence d’anticorps contre le SARS-CoV-2, y compris le test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) de référence, qui quantifie la quantité totale d’anticorps contre S21,22. Ici, nous avons décrit une méthode rapide et fiable pour détecter spécifiquement les anticorps neutralisants contre la protéine de pointe immunodominante du SRAS-CoV-2 dans le sérum de convalescent des patients. Nous avons amélioré le test classique de neutralisation de la réduction de la plaque (PRNT) en nous adaptant avec succès à un format de 96 puits, qui permet la détection d’anticorps neutralisants dans un grand nombre d’échantillons en 24 heures par quantification automatisée de l’infection à pseudovirus, ce qui permet un traitement rapide des rapports de données finaux. En plus de détecter les anticorps neutralisants dans le sérum, cette méthode peut être adaptée pour effectuer un criblage à haut débit d’autres stratégies thérapeutiques, qui visent à inhiber directement l’interaction de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 avec hACE2, tels que les anticorps monoclonaux, les hACE2 solubles recombinants ou les inhibiteurs de la protéase, afin d’empêcher l’entrée virale23 . Avec l’émergence de plusieurs variantes de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2, il est également important de noter que cette méthode peut être appliquée pour déterminer si des niveaux de neutralisation similaires se produisent après une infection par différentes variantes du virus24.

D’autres exemples de méthodes disponibles pour détecter les anticorps contre le SRAS-CoV-2 comprennent les ELISA, les tests à base de lentivirus et les kits commerciaux pour évaluer la capacité neutralisante des échantillons de sérum. Bien que les ELISA de liaison aux IgM ou IgG couramment utilisés soient une méthode efficace pour déterminer la présence d’une concentration d’anticorps afin de suivre une infection ou une immunisation antérieure, ils sont incapables de distinguer la capacité neutralisante des anticorps de liaison25. Les tests de neutralisation pseudotypés à base de lentivirus ont un profil d’innocuité amélioré, en utilisant des particules virales non réplicatives par opposition à la réplication de VSV-S-eGFP; cependant, cela crée une barrière en termes de capacité de test car les titres lentiviraux ont tendance à être beaucoup plus faibles26,27. Il existe plusieurs trousses disponibles dans le commerce qui mesurent la capacité des anticorps à bloquer l’infection par inhibition concurrentielle de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 (RBD en particulier) se liant au récepteur hACE2 après l’incubation avec du sérum de convalescence (p. ex., CUSABIO, GenScript, Abnova). Bien que beaucoup de ces kits aient une sensibilité et une spécificité réputées, ils ont également tendance à être relativement coûteux et donc pas idéaux pour un grand volume d’échantillons. Le protocole fourni ici est rapide, fiable et peu coûteux. Cette méthode à haut débit peut être utilisée pour tester de nombreux échantillons, obtenant une lecture robuste en 24 heures.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents liés à cette publication.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le laboratoire Whelan d’avoir généreusement fourni le virus VSV-S-eGFP utilisé dans ce protocole (décrit dans Case et al. 2020). Nous remercions également les Drs Bill Cameron et Juthaporn Cowan (et leur équipe) d’avoir prélevé les échantillons de sang des patients (ID du protocole REB 20200371-01H). Les auteurs divulguent avoir reçu le soutien financier suivant pour la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article : Ce travail a été financé par le généreux soutien de la Fondation de l’Hôpital d’Ottawa et une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (no 448323) et une subvention rapide de la Fondation Thistledown pour la science covid-19 au C.S.I. T.R.J. est financée par une bourse d’études supérieures de l’Ontario et une bourse Mitacs de grappe. JP est financé par une bourse Mitacs de cluster. T.A. est financé par une bourse d’interdiction des IRSC. Nous tenons également à remercier toutes les personnes qui ont participé et donné leurs échantillons de sang pour cette étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

Immunologie et infection numéro 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Pseudovirus Anticorps neutralisants Virus de la stomatite vésiculeuse Glycoprotéine Spike
Détection des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide de l’imagerie fluorescente à haut débit de l’infection à pseudovirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter