Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning av SARS-CoV-2 Nøytraliserende antistoffer ved bruk av fluorescerende avbildning av pseudovirusinfeksjon med høy gjennomstrømning

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

Protokollen som er beskrevet her skisserer en rask og effektiv metode for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 spike protein ved å evaluere evnen til rekonvalesent serumprøver for å hemme infeksjon av et forbedret grønt fluorescerende proteinmerket vesikulær stomatittvirus pseudotyped med spike glykoprotein.

Abstract

Ettersom COVID-19-pandemien forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsetter å utvikle seg, har det blitt tydelig at tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer mot viruset kan gi beskyttelse mot fremtidig infeksjon. Således, etter hvert som opprettelsen og oversettelsen av effektive COVID-19-vaksiner fortsetter med en enestående hastighet, vil utviklingen av raske og effektive metoder for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 bli stadig viktigere for å bestemme langsiktig beskyttelse mot infeksjon for både tidligere infiserte og immuniserte individer. Dette dokumentet beskriver en protokoll med høy gjennomstrømning ved hjelp av vesikulær stomatittvirus (VSV) pseudotypet med SARS-CoV-2 spike protein for å måle tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer i rekonvalesent serum fra pasienter som nylig har kommet seg fra COVID-19. Bruken av et replikerende pseudotypet virus eliminerer nødvendigheten av et anlegg på nivå 3 som kreves for SARS-CoV-2-håndtering, noe som gjør denne protokollen tilgjengelig for praktisk talt alle inneslutningsnivå 2-laboratorier. Bruken av et 96-brønns format gjør det mulig å kjøre mange prøver samtidig med en kort behandlingstid på 24 timer.

Introduction

I desember 2019 ble det identifisert et nytt koronavirus, som vi nå kjenner som SARS-CoV-2, årsaksmiddelet til koronavirussykdommen 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 er et betacoronavirus som tilhører Coronaviridae-familien. Disse innkapslede virusene utgjør et stort positivt RNA-genom og er ansvarlige for luftveis- og tarminfeksjoner hos både mennesker og dyr2. Per mai 2021 har det vært mer enn 157 millioner rapporterte tilfeller av COVID-19 globalt og mer enn 3,2 millioner dødsfall3. Utviklingen av en effektiv vaksine har blitt det primære målet for forskere over hele verden med minst 77 prekliniske vaksiner under undersøkelse og 90 som for tiden gjennomgår kliniske studier4.

Koronavirus koder fire strukturelle proteiner, inkludert piggproteinet (S), nukleocapsid (N), konvoluttprotein (E) og membranproteinet (M). Oppføring av SARS-CoV-2 krever interaksjon av reseptorbindingsdomenet (RBD) til S med vertsreseptoren, human angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) og påfølgende membranfusjon etter proteolytisk spalting av vertscelle serinprotease, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9, 10,10 . Humoral immunodominans av S-proteinet til SARS-CoV har tidligere blitt rapportert og har nå også blitt vist for SARS-CoV-211,12,13. Faktisk har nøytraliserende antistoffresponser mot S blitt påvist i rekonvalesent serum fra SARS-CoV-pasienter 24 måneder etter infeksjon14, og fremhever deres kritiske rolle i den langsiktige immunresponsen. S-proteinet har blitt identifisert som et lovende vaksinemål og har dermed blitt en nøkkelkomponent i de fleste vaksiner under utvikling15,16.

Mens den raske påvisning av nøytraliserende antistoffer er et kritisk aspekt av vaksineutvikling, kan det også belyse infeksjonshastigheten og seroepidemiologisk overvåking i berørte områder17. En replikasjons-kompetent VSV pseudotypet med SARS-CoV-2 S glykoprotein, i stedet for wild-type VSV glykoprotein, for å studere SARS-CoV-2 infeksjon i biosikkerhet nivå 2 innstillinger ble vennlig donert av Whelan og medarbeidere18. VSV uttrykker spike (VSV-S) vil bli brukt til å bestemme nøytraliserende antistoff respons mot SARS-CoV-2 spike protein. Ettersom VSV-S som brukes her også uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), kan eGFP-foci påvises innen 24 timer for å kvantifisere infeksjon, mens plakkdannelse kan ta 48 til 72 timer. Oppsummert her er en enkel og effektiv protokoll for å bestemme evnen til rekonvalesens pasientserum for å nøytralisere VSV-S-eGFP-infeksjon. Denne metoden kan også enkelt tilpasses for å forhøre andre potensielle terapeutiske behandlinger som tar sikte på å forstyrre den verts-virale interaksjonen mellom SARS-CoV-2 S-protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plating celler (dag 1) for produksjon og kvantifisering av SARS-CoV-2 pseudovirus

  1. Forberedelse for vevskultur
    1. Varm 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% Fetal Bovine Serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (valgfritt); og 0,25% trypsin-etylendiamin tetraacetic acid (EDTA) til 37 °C i et vannbad i ca. 15 min.
    2. Desinfiser en vevskulturhette med 70% etanol, og plasser vevskulturretter, Pasteur pipetter og serologiske pipetter i vevskulturhetten etter behov. Fjern PBS, DMEM og trypsin fra vannbadet, og desinfiser med 70% etanol før du plasserer i vevskulturhetten.
  2. Plating og vedlikehold av celler
    1. Vokse Vero E6 celler i DMEM (inneholder 10% FBS) i T75 vev kultur kolber eller 15 cm vev kultur retter i en 37 °C inkubator med 5% CO2. Passer cellene etter behov når cellene er 80-90% sammenløp.
    2. Vask cellene ved å legge 10 ml 1x PBS til hver tallerken og forsiktig gynge 4-5 ganger; aspirere PBS. Tilsett 3 ml trypsin-EDTA i hver tallerken, gyng platen for å sikre at hele overflaten er dekket. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i ca. 5 minutter, eller til cellene har løsnet.
    3. Tilsett 7 ml DMEM (som inneholder 10% FBS) for å deaktivere trypsin, og resuspend cellene ved pipettering opp og ned flere ganger. Spinn ned cellene for å fjerne trypsin ved hjelp av en benkeplate sentrifuge ved 500 × g i 5 min, aspirere mediet uten å forstyrre cellepellet, og resuspend cellene i 10 ml DMEM (inneholder 10% FBS). Hvis det kreves celler for fremtidige eksperimenter, plasser 1 ml i en ny tallerken som inneholder 15 ml fersk DMEM (som inneholder 10% FBS).
    4. Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller eller hemocytometer, og tilsett ca. 1 × 107 celler til hver 15 cm plate, og inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 til de er 100 % konfluenens (1-2 dager).

2. VSV-S-EGFP pseudoviruspreparat

  1. Infeksjon
    1. Infiser celler ved multiplisitet av infeksjon (MOI) 0,01 med VSV-S-eGFP-lagervirus i 12 ml serumfri DMEM i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2, og gynger av og til platene. Bytt ut inokulumet med fersk DMEM (inneholder 2% FBS og 20 mM HEPES, pH 7.7), og flytt til en inkubator satt til 34 °C med 5 % CO2.
      MERK: Det kreves en temperatur på 34 °C for forplantning av VSV-S-eGFP i cellekulturen.
    2. Samle celle supernatanter ved observasjon av omfattende cytopatisk effekt (CPE) og celleavløsning, ca. 48 timer etter infeksjon. Bruk et fluorescerende mikroskop for å visualisere det omfattende uttrykket av eGFP av infiserte celler som starter ved 24 timers postinfeksjon.
  2. Samling
    1. Sentrifuger supernatantene ved hjelp av en sentrifuge på benken i 5 minutter ved 1000 × g ved 4 °C for å fjerne celleavfallet. Aliquot supernatant for å unngå flere fryse-tine sykluser, og lagre ved -80 °C.

3. Titering av VSV-S-eGFP pseudovirus

  1. Seriell fortynning for å bestemme viral titer
    1. Plate Vero E6 celler på 6-brønns plater med en sådd tetthet på 6 × 105 celler per brønn i DMEM (med 10% FBS), og inkubere over natten ved 37 °C med 5% CO2.
      MERK: Vero-celler som overekspresserer TMPRSS2 og hACE2 kan også brukes.
    2. Sett opp en 10 ganger seriell fortynningsserie av VSV-S-eGFP-viruset i kald serumfri DMEM ved å plassere 900 μL medier i syv mikrocentrifugerør. Etikettrør fra 1 til 7. Tilsett 100 μL av viral lager til det første røret og virvelen kort. Overfør 100 μL fortynnet virus fra rør 1 til rør 2 og virvel kort; fortsett til rør 7.
    3. Aspirer mediet fra alle brønnene i 6-brønnsplaten som inneholder Vero E6-celler, og erstatt med 500 μL fortynning10-2 til 10-7. Inkuber platene i 45 min ved 37 °C med 5 % CO2– gyng forsiktig hvert 15.
    4. Aspirer inokulumet og erstatt med overlegg som inneholder en 1:1-blanding av 2x DMEM og 6% karboksymetylcellulose (CMC), sluttkonsentrasjon på 3% CMC, supplert med 10% FBS; inkuber ved 34 °C med 5 % CO2 i 48 timer.
      MERK: Forvarm overleggsblandingen i et 37 °C vannbad i 15 minutter under infeksjonstrinnet. En 1:1 blanding av 1% agarose med 2x DMEM supplert med 10% FBS kan brukes i stedet for CMC. For å legge over med agarose, kok 1% agarose (i dH2O) og bland med kald 2x DMEM. Forsikre deg om at blandingen er en passende temperatur før du legger til cellemonolayeren (ca. 37-40 °C). Hvis agarose brukes til overlegget, må cellene festes ved å inkubere i 2 ml 3:1 metanol:eddiksyre i minst en time før farging.
  2. Farging og beregning av viral titer
    1. Visualiser plakk ved å fargelegge med krystallfiolett eller direkte visualisering av eGFP under et fluorescerende mikroskop.
    2. For å flekke plater, aspirer overlegget, vask en gang med PBS, legg deretter 2 ml 0,1% krystallfiolett (i 80% metanol og dH2O) til hver brønn. Plasser på en plate rocker i ca 20 min ved romtemperatur før avfarging. Fjern krystallfiolett, og vask forsiktig hver brønn to ganger ved hjelp av dH2O eller PBS.
      MERK: Vaske- og fargingstrinn bør utføres forsiktig ved å pipettere sakte mot siden av hver brønn for å sikre at cellemonolayeren forblir intakt gjennom hele prosedyren.
    3. La platene tørke i minst 1 time før du teller plakk. Påse at plakktellinger oppnås fra brønner som inneholder 20 til 200 plakk. For å beregne virusets titer i plakkdannende enheter (PFU) per ml, multipliser fortynningsfaktoren til brønnen som telles med infeksjonsvolumet, og del dette tallet fra plakkene som er tilstede i den respektive brønnen.
      Equation 1

4. Plating celler (dag 1) for måling av nøytralisering av SARS-CoV-2 pseudovirus ved kommersielt tilgjengelige antistoffer og rekonvalesensende pasientserum

  1. Forberedelse for vevskultur
    1. Forbered middels og vevskultur hette som beskrevet i avsnitt 1. I tillegg forbereder du det nødvendige antallet 96 brønnplater for å imøtekomme minst 2 repliker per prøve (dvs. 1 plate per 6 prøver); legg til flere replikeringer hvis eksempelvolumet tillater det.
  2. Plating og vedlikehold av celler
    1. Vokse og vedlikeholde Vero E6-celler som beskrevet i avsnitt 1. Forbered minst 10 ml celleoppheng per 96-brønnsplate i en konsentrasjon på 2 × 105 celler per ml (plate 1,5 × 105 celler per ml for analyser utført etter 48 timer, om nødvendig). Tilsett 100 μL celleoppheng i hver brønn på en 96-brønnsplate ved hjelp av en flerkanals pipette, og inkuber i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
      MERK: Bland celleopphenget godt, og berg hver plate forsiktig i alle retninger for å sikre jevn fordeling av celler.

5. Antistoff- eller serumfortynning og infeksjoner (dag 2)

MERK: Denne protokollen kan brukes til å måle nøytraliseringen av VSV-S-eGFP av både kommersielt tilgjengelige antistoffer og pasientserum, samt serum samlet inn fra dyr for prekliniske vaksineutviklingsstudier. *Vær oppmerksom på de ekstra trinnene som er oppført ved håndtering av serumprøver for pasienter/dyr.

  1. Seriell fortynningsserie
    1. Før du fortynner serumprøver, må du varmeaktivere hver prøve i et 56 °C vannbad i 30 minutter for å inaktivere komplement. Sørg for at nødvendige sikkerhetsforanstaltninger tas ved håndtering av pasientprøver; kun åpne prøvebeholdere når du er i vevskulturhetten, og sørg for at passende inneslutningsnivå 2 personlig verneutstyr er slitt.
    2. Sett opp fortynningsserien i en tom 96-brønnsplate (plate 1).
    3. Begynn alle fortynning i rad A på 96-brønnsplaten i 80 μL. *For pasientprøver begynner du fortynningsserien ved 1 av 10 ved å plassere 8 μL serum i 72 μL serumfri DMEM (med 1 % penicillin/streptomycin).
      MERK: Konsentrasjonen av nøytraliserende antistoff som brukes vil avhenge av aktiviteten som er spådd av produsenten. For SARS-CoV-2 Spike nøytraliserende antistoff som brukes her (se materialtabellen), start med 5 μg/ml for å observere minst 50 % nøytralisering.
    4. Tilsett 40 μL serumfri DMEM (med 1% penicillin/streptomycin) i rad B til G, og 80 μL til rad H. Ikke legg til virus i rad H, da det fungerer som en ren cellekontroll.
    5. Bruk en 12-brønns flerkanals pipette, bland og overfør 40 μL fortynnet serum eller antistoff fra rad A til rad B. Bland og gjenta til rad F, kast 40 μL fra rad F. Ikke legg til serum i rad G, da det representerer den virusfrie kontrollraden.
  2. Infeksjon og overlegg
    1. Forbered et passende volum fortynnet VSV-S-eGFP for å behandle hver brønn ved MOI 0,05 (eller 2000 pfu). (Når du fullfører denne beregningen, husk at bare 60 μL av det totale volumet på 80 μL vil bli flyttet til cellene; sørg derfor for å multiplisere volumet av viruset med 1,33 for å opprettholde 2000 pfu).
      MERK: Siden VSV-S-eGFP er temperaturfølsom, må du sørge for at viruslagrene forblir på is når de ikke er i bruk, og unngå flere fryse-tine sykluser som titers vil variere etter gjentatt frysing.
    2. Tilsett 40 μL fortynnet virus til hver brønn i rad A til G av plate 1 og bland ved å pipettere opp og ned 4-5 ganger. Inkuber platen i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2.
    3. Fjern platen som inneholder celler fra inkubatoren (plate 2), og aspirer forsiktig mediet fra alle brønner. Overfør 60 μL antistoff/virusblanding fra plate 1 til plate 2, og inkuber i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2, gyng platen hver 20.
    4. Fyll opp hver brønn med 140 μL overlegg som inneholder CMC i DMEM for en endelig konsentrasjon på 3% CMC (med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin). Plasser plate 2 i en inkubator satt til 34 °C med 5 % CO2 i ca. 24 timer før avbildning.
      MERK: Forvarm overleggsblandingen i et 37 °C vannbad i 15 minutter under infeksjonstrinnet.

6. Avbildning og kvantifisering (dag 3)

  1. Bildeplater ved hjelp av en automatisert fluorescerende imager (ved hjelp av et fluorescein isothiocyanate (FITC) filter eller et alternativt filter med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm). Kvantifisere virusinfeksjon ved å opprette en protokoll som automatisk identifiserer og teller individuelle eGFP-foci. Hvis en funksjon for automatisk telling ikke er tilgjengelig, bruker du ImageJ-programvare til å kvantifisere antall eGFP-foci.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen skisserer en rask og effektiv metode for å oppdage nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 S-protein via hemming av VSV-S-eGFP pseudovirusinfeksjon (kvantifiserbar ved tap av eGFP-foci oppdaget). En skjematisk representasjon av protokollen er vist i figur 1. Det anbefales at et kommersielt tilgjengelig antistoff brukes som en positiv kontroll hver gang analysen kjøres for å sikre konsistensen av analysen. Her demonstrerer vi en fortynningskurve ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig nøytraliserende IgG-antistoff mot SARS-CoV-2 Spike RBD sammenlignet med en IgG-kontroll (se materialtabellen for detaljer om begge antistoffene; Figur 2).

Rekonvalesenspasientprøver ble samlet inn omtrent tre måneder etter SARS-CoV-2-infeksjon, og pseudovirusnøytralisering ble bestemt ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor (figur 3). Det er viktig at minimal bakgrunnshemming ble observert ved hjelp av sunt donorserum. Videre skiller denne analysen mellom pasienter med høy symptom alvorlighetsgrad kontra de med mildere sykdom basert på behovet for sykehusinnleggelse. I tråd med andre rapporter har vi observert i vår lille kohort at innlagte pasienter har en tendens til å demonstrere økt nøytraliserende kapasitet enn de som ikke krevde sykehusinnleggelse19,20. Selv om dette kanskje ikke alltid er tilfelle for innlagte versus ikke-innlagte pasientprøver, er analysens evne til å skille mellom varierende grad av nøytralisering en ressurs. Det kan også være tilfeller der det nøytraliserende evnen til pasientserumet er mye høyere enn de som er demonstrert her. Om nødvendig kan startfortynning av pasientserum justeres, eller ytterligere fortynningstrinn kan utføres på en ekstra plate.

Figure 1
Figur 1: Protokolldisposisjon som demonstrerer nøytralisering av VSV-S-eGFP ved rekonvalesensserterum. Forkortelser: VSV = vesikulær stomatittvirus; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; COVID-19 = koronavirussykdom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Et kommersielt tilgjengelig nøytraliserende antistoff mot SARS-CoV-2 har blitt brukt som et eksempel på en positiv kontroll sammen med IgG som negativ kontroll. Evnen til å nøytralisere antistoffer for å hemme virusinfeksjon vil variere; se informasjonen som er tilgjengelig for det spesifikke antistoffet som er kjøpt for å avgjøre hvilken konsentrasjon som skal begynne fortynningskurven (prøver ble kjørt i triplikat, feilstenger representerer ± SD). (A) Prosent hemming er beregnet basert på antall eGFP foci oppdaget via (B) fluorescerende avbildning. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; IgG = immunglobulin; SD = standardavvik; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; RBD = reseptorbindingsdomene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Rekonvalesenssenterumets evne til å nøytralisere VSV-S-eGFP varierer avhengig av alvorlighetsgraden av symptomene. Pasientserumprøver ble samlet inn ca. 3 måneder etter SARS-CoV-2-infeksjon, og kontrollprøver ble samlet inn fra uinferte pasienter (prøver ble kjørt i triplikat, feilfelt representerer ± SD). (A) Prosent hemming er beregnet basert på antall eGFP foci oppdaget via (B) fluorescerende avbildning. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; SD = standardavvik; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som beskrives her, kan tilpasses ulike laboratoriemiljøer og ressurser etter behov. Viktigst, hovedbegrensningen av denne protokollen er nødvendigheten av en inneslutning nivå 2 plass og vev kultur hette. Anvendelsen av et replikering av RNA-virus pseudotypet med SARS-CoV-2-spissen, for eksempel VSV-S-eGFP, er et formidabelt alternativ til SARS-CoV-2-viruset, som krever et inneslutningsnivå 3 arbeidsområde, men kan forbli en begrensning for noen grupper. Alle andre trinn som er beskrevet her, er ganske fleksible og kan utføres i nesten alle inneslutningsnivå 2-laboratorier. For eksempel er det ikke nødvendig å bruke en fluorescerende imager med en automatisert tellefunksjon. 96-brønnsformatet som brukes her betyr at bare ca. 4 synsfelt er nødvendig for å avbilde nesten hele brønnen ved hjelp av det laveste tilgjengelige målet (2x).

Et manuelt fluorescerende mikroskop kan brukes til å avbilde flere felt av hver brønn, og ImageJ (fri programvare) kan deretter brukes til å kvantifisere eGFP foci. I tillegg har vi valgt å bruke 96-brønnsformatet til å bruke det laveste volumet av serum som mulig, samt holde forbruksbruken på et minimum. Hvis et fluorescerende mikroskop ikke er tilgjengelig, kan denne protokollen skaleres opp til et 6- eller 12-brønns format for å oppdage plakkdannelse etter krystallfiolett fiksering og farging (ligner viral titerprotokollen beskrevet ovenfor). Den mest kritiske vurderingen å huske på når du utfører denne protokollen, er temperaturfølsomheten til VSV-S-eGFP. Når du arbeider med VSV-S-eGFP, må du alltid aliquot viruset i små mengder for å unngå flere fryse-tine sykluser, og holde viruset på is når det er mulig. I tillegg kan robust fluorescerende signal oppdages etter 24 timer; Vi har imidlertid fått lignende resultater etter avbildning ved 20 til 28 timer etter infeksjon.

Det finnes flere metoder for å oppdage tilstedeværelsen av antistoffer mot SARS-CoV-2, inkludert den gullstandard enzymbundne immunosorbente analysen (ELISA), som kvantifiserer den totale mengden antistoffer mot S21,22. Her har vi skissert en rask og pålitelig metode for å spesifikt oppdage nøytraliserende antistoffer mot det immunodominante SARS-CoV-2 spike proteinet i rekonvalesent serum fra pasienter. Vi har forbedret den klassiske plakkreduksjonsnøytraliseringstesten (PRNT) ved å tilpasse oss et 96-brønns format, noe som gjør det mulig å oppdage nøytraliserende antistoffer i et stort antall prøver innen 24 timer ved automatisert kvantifisering av pseudovirusinfeksjon, noe som muliggjør rask behandling av endelige datarapporter. I tillegg til å oppdage nøytraliserende antistoffer i serum, kan denne metoden tilpasses for å utføre høy gjennomstrømningsscreening av andre terapeutiske strategier, som tar sikte på å direkte hemme SARS-CoV-2 spike proteininteraksjon med hACE2, for eksempel monoklonale antistoffer, rekombinant løselig hACE2, eller proteasehemmere, for å hindre viral oppføring23 . Med fremveksten av flere SARS-CoV-2 spike proteinvarianter, er det også viktig å merke seg at denne metoden kan brukes til å avgjøre om lignende nøytraliseringsnivåer oppstår etter infeksjon med forskjellige varianter av viruset24.

Andre eksempler på tilgjengelige metoder for å oppdage antistoffer mot SARS-CoV-2 inkluderer ELISAer, lentivirusbaserte analyser og kommersielle sett for å evaluere nøytraliserende kapasitet for serumprøver. Mens de ofte brukte IgM- eller IgG-bindende ELISA-ene er en effektiv metode for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffkonsentrasjon for å spore tidligere infeksjon eller immunisering, er de ikke i stand til å skille de bindende antistoffenes nøytraliserende kapasitet25. Pseudotypede lentivirusbaserte nøytraliseringsanalyser har en forbedret sikkerhetsprofil ved å bruke ikke-replikerende viruspartikler i motsetning til å replikere VSV-S-eGFP; Dette skaper imidlertid en barriere når det gjelder testkapasitet, da lentivirale titere har en tendens til å være mye lavere26,27. Det finnes flere kommersielt tilgjengelige sett som måler antistoffenes evne til å blokkere infeksjon via konkurransedyktig hemming av SARS-CoV-2 spikeprotein (RBD spesielt) binding med hACE2-reseptoren etter inkubasjon med rekonvalesent serum (f.eks. CUSABIO, GenScript, Abnova). Mens mange av disse settene har anerkjent følsomhet og spesifisitet, har de også en tendens til å være relativt dyre og derfor ikke ideelle for et stort volum prøver. Protokollen som tilbys her er rask, pålitelig og billig. Denne metoden for høy gjennomstrømning kan brukes til å teste mange prøver, og oppnå en robust avlesning innen 24 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser knyttet til denne publikasjonen.

Acknowledgments

Vi vil takke Whelan lab for sjenerøst å gi VSV-S-eGFP-viruset som brukes i denne protokollen (beskrevet i Case et al. 2020). Vi takker også Drs. Bill Cameron og Juthaporn Cowan (og team) for å samle inn pasientblodprøvene (REB-protokoll-ID 20200371-01H). Forfatterne avslører mottak av følgende økonomiske støtte til forskning, forfatterskap og / eller publisering av denne artikkelen: Dette arbeidet ble finansiert av den sjenerøse støtten fra Ottawa Hospital Foundation og et stipend fra Canadian Institutes of Health Research (#448323) og et Fast Grant fra Thistledown-stiftelsen for COVID-19 Science til C.S.I. T.R.J. er finansiert av et Ontario Graduate Scholarship og cluster Mitacs fellowship. JP er finansiert av en klynge Mitacs fellowship. T.A. er finansiert av et CIHR Banting Fellowship. Vi vil også takke alle personene som deltok og donerte blodprøvene sine for denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Pseudovirus Nøytraliserende antistoff Vesicular stomatittvirus Spike glykoprotein
Påvisning av SARS-CoV-2 Nøytraliserende antistoffer ved bruk av fluorescerende avbildning av pseudovirusinfeksjon med høy gjennomstrømning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter