Summary
Biyomembran kuvvet probu (BFP), yerinde dinamik kuvvet spektroskopisi (DFS) tekniğidir. BFP, canlı hücreler üzerindeki moleküler etkileşimlerin yay sabitini ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol, BFP tarafından tespit edilen moleküler bağlar için yay sabit analizi sunar.
Abstract
Bir biyomembran kuvvet sondası (BFP) son zamanlarda tek moleküler bağlayıcı kinetiği ölçebilen, ligand-reseptör etkileşimlerinin mekanik özelliklerini değerlendirebilen, protein dinamik konformasyonel değişiklikleri ve daha heyecan verici bir şekilde elucidate reseptör aracılı hücre mekanosensing mekanizmalarını değerlendirebilen bir yerli hücre yüzeyi veya yerinde dinamik kuvvet spektroskopisi (DFS) nanotool olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, BFP moleküler bağların yay sabitini ölçmek için kullanılmıştır. Bu protokol, moleküler yay sabit DFS çözümlemesi gerçekleştirmek için adım adım yordamı açıklar. Özellikle, boncuk hücresi ve boncuk-boncuk modları olmak üzere iki BFP çalışma modu tartışılır. Bu protokol, moleküler bağın ve hücrenin yay sabitlerini DFS ham verilerinden türetme üzerine odaklanır.
Introduction
Canlı hücreli bir DFS tekniği olarak, BFP bir insan kırmızı kan hücresi (RBC; Şekil 1) 0.1-3 pN/nm 1,2,3'te uyumlu bir yay sabit aralığına sahip ultra duyarlı ve ayarlanabilir bir kuvvetdönüştürücüye. Ligand-reseptör etkileşimini araştırmak için BFP, DFS ölçümlerini ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) ve ~0,5 ms(10 -3 s) kuvvet, mekansal ve zamansal çözünürlük4,5'te etkinleştirir. Deneysel konfigürasyonu iki karşıt mikropipetten oluşur, yani Prob ve hedef. Prob mikropipette bir RBC'yi aspire eder ve bir boncuk, biotin-streptavidin etkileşimi yoluyla tepe noktasında yapıştırılır. Boncuk, ilgi çekici ligand ile kaplanmıştır (Şekil 1A). Hedef mikropipette, sırasıyla Boncuk Hücresi (Şekil 1B) ve Boncuk-Boncuk ( Şekil 1C ) modlarına karşılık gelen,ilgi çekiciyi taşıyan bir hücre veya boncuk aspireeder.
BFP inşaat, montaj ve DFS deneysel protokolleri daha önce ayrıntılı olarak açıklanmıştır1,6. Kısaca, bir BFP dokunma döngüsü 5 aşamadan oluşur: Yaklaşım, impinge, temas, geri çekme ve ayrışma (Şekil 1D). Yatay RBC apeks konumu ΔxRBColarak gösterilir. Başlangıçta, paysız (sıfır kuvvet) RBC deformasyonu ΔxRBC 0'dır( Tablo 1 ). Hedef daha sonra bir piezotranslator tarafından Prob boncuk üzerinde impinge ve geri çekmek için tahrik edilir (Şekil 1D). RBC probu ilk olarak Hedef tarafından negatif RBC deformasyonu ΔxRBC < 0 ile sıkıştırılır. Bir Bond olayında, Geri Çekme aşaması pozitif RBC deformasyonu Δ x RBC> 0(Şekil 2C ve D)ile bir basınçtan çekme faza geçiş yapar. Hooke yasasına göre, BFP rulman kuvveti F = kRBC × ΔxRBColarak ölçülebiliyor, burada kRBC ( Tablo1) BFP'nin RBC yay sabitidir. Bağ yırtılması ve bir dokunma döngüsünün tamamlanması üzerine, prob boncuk ΔxRBC = 0 (Şekil 1D)ile sıfır kuvvet konumuna geri döner.
kRBC'yibelirlemek için, prob mikropipette iç deliğin (Rp), RBC ( R0) ve RBC ile prob boncuk arasındaki dairesel temas alanının (Rc) radiisini ölçüp kaydederiz (Şekil 1A). Daha sonra kRBC, Evan'ın modeline göre hesaplanır (Eq.1) 7,8, BFP ' yi çalıştırmak için sanal bir enstrüman (VI) görevi görür bir LabVIEW programı kullanılarak ( ŞekilS1A)8,9.
(Eş. 1)
Kurulan bir BFP ve elde edilen DFS ham verileri ile ligand-reseptör çiftinin veya hücrelerinin yay sabitinin nasıl analiz edildiğini sunuyoruz. Glikosillenmiş protein Thy-1 ve K562 hücreli integrin α 5 β1(Thy-1-α 5 β1' in etkileşimineilişkinDFSham verileri; Şekil 3A ve 3B)10 ve fibrinojen ve boncuk kaplı integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Şekil 3C) 11,12 sırasıyla Boncuk Hücre ve Boncuk-Boncuk analiz modlarını göstermek için kullanılmıştır.
BFP Deneysel Hazırlık
BFP deneysel hazırlık ve enstrümantasyonunun ayrıntıları için lütfen daha önce yayınlanan protokollere bakın3. Kısacası, insan RBC karbon/bikarbonat tamponunda Biotin-PEG3500-NHS kullanılarak biyotinillenmiştir. İlgi çekici proteinler, fosfat tamponunda MAL-PEG3500-NHS kullanılarak borosilikat cam boncuklarla birlikte tanımlanmıştır. Biyotinillenmiş RBC'ye bağlanmak için, prob boncuk ayrıca MAL-SA kullanılarak streptavidin (SA) ile kaplanır. Lütfen Malzeme Masası ve Tablo 2'yebakın.
BFP'yi monte etmek için (Şekil 1, sol), prob boncuklarını teslim etmek ve RBC'nin apeksi1,3'e yapıştırmak için 'Yardımcı' olarak adlandırılan üçüncü mikropipette kullanılacaktır. SA kaplamalı prob boncuk ve biyotinilasyonlu RBC arasındaki etkileşim, ligand-reseptör bağından çok daha güçlüdür. Bu nedenle, Ayrışma aşaması, Prob boncukunun RBC'den kopuşundan ziyade ligand-reseptör bağı kopuşsu olarak yorumlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Çözümlenebilir DFS Olayları Elde Edin
- BFP kontrolü ve parametre ayarı(Şekil S1A)için deneyi yazılımda (örneğin LabVIEW VI) başlatın.
- BFP Monitörü(Şekil S1B)yazılımında tekrarlayan prob boncuk hedef boncuk / hücre dokunuşlarını gözlemleyin.
- DFS yapıştırma olayının ≥% 89'unun tek bir bağ tarafından aracılık ≤ sağladığı impingement kuvvetini ve temas süresini ayarlayarak ilk 50 dokunuşta%20yapışıklık sıklığını test edin ve elde edin 12,13,14.
NOT: Her Boncuk Hücre/Boncuk çifti için 200 tekrarlayan dokunma döngüsü gerçekleştiriyoruz. Yayınlanabilir veri kalitesi elde etmek için genellikle 3 Boncuk Boncuk veya Boncuk Hücre çifti ≥ gerçekleştiriyoruz.- Verileri, BFP denetimi ve parametre ayarı için yazılım tarafından istenilen, her çiftin sonuna kadar Kullanıcı tarafından yönlendirilen klasöre Zorla ve Zaman şeklinde kaydedin.
- Şekil 2A'daörneklenerek Bond olaylarının Kuvvet ve Zaman ham verilerini BFP alım platformunu (Şekil S1C)kullanarak toplayın.
- BFP veri analizi yazılımını açın. Sarı klasör simgesine tıklayın ve ilgili ham veri dosyasını çift tıklayarak seçin.
- Programı çalıştırın ve olaylar arasında geçiş yapmak için yukarı ve aşağı düğmesini tıklatın. Geçersiz olayları taramak için aykırı dışlama ölçütlerini (Şekil S2)kullanın. Dışa aktarma veri türünü Zorla ve Zaman biçimi olarak seçin ve Çizim Verilerini Dışa Aktar düğmesini tıklatın.
2. Kuvvet ve Zaman Eğrisini Kuvvet ve Yer Değiştirme Eğrisine Dönüştürün
- Geri Çekme aşamasına karşılık gelen veri segmentini, yay sabit analiziyle ilgili bir elektronik tabloya (Şekil 2A, kare seçim çerçevesi) dışa aktarın.
- Elektronik tablo yazılımını kullanarak Kuvvet ve Zaman Eğrisi karşılaştırmasını çizin. Ayırmaya karşı Kuvvet eğrisini elde etmek için, zaman değerlerini piezo hareket hızıyla (yani, önceden ayarlanmış olarak 4.000 nm/sn) çarparak zaman değerlerini(Şekil 2A, x -eksen) toplam yer değiştirme değerlerine (Δxtot)dönüştürün.
- Alınan her yer değiştirme değerinden en küçük öteleme değerini çıkararak ilk veri noktasını sıfırla. Bu yatay dönüşüm, Geri Çekme aşamasının yükselen eğimlerini veya sonraki yay sabit hesaplamasını etkilemez.
- Özellikle, BFP, Δ xtot ( Tablo 1 ) RBC, ΔxRBC ( Tablo1), moleküler bağ, Δxmol ( Tablo1) ve Hedef hücre, Δxhücresi (Tablo 1), Eq. 2 olarak toplam deformasyonlarını toplayan bir seri yay sistemi olarak kabul edilir:
(Eş. 2) - Şekil 2B'degösterildiği gibi Kuvvet (F) ve Yer Değiştirme (Δxtot) eğrisini çizin.
(Eş. 2)3. Boncuk Hücre Modunun İlkbahar Cnstant Analizi
- Kuvvet ve Yer Değiştirme eğrisinde, her birinin basınç fazını ve çekme fazını temsil edebileceği iki farklı eğim tanımlanabilir. Her veri grubuna bir regresyon çizgisi takın (Şekil 2B), burada daha büyük doğrusal oturma eğimi basınçlı fazda toplam yay sabitini temsil eder (Şekil 2B, kırmızı), k1 (Tablo 1) olarak gösterilir; ve daha küçük lineer oturma eğimi, tenslile fazdaki toplam yay sabitini temsil eder (Şekil 2B, mavi), k2 (Tablo 1) olarak açıklamalandırılmıştır.
- Adım başına seri olarak bağlanan yaylar için 2.2 açıklama, toplam yay sabitinin, ktot ( Tablo 1 ), RBC, kRBC (Tablo 1), moleküler bağ, kmol (Tablo 1) ve Hedef hücre, k hücresi (Tablo 1) bahar sabiti terslerinin toplamı olarak karşılıklı ifade edin. Boncuk Hücre modunun basınçlı fazı sırasında moleküler bağ gerilmez, bu nedenle kmol dikkate alınmaz. K tot'un bu senaryodaki karşılığı (1/k1)
(Eş. 3).
Örnek verilerde, kRBC önceden belirlenir (varsayılan olarak 0,25 pN/nm). khücresi, elde edilen k 1 ve kRBC ( Şekil3B)ile Eş3'ten türetilebilir. - Gerilme aşamasında ligand-reseptör çifti arasında yapıştırma oluşur. Bu senaryoda ktot'un karşılıklısını ifade edin (1/k2)
(Eş. 4)
burada k2 (Tablo 1) çekme aşamasında toplam yay sabitini temsil eder. - 1/ k1'i 1/k2'den çıkarmaktank moltüretin (Eş. 3 ile Eş. 4'ü karşılaştırın).
(Eş. 3).
(Eş. 4)4. Boncuk- Boncuk Modunun Bahar Sabit Analizi
- k1 'i elde etmek için basınç fazı verilerine bir regresyon hattı takın (Şekil 2B, kırmızıyabenzer). Not olarak, Boncuk-Boncuk modunda, Hedef hücre, ilgi çekici ile kaplanmış bir cam boncuk ile değiştirilir (Şekil 1C). Boncuk deformasyonu ihmal edilebilir olduğundan, 1/khücre terimi Ayt. 3 ve Eş. 4'ten buna göre çıkarılabilir. Basınç fazının karşılıklı ktot 'u (1/k1)aşağıdaki gibi ifade edilebilir:
(Eş. 5) - k2 'yi elde etmek için çekme fazı verilerine bir regresyon çizgisi takın (Şekil 2B, maviyebenzer). Çekme fazının karşılıklı ktot 'u (1/k2)şu şekilde ifade edilebilir:
(Eş. 6) - 1/ k1'i 1/k2'den çıkarmaktank moltüretin (Eq. 5 ile Eq. 6'yi karşılaştırın).
(Eş. 5)
(Eş. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada BFP bahar sabit analizinin protokolünü ortaya koyduk. Boncuk Hücresi analiz modu için, Prob boncuk üzerine kaplanmış glikosillenmiş protein THY-1 ile HedefK562hücresinde ifade edilen 5 β1 α integrin arasındaki moleküler bağın kmol'ını analiz ettik (Thy-1-integrin α5β1; Şekil 3A) 10. Khücresi ayrıca Boncuk Hücresi modundan (K562 Hücresi; Şekil 3B). Boncuk-Boncuk modu için, fibrinojen ve integrin αIIbβ3 (FGN-integrin αIIbβ3arasında oluşan moleküler bağ; Şekil 3C) Boncuk-Boncukanaliz modunu göstermek için 11,12 kullanılır.
Boncuk Hücre modu için, Thy-1-integrin yay sabitlerini 5 β 1bağ veK562hücresi α kmol = 0,45 ± 0 olarak ölçtük. Önceden taranmış 27 analiz edilebilir olaydan 28 pN/nm (Şekil 3A) ve khücresi = 0,18 ± 0,07 pN/nm (Şekil 3B). Boncuk-Boncuk modu için, önceden taranmış33 analiz edilebilir olaydan FGN-integrin αIIbβ 3 bağınınyay sabitlerini kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm (Şekil 3C) olarak ölçtük.
| Sembol | Tanım | Sembol | Tanım |
| Δxtot | Piezo'nun toplam yer değiştirmesi, RBC, hedef hücre ve moleküler bağın toplam deformasyonu olarak da yorumlanabilir. | ΔxRBC | Prob boncukunun yer değiştirmesi olarak da yorumlanabilen RBC deformasyonu. |
| ktot | Tüm BFP seri yay sisteminin toplam yay sabiti. | kRBC | Prob mikropipette tarafından aspire edilen RBC'nin yay sabiti. |
| kmol | BFP'nin yay sabiti moleküler bağ tespit edildi | khücresi | Hedef hücrenin yay sabiti. |
| k1 | kgeri çekme aşamasındaki basınç fazının tot. | k2 | Geriçekme aşamasındaki çekme fazının ktot. |
| ΔF1 | Basınç fazında Prob boncuk tarafından algılanan kuvvet artışı. | ΔF2 | Gerilme aşamasında Prob boncuk tarafından algılanan kuvvet artışı. |
| Δx1 | Basınç fazında yer değiştirme artışı. | Δx2 | Gerilme aşamasında yer değiştirmenin artışı. |
Tablo 1. BFP moleküler yay sabit analizi için sembol tanımları. Tüm nesnelerin yatay konumları xolarak tanımlanırken, Δx [nm] orijinal konuma göre deformasyonu ifade eder. ΔF [pN], BFP ile ölçülen kuvvet artışı anlamına gelir. k [pN/nm] yay sabitini ifade eder. 1 ve 2 alt simgeleri sırasıyla basınç ve çekme aşamalarına karşılık gelir. Moleküler yay sabiti Kuvvet (F)vs. Öteleme (Δxtot)eğrisi.
Şekil 1: BFP yapılandırması ve DFS dokunma döngüsü. (A) BFP sistemi iki karşıt mikropipetteyi birleştirir, yani Prob (sol) ve Hedef (sağ). Prob mikropipette, bir kuvvet dönüştürücüsü olarak hizmet etmek için apeksine yapıştırılmış bir cam boncuk ile bir RBC(kırmızı)aspire eder. Hedef mikropipette reseptör taşıyan bir hücreyi(mavi)aspire eder. RBC yay sabiti (kRBC) aspirasyon basıncı (Δp) ve emişli RBC (R0), Prob mikropipette (Rp) ve RBC ile Prob boncuk arasındaki dairesel temas alanının(Rc) yarıçapı ile belirlenir. (B ve C) Boncuk Hücre (B) ve Boncuk Boncuk (C) BFP modlarının mikrografileri. Ölçek çubukları = 5 μm. (D) Yaklaşım, impinge, temas, geri çekme ve ayrıştırma aşamalarından oluşan bir BFP dokunma döngüsü. ΔxRBC = 0 tire çizgisi, BFP'nin payandasız veya sıfır kuvvetli konumunu gösterir. Geri çekme aşaması sırayla basınç fazı (ΔxRBC < 0, kırmızı),sıfır kuvvet pozisyonu (ΔxRBC = 0, siyah)ve çekme fazı (ΔxRBC > 0, mavi)içerir. Siyah ok Bond olayının konumunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DFS ham verilerinden moleküler yay sabitleri türetin. (A) Temsili Kuvvet (F) ve DFS ham verilerinin zaman (t) eğrisi bir BFP dokunma döngüsünde. (B) Geri Çekme aşamasını gösteren temsili dönüştürülmüş Kuvvet (F) ve Yer Değiştirme (Δxtot) eğrisi. k1 ve k2 sırasıyla ardışık basınç ve çekme fazlarının uygun eğimini temsil eder. ΔF1 ve ΔF2, sırasıyla basınç fazındaki kuvvet artışlarını ve gerilme fazı verilerini temsil eder, burada Δx1 ve Δx2, sırasıyla basınç fazındaki yer değiştirme artışlarını ve gerilme fazı verilerini temsil eder. İyi istatistiksel uygunluğu belirtmek için basınçlı aşamada(R12)ve çekme fazında(R2 2 2)yay sabiti için R2değerleri etiketlenir. (C ve D) Boncuk Hücresi (C) ve Boncuk-Boncuk (D) deneysel modlarındaki Geri Çekme aşamasının çizimleri. kRBC, RBC'nin yay sabitini temsil eder; khücre ve kmol sırasıyla Hedef hücrenin ve moleküler bağın yay sabitlerini temsil eder. Gerilme aşamasında, ligand-reseptör çifti arasında yapıştırma oluşur, RBC, piezo'nun sıfır kuvvet pozisyonunun ötesine çekilmesiyle aynı yönde sapır (ΔxRBC > 0). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BFP ölçülen yay sabitlerinin temsili histogramları. Boncuk Hücre modundaThy-1-integrinα 5 β 1 bond (A) veK562Target hücresi (B) ve Boncuk-Boncuk modundaIIbβ3 bond (C) α FGN-integrin için ölçülen yay sabitlerinin olay numarası (soly ekseni)ve frekans dağılımı ( sağy ekseni). Histogramlar Gauss dağılım eğrisine(pembe)uygundur ve istatistiksel parametre olan R2,fitness'ın gücünü belirtmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S1: Ev yapımı BFP arayüzü. (A) BFP kontrolü ve parametre ayarı arayüzü. RBC yay sabitini belirlemek için parametreler biyofiziksel parametreler panelinden girilir. (B) BFP izleme. Canlı BFP dokunma döngüleri bu kamera görünümünden gözlemlenecektir. (C) Kuvvet (F) ve Zaman (t) eğrilerinin çevrimdışı olarak gözden geçirildiği ve sonraki moleküler yay sabit analizi için önceden işlendiği BFP DFS analiz arayüzü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S2. BFP analiz edilebilir veri kalitesi kontrolü ve ön eleme kriterleri. (A) Yüksek kalitede iyi DFS olayları: (i) Boncuk Hücreli yırtılma kuvvet olayı; (ii) Boncuk Hücre yaşam boyu olayı; (iii) Boncuk-Boncuk kopma kuvveti olayı; (iv) Boncuk-Boncuk yaşam boyu olay. (B) Bazı gürültü ile kabul edilebilir DFS olayları: (i) Veri sürüklenmesi ancak yakınlaştırma Geri Çekme aşaması geçerliliğini korur; (ii) Tahvil ayrışması sonrası hafif veri sürüklenmesi; (iii) Sıfır kuvvet rejiminde veri bükülmesi; (iv) Tutma kuvveti küçüktür (< 10 pN). (C) Atılması gereken kalitesiz olaylar: (i) Yapıştırma yok; (ii) Veri salınımı; (iii) Her zaman sürüklenen veriler; (iv) Süreksiz veriler; (v) Basınç kuvveti çok küçük (≈ 0 pN); (vi) Çoklu bağlar; (vii) Türetilmiş kmol < 0 ile geçersiz veriler; (viii) Sinyal hatası. Sıfır kuvvet gri aralıklı çizgi ile gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özetle, BFP Boncuk-Boncuk ve Boncuk Hücre analiz modlarında DFS ham verilerinin ön işlemesi ve moleküler yay sabitlerinin türetilmesi için ayrıntılı bir veri analizi protokolü sağladık. Moleküler ve hücresel yay sabitlerinin belirlenmesi için gerekli biyomekanik modeller ve denklemler sunulmuştur. Farklı integrinler çalışılmış olsa da, Boncuk-Boncuk modu ve Boncuk Hücresi modu ile ölçülen kmol önemli aralık farklılıklarına sahiptir(Şekil 3A ve Şekil 3C). Not olarak, Boncuk-Boncuk modu ile reseptör, cam boncukla birlikte bağlanır. Buna karşılık, Boncuk Hücre modu ile yüzey reseptörü, büyük olasılıkla ölçülen kmol'uetkileyen alttaki plazma zarı ve sitoskeletonlar tarafından uyarlanır.
Veri kalitesi kontrolü, tekrarlanabilirliği sağlamak için çok önemlidir. Bu amaçla, DFS veri ön eleme ve aykırı dışlama ölçütlerini Force vs. Time çizimlerinde uyguladık. Bunu göstermek için, DFS ham verilerini üç kalite düzeyine kategorize ettiğimiz temsili bir veri kümesi seçildi: İyi (Şekil S2A), Gürültü ile kabul edilebilir (Şekil S2B) ve Zayıf kabul edilemez (Şekil S2C). BFP'yi kullanmaya yeni başlayanlar için, verileri İyi kalitede (Şekil S2A) önceden taramak için katı kriterleri öneririz. Not olarak, veri ön eleme kriterlerine dayanarak, basınç fazının regresyon uyum çizgisi, özellikle k1 > k2 (Şekil S2C, vii) olmak üzere çekme fazından daha dik olmalıdır. k1 < k2 (Şekil S2C, vii) ölçüldüğünde, türetilmiş kmol < 0, adım 4'teki hesaplama başına rasyonele aykırıdır. Bu tür olaylar daha sonra geçersiz aykırılıklar olarak kabul edilmeli ve atılmalıdır.
Veri toplama sırasında tek moleküler düzeyde BFP ölçümünü tercih etmek için, önceki çalışmaya göre birden fazla deneysel konfigürasyon uygulanmıştır12. İlk olarak, boncuklardaki protein kaplama yoğunluğu genellikle çözelti konsantrasyonu, protein miktarı ve reaksiyon koşulları15'isıkı bir şekilde kontrol ederek minimum seviyeye (örneğin 60 μm-2)kadar titratlanır. Boncuk üzerindeki proteinler arasındaki ortalama mekansal mesafe, böylece proteinin doğrusal boyutlarından çok daha büyük olarak tahmin edilir ve tek moleküler seviye12 , 13,14üzerindeki ölçümlerimizi tercih eder. İkincisi, her ligand-reseptör çifti için yapışma sıklığını% 20'≤ kontrol ediyoruz, bu altında moleküler bağlama olayları, olayların ≥% 89'unun tek moleküler bağlayıcı olacağını tahmin eden Poisson dağılımını takip edecek14,15. Bunu başarmak için, engel gücü ve temas süresi buna göre ayarlanır ve deney boyunca tutarlı olması gerekir12. Bununla birlikte, birden fazla bağın ardışık olarak gerçekleşmesi hala mümkündür(Şekil S2C, vi). Bu gibi durumlarda, olayları birden fazla tahvilin imzasıyla atacağız. Son olarak, spesifik olmayan yapışmasıklığının%216,17'≤emin olmak için tek başına sığır serum albümini ( Malzeme Tablosu ) veya SA ile kaplanmış boncuklarla negatif kontrol deneyleri yapılacaktır.
BFP canlı hücre yüzeyinde protein dinamiklerini araştırmak için güçlü olmasına rağmen10,11,12, teknik sınırlamalar vardır. BFP'de aynı anda sadece bir ligand-reseptör çifti araştırılabilir. İstatistiksel öneme sahip yeterli veri elde etmek zaman alıcı olacaktır. Ayrıca, deneysel prosedürler dik öğrenme eğrileri ile emek yoğundur. Uygulama akıllıca, mevcut BFP sistemi çevresel sürüklenme ve çevreleyen mekanik titreşime karşı hassastır. Sonuç olarak, DFS veri kalitesini sağlamak için sürekli manuel ayarlama gereklidir. Bu amaçla, son çalışmalarımızdan biri, BFP kuvvet kelepçesi DFS testlerinin stabilitesini artırmak için ultra kararlı BFP geri bildirim kontrol algoritmalarını tanıttı4. Bu teknik ilerleme, ultra uzun bağ ömrü (>50 s) ile antijen-antikor bağlama gibi daha güçlü moleküler etkileşim ölçümlerini sağlar. Bununla birlikte, BFP veri toplama ve DFS analizini tek bir bilgisayarlı programa otomatikleştirmek ve entegre etmek için gelecekteki çabaların yapılacağını ve tüm BFP operasyonunu ve veri analizini daha kullanıcı dostu ve yüksek aktarım hızına sahip hale getirileceğini öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, mevcut çalışmayla ilgili olarak rapor edecek rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yararlı tartışmalar için Guillaume Troadec'e, donanım danışmanlığı için Zihao Wang'a ve laboratuvar girişimimizi desteklediği için Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning ve Simon Ringer'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Keşif Projesi (DP200101970 - L.A.J.), NSW Kardiyovasküler Kapasite Geliştirme Programı (Erken-Orta Kariyer Araştırmacısı Grant - L.A.J.), Sydney Araştırma Hızlandırıcı ödülü (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations tarafından desteklendi. Sağlık Yatırım Hibesi (2020HIG76 - L.A.J.), Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Fikirler Hibesi (APP2003904 - L.A.J.) ve Sydney Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Başlangıç Fonu ve Ana Ekipman Programı (L.A.J.). Lining Arnold Ju, Avustralya Araştırma Konseyi DECRA üyesidir (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
