Summary
גשושית כוח ביו-מברן (BFP) היא טכניקה של ספקטרוסקופיית כוח דינמית (DFS). BFP יכול לשמש כדי למדוד את קבוע האביב של אינטראקציות מולקולריות על תאים חיים. פרוטוקול זה מציג ניתוח מתמיד באביב עבור קשרים מולקולריים שזוהו על ידי BFP.
Abstract
בדיקה כוח biomembrane (BFP) הופיע לאחרונה כמו פני תא יליד או ספקטרוסקופיה כוח דינמית במקום (DFS) ננו-אמול שיכול למדוד קינטיקה מחייבת מולקולרית אחת, להעריך תכונות מכניות של אינטראקציות קולטן ליגנד, לדמיין שינויים קונפורמציה דינמית חלבון ומרגש יותר לפרטנרציה של תאים מיושרים קולטן. לאחרונה, BFP שימש למדידת קבוע האביב של קשרים מולקולריים. פרוטוקול זה מתאר את ההליך שלב אחר שלב לביצוע ניתוח DFS קבוע קפיץ מולקולרי. באופן ספציפי, שני מצבי פעולה BFP נדונים, כלומר מצבי חרוז-תא וחרוזים. פרוטוקול זה מתמקד בהפקת קבועי האביב של הקשר המולקולרי והתא מנתונים גולמיים של DFS.
Introduction
כניקת DFS של תאים חיים, BFP מהנדסת תא דם אדום אנושי (RBC; איור 1) לתוך מתמר כוח רגיש במיוחד וטונה עם טווח קבוע קפיץ תואם ב 0.1-3 pN / nm1,2,3. כדי לחקור אינטראקציה עם קולטן ליגנד, BFP מאפשר מדידות DFS ב~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 ננומטר (10-9 מ '), ו ~ 0.5 ms (10-3 s) בכוח, מרחבי, ורזולוציה זמנית4,5. התצורה הניסיונית שלו מורכבת משני מיקרופיטים מנוגדים, כלומר הגשוש והמטרה. מיקרופיפט הגשושית שואף ל-RBC וחרוז מודבק בשיאו באמצעות אינטראקציה ביוטין-סטרפטבידין. החרוז מצופה בליגנד מעניין(איור 1A). המיקרופיט היעד שואף לתא או לחרוז הנושא את קולטן העניין, המתאים למצבי חרוז-תא (איור 1B) וחרוזים (איור 1C), בהתאמה5.
בניית BFP, הרכבה ופרוטוקולי הניסוי של DFS תוארו בפירוט בעבר1,6. בקצרה, מחזור מגע BFP מורכב מ-5 שלבים: גישה, פגיעה, מגע, חזרה ושיתוק (איור 1D). מיקום השיא האופקי של RBC מסומן כ- ΔxRBC. בהתחלה, עיוות RBC שאינו מנוטר (אפס כוח) ΔxRBC הוא 0 (טבלה 1). היעד מונע על ידי פייזו-טרנסלטור שיפגע בו ויסוג מחרוז הגשושית(איור 1D). הגשושית RBC נדחסת לראשונה על ידי היעד עם עיוות RBC שלילי ΔxRBC < 0. באירוע בונד, שלב ה-Retract עובר משלב דחיסה לשלב מתיחה עם עיוות RBC חיובי ΔxRBC > 0 (איור 2C ו- D). על פי החוק של הוק, כוח הנושא BFP הוא מסוגל להימדד כ- F = kRBC × ΔxRBC, שם kRBC (טבלה 1) הוא קבוע האביב RBC של BFP. לאחר קרע באג"ח והשלמת מחזור מגע אחד, חרוז הגשושית חוזר לעמדת אפס כוח עם ΔxRBC = 0 (איור 1D).
כדי לקבוע את ה- KRBC,אנו מודדים ומתעדים את הרדי של פתח המיקרופיט הפנימי של הגשושית (Rp), RBC (R0) ואזור המגע המעגלי (Rc) בין RBC לחרוז הגשושית ( איור1A). ואז kRBC מחושב על פי המודל של אוון (Eq. 1)7,8 באמצעות תוכנית LabVIEW הפועלת ככלי וירטואלי (VI) להפעלת ה- BFP ( איורS1A)8,9.
(א"ק 1)
עם BFP הוקם ונתונים גולמיים DFS הושגו, בזאת אנו מציגים כיצד לנתח את קבוע האביב של זוג קולטן ליגנד או תאים. הנתונים הגולמיים של DFS על האינטראקציה של החלבון הגליקוסילי Thy-1 ו- K562 הנושאים אינתגרין α5β1 (Thy-1-α5β1; איורים 3A ו-3B)10, ושל הפיברינוגן והחרוזים מצופים האינטיגרין αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; איור 3C) 11,12 שימשו כדי להדגים את מצבי ניתוח חרוז-תא וחרוזים, בהתאמה.
הכנה ניסיונית BFP
לקבלת פרטים על הכנה ניסויית ומכשור BFP, עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר3. בקצרה, RBC האנושי כבר biotinylated באמצעות ביוטין-PEG3500-NHS במאגר פחמן / ביקרבונט. חלבונים מעניינים הוצמדו באופן קוולנטי אל חרוזי הזכוכית הבורוסיליקט באמצעות MAL-PEG3500-NHS במאגר הפוספט. כדי לצרף RBC biotinylated, חרוז הגשושית מצופה גם סטרפטאבידין (SA) באמצעות MAL-SA. נא עיין בטבלת החומרים ושולחן 2.
כדי להרכיב את ה- BFP (איור 1, משמאל), המיקרופיט השלישי המכונה 'עוזר' ישמש להעברת חרוז הגשושית ולהדבקתו לשיא של RBC1,3. האינטראקציה הקוולנטית בין חרוז הגשושית מצופה SA לבין RBC הביוטיניל הוא הרבה יותר חזק מאשר קשר קולטן ליגנד של עניין. לפיכך, ניתן לפרש את שלב הניתוק כקרע בקשר קולטן ליגנד ולא כניתוק של חרוז הגשושית מה- RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. השג אירועי DFS הניתנים לניתוח
- התחל את הניסוי בתוכנה (לדוגמה, LabVIEW VI) עבור הגדרת הבקרה והפרמטרים של BFP(איור S1A).
- שים לב לחרוזים/סלולריים חוזרים ונשנים של חרוזי החרוזים/תאים בתוכנה עבור צג BFP(איור S1B).
- בדוק והשג את תדירות ההדבקה ≤ 20% בתוך 50 הנגיעות הראשונות על ידי כוונון כוח ההחסה וזמן המגע, שבאמצעותו הוא מבטיח כי ≥ 89% מאירוע הידבקות DFS מתווכים על ידי אג"ח בודדות12,13,14.
הערה: עבור כל זוג חרוזים/חרוזים, אנו מבצעים 200 מחזורי מגע חוזרים ונשנים. כדי להשיג איכות נתונים הניתנת לפרסום, אנו מבצעים בדרך כלל n ≥ 3 זוגות חרוזים או חרוזים.- שמור נתונים, בצורה של כוח לעומת זמן, לתיקיה המופנית על-ידי המשתמש עד סוף כל זוג, שהתבקשה על-ידי התוכנה עבור פקד BFP והגדרת פרמטר.
- אסוף את הנתונים הגולמיים של כוח לעומת זמן של אירועי בונד, כפי שהם מדגמנים באיור 2A, באמצעות פלטפורמת הרכישה BFP (איור S1C).
- פתח את תוכנת ניתוח הנתונים של BFP. לחץ על סמל התיקייה הצהובה ובחר את קובץ הנתונים הגולמי המתאים על ידי לחיצה כפולה עליהם.
- הפעל את התוכנית ולאחר מכן לחץ על לחצן למעלה ולמטה כדי לעבור בין אירועים. השתמש בקריטריוני אי-הכללה חריגים (איור S2) כדי לסנן אירועים לא חוקיים. בחר את סוג הנתונים המייצא כתבנית כוח לעומת זמן ולחץ על לחצן יצא נתוני התוויות.
2. המר את עקומת הכוח לעומת הזמן לעקומת הכוח לעומת עקומת ההעתקה
- יצא את מקטע הנתונים המתאים לשלב 'ביטול' לגיליון אלקטרוני (איור 2A, כתובית מרובעת),הרלוונטי לניתוח הקבוע של האביב.
- התווה את עקומת הכוח לעומת הזמן באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני. כדי להשיג את עקומת הכוח לעומת עקירה, המר את ערכי הזמן(איור 2A, x-ציר) לערכי ההעתקה הכוללים (Δxtot) על-ידי הכפלת ערכי הזמן במהירות תנועת פיזו (כלומר, 4,000 ננומטר/שניה לפי קביעה מוגדרת מראש).
- אפס את נקודת הנתונים הראשונה על-ידי הפחתה של ערך ההעתקה הקטן ביותר מכל ערך תזוזה שנרכש. שינוי אופקי זה אינו משפיע על השיפועים העולים של שלב ההסרה או על חישוב קבוע האביב הבא.
- ראוי לציין, BFP נחשב כמערכת קפיצית סדרתית שבה Δxטוט (טבלה 1) סיכום עיוותים של RBC, ΔxRBC (טבלה 1),הקשר המולקולרי, Δxמול ( טבלה1), ותא היעד, Δxתא (טבלה 1), כמו Eq. 2:
(א"ק 2) - התווה את העקומה כוח (F) לעומת תזוזה (Δxטוט)כפי שמוצג באיור 2B.
(א"ק 2)3. ניתוח קן-ים באביב של מצב חרוזים- תא
- בעקומת הכוח לעומת תזוזה, ניתן לזהות שני רשלנות נפרדת, שבה כל אחד יכול לייצג את שלב הדחיסה ואת שלב המתיחה. התאם קו רגרסיה לכל קבוצת נתונים (איור 2B), כאשר שיפוע ההתאמה הליניארית הגדול יותר מייצג את קבוע הקפיצה הכולל בשלב דחיסה (איור 2B, אדום),מסומן כ- k1 (טבלה 1); ושיפוע ההתאמה הליניארי הקטן יותר מייצג את קבוע האביב הכולל בשלב מתיחה(איור 2B, כחול),המציין כ- k2 (טבלה 1).
- עבור קפיצים המחוברים בסדרה לכל שלב 2.2 תיאור, לבטא את ההדדיות של קבוע האביב הכולל, kטוט (טבלה 1), כסכום של הפוך קבוע האביב של RBC, kRBC (טבלה 1), הקשר המולקולרי, kמול (טבלה 1), ותא היעד,תא k(טבלה 1). במהלך שלב הדחיסה של מצב חרוז-תא, הקשר המולקולרי אינו נמתח, ולכן kמול אינו נלקח בחשבון. ההדדיות של ktot בתרחיש זה (1/k1) באה לידי ביטוי כ
(א"ק ג).
בנתונים לדוגמה, kRBC נקבע מראש (0.25 pN/nm כברירת מחדל). ניתן להפיק תא k מה- Eq. 3 עם k1 ו- kRBC שנרכשו (איור 3B). - במהלך שלב המתיחה, הידבקות נוצרת בין זוג קולטן ליגנד. לבטא את ההדדיות של kטוט בתרחיש זה (1/k2) כ
(א"ק 4)
כאשר k2 (טבלה 1) מייצג את קבוע האביב הכולל במהלך שלב המתיחה. - יש להפיק kמול מהפחתה 1/k1 מ 1/k2 (השווה Eq. 3 לעומת Eq. 4).
(א"ק ג).
(א"ק 4)4. ניתוח מתמיד של מצב חרוזים- חרוזים באביב
- התאם קו רגרסיה לנתוני שלב הדחיסה כדי להשיג k1 (בדומה לאיור 2B, אדום). שימו לב, במצב חרוז-חרוז, תא היעד מוחלף בחררוז זכוכית מצופה בקולטן העניין(איור 1C). מאחר שעיוות חרוזים זניח, ניתן להסיר את מונחתא 1/kמה- Eq. 3 ו- Eq. 4 בהתאם. ניתן לבטא אתהטוט הקיט ההדדישל שלב הדחיסה (1/k1) כ:
(א"ק 5) - התאם קו רגרסיה לנתוני שלב המתיחה כדי להשיג k2 (בדומה לאיור 2B, כחול). ניתן לבטא אתהטוט הקתי ההדדישל שלב המתיחה (1/k2)כ:
(א"ק 6) - יש להפיק kמול מהפחתה 1/k1 מ- 1/k2 (השווה Eq. 5 לעומת Eq. 6).
(א"ק 5)
(א"ק 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעבודה זו, הדגמנו את הפרוטוקול של ניתוח מתמיד האביב BFP. עבור מצב ניתוח חרוז-תא, ניתחנו את kמול של הקשר המולקולרי בין חלבון גליקוסילאט Thy-1 מצופה חרוז בדיקה ואת האינתגרין α5β1 לידי ביטוי על תא היעד K562 (Thy-1-integrin α5β1; איור 3א) 10.תא kנגזר גם ממצב תא חרוזים (תא K562; איור 3B). עבור מצב חרוז-חרוז, הקשר המולקולרי שנוצר בין פיברינוגן לאינטגרין αIIbβ3 (FGN-integrin αIIbβ3; איור 3C) 11,12 משמש כדי להדגים את מצב ניתוח חרוזים.
עבור מצב תא חרוזים, מדדנו את קבועי האביב של Thy-1-integrin α5β1 אג"ח ותא K562 כ kמול = 0.45 ± 0.28 pN / nm (איור 3A) ותא k= 0.18 ± 0.07 pN / nm ( איור3B) מ 27 אירועים ניתנים לניתוח מראש. עבור מצב חרוז-חרוז, מדדנו את קבועי האביב של FGN-integrin αIIbβ3 אג"ח כמו kמול = 0.53 ± 0.29 pN / nm (איור 3C) מתוך 33 אירועים הניתנים לניתוח מראש.
| סמל | הגדרה | סמל | הגדרה |
| Δxtot | ההעתקה הכוללת של הפיזו, אשר יכול להתפרש גם כעיוות מוחלט של RBC, תא יעד וקשר מולקולרי. | ΔxRBC | עיוות RBC, אשר יכול להתפרש גם כמו עקירה של חרוז הגשושית. |
| ktot | קבוע האביב הכולל של כל מערכת האביב הסדרתי BFP. | kRBC | קבוע האביב של RBC השאפתן על ידי מיקרופיט בדיקה. |
| kמול | קבוע האביב של BFP זיהה קשר מולקולרי | kcell | קבוע האביב של תא היעד. |
| k1 | kטוט של שלב הדחיסה בשלב ההסרה. | k2 | kטוט של שלב המתיחה בשלב לסגת. |
| פ1 | תוספת הכוח שחשה חרוז הגשושית בשלב הדחיסה. | ΔF2 | הצטברות הכוח שחש חרוז הגשושית בשלב המתיחה. |
| Δx1 | ההפרשה המצטברת של תזוזה בשלב הדחיסה. | Δx2 | ההפרשה של עקירה בשלב המתיחה. |
טבלה 1. הגדרות סמלים לניתוח קבוע של האביב המולקולרי BFP. מיקומים אופקיים של כל האובייקטים מוגדרים כ- x, בעוד ש- Δx [nm] מתייחס לעיוות ביחס למיקום המקורי. ΔF [pN] מתייחס להפרש הכוח הנמדד על-ידי BFP. k [pN/nm] מתייחס קבוע האביב. כתבים תחתיים 1 ו- 2 תואמים לשלבי הדחיסה והמתיחה, בהתאמה. קבוע הקפיץ המולקולרי נגזר מהכוח (F) לעומת. עקומת תזוזה (Δxtot).
איור 1: תצורת BFP ומחזור מגע של DFS. (A) מערכת BFP מרכיבה שני מיקרופיטים מנוגדים, כלומר הגשוש (משמאל) והמטרה(מימין). מיקרופיפט הגשושית שואף RBC (אדום) עם חרוז זכוכית מודבק בשיאו כדי לשמש מתמר כוח. המיקרופיט היעד שואף תא נושא קולטן(כחול). קבוע האביב RBC (kRBC) נקבע על ידי לחץ השאיפה (Δp)ואת radii של RBC שאפתני (R0),מיקרופיפט בדיקה (Rp) ואזור מגע מעגלי (Rc) בין RBC וחרוז הגשושית. (B ו- C) מיקרוגרפים של מצבי BFP של תאי חרוזים (B) וחרוזים (C). סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר. (D) מחזור מגע BFP המורכב משלבי גישה, שיכוך, איש קשר, חזרה ושיוך. קו המקף ΔxRBC = 0 מקף מציין את המיקום של BFP ללא מותח או אפס כוח. שלב ה- Retract כולל שלב דחיסה (ΔxRBC < 0, אדום),מיקום אפס כוח (ΔxRBC = 0, שחור) ושלב מתיחה (ΔxRBC > 0, כחול) ברצף. החץ השחור מציין את המיקום של אירוע בונד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הפקת קבועי קפיץ מולקולריים מנתונים גולמיים של DFS. (A) כוח מייצג (F) לעומת עקומת זמן (t) של נתונים גולמיים של DFS במחזור מגע אחד של BFP. (B)עקומת כוח מומרת מייצגת (F) לעומת עקומת עקירה (Δxטוט)המתארת את שלב ההסרה. k1 ו- k2 מייצגים את השיפוע המתאים של שלבי הדחיסה והמתיחה הרצופים בהתאמה. ΔF1 ו- Δ F2 מייצגים את ההפרשים ההפרשיים של כוח בשלב הדחיסה ואת נתוני שלב המתיחה, בהתאמה, כאשר Δx1 ו- Δx2 מייצגים את ההפרשים ההפרשיים של תזוזה בשלב הדחיסה ובנתוני שלב המתיחה, בהתאמה. ערכי R2 עבור קבוע האביב במהלך שלב דחיסה (R12) ושלב מתיחה (R2 2) מסומנים על הגרף כדי לציין כושר סטטיסטי טוב. (C ו- D) איורים של שלב הניתון Retract במצבי הניסוי של תא חרוזים (C) וחרוזים (D). kRBC מייצג את קבוע האביב של RBC; תא k ו kמול מייצגים את קבועי האביב של תא היעד ואת הקשר המולקולרי, בהתאמה. במהלך שלב המתיחה, הידבקות נוצרת בין זוג קולטני ליגנד, RBC מסיט באותו כיוון כמו פיזו נסוג מעבר למיקום אפס כוח (ΔxRBC > 0). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: היסטוגרמה מייצגת של BFP נמדדו קבועי האביב. מספר האירוע (ציר y השמאלי)והתפלגות התדרים(ציר y ימני)של קבועי קפיץ נמדדים עבור Thy-1-integrin α5β1 אג"ח (A) ו- K562 תא יעד (B) במצב תא חרוזים ו- FGN-integrin αIIbβ3 אג"ח (C) במצב חרוז-חרוז. היסטוגרמות מתאימות לעקומת ההתפלגות הגאוסית(ורוד)והפרמטר הסטטיסטי, R2, משמש לציון חוזק הכושר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור S1: ממשק BFP תוצרת בית. (A) ממשק בקרת BFP והגדרת פרמטר. הפרמטרים כדי לקבוע קבוע האביב RBC הוזנו מלוח של פרמטרים ביופיסיים. (ב) ניטור BFP. מחזורי מגע BFP חיים נצפו מתצוגת מצלמה זו. (C) ממשק ניתוח DFS BFP שבו עקומות כוח (F) לעומת זמן (t) נבדקות ומעובדות מראש לניתוח קבוע קפיץ מולקולרי עוקב. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור 2. BFP בקרת איכות נתונים הניתנת לניתוח וקריטריוני סינון מראש. (A)אירועי DFS טובים באיכות גבוהה: (i) אירוע כוח קרע של תא חרוזים; (ii) אירוע לכל החיים של תא חרוזים; (iii) אירוע כוח קרע חרוזים; (4) אירוע לכל החיים של חרוזים. (B)אירועי DFS מקובלים עם קצת רעש: (i) נתונים נסחפים אך שלב ה- Zoom-in Retract נשאר חוקי; (ii) נתונים קלים נסחפים לאחר ניתוק אג"ח; (iii) דאטה קינקית במשטר אפס הכוח; (4) כוח החזקה הוא קטן (< 10 pN). (ג) אירועים באיכות ירודה שיש להשליך: (i) אין הידבקות; (ii) תנודות נתונים; (iii) נתונים נסחפים כל הזמן; (4) נתונים לא רציניים; (v) כוח דחיסה קטן מדי (≈ 0 pN); (vi) קשרים מרובים; (vii) נתונים לא חוקיים עם kmol נגזר < 0; (viii) שגיאת אות. אפס כוח מצוין על-ידי הקו האפור לסירוגין. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לסיכום, סיפקנו פרוטוקול ניתוח נתונים מפורט עבור עיבוד מראש של הנתונים הגולמיים של DFS וגזירת קבועי קפיץ מולקולריים במצבי ניתוח חרוזים וחרוזים BFP. מודלים ומשוואות ביומכניים הנדרשים לקביעת קבועי קפיץ מולקולריים ותאיים מוצגים. למרות שנלמדים אינטילגרינים שונים, ה-kמול הנמדד על ידי מצב חרוז-חרוז ומצב חרוז-תא הוא בעל הבדלי טווח משמעותיים(איור 3A לעומת איור 3C). שימו לב, עם מצב חרוז-חרוז, הקולטן מקושר באופן קוולנטי חרוז הזכוכית. לעומת זאת, עם מצב חרוז-תא, קולטן פני השטח מותאם על ידי קרום הפלזמה הבסיסי ו cytoskeletons, אשר ככל הנראה להשפיע על kmolנמדד .
בקרת איכות נתונים חיונית כדי להבטיח את יכולת הרבייה. לכך, יישמנו את קריטריוני המיון מראש של נתוני DFS וההדרה החריגה במזימות הכוח לעומת הזמן. כדי להדגים זאת, נבחרה ערכת נתונים מייצגת, שבה סיווגנו את הנתונים הגולמיים של DFS לשלוש רמות איכות: Good (איור S2A),מקובל ברעש (איור S2B) ו Poor לא מקובל(איור S2C). למתחילים של שימוש BFP, אנו ממליצים על הקריטריונים הקפדניים כדי לסנן מראש את הנתונים עם איכות טובה (איור S2A). שימו לב, בהתבסס על קריטריוני המיון מראש של הנתונים, קו התאמת הרגרסיה של שלב הדחיסה צריך להיות תלול יותר מזה של שלב המתיחה, במיוחד k1 > k2 (איור S2C,vii). כאשר נמדד k1 < k2 ( איורS2C, vii), ה- kmol הנגזר < 0 מנוגד לרציונל לכל חישוב בשלב 4. לאחר מכן יש להתייחס לאירועים כאלה כחוליים לא חוקיים ולהימחק.
כדי להעדיף את מדידת BFP ברמה מולקולרית אחת במהלך רכישת נתונים, תצורות ניסיוניות מרובות יושמו על פי מחקר קודם12. ראשית, צפיפות ציפוי חלבון על חרוזים הוא בדרך כלל titrated עד לרמה מינימלית (למשל 60 מיקרומטר-2) על ידי שליטה קפדנית בריכוז הפתרון, כמות החלבון ותנאי התגובה15. המרחק המרחבי הממוצע בין חלבונים על החרוז מוערך בכך הרבה יותר גדול מהממדים הליניאריים של החלבון, ומעדיף את המדידות שלנו ברמהחד-מולקולרית 12,13,14. שנית, אנו שולטים בתדר ההדבקה עבור כל זוג קולטני ליגנד ≤ 20%, שתחתיו אירועים מחייבים מולקולריים יעקבו אחר התפלגות פואסון המנבאת ≥ 89% מהאירועים יהיו מחייביםחד-מולקולריים 14,15. כדי להשיג זאת, כוח ההסתה וזמן המגע נקבעים בהתאם וצריכים להיות עקביים לאורך כל הניסוי12. עם זאת, עדיין ייתכן כי קשרים מרובים מתרחשים ברצף(איור S2C, vi). במקרים כאלה, אנו נבטל את האירועים עם חתימות של איגרות חוב מרובות. אחרון חביב, ניסויי שליטה שלילית יבוצעו עם חרוזים מצופים אלבומין סרום בקר(שולחן החומרים)או SA לבד כדי להבטיח את תדירות הידבקות לא ספציפית הוא ≤ 2%16,17.
למרות BFP הוא חזק לחקור דינמיקה חלבון על פני תא חי10,11,12, יש מגבלות טכניות. ב- BFP, רק זוג קולטני ליגנד אחד יכול להיחקר בכל פעם. זה יהיה זמן רב כדי לקבל נתונים מספיקים עם משמעות סטטיסטית. חוץ מזה, ההליכים הניסיוניים הם עבודה אינטנסיבית עם עקומות למידה תלולות. מבחינת יישום, מערכת BFP הנוכחית רגישה להיסחף הסביבתי ולרטט המכני שמסביב. כתוצאה מכך, נדרשת התאמה ידנית רציפה כדי להבטיח את איכות הנתונים של DFS. לכך, אחד המחקרים האחרונים שלנו הציג אלגוריתמים אולטרה יציבים לבקרת משוב BFP כדי לשפר את היציבות של BFP כוח מהדק DFS4. התקדמות טכנית זו מאפשרת מדידות של אינטראקציה מולקולרית חזקה יותר כגון כריכת אנטיגן-נוגדנים עם חיי קשר ארוכים במיוחד (>50 s). עם זאת, אנו צופים שמאמצים עתידיים ייעשו כדי להפוך את רכישת הנתונים של BFP לאוטומטית ולשלב את רכישת הנתונים BFP וניתוח DFS בתוכנית ממוחשבת אחת, מה שהופך את כל פעולת BFP וניתוח הנתונים לידידותיים יותר למשתמש ולתפוקה גבוהה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים לדווח לגבי המחקר הנוכחי.
Acknowledgments
אנו מודים לגיום טרואדק על הדיון המועיל, זיהאו וואנג לייעוץ בחומרה, ולמרכז הייצור של סידני, גרג סואנינג וסיימון רינגר על התמיכה בסטארט-אפ המעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט דיסקברי מועצת המחקר האוסטרלית (DP200101970 - L.A.J.), תוכנית בניית קיבולת לב וכלי דם של NSW (מענק חוקר קריירה בתחילת אמצע - L.A.J.), פרס מאיץ המחקר של סידני (SOAR - L.A.J.), ראמאסיו מענק השקעות בריאות קרנות טי (2020HIG76 - L.A.J.), מענק רעיונות לבריאות ומחקר רפואי לאומי (APP2003904 - L.A.J.), וקרן הסטארט-אפ של הפקולטה להנדסה באוניברסיטת סידני ותוכנית ציוד גדולה (L.A.J.). בטנה ארנולד ג'ו הוא עמית מועצת המחקר האוסטרלית DECRA (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
