Summary
En biomembrankraftsonde (BFP) er en in situ dynamic force spektroskopi (DFS) teknik. BFP kan bruges til at måle fjederkonstanten af molekylære interaktioner på levende celler. Denne protokol præsenterer foråret konstant analyse for molekylære obligationer opdaget af BFP.
Abstract
En biomembrane force probe (BFP) har for nylig vist sig som en indfødt celle-overflade eller in situ dynamisk kraft spektroskopi (DFS) nanotool, der kan måle enkelt-molekylær bindende kinetikere, vurdere mekaniske egenskaber ligand-receptor interaktioner, visualisere protein dynamisk kropsbygning ændringer og mere spændende belyse receptor medieret celle mekanosensing mekanismer. For nylig er BFP blevet brugt til at måle forårskonstanten af molekylære bindinger. Denne protokol beskriver den trinvise procedure til at udføre molekylær fjederkonstant DFS-analyse. Specifikt diskuteres to BFP-driftstilstande, nemlig perlecelle- og perleperletilstandene. Denne protokol fokuserer på at udlede fjederkonstanter af molekylærbindingen og cellen fra DFS-rådata.
Introduction
Som en live-celle DFS teknik, BFP ingeniører en menneskelig rød blodlegemer (RBC; Figur 1) til en ultrafølsom og tunable krafttransducer med et kompatibelt fjederkonstantområde ved 0,1-3 pN/nm1,2,3. For at sondere ligand-receptor interaktion, BFP muliggør DFS målinger på ~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 nm (10-9 m), og ~ 0,5 ms (10-3 s) i kraft, rumlig og tidsmæssig opløsning4,5. Dens eksperimentelle konfiguration består af to modsatrettede mikropipetter, nemlig sonden og målet. Probe mikropipetten aspireerer en RBC og en perle er limet på sit højdepunkt via en biotin-streptavidin interaktion. Perlen er belagt med ligand af interesse (figur 1A). Target-mikropipetten aspireerer enten en celle eller en perle, der bærer receptoren af interesse, svarende til perlecelle -figur 1B) og perleperle (Figur 1C) tilstande, henholdsvis5.
BFP konstruktion, samling og DFS eksperimentelle protokoller blev beskrevet i detaljer tidligere1,6. Kort fortalt består en BFP-berøringscyklus af 5 faser: Tilgang, Hindring, Kontakt, Tilbagetrækning og Dissociate (Figur 1D). Den vandrette RBC-spidsposition er angivet som ΔxRBC. I begyndelsen er den ustrøede (nul-kraft) RBC deformation ΔxRBC 0 (Tabel 1). Målet køres derefter af en piezotranslator for at gribe ind og trække sig tilbage fra sondeperen (Figur 1D). RBC-sonden komprimeres først af Target med negativ RBC-deformation ΔxRBC < 0. I en Bond-hændelse skifter tilbagetrækningsstadiet fra et kompressivt til en trækfase med positiv RBC-deformation ΔxRBC > 0 (Figur 2C og D). Ifølge Hookes lov kan BFP's bærekraft måles som F = kRBC × ΔxRBC, hvor kRBC ( tabel1) er BFP's RBC-fjederkonstant. Ved lim brud og afslutningen af en touch cyklus, sonden perle vender tilbage til nul-kraft position med ΔxRBC = 0 (Figur 1D).
For at bestemme kRBCmåler og registrerer vi radierne i sondemikropipettens indre åbning (Rp), RBC (R0) og det cirkulære kontaktområde (Rc) mellem RBC og sondeperen ( Figur1A). Derefter beregnes kRBC i henhold til Evans model (Eq. 1)7,8 ved hjælp af et LabVIEW-program, der fungerer som et virtuelt instrument (VI) til at betjene BFP ( FigurS1A)8,9.
(Eq. 1)
Med en BFP etableret og DFS rå data opnået, hermed præsenterer vi, hvordan man analyserer foråret konstant af ligand-receptor par eller celler. DFS-rådata om samspillet mellem det glycosylerede protein Thy-1 og K562-cellen med integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Figur 3A og 3B)10 og fibrinogen og perlebelagt integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figur 3C) 11,12 er blevet brugt til at demonstrere henholdsvis perlecelle- og perleperleanalysetilstandene.
BFP eksperimentel forberedelse
Yderligere oplysninger om BFP's eksperimentelle forberedelse og instrumentering henvises til de tidligere offentliggjorte protokoller3. Kort sagt er human RBC blevet biotinyleret ved hjælp af Biotin-PEG3500-NHS i kulstof /bicarbonatbufferen. Proteiner af interesse er blevet kovalent koblet til borosilicate glasperler ved hjælp af MAL-PEG3500-NHS i fosfat buffer. For at fastgøres til den biotinylerede RBC er sondeperen også belagt med streptavidin (SA) ved hjælp af MAL-SA. Se tabellen over materialer og tabel 2.
For at samle BFP(figur 1, til venstre)vil den tredje mikropipette , der kaldes 'Hjælper', blive brugt til at levere sondeperen og lime den fast til RBC's spids1,3. Den kovalente interaktion mellem sa-coated sondeper og biotinyleret RBC er meget stærkere end ligandreceptorbindingen af interesse. Således kan Dissociate-stadiet fortolkes som ligand-receptorbindingsbrud snarere end løsrivelse af Probe perle fra RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Få analyserelige DFS-hændelser
- Start eksperimentet i softwaren (f.eks. LabVIEW VI) til BFP-kontrol- og parameterindstillingen (Figur S1A).
- Overhold de gentagne sondeper-målperle/celleberøring i softwaren til BFP Monitor (Figur S1B).
- Test og opnå vedhæftning frekvens ≤ 20% inden for de første 50 rører ved at indstille impingement kraft og kontakt tid, hvorved det sikrer, at ≥ 89% af DFS vedhæftning begivenhed er medieret af enkelt obligationer12,13,14.
BEMÆRK: For hvert perlecelle-/perlepar udfører vi 200 gentagne berøringscyklusser. For at opnå datakvalitet, der kan udgives, udfører vi normalt n ≥ 3 Perle-Perle eller Perle-Celle par.- Gem data i form af Force vs. Time i den brugerstyrede mappe ved udgangen af hvert par, der er bedt om det, og som er angivet i softwaren til BFP-kontrol og parameterindstilling.
- Indsamle Force vs. Time raw data om Bond-begivenheder, som eksemplificeret i figur 2A, ved hjælp af BFP erhvervelse platform (Figur S1C).
- Åbn BFP-dataanalysesoftwaren. Klik på ikonet for den gule mappe, og vælg den tilsvarende raw-datafil ved at dobbeltklikke på dem.
- Kør programmet, og klik derefter på knappen op og ned for at skifte mellem hændelser. Brug outlier-udelukkelseskriterierne (Figur S2) til at frasortere ugyldige hændelser. Vælg eksportdatatypen som Tving vs. klokkeslætsformat, og klik på knappen Eksporter plotdata.
2. Konverter kraften vs. tidskurven til kraften vs. forskydningskurve
- Eksporter det datasegment, der svarer til tilbagetrækningsfasen, til et regneark (Figur 2A, firkantet lysavis), som er relevant for forårskonstantanalysen.
- Plot Force vs Time Curve ved hjælp af regnearkssoftware. Hvis du vil opnå kurven Force vs. Displacment, skal du konvertere tidsværdierne (Figur 2A, x-axis) til de samlede forskydningsværdier (Δxtot)ved at gange tidsværdier med piezobevægelseshastighed (dvs. 4.000 nm/s ved forudindstillet).
- Nul det første datapunkt ved at trække den mindste forskydningsværdi fra hver erhvervet forskydningsværdi. Denne horisontale transformation påvirker ikke de stigende skråninger af tilbagetrækningsfasen eller den efterfølgende forårskonstantberegning.
- Navnlig betragtes BFP som et seriel fjedersystem, hvor Δxtot (tabel 1) opsummerer deformationer af RBC, ΔxRBC (Tabel 1), molekylærbindingen, Δxmol (Tabel 1) og målcellen, Δxcelle (Tabel 1), som Eq. 2:
(Eq. 2) - Plot force (F) vs. Forskydning (Δxtot)kurve som vist i figur 2B.
(Eq. 2)3. Forår Cnstant Analyse af Perle-Cell Mode
- I kraft vs. forskydningskurven kan der identificeres to forskellige skrå, hvor hver kan repræsentere trykfasen og trækfasen. Sæt en regressionslinje på hver datagruppe (Figur 2B), hvor den større lineære tilpasningsskråning repræsenterer den samlede fjederkonstant i trykfasen (Figur 2B, rød), angivet som k1 (Tabel 1); og den mindre lineære pasform hældning repræsenterer den samlede fjeder konstant ved tenslile fase (Figur 2B, blå), betegnet som k2 (Tabel 1).
- For fjedre, der er forbundet i serie pr. trin 2.2-beskrivelse, udtrykkes den samlede fjederkonstant, ktot (tabel 1), som summen af fjederkonstantinerne af RBC, kRBC ( tabel1), molekylærbindingen, kmolen ( tabel1) og målcellen,k-cellen (tabel 1). Under kompressiv fase af Perle-Celle-tilstanden strækkes molekylærbindingen ikke, derfor tages der ikke hensyn til kmol. Den gensidige ktot i dette scenario (1 /k1) udtrykkes som
(Eq. 3).
I eksempeldataene er kRBC forudbestemt (som standard 0,25 pN/nm). kcelle kan udledes af Eq. 3 med den erhvervede k1 og kRBC ( Figur3B). - I trækfasen dannes vedhæftning mellem ligand-receptorparret. Udtrykke den gensidige ktot i dette scenario (1 /k2) som
(Eq. 4)
hvor k2 (tabel 1) repræsenterer den samlede fjederkonstant i trækfasen. - Udlede kmol fra at trække 1/k1 fra 1/k2 (sammenlign Eq. 3 vs. Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Forår Konstant analyse af perle- perle Mode
- Sæt en regressionslinje på de kompressive fasedata for at hente k1 (svarende til figur 2B, rød). Bemærk, at målcellen i perle-perle-tilstand erstattes af en glasperle belagt med receptoren af interesse (Figur 1C). Da perledeformation er ubetydelig,kan celleudstummet på 1/ k fjernes fra Eq. 3 og Eq. 4 i overensstemmelse hermed. Den gensidige ktot af trykfasen (1 /k1) kan udtrykkes som:
(Eq. 5) - Sæt en regressionslinje på trækfasedataene for at opnå k2 (svarende til figur 2B, blå). Den gensidige ktot af trækfasen (1 /k2) kan udtrykkes som:
(Eq. 6) - Udlede kmol fra at trække 1/k1 fra 1/k2 (sammenlign Eq. 5 vs. Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbejde har vi demonstreret protokollen for BFP foråret konstant analyse. For Perle-Celle analyse mode, analyserede vi kmol af molekylær lim mellem glycosylated protein Thy-1 belagt på Probe perle og integrin α5β1 udtrykt på Target K562 celle (Thy-1-integrin α5β1; Figur 3A) 10. K-cellen er også afledt af perlecelletilstanden (K562-cellen; Figur 3B). For perle-perle-tilstand, molekylær lim dannet mellem fibrinogen og integrin αIIbβ3 (FGN-integrin αIIbβ3; Figur 3C) 11,12 bruges til at demonstrere analysetilstanden Perle-Perle.
For Perle-Celle-tilstand målte vi fjederkonstanterne i Thy-1-integrin α5β1 binding og K562 celle som kmol = 0,45 ± 0,28 pN /nm (Figur 3A) og kcelle = 0,18 ± 0,07 pN /nm (Figur 3B) fra 27 forudscreenede analyserelige hændelser. For Perle-Perle mode, målte vi foråret konstanter af FGN-integrin αIIbβ3 obligation som kmol = 0,53 ± 0,29 pN /nm (Figur 3C) fra 33 pre-screened analyseres begivenheder.
| Symbol | Definition | Symbol | Definition |
| Δxtot | Den samlede forskydning af piezoen, som også kan fortolkes som den samlede deformation af RBC, målcelle og molekylær binding. | ΔxRBC | RBC deformation, som også kan fortolkes som forskydning af Probe perle. |
| ktot | Den samlede fjederkonstant i hele BFP's serielle fjedersystem. | kRBC | Fjederkonstanten af den indsugnings-RBC af Probe-mikropipetten. |
| kmol | Fjederkonstanten i BFP opdagede molekylær binding | kcelle | Fjederkonstanten i målcellen. |
| k1 | ktot af kompressiv fase i tilbagetrækningsfasen. | k2 | ktot af trækfasen i tilbagetrækningsfasen. |
| ΔF1 | Den kraftforøgelse, som sondeperen fornemmer i trykfasen. | ΔF2 | Den kraftforøgelse, som sondeperen fornemmer i trækfasen. |
| Δx1 | Forøgelsen af forskydningen i kompressiv fase. | Δx2 | Tilvæksten af forskydning i trækfasen. |
Tabel 1. Symboldefinitioner for BFP's molekylære forårskonstantanalyse. Vandrette positioner for alle objekter defineres som x, mens Δx [nm] refererer til deformationen i forhold til den oprindelige position. ΔF [pN] refererer til kraftforøgelsen målt af BFP. k [pN/nm] refererer til fjederkonstanten. Sænkede skrift 1 og 2 svarer til henholdsvis kompressive og trækfaser. Den molekylære fjederkonstant er afledt af Kraften (F) vs. Forskydning (Δxtot)kurve.
Figur 1: BFP-konfiguration og DFS-berøringscyklus. (A) BFP-systemet samler to modsatrettede mikropipetter, nemlig sonden (venstre) og Target (højre). Probe mikropipetten aspirerer en RBC (rød) med en glasperle limet på toppen til at tjene som en kraft transducer. Target-mikropipetten aspireerer en receptorbærende celle (blå). RBC fjederkonstanten (kRBC) bestemmes af aspirationstrykket (Δp) og radierne fra indsugnings-RBC (R0), Probemikropipetten (Rp) og det cirkulære kontaktområde (Rc) mellem RBC og sondeperen. (B og C) Mikrografer af BFP-tilstandene (Perle-Celle) og Perle-Perle (C). Skalastænger = 5 μm. (D) En BFP-berøringscyklus, der består af indflyvnings-, berørings-, kontakt-, tilbagetræknings- og dissociate-faser. ΔxRBC = 0-stregen angiver BFP'ens ikke-overbelastede eller nul-kraft-position. Tilbagetrækningsfasen omfatter kompressiv fase (ΔxRBC < 0, rød), nulkraftsposition (ΔxRBC = 0, sort) og trækfase (ΔxRBC > 0, blå) i rækkefølge. Sort pil angiver placeringen af Bond-hændelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udlede molekylære fjederkonstanter fra DFS-rådata. (A) Repræsentativ kraft (F) vs. Tid (t)kurve af DFS-rådata i én BFP-berøringscyklus. (B) Repræsentativ konverteret kraft (F) vs. Forskydning (Δxtot)kurve, der skildrer tilbagetrækningsstadiet. k1 og k2 repræsenterer henholdsvis pasformshæningen i de på hinanden følgende tryk- og trækfaser. ΔF1 og ΔF2 repræsenterer kraftforøgelserne i henholdsvis kompressive fase- og trækfasedata, hvor henholdsvis Δx1 og Δx2 repræsenterer forskydningsforøgelserne i henholdsvis kompressive fase- og trækfasedata. R2-værdier for fjederkonstant i trykfasen (R12) og trækfasen (R2 2) er mærket på grafen for at angive god statistisk kondition. (C og D) Illustrationer af tilbagetrækningsfasen i forsøgstilstandene Perlecelle (C) og Perleperle (D). kRBC repræsenterer RBC's forårskonstant; kcelle og kmol repræsenterer henholdsvis målcellens og molekylærbindingens fjederkonstanter. I trækfasen dannes vedhæftningen mellem ligand-receptorparret, RBC afleder i samme retning som piezo trækker sig tilbage ud over nul-kraft position (ΔxRBC > 0). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative histogrammer af BFP målte fjederkonstanter. Hændelsesnummeret (venstre y-akse) og frekvensfordelingen (højre y-akse) af målte fjederkonstanter for Thy-1-integrin α5β1 binding (A) og K562 Målcelle (B) i perlecelletilstanden og FGN-integrin αIIbβ3-binding (C) i Perle-Perle-tilstand. Histogrammer er egnet med gaussisk fordelingskurve (pink) og den statistiske parameter, R2, bruges til at angive styrken af fitness. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Den hjemmelavede BFP-grænseflade. (A) BFP-kontrol- og parameterindstillingsgrænseflade. Parametrene til bestemmelse af RBC fjederkonstant indtastes fra panelet af biofysiske parametre. B) BFP-overvågning. Live BFP touch cykler vil blive observeret fra dette kamera visning. (C) BFP DFS-analysegrænseflade, hvor Force (F) vs. Time (t)kurverne offline gennemgås og forbehandles til efterfølgende molekylær forårskonstantanalyse. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S2. BFP-kriterier for datakvalitetskontrol og præscreening. (A) Gode DFS-begivenheder af høj kvalitet: (i) Biad-Cell brudstyrke begivenhed; ii) Levetidshændelse for perleceller — Biad-Perle brud kraft begivenhed (iv) Perle-Perle levetid begivenhed. (B) Acceptable DFS-hændelser med en vis støj: (i) Data, der driver, men zoom-in Retract-fasen forbliver gyldig; ii) Små data, der driver efter bindingsbinding; iii) Data kink ved nul-kraft-regimet — Bedriftsstyrken er lille (< 10 pN). C) Hændelser af dårlig kvalitet, der bør kasseres: (i) Ingen vedhæftning; — Datasvingninger iii) Data, der driver hele tiden iv) Diskontinuerlige data v) Trykkraft for lille (≈ 0 pN) vi) Flere obligationer vii) Ugyldige data med afledt kmol < 0; viii) Signalfejl. Nul kraft er angivet med den grå intermitterende linje. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenfattende har vi leveret en detaljeret dataanalyseprotokol til forbehandling af DFS-rådata og udlede molekylære fjederkonstanter i BFP Bead-Bead- og Perlecelleanalysetilstandene. Biomekaniske modeller og ligninger, der kræves til bestemmelse af molekylære og cellulære fjederkonstanter præsenteres. Selvom forskellige integriner studeres, har kmol målt ved Perle-Perle-tilstanden og Perlecelletilstanden betydelige rækkeviddeforskelle (Figur 3A vs. Figur 3C). Bemærk, med Perle-Perle tilstand, receptoren er kovalent knyttet til glas perlen. I modsætning hertil er overfladereceptoren med Perlecelletilstanden tilpasset af den underliggende plasmamembran og cytoskeletoner, som sandsynligvis påvirker den målte kmol.
Datakvalitetskontrol er afgørende for at sikre reproducerbarheden. Til dette formål har vi implementeret DFS-data før screening og outlier udelukkelseskriterier på Force vs. Time-plots. For at demonstrere dette blev der valgt et repræsentativt datasæt, hvor vi kategoriserede DFS-rådata i tre kvalitetsniveauer: God (Figur S2A), Acceptabel med støj (Figur S2B) og Dårlig uacceptabel (Figur S2C). For begyndere af at bruge BFP anbefaler vi de strenge kriterier for at forhåndsscreene dataene med den gode kvalitet (Figur S2A). Det skal bemærkes, at regressionslinjen i trykfasen er baseret på kriterierne for datascreening, der skal være stejlere end trækfasens, specifikt k1 > k2 ( FigurS2C, vii). Målt k1 < k2 ( FigurS2C, vii), er den afledte kmol < 0 mod rationalet pr. beregning i trin 4. Sådanne hændelser bør derefter betragtes som de ugyldige outliers og kasseres.
For at favorisere BFP-målingen på enkelt molekylært niveau under dataindsamling er flere eksperimentelle konfigurationer blevet implementeret i henhold til tidligere undersøgelse12. For det første titreres proteinbelægningstætheden på perler normalt ned til et minimalt niveau (f.eks. 60 μm-2) ved nøje at kontrollere opløsningskoncentrationen, mængden af proteinet og reaktionsbetingelserne15. Den gennemsnitlige rumlige afstand mellem proteiner på perlen anslås derved meget større end proteinets lineære dimensioner, hvilket favoriserer vores målinger på enkelt molekylært niveau12,13,14. For det andet kontrollerer vi vedhæftning frekvensen for hver ligand-receptor par ≤ 20%, hvorunder molekylær bindende begivenheder vil følge Poisson distribution forudsige ≥ 89% af begivenhederne ville være single-molekylær bindende14,15. For at opnå dette, impingement kraft og kontakt tid er fastsat i overensstemmelse hermed og skal være konsekvent i hele eksperimentet12. Ikke desto mindre er det stadig muligt, at flere obligationer forekommer sekventielt (Figur S2C, vi). I sådanne tilfælde vil vi kassere begivenhederne med underskrifter af flere obligationer. Sidst men ikke mindst vil der blive udført negative kontrolforsøg med perler belagt med kvægserumalbumin (Materialetabel) eller SA alene for at sikre, at den ikke-specifikke vedhæftning frekvens er ≤2% 16,17.
Selvom BFP er kraftfuld til at undersøge proteindynamikken på levende celleoverflade10,11,12, er der tekniske begrænsninger. I BFP kan kun et ligand-receptorpar undersøges ad gangen. Det ville være tidskrævende at indhente tilstrækkelige data med statistisk signifikans. Desuden er de eksperimentelle procedurer arbejdskrævende med stejle indlæringskurver. Implementeringsmæssigt er det nuværende BFP-system modtageligt for den miljømæssige drifting og omgivende mekaniske vibrationer. Som følge heraf kræves kontinuerlig manuel justering for at sikre DFS-datakvaliteten. Til dette formål har en af vores seneste undersøgelser introduceret ultrastabile BFP feedback kontrol algoritmer til at forbedre stabiliteten af BFP kraft-klemme DFS assays4. Dette tekniske fremskridt muliggør målinger af stærkere molekylær interaktion såsom antigen-antistofbinding med ultralang bindingslevetid (>50'erne). Ikke desto mindre forudser vi, at der vil blive gjort en fremtidig indsats for at automatisere og integrere BFP-dataindsamlingen og DFS-analysen i ét edb-program, hvilket gør hele BFP-driften og dataanalysen mere brugervenlig og højgennemsigtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser til at rapportere om denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi takker Guillaume Troadec for nyttige diskussion, Zihao Wang for hardware høring, og Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning og Simon Ringer for støtte til vores lab opstart. Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator-prisen (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) og University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju er en australsk Research Council DECRA stipendiat (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
