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Cancer Research

लक्षित नैनोकणों के अध्ययन के लिए स्तन कैंसर के सिंजेनिक मुरीन मॉडल से प्राथमिक कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62504
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 3, 2, 1,2
1Istituti Clinici Scientifici Maugeri IRCCS, 2Dipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche “L. Sacco”, Università di Milano, 3Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca
* These authors contributed equally

Summary

इस पत्र का उद्देश्य ट्रिपल-निगेटिव स्तन कैंसर के सिंजेनिक मुरीन मॉडल से प्राथमिक कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास नैनोकणों के प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए उनके आवेदन का उद्देश्य है।

Abstract

कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के संदर्भ में प्रमुख अभिनेता हैं। ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में संख्या में कम होने के बावजूद, CAFs ट्यूमर प्रगति को विनियमित और एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा से सुरक्षा प्रदान करते हैं । उभरती कैंसर रोधी रणनीतियों का उद्देश्य ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को प्रो-ट्यूमरजेनिक सीएएफ या सीएएफ कार्यों के पुनर्प्रोग्रामिंग और उनकी सक्रियण स्थिति के एब्लेशन के माध्यम से फिर से तैयार करना है। एक आशाजनक दृष्टिकोण नैनोसाइज्ड डिलीवरी एजेंटों का विकास है जो सीएएफ को लक्षित करने में सक्षम हैं, इस प्रकार दवाओं और सक्रिय अणुओं के विशिष्ट वितरण की अनुमति देते हैं। इस संदर्भ में, सीएएफ का एक सेलुलर मॉडल इन विट्रो स्क्रीनिंग और ऐसे नैनोफॉर्मेशन की प्रारंभिक जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है।

इस अध्ययन में ट्रिपल-निगेटिव ब्रेस्ट कैंसर के सिनेजेनिक 4T1 मुरीन मॉडल से प्राइमरी सीएएफ के अलगाव और संस्कृति का वर्णन किया गया है । चुंबकीय मोतियों का उपयोग 2-चरण की पृथक्करण प्रक्रिया में अलग ट्यूमर से सीएएफ निकालने के लिए किया गया था। प्रक्रिया उपज को सत्यापित करने के लिए प्रत्येक मार्ग के बाद प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके इम्यूनोफेनोटाइपिंग नियंत्रण किया गया था। ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट से निपटने के लिए डिज़ाइन किए गए विभिन्न नैनोफॉर्मुलेशन की लक्षित क्षमता का अध्ययन करने के लिए अलग-थलग सीएएफ को नियोजित किया जा सकता है। फ्लोरोसेंटली लेबल एच-फेरिटिन नैनोकेज को विधि स्थापित करने के लिए उम्मीदवार नैनोकणों के रूप में इस्तेमाल किया गया था। नैनोकणों, या तो नंगे या एक लक्ष्यीकरण ligand के साथ संयुग्मित, CAFs के लिए उनके बाध्यकारी के लिए विश्लेषण किया गया । परिणाम बताते हैं कि स्तन सीएएफ का पूर्व वीवो निष्कर्षण ट्यूमरजेनिक सीएएफ के विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए नैनोकणों का परीक्षण और सत्यापन करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली हो सकती है।

Introduction

पिछले दशकों के दौरान, यह स्पष्ट हो गया है कि ट्यूमर कोशिकाओं को मारना आमतौर पर द्रोह को समाप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं होता है, क्योंकि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट ट्यूमर को पतन और चिकित्सीय प्रतिरोध1,2को प्रेरित कर सकता है। एक उपन्यास प्रतिमान तो उभरा है: ट्यूमर स्ट्रोमा को लक्षित करने के लिए सहायक कारकों के ट्यूमर से वंचित है और इस तरह,कीमोथैरेपी3,4,5की प्रभावकारिता को बढ़ावा देने । विशेष रूप से, कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) कई ठोस ट्यूमर6, 7में एक दिलचस्पस्ट्रोमललक्ष्य हैं। सीएसीएफ कोशिकाओं का एक बहुत ही विषम समूह है जो विकास कारकों, साइटोकिन्स और केमोकिन्स के स्राव के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रणाली की कैंसर कोशिकाओं और कोशिकाओं के साथ बातचीत करता है; निर्माण और बाहेल मैट्रिक्स को फिर से तैयार करें; और मेटास्टेसिस फॉर्मेशन8, 9,10,11,12 ट्यूमर प्रकार के आधार पर, सीएएफ प्रो-ट्यूमरजेनिक कार्य दिखाते हैं, जबकि सीएएफ के अन्य उपप्रकारों में ट्यूमर-दमनकारी कार्य13,14लगते हैं। इस विरोधाभास को बेहतर ी से स्पष्ट करने के लिए, प्राथमिक और मेटास्टैटिक ट्यूमर से सीएएफ का पूरी तरह से लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण है।

इस संदर्भ में, अनुसंधान के एक उभरते क्षेत्र ने ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट 15 , 16 ,17,18,18को फिर से तैयार करने में सक्षम सक्रिय अणुओं और दवाओं को वितरित करके सीएएफ को लक्षित करने और/या नष्ट करने के लिए डिज़ाइन किए गए नैनोसाइज्ड एजेंटों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है । साइटोटॉक्सिक दवाओं द्वारा सीएएफ एब्लेशन प्राप्त करने, सीएएफ-लक्षित फोटोडायनामिक थेरेपी को प्रेरित करने, या सीएएफ को एक क्विसेंट राज्य में वापस लाने या टीएनएफ से संबंधित एपोप्टोसिस प्रेरित लिगांड अभिव्यक्ति को प्रेरित करके सीएएफ एब्लेशन प्राप्त करने के लिए कई प्रकार के नैनोकणों को डिजाइन किया गया है, जो पड़ोसी कैंसर कोशिकाओं16, 19के एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है। इसके अलावा, सक्रिय रूप से विशिष्ट जैविक मार्कर को लक्षित करने के लिए कई नैनोकणों की क्षमता सीएएफ सबसेट का चयन करने के लिए लक्ष्य की आशा को जंम देता है । हालांकि सीएएफ के लिए इसकी पूर्ण विशिष्टता पर अभी भी सवाल उठाया जाता है, फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन प्रोटीन (एफएपी) प्रो-ट्यूमरजेनिक स्ट्रोमा के सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक है और नैनोड्रग डिलीवरी चलाने के लिए शोषण किया जाता है, इस प्रकार सीएएफ-लक्षित नैनोथेरेप्यूटिक्स20,21,22के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त होता है।

यह पेपर मुरीन स्तन कैंसर के एक सिनेजेनिक मॉडल से प्राथमिक सीएएफ के अलगाव का वर्णन करता है और सीएएफ मार्कर, एफएपी को पहचानने के लिए इंजीनियर नैनोकणों की लक्षित क्षमता के अध्ययन में उनके उपयोग की रिपोर्ट करता है। फेरिटिन नैनोकेज का उपयोग विधि स्थापित करने के लिए उम्मीदवार नैनोसिस्टम के रूप में किया जाता है, क्योंकि वितरण की उनकी विशिष्टताको 23, 24को लक्षित करने के सतह जोखिम से आकार दिया जा सकता है। इसके अलावा, फेरिटिन को एंटीट्यूमर अनुप्रयोगों के लिए उत्कृष्ट जैव संगत शटल के रूप में सफलतापूर्वक साबित किया गया है, जिससे ट्यूमरद्रव्यमान25, 26,27में पेलोड के तेजी से संचय को ट्रिगर कियागयाहै। आज तक, सीएएफ-टार्गेटिंग नैनोसिस्टम्स के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों पर विट्रो परीक्षण में शामिल किया है, जो कोशिका सक्रियण को प्रेरित करने के लिए विकास कारक-बीटा को बदलने के साथ संस्कृति में उत्तेजित है और सीएएफ28,29की कुछ इम्यूनोफेनोटिक विशेषताओं की अभिव्यक्ति है। यह विधि आमतौर पर अमर कोशिका लाइनों (जैसे NIH3T3, LX-2) पर लागू होती है और यह काफी तेजी से और सरल होती है, जो कुछ घंटों या दिनों में सक्रिय कोशिकाओं को उत्पीड करती है। एक सीमा यह है कि हालांकि इन विट्रो उत्तेजना कुछ जीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय myofibroblasts के लिए जिम्मेदार ठहराया प्रेरित करती है, यह पूरी तरह से वास्तविक CAFs की सभी जैविक विशेषताओं, विशेष रूप से वीवो मेंउनकी विषमता को फिर से नहीं बदल सकता है।

एक अन्य रणनीति में मानव या माउस ट्यूमर के नमूनों से प्राथमिक सीयूएफ निकालना शामिल है30,31. यह सुनिश्चित करता है कि सीएएफ सक्रियण एक शारीरिक संदर्भ में होता है, और सीएएफ उपजनसंख्या की विषमता को बनाए रखा जाता है। अनुसंधान उद्देश्य के अनुसार, CAFs विभिन्न स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार सबसे विश्वसनीय स्थिति का अध्ययन करने की संभावना की पेशकश की । प्रोटोकॉल यहां रिपोर्ट वैज्ञानिकों जो एक murine स्तन कैंसर मॉडल से CAFs लक्ष्य डिजाइन उपन्यास नैनोकणों की कार्यक्षमता का प्रारंभिक मूल्यांकन करने की तलाश के लिए मूल्यवान होगा । अलग CAFs उन नैनोकणों कि काफी वादा कर रहे है कैंसर के पशु मॉडल में वीवो मूल्यांकन में आगे बढ़ने की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी होगा । यह नैनोपार्टिकल उत्पादन के पहले चरणों के दौरान प्रासंगिक होगा, मुख्य रूप से इष्टतम लक्ष्यीकरण गुणों को प्राप्त करने के लिए लिगांड स्थिरीकरण की रणनीति पर विचार करके नैनोकणों को नैनोपार्टिकल डिजाइन के शोधन की ओर चलाना।

Protocol

1. स्तन कैंसर का एक सिनेजेनिक 4T1 मॉडल की स्थापना

नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल एक माउस 4T1 स्तन ट्यूमर से प्राथमिक CAFs के अलगाव का वर्णन करता है । यहां वर्णित पशु अध्ययन को इटली के स्वास्थ्य मंत्रालय (ऑट. संख्या 110/2018-पीआर) ने मंजूरी दे दी है।

  1. ट्यूमर सेल संस्कृति और प्रत्यारोपण
    1. गल 1 × 106 4T1-ल्यूस कोशिकाओं के साथ एक T75 फ्लास्क में रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) १६४० मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस), और 1% एल-amine ग्लूट के साथ पूरक । संस्कृति माध्यम में Mycoplasma हटाने एजेंट (1:100) जोड़ें।
      नोट: 4T1-ल्यूक कोशिकाएं लूसिफ़ेरेस को स्थिर रूप से व्यक्त करती हैं और डी-लूसिफ़ेरिन के साथ उचित उत्तेजना पर बायोल्यूमिनेसेंस (BLI) द्वारा कल्पना की जा सकती है। यह चूहों(चित्रा 1)में प्रत्यारोपण पर ट्यूमर कोशिकाओं की व्यवहार्यता और प्रसार की वीवो निगरानी में अनुमति देता है।
    2. हर 2 दिन में माध्यम बदलकर,~80% संगम तक आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर कोशिकाओं को बनाए रखें।
      नोट: चूहों में इंजेक्शन से पहले 1 सप्ताह (~ 2/3 मार्ग) के लिए Mycoplasma हटाने एजेंट के साथ उपचार जारी रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इंजेक्शन कोशिकाएं माइकोप्लाज्मा-मुक्त हैं।
    3. प्रक्रिया के दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्राइप्सिन-एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान (ट्राइप्सिन 1:250) के 1 मिलीलन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें। संस्कृति माध्यम जोड़कर ट्रिप्पसिन गतिविधि बंद करो, ट्राइपैन ब्लू (1:1) के साथ कोशिकाओं की गिनती, और कोशिकाओं की संख्या की गणना/
    4. 1 × 106 कोशिकाओं और 400 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के लिए इसी मात्रा पिपेट। सुपरनैंट से डालो, और आरपीएमआई 1640 बेस मीडियम के 1 एमसीएल में गोली को फिर से खर्च करें। इंजेक्शन के लिए तैयार होने तक कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
      नोट: प्रत्येक माउस के लिए, 1 × 105 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है; हालांकि, हमेशा सिरिंज लोडिंग को कम करने के लिए 2 चूहों (2 ×10 5 कोशिकाओं के अनुरूप) की अधिकता की गणना करें।
    5. ऑपरेशन से एक दिन पहले, दाईं ओर पेट स्तन ग्रंथियों के क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए 8 BALB/c चूहों (महिला, सात सप्ताह पुराने) के फर दाढ़ी । एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करें और 4 मिनट के लिए डिपिलेटरी क्रीम की एक पतली परत लागू करें; फिर, पानी और कागज के एक टुकड़े के साथ क्रीम को धो लें।
    6. ~ 5 मिनट के लिए 2% आइसोफ्लून गैस के निरंतर साँस लेने से संज्ञाहरण प्रेरित करें, और 27 ग्राम ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज के साथ पेट के स्तन ग्रंथियों के क्षेत्र में एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन करें। त्वचा में चमड़े के नीचे प्रवेश करने के लिए सुई को ऊपर की ओर घुमाएं; फिर, त्वचा को ऊपर की ओर पकड़ें और धीरे-धीरे सेल निलंबन (1 × 105 कोशिकाओं) के 100 माइक्रोन इंजेक्ट करें। धीरे-धीरे सिरिंज से मुकर जाने से पहले सुई को थोड़ा बदल दें।
      नोट: इंजेक्शन से पहले कमरे के तापमान 15 मिनट के लिए सेल निलंबन लाने के लिए याद रखें ।
  2. ट्यूमर विकास और विच्छेदन
    1. 5 दिनों के बाद सेल इंजेक्शन, इंजेक्शन 150 मिलीग्राम/किलो डी-लूसिफ़ेरिन इंट्रापेरिटोनेली (100 माइक्रोल) इमेजिंग से पहले 5 मिनट। 10 एस एक्सपोजर, मीडियम बिनिंग और एफ/स्टॉप की स्थापना के लिए वीवो इमेजिंग सिस्टम में एक का उपयोग करके BLI छवियों को कैप्चर करें। ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) के रूप में ट्यूमर के ल्यूमिनेसेंट क्षेत्र को परिभाषित करें, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आरओआई (फोटॉन/सेकंड/एम2)में कुल संकेत की मात्रा निर्धारित करें।
    2. BLI में वृद्धि के मामले में ट्यूमर के विकास की निगरानी करने के लिए इंजेक्शन से हर 5 दिनों में इमेजिंग (1.2.1) की प्रक्रिया दोहराएं।
    3. ट्यूमर की मात्रा स्थापित करने के लिए, माउस पकड़ और उसके पेट का पर्दाफाश। सप्ताह में एक बार ट्यूमर की लंबाई (एल) और चौड़ाई (डब्ल्यू) को मापने के लिए कैलिपर्स का उपयोग करें। समीकरण 1 का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा (वी) की गणना करें।
      [V = (एलx W 2)/2]     (1)
    4. सेल-इंजेक्शन के बाद 20 दिनों में, गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा जानवरों का बलिदान करें, कैंची के साथ त्वचा से ट्यूमर को अलग करें, और उन्हें ऊतक भंडारण समाधान में एकत्र करें (सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: ट्यूमर के नमूनों का उपयोग एकल कोशिकाओं (धारा 2) में वियोजन के लिए तुरंत किया जा सकता है या 48 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. ट्यूमर एकल कोशिकाओं में वियोजन

नोट: निम्नलिखित चरणों के लिए, लैमिनार फ्लो हुड में बाँझ अभिकर्मक और डिस्पोजेबल का उपयोग करें। एक बार में 4 ट्यूमर के साथ काम करें।

  1. ट्यूमर के नमूने को पेट्री डिश में रखें, और चिमटी और स्केलपेल की मदद से त्वचा, वसा और परिगलित क्षेत्रों के किसी भी टुकड़े को ध्यान से हटा दें। फिर, ट्यूमर को लगभग 1-2 मिमी के छोटे टुकड़ों में कम करें और उन्हें एक ट्यूब(चित्रा 2 ए)में स्थानांतरित करें।
    नोट: 4T1 ट्यूमर अत्यधिक परिगलित हो जाते हैं, जबकि बढ़ती है, अल्सर की प्रवृत्ति के साथ । अगले चरणों के साथ मलबे के किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए परिगलित क्षेत्रों को सावधानीपूर्वक हटाना महत्वपूर्ण है।
  2. ट्यूमर वियोजन के लिए पाचन मिश्रण तैयार करें: आरपीएमआई 1640 माध्यम के 2.35 एमएल, एंजाइम डी के 100 माइक्रोन, एंजाइम आर के 50 माइक्रोन, और एंजाइम ए के 12.5 माइक्रोन घोल में ट्यूमर के टुकड़ों को भिगोएं और ट्यूब को कसकर बंद करें।
    नोट: पाचन मिश्रण की संकेत मात्रा 1 ग्राम तक ट्यूमर के लिए मान्य हैं और उनके वजन के अनुसार बड़े ट्यूमर के लिए समायोजित किया जा सकता है। 4T1 ट्यूमर 20 दिनों के लिए उगाया आम तौर पर 0.5-0.8 ग्राम की सीमा में हैं।
  3. ट्यूब को उल्टा करें, जांच करें कि ट्यूमर के सभी टुकड़े ट्यूब के नीचे टोपी की ओर खड़े हैं। उचित आवास में एक यांत्रिक वियोजना के लिए ट्यूब संलग्न करें, और कठिन ट्यूमर के लिए डिज़ाइन किए गए एक विशिष्ट वियोजन कार्यक्रम चलाएं (निर्माता के निर्देश देखें)।
    नोट: विशेष ट्यूबों को वियोजन में फिट करने की आवश्यकता हो सकती है। सी-ट्यूब ऊतक के यांत्रिक वियोजन को बढ़ावा देने के लिए टोपी के अंदर एक रोटर सहन करते हैं।
  4. ट्यूब को अलग करें, इसे उल्टा बनाए रखें, और कोमल झटकों के साथ 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें। फिर, उचित आवास में वियोजन के लिए ट्यूब देते हैं, और दो बार कठिन ट्यूमर के लिए डिज़ाइन किए गए निम्नलिखित विशिष्ट वियोजन कार्यक्रम चलाते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया के अंत में ऊतक के कोई बड़े टुकड़े नहीं हैं(चित्रा 2B)।
    नोट: ट्यूमर को अलग करने के लिए, अन्य एंजाइम कॉकटेल का उपयोग बाह्य मैट्रिक्स को नीचा दिखाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्यूमर वियोजन किट जिसमें एक अनुकूलित एंजाइम मिश्रण (एंजाइम डी, आर, ए) और एक अर्ध-स्वचालित वियोजनक होता है जो यांत्रिक रूप से ऊतक को अलग करता है, का उपयोग किया जाता था। इस संयोजन ने सेल अखंडता और सेल सतह एपिटोप के रखरखाव के साथ-साथ एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स का उचित क्षरण सुनिश्चित किया।
  5. एक 50 एमएल ट्यूब में 40 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से नमूना फ़िल्टर करें, आरएमआई 1640 माध्यम के 10 एमएल के साथ फ़िल्टर धोएं, और 300 × ग्राम पर 7 मिनट के लिए ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। यदि सेल पेलेट लाल दिखाई देता है, तो अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) के 1 एमएल जोड़कर, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बफर को धोएं, आरपीएमआई 1640 के 10 एमएल से धोएं, सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और फिर से सेंट्रलाइज करें।
  6. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), और 2 एमएम ईडीटीए से बना पीबीई बफर के 1 मिलीलन में गोली को फिर से रीसुस्ट करें, और ट्राइपैन ब्लू (1:1) के साथ कोशिकाओं की गिनती करें। सेल झुरमुट के मामले में, पहले पीबीएस से लथपथ 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
    नोट: विशेष रूप से जब ट्यूमर बड़े होते हैं, तो सेल काउंट की जांच करना महत्वपूर्ण होता है और अंततः प्रत्येक ट्यूब में प्रत्येक ट्यूमर के नमूने को अलग-अलग ट्यूबों में विभाजित करना महत्वपूर्ण होता है, जिसमें प्रत्येक ट्यूब में 10 से अधिक कोशिकाएं नहीं होती हैं।
  7. 20x बाध्यकारी बफर स्टॉक समाधान को कमजोर करके मृत सेल रिमूवल बाइंडिंग बफर तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें) बाँझ डबल-आसुत पानी के साथ। 1× बाइंडिंग बफर(चित्रा 2C)के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं ।
    नोट: बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  8. 300 × जी पर 7 मिनट के लिए सेंट्रलाइज, और मृत सेल हटाने माइक्रोमोतियों के 0.1 एमएल के साथ सेल पेलेट को फिर से खर्च करें (सामग्री की तालिकादेखें)। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
  9. मोतियों के साथ इनक्यूबेशन के दौरान, हुड के नीचे एक चुंबकीय स्टैंड तैयार करें और नीचे की ओर इशारा करते हुए सुझावों के साथ उस पर फेरोमैग्नेटिक सेपरेशन कॉलम (107 कोशिकाओं तक के लिए एक कॉलम) लटकाएं। 0.5 एमएल ठंडे 1× बाइंडिंग बफर के साथ कॉलम को बराबर करें। जब तक समाधान गुरुत्वाकर्षण के तहत के माध्यम से प्रवाहित किया गया है रुको ।
    नोट: कॉलम बिस्तर को थक्के बनाने और वसूली उपज को कम करने के किसी भी जोखिम से बचने के लिए प्रति कॉलम कोशिकाओं की संख्या से अधिक नहीं होना महत्वपूर्ण है। 107 से अधिक कोशिकाओं के साथ काम करते समय, या तो कोशिकाओं की कुल संख्या के अनुसार अधिक कॉलम का उपयोग करें या बड़े स्तंभों का उपयोग करें। ऐसे मामलों में, निर्माता द्वारा इंगित लोगों को निम्नलिखित चरणों में वर्णित अभिकर् तावों को समायोजित करें।
  10. इनक्यूबेशन के अंत में, मनका/सेल निलंबन के लिए ठंड 1× बाध्यकारी बफर के ४०० μL जोड़ें, कॉलम पर पूरी मात्रा लोड, और एक 15 एमएल ट्यूब में बहिस्त्राव (अवेलेबल कोशिकाओं के अनुरूप) इकट्ठा ।
  11. कॉलम को ठंडे 1× बाध्यकारी बफर के 0.5 एमएल के साथ चार बार धोएं, और एक ही ट्यूब में कुल प्रवाह (जीवित कोशिका अंश के अनुरूप) एकत्र करें।
  12. ट्राइपैन ब्लू (1:1) के साथ कोशिकाओं की गणना करें। फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) के लिए दो ट्यूबों में 1 × 105 कोशिकाओं को रखें, और प्रक्रिया सत्यापन तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (चरण 4.1 देखें): विश्लेषण मापदंडों और सकारात्मकता के क्षेत्रों (नियंत्रण ट्यूब) और बायोमार्कर विश्लेषण (नमूना ट्यूब) के लिए दूसरे का उपयोग करें। CAFs निष्कर्षण के लिए शेष कोशिकाओं का उपयोग करें (धारा 3 देखें) ।
    नोट: धारा 3 में माइक्रोमोतियों के साथ गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए मृत कोशिकाओं को हटाना महत्वपूर्ण है। हालांकि, उपज में सुधार करने के लिए, मृत कोशिकाओं को हटाने से बचें यदि मृत कोशिकाओं का अनुपात <20% है।

3. स्तन ट्यूमर से प्राथमिक CAFs की निकासी

नोट: धारा 3 के लिए, माउस ट्यूमर-संबद्ध फाइब्रोब्लास्ट आइसोलेशन किट का उपयोग करें जिसमें गैर-ट्यूमर-संबद्ध फाइब्रोब्लास्ट कमी कॉकटेल और ट्यूमर-संबद्ध फाइब्रोब्लास्ट माइक्रोमोतियों को कोशिकाओं की चुंबकीय लेबलिंग के लिए अनुकूल बनाया गया है (सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. गैर-कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की कमी
    1. पीबीएस के साथ 70 माइक्रोन सेल छन्नी को गीला करें, और किसी भी झुरमुट को हटाने के लिए सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। फिर, 300 × जी पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
      नोट: यदि एक भी ट्यूमर कदम २.७ के लिए दो नमूनों में विभाजित किया गया था, पूल सेल निलंबन दो से दो कदम ३.१.२ के साथ आगे बढ़ने से पहले ।
    2. ठंडे PBE बफर के 80 माइक्रोन में गोली को फिर से ढिंढा करें, और गैर-ट्यूमर-संबद्ध फाइब्रोब्लास्ट कमी कॉकटेल के 20 माइक्रोल जोड़ें। अंधेरे में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    3. मोतियों के साथ इनक्यूबेशन के दौरान, एक चुंबकीय स्टैंड पर फेरोमैग्नेटिक घटता कॉलम (1 प्रति नमूना) तैयार करें, और ठंडे पीबीई बफर के 2 एमएल के साथ स्तंभों को बराबर करें। जब तक समाधान के माध्यम से प्रवाहित किया गया है रुको ।
    4. इनक्यूबेशन के अंत में, मनका/सेल निलंबन के लिए ठंडे PBE बफर के ४०० μL जोड़ें, कॉलम पर पूरी मात्रा लोड, और एक 15 मिलीएल ट्यूब में प्रवाह (अवेलेबल कोशिकाओं के अनुरूप) इकट्ठा ।
    5. कोल्ड पीबीई बफर के 2 एमएल के साथ कॉलम को दो बार धोएं, और एक ही ट्यूब में कुल प्रवाह एकत्र करें। 300 × जी पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और कोल्ड पीबीई बफर के 0.1 एमएल में रिसिपेंड।
      नोट: गैर कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की कमी से बरामद कोशिकाओं की कुल मात्रा में काफी कमी आती है । यह आम तौर पर आवश्यक है और चरण 3.2 के लिए एक दृश्यमान गोली और पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए चार अलग-अलग नमूनों से पूल सेल निलंबन की सिफारिश की जाती है। इससे इष्टतम उपज सुनिश्चित होगी।
    6. एक FACS ट्यूब में सेल निलंबन के 20 μL रखें और प्रक्रिया सत्यापन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (धारा 4 देखें) । सीएएफ चयन के लिए शेष कोशिकाओं का उपयोग करें (चरण 3.2 देखें)।
  2. कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट का सकारात्मक चयन
    1. ट्यूमर के 20 माइक्रोन-एसोसिएटेड फाइब्रोब्लास्ट माइक्रोमोतियों को सेल निलंबन के 80 माइक्रोन में जोड़ें। अंधेरे में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    2. मोतियों के साथ इनक्यूबेशन के दौरान, एक चुंबकीय स्टैंड पर फेरोमैग्नेटिक सेपरेशन कॉलम (1 प्रति नमूना) तैयार करें, और ठंडे पीबीई बफर के 0.5 एमएल के साथ कॉलम को बराबर करें। जब तक समाधान के माध्यम से प्रवाहित किया गया है रुको ।
    3. इनक्यूबेशन के अंत में, मनका/सेल निलंबन के लिए ठंडे PBE बफर के ४०० μL जोड़ें, कॉलम पर पूरी मात्रा लोड, और अवेलेबल कोशिकाओं के माध्यम से एक 15 एमएल ट्यूब में प्रवाह ।
    4. कॉलम को कोल्ड पीबीई बफर के 0.5 एमएल के साथ तीन बार धोएं, और एक ही ट्यूब में कुल प्रवाह एकत्र करें।
      नोट: प्रवाह के माध्यम से अवेलेबल CD90.2-नकारात्मक कोशिकाओं, जो गैर कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के रूप में खारिज किया जा सकता है शामिल हैं ।
    5. चुंबक से कॉलम निकालें और इसे 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। कॉलम पर ठंडे PBE के 1 एमएल जोड़ें, और तुरंत कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए स्तंभ में प्लंजर धक्का ।
    6. 400 × जी पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और कोल्ड पीबीई बफर के 0.1 एमएल में रिसिपेंड। एक FACS ट्यूब में सेल निलंबन के 20 μL रखें और प्रक्रिया सत्यापन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (धारा 4 देखें) ।
      नोट: अपकेंद्रित्र के बाद, गोली शायद ही दिखाई दे सकता है, खासकर जब मूल ट्यूमर छोटे होते हैं। शंकु नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग करें और किसी भी कोशिकाओं को खोने के लिए नहीं जब supernatant आकांक्षी सावधान रहना ।
    7. Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) की एक उपयुक्त मात्रा में शेष कोशिकाओं को पतला/हैम के एफ-12 15% FBS, 2 mM एल ग्लूटामीन, 1% पी/एस, और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक है, और एक ऊतक संस्कृति प्लेट में कोशिकाओं बीज ।
    8. एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल घनत्व की जांच करें, और कोशिकाओं का पालन और बढ़ने देने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: यदि कोशिकाएं बहुत घने हैं, तो तुरंत इनक्यूबेटर में प्लेट रखने से पहले कोशिका निलंबन को ऊतक संस्कृति प्लेट के दो कुओं में विभाजित करें।

4. प्रक्रिया सत्यापन

  1. फ्लो साइटोमेट्री
    नोट: धारा 4.1 बाँझ स्थितियों की आवश्यकता नहीं है और लैमिनार हुड के बाहर किया जा सकता है। चरण 2.11 (अलग ट्यूमर), चरण 3.1.6 (गैर-कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की कमी के बाद), और चरण 3.2.6 (कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के संवर्धन के बाद) में एकत्र किए गए नमूनों के लिए समानांतर में धारा 4.1 करें।
    1. 300 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए चरण 2.11, 3.1.6, और 3.2.6 में तैयार FACS ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
      नोट: कम से कम एक अतिरिक्त ट्यूब तैयार करें, जिसमें विश्लेषण के लिए पैरामीटर सेट करने के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करने वाली अन दाग कोशिकाएं शामिल हैं।
    2. नमूना ट्यूबों में, पीबीई के 88 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से ढंकें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट (फिटसी, 1:50 कमजोर पड़ने) और एंटी-सीडी 90.2 एंटीबॉडी के साथ 2-सीडी 45 एंटीबॉडी के 2 माइक्रोन जोड़ें, निर्माता के निर्देशों के अनुसार)। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट करें। नियंत्रण ट्यूब (अन दाग) में, पीबीई के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से पेंड करें। एंटीबॉडी-सना हुआ कोशिकाओं के लिए अपनाई गई प्रक्रिया को दोहराने के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: तापमान और इनक्यूबेशन के समय को ध्यान से जांचा जाना चाहिए, क्योंकि ऐसे चरों में भिन्नता के परिणामस्वरूप खराब या गैर-विशिष्ट धुंधला हो सकता है, इस प्रकार परिणामों में फेरबदल हो सकता है।
    3. इनक्यूबेशन स्टेप पूरा करने के बाद पीबीई के 1 एमएल जोड़कर वॉश करें। 300 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्याग दें।
    4. पीबीएस के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं (सभी ट्यूब) को फिर से र्ल्स करें।
    5. अच्छी तरह से मिलाएं और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें। एंटीबॉडी (यानी, फिटसी और पीई) के फ्लोरेसेंस को मापने के लिए चैनल सेट करें।
    6. नियंत्रण ट्यूब से, फॉरवर्ड बनाम साइड स्कैटर (एफएससी बनाम एसएससी) प्लॉट पर पहला गेट (पी 1) खींचकर सभी व्यवहार्य कोशिकाओं का चयन करें। पी 1 के भीतर, एक दूसरा गेट (पी 2) सेट करें जिसमें केवल एकल कोशिकाएं शामिल हैं।
    7. एंटीबॉडी (यानी, फिटसी और पीई) के विशिष्ट फ्लोरेसेंस चैनलों का उपयोग करके, सकारात्मक रूप से दाग कोशिकाओं को समझने के लिए उचित द्वार निर्धारित करें।
    8. विश्लेषण शुरू करें और P2 में कम से कम 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें। दोनों चैनलों से सिग्नल एक साथ पढ़ें।
      नोट: यदि कोशिकाओं की कुल संख्या उम्मीद से कम है, तो पूरी ट्यूब को पढ़ना बेहतर हो सकता है।
    9. (वैकल्पिक) यदि अतिरिक्त एंटीबॉडी/फ्लोरोफोरस के साथ आगे धुंधला प्रोग्राम किया जाता है, तो विश्लेषण शुरू करने से पहले एक उपयुक्त मुआवजा मैट्रिक्स सेट करें।
  2. सेल आकृति विज्ञान और विशेषताओं की निगरानी
    नोट: एक बार वरीयता प्राप्त, कोशिकाओं बाँझ परिस्थितियों में संभाला जाना चाहिए ।
    1. सीडिंग के बाद दिन में, कोशिका आसंजन और आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की कल्पना करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित करें।
      नोट: CAFs बड़े धुरी के आकार की कोशिकाओं, जो आसानी से 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं की epithelial की तरह संरचना से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
    2. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर आर्द्र वातावरण में बनाए रखें, हर2 दिनों में माध्यम बदलें।
    3. जब कोशिकाएं ~ 80% संगम तक पहुंचती हैं (सीडिंग के लगभग 4-6 दिन बाद), तो ट्रिप्ले सेलेक्ट सॉल्यूशन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें) कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए। ताजा माध्यम (4:1), 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र जोड़ें, और ताजा माध्यम में गोली को फिर से खर्च करें।
    4. कोशिकाओं को 1:2 विभाजित करें, और प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या प्राप्त होने तक संस्कृति का विस्तार करें।
    5. प्रत्येक मार्ग पर, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान और विकास की जांच करें। यदि कोशिका आकृति विज्ञान सजातीय नहीं है (उदाहरण के लिए, संस्कृति में प्रदर्शित होने वाली छोटी गोल आकार कोशिकाओं के क्लोन), धारा 4.1 में वर्णित प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं के नमूने का विश्लेषण करें। यदि सजातीय है, तो 4.2.7 कदम पर आगे बढ़ें।
      नोट: सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन गैर कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट द्वारा संदूषण का संकेत हो सकता है, जिसे संस्कृति शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए हटाने की आवश्यकता है ।
    6. प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों का विश्लेषण करें और निम्नलिखित परिदृश्यों में से एक के अनुसार आगे बढ़ें: (i) यदि CD90.2-/CD45-कोशिकाओं का संदूषण होता है, तो सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और चरण 3.2 का पालन करके सकारात्मक चयन दोहराएं; (ii) यदि सीडी 45 + कोशिकाओं का संदूषण भी होता है, तो सभी कोशिकाओं को एकत्र करें, और चरण 3.1 में कमी को दोहराएं; (iii) यदि कोई संदूषण नहीं होता है (केवल सीडी 90.2+/सीडी 45- कोशिकाएं मौजूद हैं), तो कोशिकाओं को संस्कृति में रखें और सीधे 4.2.7 तक आगे बढ़ें।
      नोट: माइक्रोमोतियों के साथ कमी की प्रक्रिया को दोहराने के रूप में सेल वसूली को कम करेगा, यह केवल जब कोशिकाओं को तुरंत इस्तेमाल करने की आवश्यकता नहीं है की सिफारिश की है ।
    7. ट्राइपैन ब्लू (1:1) के साथ कोशिकाओं की गणना करें, दो FACS ट्यूबों में 5 ×10 5 कोशिकाओं को रखें, और 300 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें। सुपरनैंट को त्यागें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 2% बीएसए, 2% बकरी सीरम के साथ पूरक बफर (पीबीएस) को अवरुद्ध करने के 0.5 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें।
      नोट: एक ट्यूब केवल दाग कोशिकाओं से मिलकर एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, जबकि दूसरी ट्यूब में कोशिकाओं प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए दाग दिया जाएगा ।
    8. 300 × जी पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज, सुपरनेट को त्यागें और बफर को अवरुद्ध करने के 99 माइक्रोल में रिसिपेंड करें। नमूना ट्यूब में एंटी-एफएप एंटीबॉडी का 1 माइक्रोन जोड़ें और नियंत्रण ट्यूब में बफर को अवरुद्ध करने का 1 एमएल। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
      नोट: FAP प्रतिक्रियाशील ट्यूमर स्ट्रोमा का एक सतह मार्कर है और CAFs की पहचान और विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    9. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने में फ्लोरोसेंट डाई (1 माइक्रोन) के साथ उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पीबीएस, अपकेंद्रित्र, और इनक्यूबेट के साथ तीन बार धोएं।
    10. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें (उपयोग किए गए फ्लोरोफोर का पता लगाने के लिए उपयुक्त चैनल सेट करके चरण 4.1.5 से 4.1.7 का पालन करें)। फिर, प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें (चरण 5.2)।
    11. (वैकल्पिक) 90% एफबीएस और 10% डिमेथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 1 एमसीएल में कोशिकाओं का एक नमूना फ्रीज करें; आगे के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. इंजीनियर फेरिटिन नैनोकणों द्वारा लक्ष्यीकरण सीएएफ

नोट: मानव फेरिटिन भारी श्रृंखला (एचएफएन) के एक पुनः संयोजन संस्करण का उपयोग नंगे नैनोपार्टिकल के रूप में किया जाता था या मोइटियों को लक्षित करने के साथ संयुग्मित किया जाता था। यहां, एचएफएन नैनोकणों को एक एंटी-एफएपी एंटीबॉडी (Fab@FAP) के चर भाग के साथ कार्यात्मक दो एचएफएन: Fab@FAP मोलर अनुपात, 1:1 और 1:5 में मिलानो-बिकोका विश्वविद्यालय में नैनोबायोलैब द्वारा तैयार किया गया था, जो पहले वर्णित प्रोटोकॉल32के अनुसार था।

  1. एचएफएन नैनोकणों की फ्लोरोसेंट लेबलिंग
    नोट: दोनों नंगे और कार्यात्मक एचएफएन नैनोकजेस फ्लोरोसेंट रूप से फिटसी के साथ लेबल किए गए हैं।
    1. 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 99% इथेनॉल में फिटसी पाउडर को भंग करें।
      नोट: यह समाधान हौसले से तैयार किया जाना चाहिए ।
    2. हर 1 मिलीग्राम प्रोटीन (यानी 10 मिलीग्राम/एमसीएल पर एचएफएन के 100 माइक्रोन) के लिए तैयार घोल (200 माइक्रोन ऑफ फिटसी) का 50 माइक्रोन इनक्यूबेट करें। 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3)के 50 माइक्रोन जोड़ें और वॉल्यूम को 0.1 एम एनएएचसीओ3के साथ 500 माइक्रोन में समायोजितकरें।
      नोट: प्रायोगिक जरूरतों के अनुसार मात्रा को स्केल करें।
    3. कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें, अंधेरे में, और 1 घंटे के लिए निरंतर सरगर्मी के साथ।
    4. स्पिन डेसाल्टिंग कॉलम (7 केडीए MWCO) का उपयोग करके जेल फिल्ट्रेशन द्वारा संजूगेट से फिटसी की अतिरिक्त राशि हटा दें।
    5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके बरामद लेबल वाले प्रोटीन की एकाग्रता का आकलन करें। क्रमशः 280 एनएम पर अवशोषण को मापने और 488 एनएम पर प्रोटीन और डाई की मात्रा का अनुमान लगाएं।
  2. सीएएफ के लिए एचएफएन नैनोकणों का बंधन
    नोट: संस्कृति में 4-5 मार्ग से बाद में सीएएफ का उपयोग करें।
    1. प्रत्येक FACS ट्यूब में 5 ×10 5 कोशिकाएं रखें, 300 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और पीबीएस के 0.5 एमएल में पुनर्व्यवित, 0.3% बीएसए नैनोकणों की विभिन्न तैयारियों के 0.1 मिलीग्राम/एमएल के साथ पूरक (नंगे एचएफएन, एचएफएन-Fab@FAP 1:1, एचएफएन-Fab@FAP 1:5) पहले फिटसी के साथ लेबल किया गया था।
      नोट: प्रत्येक स्थिति को ट्रिपलिकेट में चलाएं। एक अतिरिक्त ट्यूब को नियंत्रण अवेलेबल नमूने के रूप में तैयार करें जिसमें कोई नैनोकण नहीं जोड़ा जाता है।
    2. अंधेरे, अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट, और पीबीएस में तीन बार धोएं।
    3. 0.5 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से ढिंढाएं, अच्छी तरह से मिलाएं, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें। फिटसी के फ्लोरेसेंस को मापने के लिए चैनल सेट करें।
    4. लाइव सिंगल सेल पर गेटिंग करने के बाद, 20,000 घटनाओं का अधिग्रहण करें। फिटसी सकारात्मकता के गेट सेट करने और फिटसी+ घटनाओं (नैनोपार्टिकल बाइंडिंग के अनुरूप) का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए नियंत्रण अवेलेबल ट्यूब का उपयोग करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण और प्रयोगात्मक प्रतिकृति

  1. जीवधारी
    1. ट्यूमर विकास और CAFs अलगाव के तीन स्वतंत्र प्रयोगों प्रदर्शन, एक प्रयोग प्रति 8 जानवरों का उपयोग कर, के रूप में १.१.५ में वर्णित है । सीएएफ अलगाव उपज को अनुकूलित करने के लिए, उत्पादित ऊतकों को उपसमूहों (एन = 4) में विभाजित करें और धारा 2 में वर्णित चरणों के बाद उन्हें संसाधित करें।
  2. कोशिकाओं के साथ एचएफएन इंटरैक्शन
    1. फ्लोरोसेंटली लेबल वाले नैनोकेज द्वारा सकारात्मक रूप से दाग वाली कोशिकाओं के प्रतिशत के संदर्भ में लक्ष्य और गैर-लक्षित कोशिकाओं (सीएएफ और 4T1, क्रमशः) के साथ कार्यात्मक और गैर-कार्यात्मक एचएफएन की बातचीत का मूल्यांकन करें। तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत ± मानक विचलन के रूप में परिणामों की रिपोर्ट करें ।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. एचएफएन और एचएफएन-एफएपी के साथ सेल बाध्यकारी प्रयोगों में सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए, साधारण वन-वे एवुन परीक्षण का उपयोग करें।

Representative Results

इष्टतम CAFs अलगाव के लिए वीवो मॉडल सेट-अप में
महिला BALB/c चूहों के स्तन वसा पैड में10 5 4T1-ल्यूक कोशिकाओं के इंजेक्शन प्रत्यारोपण के बाद 5 दिनों में एक पता लगाने योग्य ट्यूमर द्रव्यमान के विकास की ओर जाता है । कैलिपर्स द्वारा ट्यूमर की मात्रा और BLI द्वारा ट्यूमर सेल व्यवहार्यता को मापने के द्वारा, ट्यूमर विकास प्रत्यारोपण के बाद एक महीने के लिए निगरानी की गई थी । एक बलिदान खिड़की है कि CAFs अलगाव के लिए पर्याप्त है खोजने के लिए, एक इष्टतम समझौता उच्च ट्यूमर आकार और BLI के बीच एक तरफ और एक उभरते ट्यूमर छालों और दूसरी ओर परिगलन(चित्रा 1)की मांग की थी । जैसा कि एक परिगलित कोर प्रत्यारोपण के 20 दिन बाद दिखाई देता है, और यह 25 और 30 दिनों में बढ़ता है (जैसा कि चित्रा 1Cमें BLI छवियों द्वारा प्रलेखित है), 20 दिन अलगाव प्रक्रिया के बाद सेल वसूली को अनुकूलित करने के लिए समय बिंदु के रूप में स्थापित किया गया था। पूर्व वीवोसे निपटने के दौरान ट्यूमर हैंडलिंग के पहले चरण के दौरान सभी दृश्यमान परिगलित क्षेत्रों को ध्यान से हटाने के बाद भी, मृत कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत एकल कोशिकाओं(तालिका 1)में वियोजन के अंत में पाया गया था। चूंकि यह प्रतिशत प्रासंगिक हो सकता है, विशेष रूप से ट्यूमर के आकार में वृद्धि के साथ, 4T1 मॉडल के साथ काम करते समय मृत सेल हटाने हमेशा आवश्यक होता है।

सीएएफ अलगाव प्रक्रिया, संस्कृति और लक्षण वर्णन का अनुकूलन
एकत्र व्यवहार्य कोशिकाओं के पैनल से सीएएफ (सीडी 90.2+ सीडी 45-)की आबादी को अलग करने के लिए दो और मार्ग की आवश्यकता होती है: गैर-ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की कमी और ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट(चित्रा 2)का संवर्धन। कमी मनका कॉकटेल कुशलता से CD45+ कोशिकाओं को हटा (67.35% और कुल कोशिकाओं के 0.69% के लिए लेखांकन पूर्व और बाद की कमी, क्रमशः, तालिका 2),और हमेशा हर कॉलम में एक ही ट्यूमर को संसाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है, एलुटीई कोशिकाओं की संख्या 3 × 106 से 1 × 105 के औसत से गिर गई। कुल सेल संख्या में इस भारी कमी के कारण, संवर्धन चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले एक ही ट्यूब में कम से कम 2 से अधिकतम 4 ट्यूमर तक एकत्र कोशिकाओं को पूल करना सुविधाजनक है। ऐसा करके, ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट मोतियों के साथ इनक्यूबेशन के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त किया गया था और सीडी 90.2+ सीडी 45 - कोशिकाओं(तालिका 2)के 93% के अंतिम औसत प्राप्त करने के लिए एक ही पृथक्करण स्तंभ के माध्यम से पारित किया गया था।

एक बार ऊतक संस्कृति प्लेटों पर वरीयता प्राप्त, इन बरामद कोशिकाओं प्लास्टिक से जुड़ी और फाइब्रोब्लास्ट(चित्रा 3A,बी)और 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं(चित्रा 3 डी)से अलग की विशिष्ट एक बड़े धुरी के आकार का आकृति विज्ञान से पता चला । ट्यूमर पूलिंग नहीं होने के बाद ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट माइक्रोमोतियों के साथ सेलुलर उपज एक संस्कृति स्थापित करने के लिए बहुत कम हो । अन्य मामलों में, जब माइक्रोमोतियों के साथ ऊष्मायनों की अवधि और तापमान को सावधानीपूर्वक नहीं रखा जाता है, तो कुछ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी हो सकते हैं। ऐसे मामलों में, संवर्धन कदम CD90.2के कम कुशल और उच्च प्रतिशत थे - सीडी 45+ और सीडी 90.2- सीडी 45- कोशिकाओं को CD90.2+ CAFs (5.97 ± 1.5 और 16.75 ± क्रमशः) (चित्रा 4 और 3)(चित्रा 4 और 3)के साथ बरामद किया गया। इन संदूषक कोशिकाओं को विभिन्न आकृति विज्ञान(चित्रा 4B,काले तीर) के साथ छोटे क्लोन की संस्कृति में उपस्थिति के लिए जिम्मेदार होने की संभावना थी जो सीएएफ की तुलना में तेजी से बढ़ी और प्राथमिक सीएएफ संस्कृति(चित्रा 4 सी)पर प्रबल हुई। इन उप-प्रतिस्थापन परिणामों ने सीडी 90.2 और सीडी 45 अभिव्यक्ति दोनों की हमेशा दोहरी जांच के महत्व की पुष्टि की, साथ ही संवर्धन प्रक्रिया के अंत में और संस्कृति में सेल विकास के दौरान सेल आकृति विज्ञान।

इंजीनियर नैनोड्रग्स की सीएएफ-टार्गेटिंग क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए अलग कोशिकाओं का उपयोग
हौसले से अलग CAFs कई बुनियादी अनुसंधान से औषधीय अध्ययन को लेकर अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस समूह का उद्देश्य एचएफएन नैनोकेज विकसित करना है जो विशेष रूप से सीएएफ को लक्षित कर सकते हैं। एचएफएन को दो अलग-अलग प्रोटीन पर एक विशिष्ट एंटी-एफएपी एंटीबॉडी टुकड़ा (एचएफएन-एफएपी) के साथ कार्यात्मक किया गया था: एंटीबॉडी अनुपात (कम 1:1 और एक उच्च 1:5), और सीएएफ के साथ उनके बाध्यकारी का परीक्षण किया गया था। चूंकि एफएपी का उपयोग प्रो-ट्यूमरजेनिक सीएएफ के सतह बायोमार्कर के रूप में किया जाता था, इसलिए अलग-थलग सीएएफ(चित्रा 3 सी)पर एफएपी अभिव्यक्ति की जांच करना मौलिक महत्व का था। एफएपी अभिव्यक्ति संस्कृति में 5 मार्गों पर पीछा किया गया था पुष्टि करने के लिए कि प्राथमिक सीएएफ संस्कृति अपनी मूल विशेषताओं को बनाए रखा ।

एचएफएन पर एफएपी कार्यात्मककरण को नंगे एचएफएन की तुलना में सीएएफ लक्ष्यीकरण की ओर एक महत्वपूर्ण बदलाव में योगदान करने के लिए पाया गया था, और एंटीबॉडी की कम मात्रा (1:1) इस प्रभाव(चित्रा 5A)का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त थी। हालांकि, यह ट्यूमर 4T1 कोशिकाओं के साथ वीवो ट्यूमर मॉडल में स्थापित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था, जिसमें नंगे HFn कार्यात्मक HFn(चित्रा 5B)की तुलना में उच्च बाध्यकारी दिखाया । यह 4T1 कोशिकाओं में एफएपी अतिउप अतिउप की अनुपस्थिति और टीएफआर1 के साथ एचएफएन की तरजीही बातचीत के कारण सबसे अधिक संभावना थी, जो कोशिकाओं में एचएफएन तेज को नियंत्रित करता है, जैसा कि इस समूह द्वारा व्यापक रूप से सूचित किया गया है27,33। ये परिणाम ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट से निपटने के लिए डिज़ाइन किए गए नैनोकणों की लक्षित क्षमता को प्रारंभिक रूप से स्क्रीन करने के लिए स्तन सीएएफ की प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग करने की उपयोगिता की पुष्टि करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: 4T1 ट्यूमर मॉडल की स्थापना। कोशिकाओं (१०५ कोशिकाओं/माउस) स्तन वसा पैड में इंजेक्शन थे । ट्यूमर वृद्धि के दिनों में पीछा किया गया था 5, 10, 15, 20, 25, और 30 प्रत्यारोपण के बाद(ए)कैलिपर्स के साथ ट्यूमर की मात्रा को मापने और(बी)बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग द्वारा । ट्यूमर की मात्रा और BLI क्रमशःमिमी 3 और गिनती के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । परिणाम औसत ± एसईएम (एन = 6) के रूप में सूचित कर रहे हैं । (ग)BLI प्रतिनिधि छवियों प्राप्त 5, 10, 15, 20, 25, और 30 दिनों के बाद सेल प्रत्यारोपण 25 दिन तक ट्यूमर के विकास की पुष्टि, जब यह एक पठार तक पहुंचने लगता है । अंतिम समय में विश्लेषण के बिंदु (30 दिन) में 25 दिन की तुलना में ब्लीब नहीं बढ़ता है। 20 दिन से शुरू, परिगलन और अल्सर के क्षेत्र ट्यूमर के मध्य भाग में दिखाई देने लगते हैं। रंग स्केल: न्यूनतम = 1,194, अधिकतम = 20,462। संक्षिप्त रूप: BLI = बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग; SEM = मतलब के मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ट्यूमर नमूना तैयारी और अलग CAFs के प्रवाह साइटोमेट्री लक्षण वर्णन। ट्यूमर को स्केलपेल कीमदद से लगभग 1-2 मिमी के छोटे टुकड़ों में उत्पादित और कम किया गया था; (ख)ऊतक पाचन और एक उत्पादित ट्यूमर के यांत्रिक वियोजन के बाद एकल कोशिका निलंबन; (ग)लाल रक्त कोशिकाओं के लाइसिस के बाद प्राप्त सेल गोली; (घ)लाल रक्त कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं को हटाने के बाद प्राप्त कोशिकाओं में सीडी 45 और सीडी 90.2 अभिव्यक्ति का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण,(ई)गैर-कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की कमी के बाद, और(एफ)कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के संवर्धन के बाद, जहां अधिकांश कोशिकाएं CD90.2+ सीडी 45हैं - (नीला उद्धार) । संक्षिप्त नाम: CAFs = कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट; सीडी = भेदभाव का क्लस्टर; पीई-ए = फाइकोरीथ्रिन का क्षेत्र; फिटसी-ए = फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट के क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:सीएएफ और एफएपी अभिव्यक्ति का रूपात्मक विश्लेषण।(ए, बी)सीएएफ आकृति विज्ञान ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (मार्ग 2 और मार्ग 5 पर संगम के विभिन्न स्तरों) द्वारा संस्कृति के सभी मार्गों में जांच की गई थी और(डी)4T1 ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में; स्केल बार = 10 माइक्रोन.(C)फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन प्रोटीन (एफएपी) अभिव्यक्ति का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एकत्र सीडी 90.2+ सीडी 45 पर अलगाव प्रक्रिया के अंत में किया गया था- कोशिकाओं को उनकी आणविक विशेषताओं की पुष्टि करने के लिए। एक फ्लोरेसेंस सीमा को अन दाग नियंत्रण कोशिकाओं (लाल ग्राफ) पर निर्धारित किया गया था ताकि एंटीबॉडी-सना हुआ कोशिकाओं (नीले ग्राफ) के बीच मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता और सकारात्मक कोशिकाओं (एफएपी+)का प्रतिशत निर्धारित किया जा सके। संक्षिप्त नाम: CAFs = कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट; एफएपी = फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन प्रोटीन; सीडी = भेदभाव का क्लस्टर; एमएफआई = मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता; एबी = एंटीबॉडी; फिटसी-ए = फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट का क्षेत्र; एफएपी + = एफएपी-पॉजिटिव कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक उप-इष्टतम CAFs अलगाव प्रक्रिया का उदाहरण। (A)अंतिम अलगाव कदम के बाद प्रवाह साइटोमेट्री मूल्यांकन संदूषक सीडी 90.2- सीडी 45+ और CD90.2 - सीडी 45- कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चला। (ख)इन कोशिकाओं को सीडिंग पर छोटे गोल आकृति विज्ञान के साथ क्लोन के रूप में देखा जा सकता है (पैनल के नीचे बाएं कोने में काले एरोहेड और इनसेट) कि(सी)संस्कृति में तीसरे मार्ग के बाद CAFs पर प्रबल । स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: सीएएफ = कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट; सीडी = भेदभाव का क्लस्टर; पीई-ए = फाइकोरीथ्रिन का क्षेत्र; फिटसी-ए = फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट के क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: CAFs और 4T1 पर एचएफएन नैनोकैज की बाइंडिंग । एचएफएन नैनोकेज को फिटसी के साथ फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किया गया था, जो दो अलग-अलग प्रोटीन-एंटीबॉडी अनुपात (1:1 और 1:5) पर एंटी-एफएपी एंटीबॉडी टुकड़ा (एचएफएन-एफएपी) के साथ कार्यात्मक था, और 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर(ए)लक्ष्य सीएएफ और(बी)4T1 कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटेड था। बाइंडिंग का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। (क)सीएएफ के साथ एचएफएन-एफएपी बाध्यकारी दोनों एंटीबॉडी खंड सांद्रता में नंगे एचएफएन(बी)की तुलना में तीन गुना तक काफी वृद्धि हुई है, इसके विपरीत, 4T1 कोशिकाओं में नंगे एचएफएन का काफी अधिक बाध्यकारी देखा गया था, जहां एफएपी मान्यता द्वारा बाध्यकारी को बढ़ाया नहीं जाता है । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत ± मानक विचलन के रूप में सूचित कर रहे हैं । पी = 0.0003; ° ° p = 0.0021; ° ° ° पी = 0.0008। संक्षिप्त नाम: CAFs = कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट; एफएपी = फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन प्रोटीन; एचएफएन = मानव फेरिटिन भारी श्रृंखला का पुन: संयोजन संस्करण नंगे नैनोपार्टिकल या संयुग्मित के रूप में उपयोग किया जाता है; एचएफएन-एफएपी = एचएफएन नैनोकणों को दो एचएफएन: Fab@FAP मोलर अनुपात, 1:1 और 1:5 पर तैयार एक एंटी-एफएपी एंटीबॉडी के चर भाग के साथ कार्यात्मक किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सेल नंबर (औसत ± एसडी) निष्कर्षण यील्ड टोटल (प्रति मार्ग)
उत्पादित ट्यूमर (पोस्ट रेड ब्लड सेल हटाने) 1.27 x 108 ± 9.81 x 107 100%
एक्साइज्ड ट्यूमर (पोस्ट डेड सेल रिमूवल) 3.01 x 106 ± 9.61 x 105 2.38%
पोस्ट कमी कॉकटेल 1.15 x 105 ± 4.95 x 104 0.11% (3.82%)
संवर्धन के बाद 3.00 x 104 ± 1.2 x 104 0.027% (26.09%)

तालिका 1: कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के प्रत्येक चरण के बाद कुल सेल गिनती।

सेल डिस्ट्रीब्यूशन (%) CD90.2+ CD45- सीडी90.2+ सीडी 45+ सीडी90.2- सीडी 45+ सीडी90.2- सीडी 45-
एक्साइज्ड ट्यूमर (पोस्ट डेड सेल रिमूवल) 1.81 ± 0.98 10.78 ± 4.51 56.57 ± 14.05 28.20 ± 17.57
पोस्ट कमी कॉकटेल 69.33 ± 16.75 0.14 ± 0.13 0.55 ± 0.63 39.89 ± 30.31
संवर्धन के बाद 93.14 ± 3.3 0.09 ± 0.1 0.09 ± 0.08 6.69 ± 3.4

तालिका 2: कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के प्रत्येक मार्ग के बाद CD90.2 और CD45 की अभिव्यक्ति के अनुसार सेल वितरण।

सेल डिस्ट्रीब्यूशन (%) CD90.2+ CD45- सीडी90.2+ सीडी 45+ सीडी90.2- सीडी 45+ सीडी90.2- सीडी 45-
पोस्ट एनरिचमेंट (कोई पूलिंग नहीं) 75.80 ± 2.9 1.49 ± 0.4 5.97 ± 1.5 16.75 ± 1.1

तालिका 3: एक उप इष्टतम कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट अलगाव प्रयोग के बाद एकत्र कोशिकाओं की सीडी 90.2 और सीडी 45 अभिव्यक्ति।

Discussion

CAFs एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स को फिर से तैयार करने, मेटास्टेसिस प्रगति को बढ़ावा देने, और ट्यूमर साइट34के लिए दवा का उपयोग सीमित करने में प्रमुख खिलाड़ियों के रूप में उभर रहे हैं। हालांकि, उनकी विषमता के कारण, उनकी भूमिकाएं अभी भी विवादास्पद हैं-कुछ सीएएफ ट्यूमरजेनिक हैं, जबकि कुछ अन्य उपप्रकारों में ट्यूमर-दमनकारी भूमिका है। इस संदर्भ में, कैंसर की प्रगति में उनकी बहुचर्चित भूमिका पर अधिक प्रकाश डालने के लिए उनका अलगाव अत्यधिक रुचि हो सकता है, जिसके महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थहोंगे 12,31। इसके अलावा, मानव और पूर्व नैदानिक माउस ट्यूमर मॉडल से सफल सीएएफ निष्कर्षण भी नए सीएएफ-लक्ष्यीकरण दवाओं के विकास की सुविधा होगी । यह पेपर स्तन कैंसर के सिनेजेनिक प्रीक्लीनिकल मॉडल से प्राथमिक सीएएफ को कुशलतापूर्वक अलग-थलग करने और संस्कृति देने की विधि की रिपोर्ट करता है। अनुभव के आधार पर, तीन प्रयोगात्मक कदम ज्यादातर प्रोटोकॉल की सफलता को प्रभावित करते हैं।

पहला कॉलम में थक्के के जोखिम से जुड़े सेल निलंबन के एकत्रीकरण से बचने के लिए तेजी से काम कर रहा है और कोशिका प्रभाव को धीमा कर रहा है: वास्तव में, जब कॉलम के माध्यम से पारित कोशिकाओं को एक साथ क्लस्टर किया गया था, तो उप-इष्टतम अलगाव प्रक्रिया की संभावना बढ़ गई, और अंतिम संस्कृतियों में "संदूषक" सेल क्लोन शामिल थे। दूसरा एक अंतिम संवर्धन चरण में पारित होने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं की गारंटी के लिए पर्याप्त कोशिकाओं की गारंटी के बाद विभिन्न ट्यूमर से कोशिकाओं को पूलिंग है। अंतिम महत्वपूर्ण मुद्दा उच्च कोशिका घनत्व पर निकाले गए कोशिकाओं को चढ़ाना है, सबसे अधिक संभावना 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं से शुरू करने के लिए सेल विकास और 4-5 मार्ग तक के लिए कॉलोनी विस्तार को बढ़ावा देने के लिए । यदि कोशिकाओं को कम घनत्व पर वरीयता दी गई थी, तो वे मुक्त सतह पर विस्तारित हुए और जल्दी से नकल करना बंद कर दिया।

कई अध्ययनों से पहले से ही दोनों मानव और माउस मूल के सीएएफ निष्कर्षण तरीकों का वर्णन किया है, कैंसर के विकास और आक्रामकता को बढ़ावा देने में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए । यह स्तन कैंसर, मेलानोमा, कोलंगियोकार्सिनोमा, और अग्नाशय एडेनोकार्सिनोमा35, 36,37,38सहित कई प्रकार के ट्यूमर में किया गया है। हालांकि, विशिष्ट सीएएफ मार्कर की कमी और उनकी विषमता के कारण, इन प्रक्रियाओं के परिणाम अभी भी उप-इष्टतम हैं।

यहां, अलग-थलग कोशिकाओं का उपयोग एचएफएन नैनोकेज की सीएएफ-टार्गेटिंग क्षमता को मान्य करने के लिए किया जाता था, जो एंटी-एफएपी लक्षित मोइयटीज के साथ कार्यात्मक होता था। सीएएफ की प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग एक महत्वपूर्ण लाभ था, जिससे नैनोड्रग अनुकूलन के इस प्रारंभिक चरण में वीवो में सीधे करने की तुलना में बहुत सरल और लागत प्रभावी बाध्यकारी प्रयोग के साथ नैनोस्ट्रैटर्जी एक्स वीवो के सत्यापन की अनुमति मिली।

इस अर्थ में, सीएएफ पर पूर्व वीवो परीक्षण सीएएफ के इष्टतम लक्ष्यीकरण के लिए सबसे होनहार नैनोकणों की स्क्रीनिंग और चयन की अनुमति देकर वीवो पशु प्रयोगों में पहले हो सकता है। यहां प्रस्तुत सीएएफ मॉडल का उपयोग प्रारंभिक प्रभावकारिता अध्ययनों के लिए भी किया जा सकता है, जब सक्रिय दवाओं के साथ नैनोकणों को लोड किया जाता है। जानवरों का उपयोग केवल बाद में बायोडिलिएब्यूशन, फार्माकोकाइनेटिक्स और प्रभावकारिता अध्ययनों का मूल्यांकन करने के लिए किया जाएगा।

कई सीएएफ-लक्षित नैनोड्रग विकसित किए जा रहे हैं, जैसे स्तन कैंसर में फोटोडायनामिक थेरेपी के लिए फेरिटिन नैनोकेज और प्रोस्टेट कैंसर मॉडल39,40में डॉक्सोरुबिसिन देने के लिए पेप्टाइड आधारित कण। हालांकि, नैनोड्रग अनुकूलन के लिए सेल प्लेटफॉर्म के रूप में सीएएफ के अलगाव पर कई अध्ययनों ने ध्यान केंद्रित नहीं किया है।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह एक समय लेने वाला प्रोटोकॉल है, जिसमें कई अभिकर् ती और सामग्रियों की तैयारी और खरीद की आवश्यकता होती है। दूसरा, 4T1 ब्रेस्ट ट्यूमर में सीएएफ की कमी के कारण उनकी पैदावार कम होती है । नैनोपार्टिकल प्रयोगों की योजना बनाई जानी चाहिए और जैसे ही आवश्यक सेल नंबर प्राप्त किया जाता है, जैसे ही प्राथमिक CAFs सेनेसेंस से गुजरते हैं और लंबे समय तक संस्कृति में बनाए नहीं रखा जा सकता है। अंत में, सीएएफ अलगाव, खेती और लक्षण वर्णन की यह विधि कैंसर के खिलाफ लड़ाई में नए लक्षित नैनोमेडिसिनों के विकास में तेजी लाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को आईजी 2017-आईडी के तहत एसोसियाज़िओन इटालियाना प्रति ला राइसर्का सुल कैन्रो (एआईआरसी) द्वारा समर्थित किया गया था। 20172 परियोजना - पी कोर्सी फैबियो। एसएम बाल चिकित्सा नैदानिक अनुसंधान केंद्र "रोमियो और एनरिका Invernizzi" है कि उसकी स्थिति का समर्थन करता है स्वीकार करते हैं । एबी धन्यवाद एआईआरसी (आईडी 20172 परियोजना) और अनुसंधान फैलोशिप के लिए मिलान विश्वविद्यालय। एलएस और एमएस पोस्टडॉक्टोरल और डॉक्टरेट फैलोशिप मिलान विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing buffer Lonza 10-548E Store at +15° to +30 °C.
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody Immunological Science IS-20022 Protect from light.
Anti-FAP Fab fragment (3F2) Creative Biolabs TAB-024WM-F(E)
BALB/c mice Charles River 028BALB/C 7 weeks old female mice
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906 Store at 2-8 °C.
CD45 antibody Miltenyi Biotec 130-110-796 FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C.
CD90.2 antibody Miltenyi Biotec 130-102-960 PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C.
Cell strainers 70 µm VWR 732-2758
CytoFLEX Beckman Coulter laser configuration B4-R2-V0
Dead cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101 contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C.
D-Luciferin Caliper 760504 reagent for in vivo imaging
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine  w/ Sodium Pyruvate Euroclone ECB7501L Warm at 37 °C in a water bath before use.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium Euroclone ECB4004L Keep at room temperature.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Fetal Bovine Serum Euroclone ECS0180L Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins.
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) Sigma-Aldrich F7250 Store protected from light at 2–8 °C.
GentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334 They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.
GentleMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. 
Goat serum Euroclone ECS0200D
Ham's F12  w/o L-Glutamine Euroclone ECB7502L Warm at 37 °C in a water bath before use.
IVIS Lumina II imaging system Caliper Life Sciences This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis
LD columns Miltenyi Biotec 130-042-901 Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use
L-Glutamine Euroclone ECB3000D 200 mM stock
Light/fluorescence microscope equipped with camera Leica Microsystems DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule inverted microscope for live cells with camera
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MACS Separation Unit Miltenyi Biotec 130-090-976 Position the magnet on appropriate stand before use.
MACS Tissue Storage Solution Miltenyi Biotec 130-100-008
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.
Mycoplasma Removal Agent Euroclone ECMC210A Dilute in culture medium 1:100.
NaHCO3 Invitrogen A10235
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000C
Non essential aminoacids Euroclone ECB3054D
Penicillin-Streptomycin Euroclone ECB3001D
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)  Molirom MLR-P018
RPMI 1640 w/o L-Glutamine Euroclone ECB9006L Warm at 37 °C in a water bath before use.
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit Miltenyi Biotec 130-116-474 Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C.
Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-730 Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at - 20 °C.
Trypan blue 0.4% Lonza 17-942E dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells
TrypLE select Gibco 12563-029 use at room temperature
Trypsin-EDTA Lonza BE17-161E Warm at 37 °C in a water bath before use
T75 Primo TC flask Euroclone ET7076
Zeba Spin Desalting Columns Thermo Fisher Scientific 89890 7K MWCO, 2 mL
1.5 mL tubes Biosigma CL15.002.0500
15 mL tubes Euroclone ET5015B
4T1-luc2 Caliper Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene
50 mL tubes Euroclone ET5050B

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