Summary
Detta dokument syftar till att tillhandahålla ett protokoll för isolering och kultur av primära cancer-associerade fibroblaster från en syngeneisk murin modell av trippelnegativa bröstcancer och deras tillämpning för prekliniska studien av nya nanopartiklar utformade för att rikta tumör microenvironment.
Abstract
Cancer-associerade fibroblaster (CAFs) är nyckelaktörer i samband med tumör microenvironment. Trots att de minskas i antal jämfört med tumörceller reglerar CAF tumörprogression och ger skydd mot antitumörimmunitet. Framväxande strategier mot cancer syftar till att omforma tumörmikromiljön genom ablation av protumörogena CAF eller omprogrammering av CAF-funktioner och deras aktiveringsstatus. Ett lovande tillvägagångssätt är utvecklingen av nanosized leveransmedel som kan rikta in sig på CAF, vilket möjliggör specifik leverans av läkemedel och aktiva molekyler. I detta sammanhang kan en cellulär modell av CAF vara ett användbart verktyg för in vitro-screening och förstudie av sådana nanoformuleringar.
Denna studie beskriver isolering och kultur av primära CAFs från den syngeneiska 4T1 murin modellen av trippel-negativa bröstcancer. Magnetiska pärlor användes i en 2-stegs separationsprocess för att extrahera CAF från dissociated tumörer. Immunophenotyping kontroll utfördes med hjälp av flöde cytometri efter varje passage för att verifiera processen utbyte. Isolerade CAF kan användas för att studera inriktningsförmågan hos olika nanoformuleringar utformade för att hantera tumörmikromiljön. Fluorescerande märkta H-ferritin nanocages användes som kandidat nanopartiklar för att ställa in metoden. Nanopartiklar, antingen nakna eller konjugerade med en målligand, analyserades för sin bindning till CAF. Resultaten tyder på att ex vivo utvinning av bröst CAFs kan vara ett användbart system för att testa och validera nanopartiklar för specifik inriktning av tumörogena CAFs.
Introduction
Under de senaste decennierna har det blivit tydligt att döda tumörceller vanligtvis inte är tillräckligt för att utrota malignitet, eftersom tumörmikromiljön kan leda till tumöråterfall och inducera terapeutisk resistens1,2. Ett nytt paradigm har sedan dykt upp: rikta tumör stroma för att beröva tumören av stödjande faktorer och därmed öka effektiviteten av kemoterapeutiska3,4,5. I synnerhet är cancerrelaterade fibroblaster (CAF) ett intressant stromalt mål i många solidatumörer 6,7. CAF är en mycket heterogen grupp celler som interagerar med cancerceller och celler i immunsystemet genom utsöndring av tillväxtfaktorer, cytokiner och kemokiner; bygga upp och bygga om den extracellulära matrisen; och aktivera metastasering8,9,10,11,12. Beroende på tumörtyp visar CAF pro-tumorigenic funktioner, medan andra subtyper av CAFs verkar ha tumör-suppressiva funktioner13,14. För att bättre klargöra denna dikotomi är en grundlig karakterisering av CAFs från primära och ögonbevarande tumörer viktigt.
I detta sammanhang har ett framväxande forskningsområde fokuserat på utveckling av nanosized medel utformade för att rikta in sig på och / eller förstöra CAF genom att leverera aktiva molekyler och läkemedel som kan bygga om tumörmikromiljön15,16,17,18. Flera typer av nanopartiklar har utformats för att uppnå CAF-ablation av cytotoxiska läkemedel, för att inducera CAF-riktad fotodynamisk terapi, eller för att omprogrammera CAF genom att återställa dem till ett quiescent tillstånd eller inducera TNF-relaterad apoptos inducerad ligand uttryck, som inducerar apoptos av angränsande cancerceller16,19. Dessutom ger potentialen hos många nanopartiklar att aktivt rikta in sig på specifika biologiska markörer upphov till hoppet om att välja CAF-undergrupper att rikta in sig på. Även om dess absoluta specificitet för CAF fortfarande ifrågasätts, är fibroblastaktiveringsprotein (FAP) ett av de mest lovande målen för protumörogen stroma och utnyttjas för att styra nanodrogleverans, vilket banar väg för utveckling av CAF-riktade nanoterapeuter20,21,22.
Detta dokument beskriver isoleringen av primära CAFs från en syngeneisk modell av murin bröstcancer och rapporterar deras användning i studien av inriktning kapacitet nanopartiklar konstruerade för att känna igen CAF markör, FAP. Ferritinnannocages används som kandidatnanosystem för att ställa in metoden, eftersom deras leveranss specificitet kan formas av ytexponeringen för inriktning av moieties23,24. Dessutom har ferritiner framgångsrikt visat sig vara utmärkta biokompatibla skyttlar för antitumörapplikationer, vilket utlöser snabb ackumulering av nyttolasten itumörmassan 25,26,27. Hittills har prekliniska studier av CAF-inriktade nanosystem involverat vitro-testning på fibroblast cellinjer stimuleras i kultur med omvandla tillväxtfaktor-beta för att inducera cellaktivering och uttryck för vissa immunofenotypiska funktioner i CAFs28,29. Denna metod tillämpas vanligtvis på odödliga celllinjer (som NIH3T3, LX-2) och är ganska snabb och enkel, vilket ger aktiverade celler på några timmar eller dagar. En begränsning är att även om in vitro-stimulering inducerar uttrycket av vissa gener som tillskrivs aktiverade myofibroblaster, kan det inte helt rekapitulera alla biologiska egenskaper hos verkliga CAF, särskilt deras heterogenitet in vivo.
En annan strategi innebär extraktion av primära CAF från mänskliga eller mus tumör prover30,31. Detta säkerställer att CAF-aktivering sker i ett fysiologiskt sammanhang och att heterogeniteten hos CAF-subpopulationer upprätthålls. Enligt forskningsmålet kan CAF härledas från olika källor, vilket ger möjlighet att studera det mest tillförlitliga tillståndet. Protokollet som rapporteras här skulle vara värdefullt för forskare som försöker utföra en preliminär utvärdering av funktionaliteten hos nya nanopartiklar utformade för att rikta in sig på CAF från en murin bröstcancermodell. Isolerade CAF skulle vara användbart för att undersöka de nanopartiklar som är tillräckligt lovande för att gå vidare för in vivo-utvärdering i djurmodeller av cancer. Detta kommer att vara relevant under de första stegen i nanopartikelproduktionen, vilket driver nanotekniker mot förfining av nanopartiklars design genom att främst överväga strategin för ligand immobilisering för att uppnå optimala inriktningsegenskaper.
Protocol
1. Upprätta en syngeneisk 4T1-modell av bröstcancer
OBS: Det nuvarande protokollet beskriver isoleringen av primära CAFs från en mus 4T1 bröst tumör. Den djurstudie som beskrivs här har godkänts av det italienska hälsoministeriet (aut. nummer 110/2018-PR).
- Tumörcellskultur och implantation
- Tina 1 × 106 4T1-luc celler i en T75 kolv med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S) och 1% L-glutamin. Tillsätt Mycoplasma borttagningsmedel (1:100) i odlingsmediet.
OBS: 4T1-luc celler uttrycker stabilt luciferas och kan visualiseras genom bioluminescens (BLI) vid korrekt stimulering med D-luciferin. Detta möjliggör in vivo-övervakning av tumörcellernas livskraft och spridning vid implantation hos möss (figur 1). - Håll cellerna vid 37 °C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär till ~ 80% sammanflöde, genom att byta medium varannan dag.
OBS: Fortsätt behandlingen med Mycoplasma avlägsnande medel i 1 vecka (~ 2/3 passager) före injektion hos möss för att säkerställa att injicerade celler är mykoplasmafria. - På dagen för förfarandet lossar celler med 1 ml trypsin-etylendiaminetetraacetic syra (EDTA) lösning (trypsin 1:250) i 5 min vid 37 °C. Stoppa trypsinaktiviteten genom att lägga till odlingsmedium, räkna cellerna med trypanblått (1:1) och beräkna antalet celler/ml.
- Pipett volymen motsvarande 1 × 106 celler och centrifugera i 5 min vid 400 × g. Häll av supernatanten och sätt tillbaka pelleten i 1 ml RPMI 1640 basmedium. Håll cellerna på is tills de är klara för injektion.
OBS: För varje mus behövs 1 ×10 5 celler; Beräkna dock alltid för ett överskott på 2 möss (motsvarande 2 × 105 celler) för att underlätta sprutbelastningen. - En dag före operationen raka pälsen på 8 BALB/c möss (hona, sju veckor gammal) för att exponera området för bukens bröstkörtlar på höger sida. Använd en elektrisk rakapparat och applicera ett tunt lager av depilatorisk grädde i 4 min; tvätta sedan bort grädden med vatten och ett papper.
- Inducera anestesi genom kontinuerlig inandning av 2% isoflurangas i ~ 5 min och utför en subkutan injektion i regionen av buken bröstkörtlar med en 27 G tuberkulin spruta. Vrid nålen uppåt för att komma in i huden subkutant; håll sedan huden uppåt och injicera långsamt 100 μL cellupphängning (1 × 105 celler). Vänd nålen något innan du långsamt drar tillbaka sprutan.
OBS: Kom ihåg att ta cellfjädringen till rumstemperatur 15 min före injektion.
- Tina 1 × 106 4T1-luc celler i en T75 kolv med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S) och 1% L-glutamin. Tillsätt Mycoplasma borttagningsmedel (1:100) i odlingsmediet.
- Tumörtillväxt och dissekering
- Efter cellinjektionen efter cellerna injicerar du 150 mg/kg D-luciferin intraperitoneally (100 μL) 5 min före avbildning. Ta BLI-bilder med hjälp av ett in vivo-bildsystem som ställer in 10 s exponering, medium binning och f/stop vid 4. Definiera tumörens luminescenta område som intresseregion (ROI) och kvantifiera den totala signalen i ROI (foton/sek/m2)med hjälp av bildframställningsprogram.
- Upprepa avbildningsproceduren (1. 2.1) var femte dag från injektionen för att övervaka tumörtillväxten i form av en ökning av BLI.
- För att fastställa tumörvolymen, håll musen och exponera magen. Använd bromsok för att mäta tumörlängden (L) och bredden (W) en gång i veckan. Beräkna tumörvolymen (V) med hjälp av ekvation 1.
[V = (L x W2)/2] (1) - Vid 20 dagar efter cellinjektion, offra djuren genom livmoderhalsförskjutning, dissociera tumörerna från huden med sax och samla dem i en vävnadslagringslösning (se materialförteckningen).
OBS: Tumörprover kan användas omedelbart för dissociation i enstaka celler (avsnitt 2) eller förvaras vid 4 °C i upp till 48 timmar.
2. Tumör dissociation i enstaka celler
OBS: Använd sterila reagenser och engångsartiklar i en laminär flödeshuv för följande steg. Arbeta med 4 tumörer åt gången.
- Placera tumörprovet i en petriskål och ta försiktigt bort fragment av hud, fett och nekrotiska områden med hjälp av pincett och skalpell. Minska sedan tumören i små bitar på cirka 1–2 mm och överför dem till ett rör (Figur 2A).
OBS: 4T1 tumörer blir mycket necrotic medan växer, med en tendens till ulceration. Det är viktigt att försiktigt ta bort de nekrotiska områdena för att undvika störningar av skräp med nästa steg. - Förbered en rötningsblandning för tumördissociation: blanda 2,35 ml RPMI 1640 medium, 100 μL enzym D, 50 μL enzym R och 12,5 μL enzym A. Blötlägg tumörfragmenten i lösningen och stäng röret ordentligt.
OBS: De angivna volymerna av matsmältningsblandningen gäller för tumörer upp till 1 g och kan justeras för större tumörer beroende på deras vikt. 4T1 tumörer odlas i 20 dagar normalt är i ett intervall av 0,5-0,8 g. - Vänd röret upp och ner och kontrollera att alla bitar av tumör står i botten av röret mot locket. Fäst röret på en mekanisk dissociator i rätt hölje och kör ett specifikt dissociationsprogram utformat för tuffa tumörer (se tillverkarens instruktioner).
OBS: Specialrör kan behöva monteras i dissociatorn. C-rör bär en rotor inuti locket för att främja mekanisk dissociation av vävnaden. - Lossa röret, håll det upp och ner och inkubera provet vid 37 °C i 40 minuter med skonsam skakning. Fäst sedan röret på dissociatorn i rätt hus och kör följande specifika dissociationsprogram utformat för tuffa tumörer två gånger. Se till att det inte finns några stora vävnadsbitar i slutet av proceduren (figur 2B).
OBS: För att skilja tumören åt kan andra enzymcocktails användas för att bryta ner den extracellulära matrisen. Men i detta protokoll användes ett kommersiellt tillgängligt Tumor Dissociation kit som innehåller en optimerad enzymblandning (enzymerna D, R, A) och en halvautomatisk dissociator som mekaniskt dissocierar vävnaden. Denna kombination säkerställde en korrekt nedbrytning av den extracellulära matrisen tillsammans med upprätthållande av cellintegritet och cellytans epitoper. - Filtrera provet genom en 40 μm cellsil i ett 50 ml-rör, tvätta filtret med 10 ml RPMI 1640 medium och centrifugera röret i 7 min vid 300 × g. Om cellpelleten verkar röd, lysa erytrocyter genom att tillsätta 1 ml Ammonium-klorid-kalium (ACK) lysbuffert i 5 min vid rumstemperatur, tvätta med 10 ml RPMI 1640, överför cellfjädringen i ett 15 ml-rör och centrifugera igen.
- Återanvänd pelleten i 1 ml PBE-buffert bestående av fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA och räkna cellerna med trypanblått (1:1). Vid cellklumpar, filtrera cellupphängningen genom en 70 μm cellsil, tidigare blöt med PBS.
OBS: Speciellt när tumörer är stora är det viktigt att kontrollera cellantalet och så småningom dela varje tumörprov i olika rör med högst 107 celler i varje rör innan du fortsätter till steg 2.7. - Förbered bindbufferten för avlägsnande av döda blodkroppar genom att späda ut 20x bindningsbuffertlagerlösningen (se materialförteckningen)med sterilt dubbeldestillerat vatten. Tvätta celler med 5 ml bindningsbuffert × bindningsbuffert (figur 2C).
OBS: Håll bufferten vid 4 °C. - Centrifugera i 7 min vid 300 × g och återanvänd cellpelleten med 0,1 ml mikrober för avlägsnande av döda blodkroppar (se materialförteckningen). Blanda väl och inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Under inkubationen med pärlor, förbered ett magnetiskt stativ under huven och häng ferromagnetiska separationskolonner (en kolumn för upp till 107 celler) på den med spetsarna som pekar nedåt. Jämvikta pelarna med 0,5 ml kall 1× bindningsbuffert. Vänta tills lösningen har flödat igenom under gravitationen.
OBS: Det är viktigt att inte överskrida antalet celler per kolumn för att undvika risken för koagulering av pelarbädden och minska återhämtningsutbytet. När du arbetar med mer än 107 celler kan du antingen använda fler kolumner beroende på det totala antalet celler eller använda större kolumner. I sådana fall justerar du de reagensvolymer som beskrivs i följande steg till de som anges av tillverkaren. - I slutet av inkubationen, tillsätt 400 μL kall 1× bindningsbuffert till pärl/cellupphängningen, ladda hela volymen på kolonnen och samla in utflödet (motsvarande omärkta celler) i ett 15 ml-rör.
- Tvätta kolonnen fyra gånger med 0,5 ml kall 1× bindningsbuffert och samla in det totala utflödet (motsvarande levande cellfraktion) i samma rör.
- Räkna cellerna med trypan blue (1:1). Placera 1 × 105 celler i två rör för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och håll dem på 4 °C fram till processvalidering (se steg 4.1): Använd det första röret för att ställa in analysparametrarna och positivitetsregionerna (kontrollröret) och den andra för biomarköranalys (provrör). Använd de återstående cellerna för extrahering av klientcertifikat (se avsnitt 3).
OBS: Avlägsnande av döda celler är viktigt för att minska icke-specifika reaktioner med mikropärlorna i avsnitt 3. Men för att förbättra utbytet, undvik avlägsnande av döda celler om andelen döda celler är <20%.
3. Extraktion av primära CAF från brösttumör
OBS: För avsnitt 3, använd musen Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit som innehåller icke-tumör-associerade fibroblast utarmningscocktail och tumör-associerade fibroblastmikrober som är lämpliga för magnetisk märkning av cellerna (se materialförteckningen).
- Utarmning av icke-cancerrelaterade fibroblaster
- Fukta en 70 μm cellsil med PBS och filtrera cellupphängningen för att ta bort eventuella klumpar. Centrifugera sedan cellerna i 10 min vid 300 × g och aspirera supernaten.
OBS: Om en enda tumör delades in i två prover för steg 2,7, slå samman cellupphängningen två och två innan du fortsätter med steg 3.1.2. - Återanvänd pelleten i 80 μL kall PBE-buffert och tillsätt 20 μL icke-tumör-associerad fibroblastutarmning. Blanda väl och inkubera vid 4 °C i 15 min i mörker.
- Under inkubationen med pärlor bereder du ferromagnetiska utarmningskolonner (1 per prov) på ett magnetiskt stativ och balanserar pelarna med 2 ml kall PBE-buffert. Vänta tills lösningen har flödat igenom.
- I slutet av inkubationen, tillsätt 400 μL kall PBE-buffert till pärlan/cellupphängningen, ladda hela volymen på kolonnen och samla in utflödet (motsvarande omärkta celler) i ett 15 ml-rör.
- Tvätta kolonnen två gånger med 2 ml kall PBE-buffert och samla in det totala utflödet i samma rör. Centrifugera i 10 min vid 300 × g och återanvänd i 0,1 ml kall PBE-buffert.
OBS: Utarmning av icke-cancerrelaterade fibroblaster minskar drastiskt den totala mängden celler som återvinns. Det är i allmänhet nödvändigt och rekommenderas att poola cellupphängningar från fyra olika prover för att få en synlig pellet och tillräckligt med celler för steg 3.2. Detta säkerställer en optimal avkastning. - Placera 20 μL av cellfjädringen i ett FACS-rör och förvara den vid 4 °C för processvalidering (se avsnitt 4). Använd de återstående cellerna för CAF-markering (se steg 3.2).
- Fukta en 70 μm cellsil med PBS och filtrera cellupphängningen för att ta bort eventuella klumpar. Centrifugera sedan cellerna i 10 min vid 300 × g och aspirera supernaten.
- Positivt urval av cancerrelaterade fibroblaster
- Tillsätt 20 μL tumörrelaterade fibroblastmikrober till 80 μL cellfjädring. Blanda väl och inkubera vid 4 °C i 15 min i mörker.
- Under inkubation med pärlor, förbered ferromagnetiska separationskolonner (1 per prov) på ett magnetiskt stativ och balansera kolonnerna med 0,5 ml kall PBE-buffert. Vänta tills lösningen har flödat igenom.
- I slutet av inkubationen, tillsätt 400 μL kall PBE-buffert till pärl/cellupphängningen, ladda hela volymen på kolonnen och låt de omärkta cellerna flöda igenom i ett 15 ml-rör.
- Tvätta kolonnen tre gånger med 0,5 ml kall PBE-buffert och samla in det totala utflödet i samma rör.
OBS: Genomflödet innehåller omärkta CD90,2-negativa celler, som kan kasseras som icke-cancerrelaterade fibroblaster. - Ta bort kolonnen från magneten och placera den i ett 1,5 ml-rör. Tillsätt 1 ml kall PBE på kolonnen och tryck omedelbart in kolven i kolonnen för att spola ut cellerna.
- Centrifugera i 10 min vid 400 × g och återanvänd i 0,1 ml kall PBE-buffert. Placera 20 μL cellfjädring i ett FACS-rör och förvara det vid 4 °C för processvalidering (se avsnitt 4).
OBS: Efter centrifugering kan pelleten knappast vara synlig, särskilt när de ursprungliga tumörerna är små. Använd koniska bottencentrifugrör och var försiktig så att du inte förlorar några celler när du aspirerar supernaten. - Späd de återstående cellerna i en lämplig volym av Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Hams F-12 kompletterat med 15% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% P/S och 1% icke-essentiella aminosyror och så cellerna i en vävnadskulturplatta.
- Kontrollera celltätheten under ett mikroskop och placera plattan i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 för att låta cellerna klibba och växa.
OBS: Om cellerna är för täta, dela omedelbart cellupphängningen i två brunnar på vävnadskulturplattan innan du placerar plattan i inkubatorn.
4. Processvalidering
- Flödescytometri
OBS: Avsnitt 4.1 kräver inga sterila förhållanden och kan utföras utanför laminarhuven. Utför avsnitt 4. 1 parallellt för prover som samlats in i steg 2.11 (dissocierad tumör), steg 3. 1.6 (efter utarmning av icke-cancerrelaterade fibroblaster) och steg 3. 2.6 (efter berikning av cancerrelaterade fibroblaster).- Centrifugera FACS-rören som bereds i steg 2.11, 3.1.6 och 3.2.6 i 10 min vid 300 × g. Kassera supernaten.
OBS: Förbered minst ett extra rör, som innehåller obeknackade celler som fungerar som en kontroll för att ställa in parametrarna för analys. - I provrör, återanvända celler i 88 μL PBE, och tillsätt 2 μL anti-CD45-antikroppar konjugerade med fluorescein isothiocyanat (FITC, 1:50 utspädning, enligt tillverkarens instruktioner) och 10 μL anti-CD90.2-antikropp konjugerad med fykoerytrin (PE, 1:10 utspädning, enligt tillverkarens instruktioner). Blanda noggrant och inkubera i 10 min vid 4 °C i mörker. I kontrollröret (obekräknat) återanvänds celler i 100 μL PBE. Inkubera i 10 min vid 4 °C i mörker för att replikera proceduren som följs för antikroppsfärgade celler.
OBS: Temperatur och inkubationstid måste kontrolleras noggrant, eftersom en variation i sådana variabler kan leda till dålig eller icke-specifik färgning, vilket ändrar resultaten. - Efter avslutad inkubation steg, utför en tvätt genom att lägga till 1 ml PBE. Centrifugera i 10 min vid 300 x g. Kassera supernaten.
- Återanvända celler (alla rör) i 500 μL PBS.
- Blanda väl och fortsätt med flödescytometrianalys. Ställ in kanalerna för att mäta antikropparna (dvs. FITC och PE).
- Välj alla livskraftiga celler i kontrollröret genom att rita en första grind (P1) på FSC vs SSC-tomten (Forward versus Side Scatter). Inom P1 ställer du endast in en andra grind (P2) som endast består av enstaka celler.
- Med hjälp av antikropparas specifika fluorescenskanaler (dvs. FITC och PE) ställer du in lämpliga grindar för att urskilja positivt färgade celler.
- Starta analysen och spela in minst 10 000 händelser i P2. Läs av signaler från båda kanalerna samtidigt.
OBS: Om det totala antalet celler är mindre än förväntat kan det vara bättre att läsa hela röret. - (VALFRITT) Om ytterligare färgning med ytterligare antikroppar/fluorforer programmeras, ställ in en lämplig kompensationsmatris innan analysen påbörjas.
- Centrifugera FACS-rören som bereds i steg 2.11, 3.1.6 och 3.2.6 i 10 min vid 300 × g. Kassera supernaten.
- Övervakning av cellmorfologi och egenskaper
OBS: När cellerna har såts måste de hanteras under sterila förhållanden.- Dagen efter sådd visualiserar du cellerna under ett optiskt mikroskop för att kontrollera cellens vidhäftning och morfologi. Aspirera supernaten och ersätt med färskt medium.
OBS: CAF är stora spindelformade celler, som lätt kan särskiljas från den epitelliknande strukturen hos 4T1 tumörceller. - Håll cellerna vid 37 °C och 5% CO2 i en fuktig atmosfär och ändra mediet varannan dag.
- När cellerna når ~80% sammanflöde (cirka 4-6 dagar efter sådd) lossar cellerna med TrypLE Select-lösningen (se materialförteckningen)i 5 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt färskt medium (4:1), centrifugera cellupphängningen vid 400 × g i 5 min och återanvänd pelleten i färskt medium.
- Dela cellerna 1:2 och expandera kulturen tills antalet celler som behövs för experimentet erhålls.
- Kontrollera cellmorfologi och tillväxt under ett optiskt mikroskop vid varje passage. Om cellmorfologin inte är homogen (t.ex. kloner av små rundformade celler som förekommer i kulturen), analysera ett cellprov genom flödescytometri enligt beskrivningen i avsnitt 4.1. Om homogen, fortsätt till steg 4.2.7.
OBS: Förändringar i cellmorfologi kan tyda på kontaminering av icke-cancerrelaterade fibroblaster, som måste avlägsnas för att säkerställa kulturens renhet. - Analysera flödescytometriresultaten och fortsätt enligt ett av följande scenarier: (i) om kontaminering av CD90,2-/CD45- celler uppstår, samla alla celler och upprepa det positiva valet genom att följa steg 3.2; ii) Om kontaminering av CD45+-celler också förekommer, samla alla celler och upprepa utarmningen i steg 3.1, iii) Om ingen kontaminering förekommer (endast CD90.2+/CD45- celler förekommer), håll cellerna i odling och fortsätt direkt till 4.2.7.
OBS: Eftersom upprepandet av utarmningsprocessen med mikrober minskar cellåterhämtningen, rekommenderas det endast när celler inte behöver användas omedelbart. - Räkna cellerna med trypanblått (1:1), placera 5 × 105 celler i två FACS-rör och centrifugera i 10 min vid 300 × g. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i 0,5 ml blockeringsbuffert (PBS kompletterad med 2% BSA, 2% getserum) i 15 min vid rumstemperatur.
OBS: Ett rör fungerar endast som en kontroll bestående av obefläckade celler, medan celler i det andra röret kommer att färgas för flödescytometrianalys. - Centrifugera i 10 min vid 300 × g, kassera supernaten och återanvänd i 99 μL blockeringsbuffert. Tillsätt 1 μg anti-FAP-antikroppar i provröret och 1 ml blockeringsbuffert i kontrollröret. Blanda noggrant och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
ANM: FAP är en ytmarkör av reaktiv tumör stroma och kan användas för att identifiera och karakterisera CAF. - Tvätta tre gånger med PBS, centrifugera och inkubera med lämplig sekundär antikropp konjugerad med ett fluorescerande färgämne (1 μg) i blockerande buffert i 15 min vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med PBS och analysera med flödescytometri (följ steg 4.1.5 till 4.1.7 genom att ställa in lämplig kanal för att upptäcka den fluorfor som används). Använd sedan cellerna för experiment (steg 5.2).
- (VALFRITT) Frys ett prov av celler i 1 ml 90% FBS och 10% dimetylsulfoxid (DMSO); förvaras vid -80 °C för vidare användning.
- Dagen efter sådd visualiserar du cellerna under ett optiskt mikroskop för att kontrollera cellens vidhäftning och morfologi. Aspirera supernaten och ersätt med färskt medium.
5. CAF-mål av konstruerade Ferritin nanopartiklar
OBS: En rekombinant variant av human ferritin tung kedja (HFn) användes som bar nanopartiklar eller konjugerades med inriktning moieties. Här utarbetades HFn nanopartiklar funktionella med den varierande delen av en anti-FAP antikroppar (Fab@FAP) av NanoBioLab vid University of Milano-Bicocca vid två HFn:Fab@FAP molar förhållanden, 1:1 och 1:5, enligt ett tidigare beskrivet protokoll32.
- Fluorescerande märkning av HFn nanopartiklar
OBS: Både nakna och funktionaliserade HFn nanocages är fluorescerande märkta med FITC.- Lös upp FITC-pulvret i 99% etanol för att erhålla en koncentration på 2 mg/ml.
OBS: Denna lösning bör beredas ny. - Inkubera 50 μL av den beredda lösningen (200 μg FITC) för varje 1 mg protein (dvs. 100 μL HFn vid 10 mg/ml). Tillsätt 50 μL natriumbikarbonat (NaHCO3) ochjustera volymen till 500 μL med 0,1 M NaHCO3.
OBS: Skala upp volymerna efter de experimentella behoven. - Inkubera reaktionsblandningen vid rumstemperatur, i mörker och med kontinuerlig omrörning i 1 timme.
- Ta bort överskottet av FITC från konjugaten genom gelfiltrering med en spinnavsaltningskolonn (7 kDa MWCO).
- Utvärdera koncentrationen av det återvunna märkta proteinet med hjälp av en spektrofotometer. Uppskatta mängden protein och färgämne genom att mäta absorbansen vid 280 nm respektive vid 488 nm.
- Lös upp FITC-pulvret i 99% etanol för att erhålla en koncentration på 2 mg/ml.
- Bindning av HFn nanopartiklar till CAF
OBS: Använd CAF från senast passagerna 4–5 i kultur.- Placera 5 × 105 celler i varje FACS-rör, centrifugera i 10 minuter vid 300 × g, och återanvänds i 0,5 ml PBS, 0, 3% BSA kompletterat med 0,1 mg/ml av de olika preparaten av nanopartiklar (bare HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) som tidigare märkts med FITC.
OBS: Kör varje villkor i tre exemplar. Förbered ytterligare ett rör som ett kontrollmärkt prov till vilket inga nanopartiklar tillsätts. - Inkubera i 2 timmar vid 4 °C i mörker, centrifug och tvätta tre gånger i PBS.
- Återanvända celler med 0,5 ml PBS, blanda väl och analysera efter flödescytometri. Ställ in kanalerna för att mäta FITC:s fluorescens.
- Efter att ha gating på levande enstaka celler, förvärva 20,000 händelser. Använd kontrollröret för att ställa in grinden för FITC-positivitet och få procentandelen FITC+ -händelser (motsvarande nanopartikelbindning).
- Placera 5 × 105 celler i varje FACS-rör, centrifugera i 10 minuter vid 300 × g, och återanvänds i 0,5 ml PBS, 0, 3% BSA kompletterat med 0,1 mg/ml av de olika preparaten av nanopartiklar (bare HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) som tidigare märkts med FITC.
6. Statistisk analys och experimentella replikat
- Djur
- Utför tre oberoende experiment av tumör tillväxt och CAFs isolering, med hjälp av 8 djur per enskilt experiment, som beskrivs i 1.1.5. Om du vill optimera isoleringsutbytet för klientprocessorer delar du upp de strukna vävnaderna i undergrupper (n=4) och bearbetar dem enligt steg som beskrivs i avsnitt 2.
- HFn-interaktion med celler
- Utvärdera interaktionen mellan funktionaliserade och icke-funktionella HFn med mål- och icke-målceller (CAF respektive 4T1) när det gäller andelen positivt färgade celler med fluorescerande märkta nanocages. Rapportera resultaten som genomsnittlig ± standardavvikelse för tre oberoende experiment.
- Statistisk analys
- Om du vill beräkna statistisk signifikans i cellbindningsexperiment med HFn och HFn-FAP använder du det vanliga enkelvägs-ANOVA-testet.
Representative Results
In vivo-modellinställt för optimal isolering av KLIENT-filer
Injektionen av 105 4T1-luc celler i bröstfett pad av kvinnliga BALB/c möss leder till tillväxten av en detekterbar tumör massa 5 dagar efter implantation. Genom att mäta tumörvolymen efter bromsok och tumör cellen livskraft av BLI, tumör tillväxt övervakades i en månad efter implantation. För att hitta ett offerfönster som är tillräckligt för CAFs isolering söktes en optimal kompromiss mellan högre tumörstorlek och BLI å ena sidan och en framväxande tumörsår och nekros å andra sidan (Figur 1). Eftersom en nekrotisk kärna visas 20 dagar efter implantationen, och den förstoras vid 25 och 30 dagar (vilket dokumenteras av BLI-bilder i figur 1C),sattes dag 20 som tidspunkt för att optimera cellåterställning efter isoleringsprocessen. Även efter att noggrant ha avlägsnat alla synliga nekrotiska områden under de första stegen av tumörhantering ex vivo, hittades en hög andel döda celler i slutet av dissociationen i enstaka celler (Tabell 1). Eftersom denna procentandel kan vara relevant, särskilt med ökningen av tumörstorlek, är död cellborttagning alltid nödvändigt när man arbetar med 4T1-modellen.
Optimering av CAF-isoleringsprocedur, kultur och karakterisering
Ytterligare två passager behövs för att isolera populationen av CAF (CD90.2+ CD45-) från panelen av insamlade livskraftiga celler: utarmning av icke-tumör-associerade fibroblaster och berikning av tumör-associerade fibroblaster (Figur 2). Utarmning pärla cocktail effektivt tar bort CD45+ celler (står för 67,35% och 0,69% av de totala cellerna före respektive efter utarmning, tabell 2), och användes alltid för att bearbeta en enda tumör i varje kolumn. Som visas i tabell 1sjönk antalet eluterade celler från i genomsnitt 3 × 106 till 1 × 105 efter utarmningssteget. På grund av denna massiva minskning av det totala antalet celler är det bekvämt att slå samman de insamlade cellerna från minst 2 till högst 4 tumörer i ett enda rör innan du fortsätter med anrikningssteget. Genom att göra detta erhölls ett tillräckligt antal celler för inkubation med tumör-associerade fibroblast pärlor och passerade genom en enda separation kolumn för att få ett slutligt genomsnitt på 93% av CD90.2+ CD45- celler (Tabell 2).
När de såts på vävnadskulturplattor, dessa återvunna celler kopplade till plasten och visade en stor spindelformad morfologi som är typisk för fibroblaster (Figur 3A, B) och skiljer sig från 4T1 tumörceller ( Figur3D). Att inte poola tumörer efter utarmning orsakar cellulär avkastning med tumör-associerade fibroblast mikrober att vara för låg för att etablera en kultur. I andra fall, när inkubationerna med mikrober inte upprätthålls noggrant, kan viss icke-specifik bindning uppstå. I sådana fall var anrikningsstegen mindre effektiva och högre procentandelar CD90,2- CD45+ och CD90,2- CD45- celler återfanns tillsammans med CD90.2+ CAF (5,97 ± 1,5 respektive 16,75 ± 1,1) (figur 4 respektive tabell 3). Dessa främmande celler var sannolikt ansvariga för närvaron i kulturen av små kloner med olika morfologi(figur 4B,svarta pilspetsar) som växte snabbare än CAF och segrade över den primära CAF-kulturen (Figur 4C). Dessa suboptimala resultat bekräftade vikten av att alltid dubbelkontrollera både CD90.2 och CD45 uttryck, liksom cell morfologi i slutet av anrikningsprocessen och under cell tillväxt i kultur.
Användning av isolerade celler för att utvärdera CAF-inriktningspotentialen hos konstruerade nanodroger
De nyisolerade CAF:erna kan användas för flera tillämpningar, allt från grundforskning till farmakologiska studier. Denna grupps mål är att utveckla HFn nanocages som specifikt kan rikta sig till CAF. HFn var funktionaliserade med en specifik anti-FAP antikropp fragment (HFn-FAP) vid två olika protein:antikroppar förhållanden (en lägre 1:1 och en högre 1:5), och deras bindning med CAF testades. Eftersom FAP användes som ytbiomarkör av protumörogena CAF: er var det av grundläggande betydelse att kontrollera FAP-uttrycket på isolerade CAF (Figur 3C). FAP-uttryck följdes över 5 passager i kulturen för att bekräfta att den primära CAF-kulturen behöll sina ursprungliga egenskaper.
FAP-funktionalisering på HFn konstaterades bidra till en betydande förskjutning mot CAF-inriktning jämfört med bar HFn, och den lägre mängden antikroppar (1:1) var tillräckligt för att observera denna effekt (figur 5A). Detta observerades dock inte med tumör 4T1 celler som används för att ställa in vivo tumör modell, där i bare HFn visade högre bindning än functionalized HFn (Figur 5B). Detta berodde sannolikt på avsaknaden av FAP-överuttryck i 4T1-celler och den förmånliga interaktionen mellan HFn och TfR1, som reglerar HFn-upptaget i celler, vilket allmänt rapporterats av denna grupp27,33. Dessa resultat bekräftar nyttan av att använda primära kulturer av bröst CAFs för att preliminärt screena inriktningsförmågan hos nanopartiklar utformade för att hantera tumör mikromiljön.
Figur 1: Fastställande av 4T1 tumörmodell. Celler (105 celler/mus) injicerades i bröst fett pad. Tumör tillväxt följdes vid dagarna 5, 10, 15, 20, 25 och 30 efter implantation (A) genom att mäta tumör volym med bromsok och (B) med bioluminescens imaging. Tumörvolymer och BLI uttrycks som mm3 respektive räknas. Resultaten rapporteras som genomsnittligt ± SEM (n=6). (C) BLI representativa bilder erhöll 5, 10, 15, 20, 25 och 30 dagar efter cellimplantation bekräfta tumör tillväxt fram till dag 25, när det verkar nå en platå. Vid den senaste analyspunkten (30 dagar) ökar INTE BLI jämfört med dag 25. Från dag 20 börjar områden av nekros och sårbildning att bli synliga i den centrala delen av tumören. Färgskala: Min = 1 194, Max = 20 462. Förkortningar: BLI = bioluminescensavbildning; SEM = standardfel av medelvärdet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Tumörprovberedning och flödescytometri karakterisering av isolerade CAF. Tumörer strukits och reducerats till (A) små bitar på cirka 1-2 mm med hjälp av en skalpell; B)Enkelcelligsuspension efter vävnadsuppsmältning och mekanisk dissociation av en struken tumör. C)Cellpellet som erhålls efter lys av röda blodkroppar. D)Flödescytometrianalys av CD45- och CD90,2-uttryck i celler som erhållits efter avlägsnande av röda blodkroppar och dödaceller, (E)efter utarmning av icke-cancerrelaterade fibroblaster och (F) efter berikning av cancerrelaterade fibroblaster, där majoriteten av cellerna är CD90,2+ CD45- (blå rektangel). Förkortningar: CAFs= cancerrelaterade fibroblaster; CD = differentieringskluster; PE-A = område av fykoerytrin; FITC-A = områden med fluorescein isothiocyanate. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Morfologisk analys av CAF-och FAP-uttryck. (A, B) CAF-morfologi kontrollerades genom alla kulturpassager med optisk mikroskopi (olika nivåer av sammanflöde vid passage 2 och passage 5) och jämfördes med (D) 4T1 tumörceller; skala stänger = 10 μm. (C) Fibroblast aktivering protein (FAP) uttryck utvärderades av flöde cytometri i slutet av isoleringsprocessen på de insamlade CD90.2+ CD45 - cellerför att bekräfta deras molekylära egenskaper. En fluorescenströskel sattes på osedda kontrollceller (rött diagram) för att kvantifiera genomsnittlig fluorescensintensitet och andelen positiva celler (FAP+) bland antikroppsfärgade celler (blått diagram). Förkortningar: CAFs= cancerrelaterade fibroblaster; FAP = fibroblastaktiveringsprotein; CD = differentieringskluster; MFI = genomsnittlig fluorescensintensitet; Ab = antikroppar; FITC-A = område av fluorescein isothiocyanate; ANP+ = FAP-positiva celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Exempel på en suboptimal CAFs isoleringsprocess. (A) Flöde cytometri utvärdering efter det slutliga isoleringssteget visade förekomsten av förorenande CD90.2- CD45+ och CD90.2- CD45- celler. (B) Dessa celler kan ses som kloner med liten rund morfologi vid sådd (svarta pilspetsar och inset i panelens nedre vänstra hörn) som (C) segrade över CAF efter den tredje passagen i kulturen. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: CAF = cancer-associerade fibroblast; CD = differentieringskluster; PE-A = område av fykoerytrin; FITC-A = områden med fluorescein isothiocyanate. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Bindning av HFn-nanocages på CAF och 4T1. HFn nanocages var fluorescerande märkta med FITC, functionalized med en anti-FAP antikroppar fragment (HFn-FAP) vid två olika protein-antikropp förhållanden (1:1 och 1:5), och inkuberas med (A) mål CAFs och (B) 4T1 celler vid 4 °C för 2 h. Bindningen utvärderades av flödescytometri. (A) HFn-FAP-bindning med CAF ökas signifikant vid båda antikroppsfragmentkoncentrationerna med trefaldigt jämfört med bar HFn. (B) däremot observerades en betydligt högre bindning av bar HFn i 4T1-celler, där bindningen inte förbättras genom FAP-erkännande. Resultaten rapporteras som genomsnittlig ± standardavvikelse för tre oberoende experiment. p = 0,0003; °° p = 0,0021; °°° p = 0.0008. Förkortningar: CAFs= cancerrelaterade fibroblaster; FAP = fibroblastaktiveringsprotein; HFn = rekombinant variant av mänsklig ferritin tung kedja som används som bar nanopartikel eller konjugerad; HFN-FAP = HFn nanopartiklar som funktionaliseras med den varierande delen av en anti-FAP-antikropp beredd vid två HFn:Fab@FAP molarförhållanden, 1:1 och 1:5. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Cellnummer (genomsnittligt ± SD) | Totalt utsugsutbyte (per passage) | |
| Struken tumör (Borttagning av röda blodkroppar) | 1,27 x 108 ± 9,81 x 107 | 100% |
| Struken tumör (Post död cellborttagning) | 3,01 x 106 ± 9,61 x 105 | 2.38% |
| Cocktail efter utarmning | 1,15 x 105 ± 4,95 x 104 | 0.11% (3.82%) |
| Efter berikning | 3,00 x 104 ± 1,2 x 104 | 0.027% (26.09%) |
Tabell 1: Totalt antal celler efter varje steg av isolering av cancerrelaterade fibroblaster.
| Cellfördelning (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Struken tumör (Post död cellborttagning) | 1.81 ± 0.98 | 10.78 ± 4.51 | 56.57 ± 14.05 | 28.20 ± 17.57 |
| Cocktail efter utarmning | 69.33 ± 16.75 | 0.14 ± 0.13 | 0,55 ± 0,63 | 39.89 ± 30.31 |
| Efter berikning | 93.14 ± 3.3 | 0,09 ± 0,1 | 0,09 ± 0,08 | 6.69 ± 3.4 |
Tabell 2: Cellfördelning enligt uttryck av CD90.2 och CD45 efter varje passage av isolering av cancerrelaterade fibroblaster.
| Cellfördelning (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Efter anrikning (ingen poolning) | 75.80 ± 2.9 | 1.49 ± 0.4 | 5.97 ± 1.5 | 16.75 ± 1.1 |
Tabell 3: CD90.2 och CD45 uttryck av celler samlas in efter en suboptimal cancer-associerade fibroblast isolering experiment.
Discussion
CAF växer fram som nyckelspelare i ombyggnad av extracellulär matris, främjar metastaseringsprogression och begränsar läkemedelsåtkomsten tilltumörstället 34. Men på grund av deras heterogenitet är deras roller fortfarande kontroversiella - vissa CAF är tumörogena, medan vissa andra subtyper verkar ha en tumör-suppressiv roll. I detta sammanhang kan deras isolering vara av extremt intresse för att kasta mer ljus över deras omdiskuterade roll i cancerprogression, som kommer att ha viktiga kliniska konsekvenser12,31. Dessutom skulle framgångsrik CAF utvinning från mänskliga och prekliniska mus tumör modeller också underlätta utvecklingen av nya CAF-inriktade läkemedel. Detta dokument rapporterar en metod för att effektivt isolera och odla primära CAF från en syngeneisk preklinisk modell av bröstcancer. Baserat på erfarenhet påverkar tre experimentella steg mestadels protokollets framgång.
Den första arbetar snabbt för att undvika aggregering av cellupphängningar i samband med risken för koagulering i kolumnen och långsammare cellutflöde: i själva verket, när celler som passerade genom kolumnen grupperades tillsammans, ökade sannolikheten för en suboptimal isoleringsprocess och de slutliga kulturerna innehöll "förorenande" cellkloner. Den andra är att slå samman celler från olika tumörer efter utarmningspassagen för att garantera att tillräckligt med celler passerar i det slutliga anrikningssteget. Den sista kritiska frågan är plätering av de extraherade cellerna vid höga celltätheter, troligen från en enda brunn på 24-brunnsplattan för att öka celltillväxten och koloniexpansionen för upp till 4-5 passager. Om cellerna såddes med låg densitet expanderade de på den fria ytan och slutade snabbt replikera.
Flera studier har redan beskrivit CAF extraktionsmetoder av både människa och mus ursprung, för att studera deras roll i att främja cancerutveckling och invasivitet. Detta har gjorts i många typer av tumörer, inklusive bröstcancer, melanom, cholangiocarcinom och bukspottskörteln adenocarcinom35,36,37,38. På grund av bristen på specifika CAF-markörer och deras heterogenitet är resultaten av dessa processer fortfarande suboptimala.
Här användes de isolerade cellerna för att validera CAF-inriktningsförmågan hos HFn nanocages funktionella med anti-FAP inriktning moieties. Användningen av primära kulturer av CAF var en betydande fördel, vilket möjliggör validering av nanostrategy ex vivo med ett mycket enklare och kostnadseffektivt bindande experiment än att göra det direkt in vivo i denna preliminära fas av nanodrogoptimering.
I den meningen kan ex vivo-testning på CAF:er föregå djurförsök in vivo genom att tillåta screening och urval av de mest lovande nanopartiklarna för optimal inriktning av CAF. CAF-modellen som presenteras här kan också användas för preliminära effektstudier, vid lastning av nanopartiklar med aktiva läkemedel. Djur kommer endast att användas senare för att utvärdera biodistribution, farmakokinetik och effektstudier.
Flera CAF-riktade nanodroger utvecklas, såsom ferritinnananocager för fotodynamisk terapi vid bröstcancer och peptidbaserade partiklar för att leverera doxorubicin i prostatacancermodeller39,40. Men inte många studier har fokuserat på isolering av CAF som cellplattformar för nanodrogoptimering.
Det här protokollet har vissa begränsningar. För det första är det ett tidskrävande protokoll som kräver förberedelse och inköp av flera reagenser och material. För det andra, på grund av bristen på CAF i 4T1 brösttumör, deras utbyte är lågt. Nanopartikelexperiment bör planeras och utföras så snart det önskade cellnumret har uppnåtts, eftersom primära CAF genomgår senescens och inte kan upprätthållas i kulturen under lång tid. Sammanfattningsvis kan denna metod för CAFs isolering, odling och karakterisering vara ett kraftfullt verktyg för att påskynda utvecklingen av nya riktade nanomediciner i kampen mot cancer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) inom ramen för IG 2017-ID. 20172-projektet – P.I. Corsi Fabio. SM bekräftar Pediatric Clinical Research Center "Romeo och Enrica Invernizzi" som stödjer hennes position. AB tackar AIRC (ID. 20172-projektet) och University of Milan för forskningsstipendium. LS och MS postdoktorala och doktorandstipendier stöds av Universitetet i Milano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
| Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
| BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
| CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
| CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
| Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
| CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
| Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
| D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
| DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
| Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
| Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
| Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
| LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
| L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
| Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
| Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
| NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
| Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
| RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at - 20 °C. |
| Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
| TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
| Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
| T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
| Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
| 1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
| 15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
| 4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
| 50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |
References
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer. Breast. 30, 92-100 (2016).
- Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer. Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).
- Hui, L., Chen, Y.
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- LeBleu, V. S., Kalluri, R. A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact. Disease Models & Mechanisms. 11, (2018).
- Li, X. -Y., Hu, S. -Q., Xiao, L. The cancer-associated fibroblasts and drug resistance. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F.
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Costa, A., et al. Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer. Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).
- Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment. Advances Drug Delivery Reviews. 99, Part B 186-196 (2016).
- Chen, Q., et al. Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).
- Truffi, M., et al. Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).
- Tong, R., Langer, R.
- Kaps, L., Schuppan, D. Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers. Cells. 9 (9), 2027 (2020).
- Miao, L., et al. Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors. Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).
- Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).
- Falvo, E., et al. Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin. Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).
- Truffi, M., et al. Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer. Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).
- Cai, Y., et al. Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size. International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).
- Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R.
- Mazzucchelli, S., et al. Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity. Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).
- Yu, Q., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy. Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).
- Mertens, J. C., et al. Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma. Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).
- Kovács, D., et al. Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts. Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).
- Sitia, L., et al. Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax. Cells. 10 (2), 328 (2021).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells. Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).
- Dvořánková, B., Lacina, L., Smetana, K. Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research. Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).
- Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages. Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).
- Sha, M., et al. Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Zhen, Z., et al. Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control. Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).
- Ji, T., et al. Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery. Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).
