이 논문은 삼중 음성 유방암의 합성 뮤린 모델과 종양 미세 환경을 대상으로 설계된 새로운 나노 입자의 전임상 연구를위한 응용 프로그램에서 1 차 암 관련 섬유 아세포의 격리 및 배양에 대한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다.
암 관련 섬유아세포(CAFs)는 종양 미세 환경의 맥락에서 핵심 배우이다. 종양 세포에 비해 수감소에도 불구하고, CAFs는 종양 진행을 통제하고 항종양 면역으로부터 보호를 제공합니다. 새로운 항암 전략은 프로 종양 유발 CAF의 절제 또는 CAF 기능 및 활성화 상태의 재프로그래밍을 통해 종양 미세 환경을 재모델링하는 것을 목표로합니다. 유망한 접근법은 CAF를 표적으로 할 수 있는 나노 크기의 전달제의 개발로, 따라서 약물 및 활성 분자의 특정 납품을 허용합니다. 이러한 맥락에서, CAFs의 세포 모델은 이러한 나노 제제의 체외 스크리닝 및 예비 조사를 위한 유용한 도구를 제공할 수 있다.
이 연구는 삼중 음성 유방암의 합성 4T1 뮤린 모델에서 1 차적인 CAFs의 격리 그리고 문화를 기술합니다. 자기 구슬은 해리된 종양으로부터 CAFs를 추출하기 위해 2단계 분리 과정에서 사용되었다. 면역페노티핑 제어는 각 통로 후 유동 세포측정을 사용하여 공정 수율을 검증하기 위해 수행되었다. 고립 된 CAF는 종양 미세 환경을 해결하기 위해 설계된 다른 나노 제제의 표적 화 능력을 연구하기 위해 사용될 수있다. 형광표지 H-페리틴 나노케이지는 이 방법을 설정하는 후보 나노입자로 사용되었다. 나노 입자, 맨손으로 또는 표적 리간드와 결합, CAFs에 그들의 바인딩에 대 한 분석 되었다. 결과는 유방 CAFs의 ex vivo 추출이 종양성 CAFs의 특정 표적화를 위한 나노 입자를 시험하고 검증하는 유용한 시스템이 될 수 있다는 것을 건의합니다.
지난 수십 년 동안 종양 세포를 죽이는 것은 종양 미세 환경이 종양 재발을 유발하고 치료 저항을 유도 할 수 있기 때문에 일반적으로 악성 종양을 근절하기에 충분하지 않다는 것이분명해졌습니다. 새로운 패러다임은 그 때 나타났습니다: 지원 요인의 종양을 박탈하기 위하여 종양 기질을 표적으로 하고, 따라서, 화학요법의 효험을향상3,4,5. 특히, 암관련 섬유아세포(CAFs)는 많은 고형종양6,7에서흥미로운 기질 표적이다. CAF는 성장 인자, 사이토카인 및 화학요법의 분비를 통해 면역 계통의 암세포 및 세포와 상호 작용하는 세포의 매우 이질적인 그룹입니다; 세포 외 매트릭스를 구축하고 리모델링하는 행위 전이 형성8, 9,10,11,12를활성화한다. 종양 유형에 따라 CAFs는 프로 종양 유발 기능을 나타내고, CAFs의 다른 특수형은 종양 억제 기능이있는것으로보인다. 이 이분법을 더 잘 명확히 하기 위해 1차 및 전이성 종양에서 CAF의 철저한 특성화가 중요합니다.
이러한 맥락에서, 새로운 연구 분야는 종양 미세환경을 리모델링할 수 있는 활성분자 및 약물을15,16,17,18로환전시킴으로써 CAF를 표적으로 하거나 파괴하도록 설계된 나노크기의 제제의 개발에 초점을 맞추고있다. 여러 유형의 나노입자는 세포독성 약물에 의한 CAF 절제를 달성하거나, CAF 표적 광역학 요법을 유도하거나, 정지 상태로 되돌거나 TNF 관련 세포멸 유발 리간드 발현을 유도하여 CAF를 재프로그래밍하도록 설계되어16,19. 더욱이, 많은 나노입자가 특정 생물학적 마커를 적극적으로 표적으로 삼을 수 있는 잠재력은 대상에 대한 CAF 서브셋을 선택할 수 있는 희망을 낳는다. CAF에 대한 절대적 특이성은 여전히 의문을 제기하고 있지만, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 프로 종양성 스트로마의 가장 유망한 표적 중 하나이며 나노약물 전달을 조종하기 위해 악용되어 CAF 표적 나노치료제20,21,22의개발경로를 포장하고 있다.
이 논문은 뮤린 유방암의 합성 모델에서 1 차 적인 CAFs의 격리를 설명하고 CAF 마커, FAP를 인식하도록 설계된 나노 입자의 표적 화 능력의 연구에서 그들의 사용을 보고합니다. 페리틴 나노케이지는 포팅모이티(23),24의표면 노출에 의해 전달의 특이성이 형성될 수 있기 때문에, 방법을 설정하는 후보 나노시스템으로 사용된다. 더욱이, 페리틴은 항종양 적용을 위한 우수한 생체적합성 셔틀로 성공적으로 입증되어종양질량(25,26,27)에서탑재하중의 급속한 축적을 유발한다. 현재까지 CAF-targeting 나노시스템의 전임상 연구는 CAFs28,29의일부 면역페노티픽 기능의 발현과 세포 활성화를 유도하기 위해 성장 인자 베타를 변형시키는 배양에서 자극된 섬유아세포 세포주에 대한 시험관제 시험에 관여해 있다. 이 방법은 일반적으로 불멸의 세포주 (NIH3T3, LX-2와 같은)에 적용되며 매우 빠르고 간단하며 몇 시간 또는 며칠 동안 활성화 된 세포를 산출합니다. 제한은 시험관 내 자극이 활성화된 심섬유아세포에 기인하는 몇몇 유전자의 발현을 유도하더라도, 실제 CAF의 모든 생물학적 특징, 특히 생체 내의이질성을 완전히 회수할 수 없다는 것입니다.
또 다른 전략은 인간 또는 마우스 종양 샘플30에서1 차적인 CAFs의 추출을포함합니다 30,31. 이를 통해 CAF 활성화는 생리학적 맥락에서 발생하고 CAF 하위 집단의 이질성이 유지되도록 합니다. 연구 목표에 따르면, CAFs는 다른 소스에서 파생 될 수 있습니다., 따라서 가장 신뢰할 수 있는 상태를 공부 하는 가능성을 제공. 여기에서 보고된 프로토콜은 뮤린 유방암 모형에서 CAFs를 표적으로 하기 위하여 디자인된 새로운 나노 입자의 기능에 대한 예비 평가를 능력을 발휘하고자 하는 과학자를 위해 가치가 있을 것입니다. 고립 된 CAFs암의 동물 모델에서 생체 내 평가를 진행하기에 충분히 유망한 나노 입자를 선별하는 데 유용 할 것입니다. 이는 나노입자 생산의 첫 번째 단계에서 관련이 있으며, 나노 기술자가 최적의 표적 특성을 달성하기 위해 리간 고정 전략을 주로 고려하여 나노입자 설계의 정제를 추진합니다.
CAF는 세포외 매트릭스를 리모델링하고, 전이 진행을 촉진하고, 종양부위(34)에대한 약물 접근을 제한하는 핵심 플레이어로 부상하고 있다. 그러나, 그들의 이질성 때문에, 그들의 역할은 아직도 논쟁의 여지가 있습니다 – 몇몇 다른 특수형은 종양 억제 역할이 있는 것처럼 보이는 반면, 몇몇 CAF는 종양성 입니다. 이러한 맥락에서, 그들의 고립은 중요한 임상 적 의미를 가질 것이다 암 진행에 있는 그들의 많은 토론된 역할에 더 많은 빛을 비추기 위하여 극단적인 관심사일 수 있습니다12,31. 더욱이, 인간 및 전임상 마우스 종양 모델에서 성공적인 CAF 추출은 또한 새로운 CAF 표적화 약의 개발을 용이하게 할 것입니다. 이 논문은 유방암의 합성 전임상 모델에서 1차 CAF를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 보고합니다. 경험을 바탕으로 세 가지 실험 단계는 대부분 프로토콜의 성공에 영향을 미칩니다.
첫 번째는 컬럼의 응고 및 감속 세포 의 혈중 의 위험과 관련된 세포 현탁액의 응집을 피하기 위해 빠르게 노력하고 있습니다 : 실제로 컬럼을 통과 한 세포가 함께 클러스터링되었을 때, 최적 격리 프로세스의 확률이 증가하고 최종 배양에는 “오염물질”세포 클론이 포함되었습니다. 두 번째는 고갈 통로 후에 상이한 종양에서 세포를 풀링하여 최종 농축 단계에서 통과될 충분한 세포를 보장한다. 마지막 중요한 문제는 높은 세포 밀도에서 추출 된 세포를 도금하는 것입니다, 가장 가능성이 최대 4-5 통로에 대한 세포 성장과 식민지 확장을 강화하기 위해 24 웰 플레이트의 단일 우물에서 시작. 셀이 낮은 밀도에서 시드된 경우 자유 표면에서 확장되어 복제를 신속하게 중단했습니다.
몇몇 연구 결과는 이미 암 발달 및 침략을 승진시키기에 있는 그들의 역할을 공부하기 위하여 인간과 마우스 기원 둘 다의 CAF 추출 방법을 기술했습니다. 이것은 유방암, 흑색종, cholangiocarcinoma 및 췌장 선암35,36,37,38를포함하여 종양의 많은 모형에서 행해졌습니다. 그러나 특정 CAF 마커의 부족과 이질성으로 인해 이러한 프로세스의 결과는 여전히 최적이 아닙니다.
여기서, 분리된 세포는 항FAP 표적화 모니티로 기능화된 HFn 나노케이지의 CAF 표적화 능력을 검증하기 위해 사용되었다. CAFs의 1차 배양물의 사용은 나노약물 최적화의 이 예비 단계에서 생체내에서 직접 수행하는 것보다 훨씬 간단하고 비용 효율적인 결합 실험을 통해 나노전략 전 생체권의 검증을 허용하는 중요한 이점이었다.
이러한 의미에서 CAF에 대한 전 생체 내 검사는 CAF의 최적의 표적을 위해 가장 유망한 나노입자의 스크리닝 및 선택을 허용함으로써 생체 내 동물 실험에 선행될 수 있다. 여기에 제시된 CAF 모델은 활성 약물로 나노입자를 적재할 때 예비 효능 연구에도 사용될 수 있다. 동물은 나중에 생체 분포, 약물 동학 및 효능 연구를 평가하기 위해 나중에만 사용됩니다.
유방암에서 광역학 치료를 위한 페리틴 나노케이지와 전립선암 모델39,40에서독소루비신을 전달하는 펩티드 계 입자 등 여러 CAF 표적 나노약물이 개발되고 있다. 그러나, 많은 연구는 나노 약물 최적화를 위한 세포 플랫폼으로 CAFs의 격리에 초점을 맞추고 있다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 여러 시약 및 재료의 준비 및 구매를 요구하는 시간이 많이 소요되는 프로토콜입니다. 둘째, 4T1 유방 종양에서 CAF의 희소성 때문에, 그들의 수율은 낮습니다. 나노 입자 실험은 1 차적인 CAFs가 노화를 겪고 오랜 시간 동안 문화권에서 유지 될 수 없기 때문에 필요한 세포 수가 달성되는 즉시 계획및 수행되어야합니다. 결론적으로, CAFs 격리, 배양 및 특성화의 이 방법은 암과의 싸움에서 새로운 표적 나노 의약품의 개발을 가속화하는 강력한 도구가 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 IG 2017-ID. 2017프로젝트 – P.I. 코르시 파비오(P.I. Corsi Fabio)에 따라 라 라이스사 술 칸크로(AIRC) 당 아소시아지오네 이탈리아아나(AirC)에 의해 지원되었다. SM은 자신의 위치를 지원하는 소아 임상 연구 센터 “로미오와 엔리카 Invernizzi”를 인정합니다. AB 감사 AIRC (ID. 20172 프로젝트) 및 연구 펠로우십밀라노 대학. LS와 MS 박사 후 펠로우십은 밀라노 대학의 지원을 받습니다.
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |