Summary
이 논문은 삼중 음성 유방암의 합성 뮤린 모델과 종양 미세 환경을 대상으로 설계된 새로운 나노 입자의 전임상 연구를위한 응용 프로그램에서 1 차 암 관련 섬유 아세포의 격리 및 배양에 대한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다.
Abstract
암 관련 섬유아세포(CAFs)는 종양 미세 환경의 맥락에서 핵심 배우이다. 종양 세포에 비해 수감소에도 불구하고, CAFs는 종양 진행을 통제하고 항종양 면역으로부터 보호를 제공합니다. 새로운 항암 전략은 프로 종양 유발 CAF의 절제 또는 CAF 기능 및 활성화 상태의 재프로그래밍을 통해 종양 미세 환경을 재모델링하는 것을 목표로합니다. 유망한 접근법은 CAF를 표적으로 할 수 있는 나노 크기의 전달제의 개발로, 따라서 약물 및 활성 분자의 특정 납품을 허용합니다. 이러한 맥락에서, CAFs의 세포 모델은 이러한 나노 제제의 체외 스크리닝 및 예비 조사를 위한 유용한 도구를 제공할 수 있다.
이 연구는 삼중 음성 유방암의 합성 4T1 뮤린 모델에서 1 차적인 CAFs의 격리 그리고 문화를 기술합니다. 자기 구슬은 해리된 종양으로부터 CAFs를 추출하기 위해 2단계 분리 과정에서 사용되었다. 면역페노티핑 제어는 각 통로 후 유동 세포측정을 사용하여 공정 수율을 검증하기 위해 수행되었다. 고립 된 CAF는 종양 미세 환경을 해결하기 위해 설계된 다른 나노 제제의 표적 화 능력을 연구하기 위해 사용될 수있다. 형광표지 H-페리틴 나노케이지는 이 방법을 설정하는 후보 나노입자로 사용되었다. 나노 입자, 맨손으로 또는 표적 리간드와 결합, CAFs에 그들의 바인딩에 대 한 분석 되었다. 결과는 유방 CAFs의 ex vivo 추출이 종양성 CAFs의 특정 표적화를 위한 나노 입자를 시험하고 검증하는 유용한 시스템이 될 수 있다는 것을 건의합니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 종양 세포를 죽이는 것은 종양 미세 환경이 종양 재발을 유발하고 치료 저항을 유도 할 수 있기 때문에 일반적으로 악성 종양을 근절하기에 충분하지 않다는 것이분명해졌습니다. 새로운 패러다임은 그 때 나타났습니다: 지원 요인의 종양을 박탈하기 위하여 종양 기질을 표적으로 하고, 따라서, 화학요법의 효험을향상3,4,5. 특히, 암관련 섬유아세포(CAFs)는 많은 고형종양6,7에서흥미로운 기질 표적이다. CAF는 성장 인자, 사이토카인 및 화학요법의 분비를 통해 면역 계통의 암세포 및 세포와 상호 작용하는 세포의 매우 이질적인 그룹입니다; 세포 외 매트릭스를 구축하고 리모델링하는 행위 전이 형성8, 9,10,11,12를활성화한다. 종양 유형에 따라 CAFs는 프로 종양 유발 기능을 나타내고, CAFs의 다른 특수형은 종양 억제 기능이있는것으로보인다. 이 이분법을 더 잘 명확히 하기 위해 1차 및 전이성 종양에서 CAF의 철저한 특성화가 중요합니다.
이러한 맥락에서, 새로운 연구 분야는 종양 미세환경을 리모델링할 수 있는 활성분자 및 약물을15,16,17,18로환전시킴으로써 CAF를 표적으로 하거나 파괴하도록 설계된 나노크기의 제제의 개발에 초점을 맞추고있다. 여러 유형의 나노입자는 세포독성 약물에 의한 CAF 절제를 달성하거나, CAF 표적 광역학 요법을 유도하거나, 정지 상태로 되돌거나 TNF 관련 세포멸 유발 리간드 발현을 유도하여 CAF를 재프로그래밍하도록 설계되어16,19. 더욱이, 많은 나노입자가 특정 생물학적 마커를 적극적으로 표적으로 삼을 수 있는 잠재력은 대상에 대한 CAF 서브셋을 선택할 수 있는 희망을 낳는다. CAF에 대한 절대적 특이성은 여전히 의문을 제기하고 있지만, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 프로 종양성 스트로마의 가장 유망한 표적 중 하나이며 나노약물 전달을 조종하기 위해 악용되어 CAF 표적 나노치료제20,21,22의개발경로를 포장하고 있다.
이 논문은 뮤린 유방암의 합성 모델에서 1 차 적인 CAFs의 격리를 설명하고 CAF 마커, FAP를 인식하도록 설계된 나노 입자의 표적 화 능력의 연구에서 그들의 사용을 보고합니다. 페리틴 나노케이지는 포팅모이티(23),24의표면 노출에 의해 전달의 특이성이 형성될 수 있기 때문에, 방법을 설정하는 후보 나노시스템으로 사용된다. 더욱이, 페리틴은 항종양 적용을 위한 우수한 생체적합성 셔틀로 성공적으로 입증되어종양질량(25,26,27)에서탑재하중의 급속한 축적을 유발한다. 현재까지 CAF-targeting 나노시스템의 전임상 연구는 CAFs28,29의일부 면역페노티픽 기능의 발현과 세포 활성화를 유도하기 위해 성장 인자 베타를 변형시키는 배양에서 자극된 섬유아세포 세포주에 대한 시험관제 시험에 관여해 있다. 이 방법은 일반적으로 불멸의 세포주 (NIH3T3, LX-2와 같은)에 적용되며 매우 빠르고 간단하며 몇 시간 또는 며칠 동안 활성화 된 세포를 산출합니다. 제한은 시험관 내 자극이 활성화된 심섬유아세포에 기인하는 몇몇 유전자의 발현을 유도하더라도, 실제 CAF의 모든 생물학적 특징, 특히 생체 내의이질성을 완전히 회수할 수 없다는 것입니다.
또 다른 전략은 인간 또는 마우스 종양 샘플30에서1 차적인 CAFs의 추출을포함합니다 30,31. 이를 통해 CAF 활성화는 생리학적 맥락에서 발생하고 CAF 하위 집단의 이질성이 유지되도록 합니다. 연구 목표에 따르면, CAFs는 다른 소스에서 파생 될 수 있습니다., 따라서 가장 신뢰할 수 있는 상태를 공부 하는 가능성을 제공. 여기에서 보고된 프로토콜은 뮤린 유방암 모형에서 CAFs를 표적으로 하기 위하여 디자인된 새로운 나노 입자의 기능에 대한 예비 평가를 능력을 발휘하고자 하는 과학자를 위해 가치가 있을 것입니다. 고립 된 CAFs암의 동물 모델에서 생체 내 평가를 진행하기에 충분히 유망한 나노 입자를 선별하는 데 유용 할 것입니다. 이는 나노입자 생산의 첫 번째 단계에서 관련이 있으며, 나노 기술자가 최적의 표적 특성을 달성하기 위해 리간 고정 전략을 주로 고려하여 나노입자 설계의 정제를 추진합니다.
Protocol
1. 유방암의 시너지 4T1 모델 수립
참고: 본 프로토콜은 마우스 4T1 유방 종양에서 1차 CAFs의 분리를 기술합니다. 여기에 설명 된 동물 연구는 이탈리아 보건부 (aut. 번호 110/2018-PR)에 의해 승인되었습니다.
- 종양 세포 배양 및 이식
- 해동 1 × 106 4T1-luc 세포와 T75 플라스크에 10 mL의 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 중간 보충 10% 태아 소 혈 청으로 보충 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토 마이신 (P/S), 그리고 1% L-글루타민. 배양 배지에 마이코플라즈마 제거제(1:100)를 추가합니다.
참고: 4T1-luc 세포는 루시파아제를 안정적으로 표현하며, D-루시페린을 가진 적절한 자극시 생물발광(BLI)에 의해 시각화될 수 있다. 이를 통해 마우스에서 이식시 종양 세포의 생존 가능성 및 증식을 생체내에서 모니터링할 수 있습니다(도1). - 2일마다 배지를 변경하여 -80% 수렴할 때까지 가습대기에서 37°C 및 5%CO2로 세포를 유지한다.
참고: 주입된 세포가 마이코플라즈마가 없는지 확인하기 위해 마우스에서 주입하기 전에 1주일 동안 마이코플라즈마 제거제로 치료를 계속합니다. - 시술 당일, 37°C에서 5분 동안 트립신-에틸렌디아민테트라아세산(EDTA) 용액(TRYpsin 1:250)의 1mL을 이용하여 세포를 분리한다. 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고, 트라이판 블루(1:1)로 셀을 계산하고, 셀/mL수를 계산한다.
- 파이펫은 1 × 106 셀 및 원심분리기400 × g에서 5분 동안 원심분리기에 해당하는 부피. 상체를 부어, RPMI 1640 베이스 매체의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단. 주사를 준비할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 각 마우스에 대해 1×105개의 세포가 필요합니다. 그러나 주사기 하중을 용이하게하기 위해 항상 2 마우스 (2 × 105 세포에 해당)를 초과하여 계산합니다. - 수술 하루 전에 8 BALB/c 마우스(암컷, 7주 된 마우스)의 털을 면도하여 오른쪽에 있는 복부 유방 땀샘의 부위를 노출시하십시오. 전기 면도기사용과 4분 동안 디필 크림의 얇은 층을 적용하십시오. 그런 다음 크림을 물과 종이로 씻어냅니다.
- 2%의 연속 흡입에 의한 마취를 유도하여 ~5분 동안, 27G 결핵 주사기를 가진 복부 유방 땀샘 의 영역에서 피하 주사를 수행한다. 바늘을 위쪽으로 돌려 피부에 피하로 들어가십시오. 그런 다음 피부를 위쪽으로 잡고 천천히 세포 현탁액의 100 μL (1 × 105 세포)를 주입하십시오. 주사기를 천천히 철회하기 전에 바늘을 약간 돌려보십시오.
참고: 세포 현탁액을 실온으로 15분 전에 가져오는 것을 기억하십시오.
- 해동 1 × 106 4T1-luc 세포와 T75 플라스크에 10 mL의 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 중간 보충 10% 태아 소 혈 청으로 보충 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토 마이신 (P/S), 그리고 1% L-글루타민. 배양 배지에 마이코플라즈마 제거제(1:100)를 추가합니다.
- 종양 성장 및 해부
- 에서 5 일 후 세포 주입, 주입 150 mg/kg D-luciferin 내 역류 (100 μL) 5 이미징 전에 분. 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 BLI 이미지를 캡처하여 10s 노출, 중간 비닝 및 4에서 f/stop을 설정합니다. 종양의 발광 영역을 관심 영역(ROI)으로 정의하고, 이미징 소프트웨어를 사용하여 ROI(광자/초/m2)의 총 신호를 정량화한다.
- BLI의 증가 측면에서 종양 성장을 모니터링하기 위해 주사로부터 5일마다 이미징(1.2.1)의 절차를 반복한다.
- 종양 부피를 설정하려면 마우스를 잡고 배를 노출하십시오. 캘리퍼를 사용하여 일주일에 한 번 종양 길이(L) 및 너비(W)를 측정합니다. 방정식 1을 사용하여 종양 부피(V)를 계산합니다.
【V =(Lx W 2)/2】 (1) - 20 일 후에 세포 주사 후 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 희생하고, 가위로 피부에서 종양을 분리하고, 조직 저장 용액에서 수집하십시오 (재료의 표 참조).
참고: 종양 샘플은 단일 세포(섹션 2)로 해리하거나 최대 48h에 대해 4°C에 저장되도록 즉시 사용될 수 있다.
2. 단일 세포로 종양 해리
참고: 다음 단계의 경우 멸균 시약과 일회용을 라미나르 플로우 후드에 사용하십시오. 한 번에 4개의 종양으로 작업하십시오.
- 페트리 접시에 종양 샘플을 놓고 핀셋과 메스의 도움으로 피부, 지방 및 괴사 부위의 조각을 조심스럽게 제거하십시오. 이어서, 종양을 약 1~2mm의 작은 조각으로 줄이고튜브(도 2A)로이송한다.
참고: 4T1 종양은 궤양하는 경향이 있는 성장하는 동안 높게 괴사하게 됩니다. 다음 단계로 인한 파편간섭을 피하기 위해 괴사 영역을 신중하게 제거하는 것이 중요합니다. - 종양 해리를 위한 소화 믹스를 준비: RPMI 1640 배지의 2.35 mL, 효소 D 100 μL, 효소 R의 50 μL, 효소 A.의 12.5 μL을 혼합하여 용액에 종양 조각을 담그고 튜브를 단단히 닫습니다.
참고: 소화 혼합의 표시된 양은 1 g까지 종양에 유효하고 그들의 무게에 따라 더 큰 종양을 위해 조정될 수 있습니다. 20일 동안 자란 4T1 종양은 일반적으로 0.5-0.8g의 범위에 있다. - 튜브를 거꾸로 뒤집어 서 종양의 모든 조각이 튜브 의 바닥에 캡을 향하여 서 있는지 확인합니다. 적절한 하우징의 기계적 해리에 튜브를 부착하고 거친 종양을 위해 설계된 특정 해리 프로그램을 실행합니다(제조업체의 지침 참조).
참고: 특수 튜브는 해리에 맞도록 필요할 수 있습니다. C-튜브는 조직의 기계적 해리를 촉진하기 위해 캡 내부에 로터를 부담합니다. - 튜브를 분리하고 거꾸로 유지하고 샘플을 37 °C에서 부드러운 흔들림으로 40 분 동안 배양합니다. 이어서, 적절한 하우징에서 해리에 튜브를 부착하고, 거친 종양을 위해 두 번 설계된 다음과 같은 특정 해리 프로그램을 실행한다. 절차의 끝에 조직의 큰 조각이 없는지 확인(그림 2B).
참고: 종양을 해리하기 위해 다른 효소 칵테일을 사용하여 세포외 매트릭스를 저하시킬 수 있습니다. 그러나, 본 프로토콜에서, 최적화된 효소 혼합(효소 D, R, A) 및 조직을 기계적으로 해리시키는 반자동 해리를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 종양 해리 키트가 사용되었다. 이 조합은 세포 무결성 및 세포 표면 전형의 유지 보수와 함께 세포 외 매트릭스의 적절한 분해를 보장했습니다. - 50mL 튜브에서 40 μm 세포 스트레이너를 통해 샘플을 필터링하고, RPMI 1640 배지의 10mL로 필터를 세척하고, 300 × g에서 7 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 세포 펠릿이 적색으로 나타나면 실온에서 5 분 동안 암모늄 - 염화물 칼륨 (ACK) 용해 버퍼 1 mL을 추가하여 리스 에리스로사이클을 추가하고, RPMI 1640의 10mL로 세척하고, 15 mL 튜브에서 세포 현탁액을 다시 전송하고 원심분리기를 다시 전달합니다.
- 인산완충식염수(PBS), 소혈청 알부민(BSA), 2mM EDTA로 구성된 PBE 버퍼 1mL에서 펠릿을 재보중단하고, 트라이판 블루(1:1)로 세포를 세어한다. 세포 덩어리의 경우 이전에 PBS에 담근 70 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링하십시오.
참고: 특히 종양이 큰 경우, 세포 수를 확인하고 결국 2.7 단계로 진행하기 전에 각 튜브에 107 세포 이하가없는 다른 튜브에서 각 종양 샘플을 분할하는 것이 중요합니다. - 멸균 이중 증류수로 20배 결합 버퍼 스톡 솔루션(재료표참조)을 희석하여 데드 셀 제거 바인딩 버퍼를 준비합니다. 1× 결합 버퍼(도 2C)의5mL로 셀을 세척합니다.
참고: 버퍼를 4°C로 유지합니다. - 원심분리기는 300 × g에서 7분 동안, 죽은 세포 제거 마이크로비드의 0.1mL로 세포 펠릿을재연한다(재료의 표 참조). 잘 섞어서 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
- 구슬이 있는 인큐베이션 동안 후드 아래에 자기 스탠드를 준비하고 강자성 분리 열(최대107개의 셀에 대한 하나의 열)을 아래쪽을 가리키는 팁과 함께 걸어놓습니다. 0.5mL의 콜드 1× 바인딩 버퍼로 열을 계측합니다. 용액이 중력 아래에서 흘러 들어갈 때까지 기다립니다.
참고: 컬럼 침대를 응고하고 복구 수율을 줄이는 위험을 피하기 위해 열당 셀 수를 초과하지 않는 것이 중요합니다. 10개 이상의7개 셀로 작업할 때 총 셀 수에 따라 더 많은 열을 사용하거나 더 큰 열을 사용합니다. 이러한 경우 제조업체가 표시된 단계로 다음 단계에서 설명된 시약 볼륨을 조정합니다. - 인큐베이션의 끝에서, 400 μL의 차가운 1× 바인딩 버퍼를 비드/셀 서스펜션에 추가하고, 전체 부피를 기둥에 적재하고, 15mL 튜브에서 유출물(라벨이 없는 셀에 해당)을 수집한다.
- 0.5mL의 콜드 1× 바인딩 버퍼로 컬럼을 네 번 세척하고 동일한 튜브에서 총 유출물(라이브 셀 분획에 해당)을 수집합니다.
- 트라이판 블루 (1:1)로 셀을 계산합니다. 불광 활성화 세포 정렬 (FACS)에 대한 두 개의 튜브에 1 × 105 세포를 배치하고, 공정 검증 (단계 4.1 참조)까지 4 ° C에서 보관하십시오 ( 단계 4.1 참조) 분석 매개 변수 및 양성 영역 (대조관) 및 바이오 마커 분석 (샘플 튜브)에 대한 다른 하나를 사용합니다. 나머지 셀을 CAF 추출에 사용합니다(섹션 3 참조).
참고: 죽은 세포의 제거는 섹션 3에서 마이크로 비드와 비 특이적 반응을 감소시키는 것이 중요합니다. 그러나, 수율을 향상시키기 위하여는, 죽은 세포의 비율이 < 20%인 경우에 죽은 세포의 제거를 피하십시오.
3. 유방 종양에서 1 차적인 CAF의 추출
참고: 섹션 3의 경우, 비종양-관련 섬유아세포 고갈 칵테일 및 종양 관련 섬유아세포 마이크로비드를 함유한 마우스 종양 관련 섬유아세포 격리 키트를 사용하여 세포의 자기 라벨링에 적합합니다(재료표참조).
- 비암 관련 섬유아세포고갈기
- PBS로 70 μm 세포 스트레이너를 적분시키고 셀 서스펜션을 필터링하여 덩어리를 제거합니다. 그런 다음, 300g에서 1 ×0 분 동안 세포를 원심 분리하고 수퍼나티를 흡인시합니다.
참고: 단일 종양이 2.7단계에 대해 2개의 샘플로 분할된 경우, 3.1.2단계를 진행하기 전에 세포 현탁액을 2로 풀. - 차가운 PBE 버퍼의 80 μL에서 펠릿을 다시 중단하고, 비 종양 관련 섬유아세포 고갈 칵테일의 20 μL을 추가합니다. 잘 섞고 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 구슬을 사용하여 인큐베이션하는 동안 자기 스탠드에서 강자성 고갈 컬럼(샘플당 1개)을 준비하고 컬럼을 2mL의 콜드 PBE 버퍼로 상형화합니다. 솔루션이 흐르때까지 기다립니다.
- 인큐베이션의 끝에서, 비드/셀 서스펜션에 400 μL의 차가운 PBE 버퍼를 추가하고, 전체 부피를 기둥에 적재하고, 15mL 튜브에서 유출물(라벨이 없는 세포에 해당)을 수집한다.
- 콜드 PBE 버퍼 2mL로 컬럼을 두 번 세척하고 동일한 튜브에 총 유출물을 수집합니다. 원심분리기는 300g에서 10분 동안 10분 × 0.1mL의 콜드 PBE 버퍼로 재연합니다.
참고: 비암 관련 섬유아세포의 고갈은 복구된 세포의 총량을 크게 감소시킵니다. 일반적으로 4개의 상이한 샘플에서 세포 현탁액을 풀기 위해 눈에 보이는 펠릿과 3.2 단계를 위한 충분한 세포를 얻는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 최적의 수율을 보장합니다. - FACS 튜브에 세포 현탁액의 20 μL을 놓고 공정 검증을 위해 4°C로 유지하십시오(섹션 4 참조). CAF 선택에 나머지 셀을 사용합니다(3.2단계 참조).
- PBS로 70 μm 세포 스트레이너를 적분시키고 셀 서스펜션을 필터링하여 덩어리를 제거합니다. 그런 다음, 300g에서 1 ×0 분 동안 세포를 원심 분리하고 수퍼나티를 흡인시합니다.
- 암 관련 섬유아세포의 긍정적인 선택
- 종양 관련 섬유아세포 마이크로비드 의 20 μL을 세포 현탁액의 80 μL에 추가합니다. 잘 섞고 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 구슬을 배양하는 동안 자기 스탠드에 강자성 분리 컬럼(샘플당 1개)을 준비하고 0.5mL의 콜드 PBE 버퍼로 컬럼을 상형화합니다. 솔루션이 흐르때까지 기다립니다.
- 인큐베이션의 끝에서, 비드/셀 서스펜션에 차가운 PBE 버퍼 400 μL을 추가하고, 전체 부피를 컬럼에 적재하고, 라벨이 없는 세포가 15mL 튜브로 흘러 들어갑니다.
- 0.5mL의 콜드 PBE 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 동일한 튜브로 총 유출물을 수집합니다.
참고: 흐름스루에는 비암 관련 섬유아세포로 폐기될 수 있는 표지가 없는 CD90.2 음성 세포가 포함되어 있습니다. - 자석에서 컬럼을 제거하고 1.5 mL 튜브에 놓습니다. 컬럼에 1mL의 콜드 PBE를 추가하고 즉시 플런저를 열로 밀어 세포를 플러시합니다.
- 원심분리기는 400 × g에서 10분 동안 원심분리기를 × 0.1mL의 콜드 PBE 버퍼로 재연합니다. FACS 튜브에 세포 현탁액 의 20 μL을 배치하고 공정 검증을 위해 4 °C에서 보관하십시오 (섹션 4 참조).
참고: 원심 분리 후, 펠릿은 특히 원래 종양이 작을 때 거의 보이지 않을 수 있습니다. 원적 하단 원심 분리관을 사용하고 상체를 지날 때 세포를 잃지 않도록주의하십시오. - Dulbecco의 수정 된 독수리 의 매체 (DMEM)/햄의 F-12의 적절 한 부피에 나머지 세포를 희석 15% FBS, 2 mM L-글루타민, 1% P/S, 그리고 1% 비 필수 아미노산, 그리고 1% 비 필수 아미노산, 그리고 조직 배양 판에 세포를 종자.
- 현미경의 밑에 세포 밀도를 확인하고, 세포가 부착하고 성장할 수 있도록 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.
참고: 세포가 너무 조밀한 경우, 즉시 인큐베이터에 플레이트를 놓기 전에 세포 현탁액을 조직 배양 판의 두 개의 우물로 분할합니다.
4. 프로세스 유효성 검사
- 유동 세포측정
참고: 섹션 4.1은 멸균 조건이 필요하지 않으며 라미나르 후드 외부에서 수행 할 수 있습니다. 단계 2.11 (해리 된 종양), 단계 3.1.6 (비 암 관련 섬유 아세포의 고갈 후), 및 단계 3.2.6 (암 관련 섬유아세포의 농축 후)에서 수집 된 샘플에 대해 병렬로 섹션 4.1을 수행하십시오.- 30 ×0g에서 10분 동안 2.11, 3.1.6, 3.2.6단계로 준비된 FACS 튜브 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
참고: 분석을 위한 매개변수를 설정하는 대조군 역할을 하는 스테인드 셀을 포함하는 하나 이상의 추가 튜브를 준비합니다. - 샘플 튜브에서, PBE의 88 μL에서 세포를 재중단, 및 플루오레세인 이소티오카네이트(FITC, 1:50 희석)와 10 μL의 항 CD90.2 항체를 물리에리트린(PE, 1:10 희석)으로 유도하여 결합한 항 CD45 항체의 2μL을 추가합니다. 철저히 섞어서 어둠 속에서 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 대조군 관(얼룩이 없는)에서 PBE의 100 μL에서 세포를 다시 중단합니다. 어둠 속에서 4°C에서 10분 동안 배양하여 항체 염색 된 세포에 대한 절차를 복제한다.
참고: 이러한 변수의 변화로 인해 결과가 저하되거나 비특이적 얼룩이 발생할 수 있으므로 인큐베이션의 온도와 시간을 주의 깊게 확인해야 합니다. - 인큐베이션 단계를 완료한 후, PBE 1mL를 추가하여 세척을 수행합니다. 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리기. 상부체를 폐기합니다.
- PBS의 500 μL에서 세포 (모든 튜브)를 다시 중단합니다.
- 잘 섞어서 유동 세포측정 분석을 진행하십시오. 항체(즉, FITC 및 PE)의 형광을 측정하는 채널을 설정합니다.
- 제어 관에서 전방 대 사이드 분산(FSC 대 SSC) 플롯에 첫 번째 게이트(P1)를 그려 실행 가능한 모든 셀을 선택합니다. P1 내에서, 단일 셀만 을 포함하는 제2 게이트(P2)를 설정한다.
- 항체의 특정 형광 채널(즉, FITC 및 PE)을 사용하여, 긍정적으로 얼룩진 세포를 분별하기 위해 적절한 게이트를 설정합니다.
- 분석을 시작하고 P2에서 최소 10,000개의 이벤트를 기록합니다. 두 채널의 신호를 동시에 읽습니다.
참고: 전체 세포 수가 예상보다 적은 경우 전체 튜브를 읽는 것이 바람직할 수 있습니다. - (선택 사항) 추가 항체/형광으로 염색이 프로그래밍되면 분석을 시작하기 전에 적절한 보상 매트릭스를 설정하십시오.
- 30 ×0g에서 10분 동안 2.11, 3.1.6, 3.2.6단계로 준비된 FACS 튜브 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
- 세포 형태 및 특성 모니터링
참고: 일단 시드되면, 세포는 멸균 조건하에서 처리되어야 합니다.- 시드 후 날에 는 광학 현미경으로 세포를 시각화하여 세포 접착및 형태학을 검사합니다. 슈퍼나티를 흡인하고 신선한 매체로 대체하십시오.
참고: CAF는 4T1 종양 세포의 상피와 같은 구조와 쉽게 구별될 수 있는 큰 스핀들 모양의 세포입니다. - 가습된 대기에서 세포를 37°C 및 5% CO2로 유지하여 매 2일마다 배지를 변경합니다.
- 세포가 ~80%의 합류(파종 후 약 4~6일)에 도달하면 트립LE 셀렉트 용액(재료 표참조)을 사용하여 세포를 실온에서 5분 동안 분리합니다. 신선한 배지(4:1), 세포 현탁액을 400 × g에서 5분 동안 원심분리하고, 신선한 배지에서 펠릿을 다시 분리한다.
- 세포를 1:2로 나누고, 실험에 필요한 세포의 수가 얻어지을 때까지 배양을 확장한다.
- 각 통로에서, 광학 현미경의 밑에 세포 형태 및 성장을 확인하십시오. 세포 형태학이 균질적이지 않은 경우(예를 들어, 배양에 나타나는 작은 둥근 모양 세포의 클론), 섹션 4.1에 설명된 바와 같이 세포 순환을 유동하여 세포의 샘플을 분석한다. 균질한 경우 4.2.7 단계로 진행하십시오.
참고: 세포 형태학의 변화는 배양 순도를 보장하기 위해 제거해야 하는 비암 관련 섬유아세포에 의한 오염을 나타낼 수 있습니다. - 흐름 세포 분석 결과를 분석하고 다음 시나리오 중 하나에 따라 진행: (i) CD90.2-/CD45-세포의 오염이 발생하면, 모든 세포를 수집하고, 다음 단계 3.2를 통해 양성 선택을 반복; (ii) CD45+ 세포의 오염도 발생하면, 모든 세포를 수집하고, 단계 3.1에서 고갈을 반복; (iii) 오염이 발생하지 않는 경우(CD90.2+/CD45-세포만 존재), 세포를 배양에 보관하고 4.2.7로 직접 진행한다.
참고: 마이크로비드로 고갈 과정을 반복하면 세포 회복이 줄어들기 때문에 세포를 즉시 사용할 필요가 없는 경우에만 권장됩니다. - 트라이판 블루 (1:1)로 세포를 계산하고, 2 개의 FACS 튜브에 5 × 105 세포를 배치하고, 원심분리기는 300 × g에서 10 분 동안 배치합니다. 상체를 버리고, 0.5mL의 블로킹 버퍼(PBS2% BSA, 2% 염소 세럼으로 보충)에서 펠릿을 실온에서 15분 동안 재연한다.
참고: 1개의 관은 스테인드되지 않은 세포로만 구성된 대조군역할을 하며, 두 번째 튜브의 세포는 유동 세포 분석용으로 염색됩니다. - 원심분리기는 300 × g에서 10분 동안, 상류체를 폐기하고 블로킹 버퍼의 99 μL에서 재연합니다. 시료 튜브에 항 FAP 항체 1 μg, 제어 튜브에 1mL의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 철저히 섞어서 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
참고: FAP는 반응성 종양 기질의 표면 마커이며 CAF를 식별하고 특성화하는 데 사용될 수 있습니다. - PBS, 원심분리기, 적절한 이차 항체로 세 번 세척하고 실온에서 15분 동안 버퍼를 차단하는 형광 염료(1 μg)로 컨쥬게이징된 적절한 이차 항체로 배양한다.
- PBS로 세 번 세척하고, 유동 세포측정에 의해 분석한다(사용되는 플루오로포어를 검출하기 위해 적절한 채널을 설정하여 4.1.5 ~ 4.1.7단계를 따르십시오). 그런 다음 실험을 위해 세포를 사용한다(단계 5.2).
- (선택 사항) 90% FBS및 10% 디메틸 설산화물 (DMSO)의 1 mL에 있는 세포의 견본을 동결합니다; 추가 사용을 위해 -80 °C에 보관하십시오.
- 시드 후 날에 는 광학 현미경으로 세포를 시각화하여 세포 접착및 형태학을 검사합니다. 슈퍼나티를 흡인하고 신선한 매체로 대체하십시오.
5. 엔지니어링 페리틴 나노 입자에 의해 타겟팅 CAF
참고: 인간 페리틴 중형 체인(HFn)의 재조합 변종은 벌거벗은 나노입자로 사용하거나 표적 모에이티와 결합하였다. 여기서, 항FAP 항체(Fab@FAP)의 가변 부분으로 기능화된 HFn 나노입자는 이전에 설명된프로토콜(32)에따라 2개의 HFn:Fab@FAP 어어 비, 1:1 및 1:5에서 밀라노-비코카 대학의 나노바이오랩에 의해 제조되었다.
- HFn 나노 입자의 형광 라벨링
참고: 맨손으로 기능화된 HFn 나노케이지는 FITC로 형광으로 표시되어 있습니다.- FITC 분말을 99% 에탄올에 녹여 2 mg/mL의 농도를 얻습니다.
참고: 이 솔루션은 새로 준비해야 합니다. - 준비된 용액(FITC 200 μg)의 50 μL을 1mg의 단백질(즉, 10 mg/mL에서 HFn 100 μL)에 배양합니다. 중탄산나트륨 1M(NaHCO3)의50μL을 추가하고 0.1M NaHCO3로부피를 500 μL로조정한다.
참고: 실험적 필요에 따라 볼륨을 확장합니다. - 반응 혼합물을 실온, 어둠 속에서, 그리고 1h의 연속 교반으로 배양한다.
- 스핀 탈염 열(7 kDa MWCO)을 이용하여 젤 여과에 의한 컨쥬게이트에서 FITC의 초과를 제거합니다.
- 분광계를 사용하여 회수된 라벨 단백질의 농도를 평가합니다. 각각 280nm및 488nm에서 흡수도를 측정하여 단백질과 염료의 양을 추정한다.
- FITC 분말을 99% 에탄올에 녹여 2 mg/mL의 농도를 얻습니다.
- HFn 나노 입자의 결합을 CAF에
참고: 문화에서 4-5 구절보다 늦어도 CAF를 사용합니다.- 각 FACS 튜브에 5 × 105 세포를 배치하고, 300 × g에서 10 분 동안 원심 분리기, PBS의 0.5 mL로 재연, 0.3 % BSA는 나노 입자의 다른 제제의 0.1 mg / mL로 보충 (베어 HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) 이전에 FITC와 함께.
참고: 각 조건을 트리플리케이트로 실행합니다. 나노입자가 첨가되지 않은 대조군 라벨이 부착되지 않은 샘플로 추가 튜브를 준비합니다. - 어두운, 원심분리기에서 4°C에서 2시간 동안 배양하고 PBS에서 세 번 세척합니다.
- 0.5 mL PBS로 세포를 다시 중단하고 잘 혼합하고 혈류 세포측정에 의해 분석합니다. FITC의 형광을 측정하기 위해 채널을 설정합니다.
- 살아있는 단일 세포에 게이팅 후, 취득 20,000 이벤트. 표지가 없는 튜브를 사용하여 FITC 양성의 게이트를 설정하고 FITC+ 이벤트 비율(나노입자 결합에 해당)을 얻습니다.
- 각 FACS 튜브에 5 × 105 세포를 배치하고, 300 × g에서 10 분 동안 원심 분리기, PBS의 0.5 mL로 재연, 0.3 % BSA는 나노 입자의 다른 제제의 0.1 mg / mL로 보충 (베어 HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) 이전에 FITC와 함께.
6. 통계 분석 및 실험 복제
- 마리
- 1.1.5에 기술된 바와 같이, 단일 실험당 8마리의 동물을 사용하여 종양 성장 및 CAFs 격리의 3개의 독립적인 실험을 수행합니다. CAF 격리 수율을 최적화하려면 절제된 조직을 하위 그룹(n=4)으로 나누고 섹션 2에 설명된 단계에 따라 처리합니다.
- 세포와의 HFn 상호 작용
- 형광표 나노케이지에 의해 양립스테인 세포의 백분율로 표적 및 비표적 세포(CAFs 및 4T1)를 가진 기능성 및 비기능성 HFn의 상호 작용을 평가합니다. 결과를 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 보고합니다.
- 통계 분석
- HFn 및 HFn-FAP를 사용한 세포 결합 실험에서 통계적 유의를 계산하려면 일반적인 단방향 ANOVA 테스트를 사용합니다.
Representative Results
최적의 CAF 격리를 위한 생체 내 모델 설정
105 4T1-luc 세포의 주입암컷 BALB/c 마우스의 유방 지방 패드로 이식 후 5일 후에 검출 가능한 종양 질량의 성장을 유도한다. BLI에 의한 캘리퍼 및 종양 세포 생존가능성에 의한 종양 부피를 측정함으로써, 종양 성장은 이식 후 1개월 동안 모니터링되었다. CAFs 격리에 적합한 희생 창을 찾기 위해, 한편으로는 종양 크기와 BLI 사이에 최적의 타협을 모색하고 다른 한편으로는 새로운 종양 궤양및 괴사(도1). 괴사 코어는 이식 후 20일 후에 나타나고, 25일과 30일(도 1C에서BLI 이미지에 의해 문서화됨)으로 확대되기 때문에, 20일은 격리 과정 후 세포 회복을 최적화하는 시점으로 설정되었다. 종양 처리의첫 번째 단계 동안 모든 눈에 보이는 괴사 영역을 신중하게 제거한 후에도, 죽은 세포의 높은 백분율은 단일 세포로 해리의 끝에서발견되었다(표 1). 이 백분율은 특히 종양 크기의 증가와 관련이 있을 수 있기 때문에 4T1 모델로 작업할 때 죽은 세포 제거가 항상 필요합니다.
CAF 격리 절차, 문화 및 특성화 최적화
수집된 실행 가능한 세포의 패널에서 CAFs(CD90.2+ CD45)의인구를 격리하기 위해 2개의 더 많은 구절이 필요합니다: 비종양 관련 섬유아세포의 고갈 및 종양 관련 섬유아세포의 농축(도2). 고갈 비드 칵테일은 CD45+ 세포를 효율적으로 제거합니다(총 세포의 67.35% 및 0.69%를 차지하며, 각각 표 2)모든 컬럼에서 단일 종양을 처리하는 데 사용되었습니다. 표 1에도시된 바와 같이, 용출된 세포의 수는 고갈 단계 후 3× 106 에서 1 × 105의 평균에서 떨어졌다. 총 세포 수의 이 거대한 감소로 인해, 농축 단계를 진행하기 전에 단일 튜브에서 적어도 2에서 최대 4 종양으로 수집 된 세포를 풀하는 것이 편리합니다. 이렇게 함으로써, 종양 관련 섬유아세포 구슬을 가진 배양을 위해 적절한 수의 세포를 수득하고 단일 분리 컬럼을 통과하여 CD90.2+ CD45의 최종평균을 93% - CD45-세포(표 2)를얻었다.
일단 조직 배양 판에 시드되면, 이러한 회수된 세포는 플라스틱에 부착되어 있으며 섬유아세포(도3A,B)의전형적인 대형 스핀들 모양의 형태를 드러냈으며 4T1 종양 세포(도3D)와상이하였다. 고갈 후 종양을 풀링하지 않는 것은 종양 관련 섬유아세포 마이크로비드와 세포 수율이 너무 낮아 배양을 확립하는 원인이 된다. 다른 경우에는, 마이크로비드를 가진 잠복기의 지속 시간 및 온도가 신중하게 유지되지 않을 때, 몇몇 비특이적 결합이 생길 수 있습니다. 이러한 경우, 농축 단계는 CD90.2- CD45+ 및 CD90.2- CD45- 세포가 CD90.2+ CAFs (5.97 ± 1.5 및 16.75 ± 1.1과 함께 회복되었다)(그림4 및 표 3)의덜 효율적이고 더 높은 백분율이었다. 이러한 오염 물질 세포는 CAF보다 빠르게 성장하고 1차 CAF 배양(도4C)을통해 우세한 상이한형태(도 4B,검은 화살촉)를 가진 작은 클론의 배양에 대한 존재에 대한 책임이 있을 가능성이 높았다. 이러한 최적 결과 CD90.2 및 CD45 발현뿐만 아니라 농축 과정의 끝과 배양세포 성장 중 세포 형태모두 항상 재검사의 중요성을 확인했습니다.
절연 된 세포의 사용 엔지니어링 나노 약물의 CAF 타겟팅 잠재력을 평가
새로 고립 된 CAFs는 기초 연구에서 약리학 연구에 이르기까지 여러 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 이 그룹의 목표는 특히 CAF를 대상으로 할 수 있는 HFn 나노케이지를 개발하는 것입니다. HFn은 두 가지 다른 단백질에서 특정 항 FAP 항체 단편(HFn-FAP)으로 기능화되었다: 항체 비(더 낮은 1:1 및 더 높은 1:5), 그리고 CAF를 가진 그들의 결합을 시험하였다. FAP가 프로 종양 유발 CAF의 표면 바이오마커로 사용되었기 때문에, 분리된 CAF(그림3C)에대한 FAP 발현을 확인하는 것이 근본적인 중요성이었다. FAP 표현은 1차 CAF 문화가 원래의 특성을 유지한다는 것을 확인하기 위해 문화5개 구절을 따랐다.
HFn에 대한 FAP 기능화는 베어 HFn에 비해 CAF 타겟팅을 향한 상당한 전환에 기여하는 것으로 나타났으며, 항체(1:1)의 양이 적어 이 효과를 관찰하기에 충분하였다(도5A). 그러나, 이는 생체내 종양 모델을 설정하는 데 사용되는 종양 4T1 세포로 관찰되지 않았으며, 이에 따라 HFn은 기능성 HFn(도5B)보다더 높은 결합을 보였다. 이는 4T1 세포에서 FAP 과발현의 부재와 세포내 HFn 흡수를 조절하는 TfR1과의 HFn의 우대 상호 작용으로 인해 가장 가능성이 높았으며, 이는 이그룹(27,33)에의해 널리 보고되었다. 이러한 결과는 유방 CAFs의 1차 배양을 사용하여 종양 미세 환경을 해결하기 위해 설계된 나노 입자의 표적화 능력을 예식적으로 선별하는 유용성을 확인합니다.
도 1: 4T1 종양 모델의 설립. 세포(105세포/마우스)는 매머 지방 패드에 주입하였다. 종양 성장은 생체 발광 이미징에 의해 캘리퍼및(B)로종양부피를 측정하여 이식 후 5 일, 10, 15, 20, 25 및 30일에 선행되었다. 종양 부피 및 BLI는 각각 mm3 및 카운트로 표현된다. 결과는 평균 ± SEM(n=6)으로 보고됩니다. (C)BLI 대표 이미지는 세포 이식 후 5, 10, 15, 20, 25 및 30일 후에 얻은 종양 성장을 25일째까지 확인하여 고원에 도달하는 것으로 보인다. 분석의 마지막 시점(30일)에서 BLI는 25일째에 비해 증가하지 않습니다. 20일째부터 괴사와 궤양이 종양의 중심부분에서 눈에 띄기 시작합니다. 색상 배율: 최소 = 1,194, 최대 = 20,462. 약어: BLI = 생물 발광 화상 진찰; SEM = 평균의 표준 오차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 종양 샘플 제제 및 격리 된 CAF의 혈류 세포 측정 특성. 종양은 메스의 도움으로 약 1-2mm의 작은 조각(A)으로 절제되고 감소되었다; (B)세포 소화 후 단일 세포 현탁액 및 절제된 종양의 기계적 해리; (C)적혈구의 리시스 후 얻어진 세포 펠릿; (D)적혈구및 죽은세포의 제거 후 얻어진 세포에서 CD45 및 CD90.2 발현의 혈중 세포 분석,(E)비암 관련 섬유아세포의 고갈 후,(F)암 관련 섬유아세포의 농축 후, 세포의 대부분이 CD90.2+ CD45-(청색 사각형)이다. 약어: CAFs= 암 관련 섬유아세포; CD = 차별화 클러스터; PE-A = 피코에리스린 의 영역; FITC-A = 형광이소이소시아네이트 의 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: CAFs 및 FAP 발현의 형태학적 분석.(A, B)CAFs 형태는 광학 현미경검사법(통로 2 및 통로 5에서 의 다른 수준의 인플루엔자)에 의해 배양의 모든 구절을 통해 검사하고(D)4T1 종양 세포에 비해; 스케일 바 = 10 μm.(C)섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 발현은 수집된 CD90.2+ CD45-세포에 대한 격리 과정의 끝에 있는 유동 세포측정에 의해 평가되었다. 형광 임계값은 항체 염색 세포(blue graph) 사이에서 평균 형광 강도 및 양성 세포(FAP+)의백분율을 정량화하기 위해 얼룩지지 않은 대조군 세포(red graph)에 설정되었다. 약어: CAFs= 암 관련 섬유아세포; FAP = 섬유아세포 활성화 단백질; CD = 차별화 클러스터; MFI = 평균 형광 강도; Ab = 항체; FITC-A = 형광동체의 면적; FAP + = FAP 양성 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 최적 이하의 CAFs 격리 과정의 예. (A)최종 격리 단계 후 유동 세포 측정 평가는 오염 물질 CD90.2- CD45+ 및 CD90.2- CD45- 세포의 존재를 드러냈다. (B)이들 세포는 시드 시 작은 둥근 형태가 있는 클론으로 볼 수 있다(패널의 왼쪽 하단 모서리에 있는 검은 화살촉과 인세트)이(C)문화권에서 제3통로 후 CAF를 통해 우세했다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: CAF = 암 관련 섬유아세포; CD = 차별화 클러스터; PE-A = 피코에리스린 의 영역; FITC-A = 형광이소이소시아네이트 의 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: CAF 및 4T1에 HFn 나노 케이지의 결합. HFn 나노케이지는 FITC로 형광으로 표시되었고, 두 개의 상이한 단백질 항체 비(1:1 및 1:5)에서 항 FAP 항체 단편(HFn-FAP)으로기능화하고(A)표적 CAFs및(B)4T1 세포를 4°C에서 4°C로 2시간 동안 배양하였다. 결합은 유동 세포측정에 의해 평가되었다. (A)CAFs를 통한 HFn-FAP 결합은 베어 HFn(B)에 비해 두 항체단편 농도모두에서 현저히 증가하며, 4T1 세포에서 베어 HFn의 상당히 높은 결합이 관찰되었으며, 여기서 FAP 인식에 의해 결합이 강화되지 않았다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 보고됩니다. p = 0.0003; °° p = 0.0021; °° p = 0.0008. 약어: CAFs= 암 관련 섬유아세포; FAP = 섬유아세포 활성화 단백질; HFn = 베어 나노 입자 또는 공주로 사용되는 인간 페리틴 중형 체인의 재조합 변형; HFN-FAP = HFn 나노입자는 2개의 HFn:Fab@FAP 어금니비, 1:1 및 1:5로 제조된 항FAP 항체의 가변 부분으로 기능화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 셀 번호(평균 ± SD) | 추출 수율 합계(통로당) | |
| 절제된 종양 (적혈구 제거 후) | 1.27 x 108 ± 9.81 x 107 | 100% |
| 절제된 종양 (사후 죽은 세포 제거) | 3.01 x 106 ± 9.61 x 105 | 2.38% |
| 고갈 후 칵테일 | 1.15 x 105 ± 4.95 x 104 | 0.11% (3.82%) |
| 포스트 농축 | 3.00 x 104 ± 1.2 x 104 | 0.027% (26.09%) |
표 1: 암 관련 섬유아세포의 각 단계 후에 총 세포 수.
| 세포 분포(%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| 절제된 종양 (사후 죽은 세포 제거) | 1.81 ± 0.98 | 10.78 ± 4.51 | 56.57 ± 14.05 | 28.20 ± 17.57 |
| 고갈 후 칵테일 | 69.33 ± 16.75 | 0.14 ± 0.13 | 0.55 ± 0.63 | 39.89 ± 30.31 |
| 포스트 농축 | 93.14 ± 3.3 | 0.09 ± 0.1 | 0.09 ± 0.08 | 6.69 ± 3.4 |
표 2: 암 관련 섬유아세포의 각 통과 후 CD90.2 및 CD45의 발현에 따른 세포 분포.
| 세포 분포(%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| 포스트 농축(풀링 없음) | 75.80 ± 2.9 | 1.49 ± 0.4 | 5.97 ± 1.5 | 16.75 ± 1.1 |
표 3: CD90.2 및 CD45 발현은 최적 암-관련 섬유아세포 절연 실험 후에 수집하였다.
Discussion
CAF는 세포외 매트릭스를 리모델링하고, 전이 진행을 촉진하고, 종양부위(34)에대한 약물 접근을 제한하는 핵심 플레이어로 부상하고 있다. 그러나, 그들의 이질성 때문에, 그들의 역할은 아직도 논쟁의 여지가 있습니다 - 몇몇 다른 특수형은 종양 억제 역할이 있는 것처럼 보이는 반면, 몇몇 CAF는 종양성 입니다. 이러한 맥락에서, 그들의 고립은 중요한 임상 적 의미를 가질 것이다 암 진행에 있는 그들의 많은 토론된 역할에 더 많은 빛을 비추기 위하여 극단적인 관심사일 수 있습니다12,31. 더욱이, 인간 및 전임상 마우스 종양 모델에서 성공적인 CAF 추출은 또한 새로운 CAF 표적화 약의 개발을 용이하게 할 것입니다. 이 논문은 유방암의 합성 전임상 모델에서 1차 CAF를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 보고합니다. 경험을 바탕으로 세 가지 실험 단계는 대부분 프로토콜의 성공에 영향을 미칩니다.
첫 번째는 컬럼의 응고 및 감속 세포 의 혈중 의 위험과 관련된 세포 현탁액의 응집을 피하기 위해 빠르게 노력하고 있습니다 : 실제로 컬럼을 통과 한 세포가 함께 클러스터링되었을 때, 최적 격리 프로세스의 확률이 증가하고 최종 배양에는 "오염물질"세포 클론이 포함되었습니다. 두 번째는 고갈 통로 후에 상이한 종양에서 세포를 풀링하여 최종 농축 단계에서 통과될 충분한 세포를 보장한다. 마지막 중요한 문제는 높은 세포 밀도에서 추출 된 세포를 도금하는 것입니다, 가장 가능성이 최대 4-5 통로에 대한 세포 성장과 식민지 확장을 강화하기 위해 24 웰 플레이트의 단일 우물에서 시작. 셀이 낮은 밀도에서 시드된 경우 자유 표면에서 확장되어 복제를 신속하게 중단했습니다.
몇몇 연구 결과는 이미 암 발달 및 침략을 승진시키기에 있는 그들의 역할을 공부하기 위하여 인간과 마우스 기원 둘 다의 CAF 추출 방법을 기술했습니다. 이것은 유방암, 흑색종, cholangiocarcinoma 및 췌장 선암35,36,37,38를포함하여 종양의 많은 모형에서 행해졌습니다. 그러나 특정 CAF 마커의 부족과 이질성으로 인해 이러한 프로세스의 결과는 여전히 최적이 아닙니다.
여기서, 분리된 세포는 항FAP 표적화 모니티로 기능화된 HFn 나노케이지의 CAF 표적화 능력을 검증하기 위해 사용되었다. CAFs의 1차 배양물의 사용은 나노약물 최적화의 이 예비 단계에서 생체내에서 직접 수행하는 것보다 훨씬 간단하고 비용 효율적인 결합 실험을 통해 나노전략 전 생체권의 검증을 허용하는 중요한 이점이었다.
이러한 의미에서 CAF에 대한 전 생체 내 검사는 CAF의 최적의 표적을 위해 가장 유망한 나노입자의 스크리닝 및 선택을 허용함으로써 생체 내 동물 실험에 선행될 수 있다. 여기에 제시된 CAF 모델은 활성 약물로 나노입자를 적재할 때 예비 효능 연구에도 사용될 수 있다. 동물은 나중에 생체 분포, 약물 동학 및 효능 연구를 평가하기 위해 나중에만 사용됩니다.
유방암에서 광역학 치료를 위한 페리틴 나노케이지와 전립선암 모델39,40에서독소루비신을 전달하는 펩티드 계 입자 등 여러 CAF 표적 나노약물이 개발되고 있다. 그러나, 많은 연구는 나노 약물 최적화를 위한 세포 플랫폼으로 CAFs의 격리에 초점을 맞추고 있다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 여러 시약 및 재료의 준비 및 구매를 요구하는 시간이 많이 소요되는 프로토콜입니다. 둘째, 4T1 유방 종양에서 CAF의 희소성 때문에, 그들의 수율은 낮습니다. 나노 입자 실험은 1 차적인 CAFs가 노화를 겪고 오랜 시간 동안 문화권에서 유지 될 수 없기 때문에 필요한 세포 수가 달성되는 즉시 계획및 수행되어야합니다. 결론적으로, CAFs 격리, 배양 및 특성화의 이 방법은 암과의 싸움에서 새로운 표적 나노 의약품의 개발을 가속화하는 강력한 도구가 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 IG 2017-ID. 2017프로젝트 – P.I. 코르시 파비오(P.I. Corsi Fabio)에 따라 라 라이스사 술 칸크로(AIRC) 당 아소시아지오네 이탈리아아나(AirC)에 의해 지원되었다. SM은 자신의 위치를 지원하는 소아 임상 연구 센터 "로미오와 엔리카 Invernizzi"를 인정합니다. AB 감사 AIRC (ID. 20172 프로젝트) 및 연구 펠로우십밀라노 대학. LS와 MS 박사 후 펠로우십은 밀라노 대학의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
| Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
| BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
| CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
| CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
| Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
| CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
| Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
| D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
| DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
| Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
| Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
| Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
| LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
| L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
| Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
| Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
| NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
| Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
| RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at - 20 °C. |
| Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
| TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
| Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
| T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
| Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
| 1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
| 15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
| 4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
| 50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |
References
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer. Breast. 30, 92-100 (2016).
- Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer. Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).
- Hui, L., Chen, Y.
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- LeBleu, V. S., Kalluri, R. A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact. Disease Models & Mechanisms. 11, (2018).
- Li, X. -Y., Hu, S. -Q., Xiao, L. The cancer-associated fibroblasts and drug resistance. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F.
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Costa, A., et al. Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer. Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).
- Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment. Advances Drug Delivery Reviews. 99, Part B 186-196 (2016).
- Chen, Q., et al. Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).
- Truffi, M., et al. Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).
- Tong, R., Langer, R.
- Kaps, L., Schuppan, D. Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers. Cells. 9 (9), 2027 (2020).
- Miao, L., et al. Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors. Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).
- Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).
- Falvo, E., et al. Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin. Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).
- Truffi, M., et al. Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer. Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).
- Cai, Y., et al. Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size. International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).
- Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R.
- Mazzucchelli, S., et al. Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity. Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).
- Yu, Q., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy. Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).
- Mertens, J. C., et al. Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma. Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).
- Kovács, D., et al. Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts. Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).
- Sitia, L., et al. Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax. Cells. 10 (2), 328 (2021).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells. Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).
- Dvořánková, B., Lacina, L., Smetana, K. Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research. Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).
- Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages. Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).
- Sha, M., et al. Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Zhen, Z., et al. Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control. Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).
- Ji, T., et al. Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery. Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).
