Summary
Dette papir har til formål at give en protokol for isolering og kultur af primære kræft-associerede fibroblaster fra en syngeneic murin model af triple-negativ brystkræft og deres anvendelse for den prækliniske undersøgelse af nye nanopartikler designet til at målrette tumor mikromiljø.
Abstract
Kræft-associerede fibroblaster (CAFs) er centrale aktører i forbindelse med tumor mikromiljø. På trods af at være reduceret i antal i forhold til tumorceller, CAF'er regulere tumor progression og yde beskyttelse mod antitumor immunitet. Nye anticancer strategier har til formål at ombygge tumor mikromiljø gennem ablation af pro-tumorigenic CAFs eller omprogrammering af CAFs funktioner og deres aktivering status. En lovende tilgang er udviklingen af nanosized leveringsmidler, der er i stand til at målrette CAF'er, hvilket muliggør specifik levering af lægemidler og aktive molekyler. I den forbindelse kan en cellulær model af CAF'er være et nyttigt redskab til in vitro-screening og indledende undersøgelse af sådanne nanoformuleringer.
Denne undersøgelse beskriver isolation og kultur af primære CAF'er fra syngeneic 4T1 murine model af triple-negativ brystkræft. Magnetiske perler blev brugt i en 2-trins adskillelse proces til at udtrække CAF'er fra dissocierede tumorer. Immunophenotyping-kontrol blev udført ved hjælp af flowcytometri efter hver passage for at kontrollere procesudbyttet. Isolerede CAF'er kan anvendes til at studere målretning kapacitet forskellige nanoformuleringer designet til at tackle tumor mikromiljø. Fluorescerende mærket H-ferritin nanocages blev brugt som kandidat nanopartikler til at oprette metoden. Nanopartikler, enten nøgne eller konjugeret med en målretning ligand, blev analyseret for deres binding til CAF'er. Resultaterne tyder på, at ex vivo udvinding af bryst CAF'er kan være et nyttigt system til at teste og validere nanopartikler til specifik målretning af tumorigenic CAFs.
Introduction
I løbet af de sidste årtier er det blevet klart, at dræbe tumorceller normalt ikke er tilstrækkeligt til at udrydde malignitet, da tumormikromiljøet kan fremkalde tumor tilbagefald og fremkalde terapeutisk resistens1,2. Et nyt paradigme er derefter opstået: målretning tumor stroma at fratage tumoren af understøttende faktorer og dermed øge effekten af kemoterapi3,4,5. Især kræft-associerede fibroblaster (CAFs) er en interessant stromal mål i mange solide tumorer6,7. CAF'er er en meget heterogen gruppe af celler, der interagerer med kræftceller og celler i immunsystemet gennem udskillelse af vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner; opbygge og ombygge den ekstracellulære matrix; og aktivere metastaseformation8,9,10,11,12. Afhængigt af tumortypen viser CAF'er pro-tumorigenic funktioner, mens andre undertyper af CAF'er ser ud til at have tumornedsættende funktioner13,14. For bedre at afklare denne dikotomi er en grundig karakterisering af CAF'er fra primære og metastatiske tumorer vigtig.
I denne sammenhæng har et nyt forskningsfelt fokuseret på udvikling af nanosized agenter designet til at målrette og / eller ødelægge CAF'er ved at levere aktive molekyler og lægemidler, der er i stand til at ombygge tumormikromiljøet15,16,17,18. Flere typer af nanopartikler er designet til at opnå CAF ablation af cytotoksiske lægemidler, at fremkalde CAF-målrettet fotodynamisk terapi, eller at omprogrammere CAF'er ved at vende tilbage dem til en quiescent tilstand eller fremkalde TNF-relaterede apoptose induceret ligand udtryk, som fremkalder apoptose af tilstødende kræftceller16,19. Desuden giver mange nanopartiklers potentiale til aktivt at målrette specifikke biologiske markører anledning til håb om at vælge CAF-delmængder, der skal målrettes. Selv om dens absolutte specificitet for CAF stadig er spørgsmålstegn ved, fibroblast aktivering protein (FAP) er en af de mest lovende mål for pro-tumorigenic stroma og udnyttes til at styre nanodrug levering, og dermed bane vejen for udviklingen af CAF-målretning nanoterapeutik20,21,22.
Dette papir beskriver isolering af primære CAF'er fra en syngeneic model af murin brystkræft og rapporterer deres anvendelse i undersøgelsen af målretning evne nanopartikler manipuleret til at genkende CAF markør, FAP. Ferritin nanocages anvendes som kandidat nanosystemer til at oprette metoden, da deres specificitet af levering kan formes ved overfladeeksponeringen af målretning moieties23,24. Desuden har ferritiner med succes vist sig at være fremragende biokompatierbare shuttles til antitumor applikationer, udløser hurtig ophobning af nyttelasten i tumormassen25,26,27. Til dato har prækliniske undersøgelser af CAF-målretning nanosystemer involveret in vitro-test på fibroblast cellelinjer stimuleret i kultur med omdanne vækstfaktor-beta til at fremkalde celle aktivering og udtryk for nogle immunophenotypic funktioner i CAFs28,29. Denne metode anvendes normalt på udødeliggjorte cellelinjer (såsom NIH3T3, LX-2) og er ret hurtig og enkel, hvilket giver aktiverede celler om et par timer eller dage. En begrænsning er, at selv om in vitro stimulation fremkalder ekspressionen af nogle gener tilskrives aktiverede myofibroblasts, kan det ikke helt generogulere alle de biologiske træk ved ægte CAF'er, især deres heterogenitet in vivo.
En anden strategi indebærer udvinding af primære CAF'er fra humane eller mus tumor prøver30,31. Dette sikrer, at CAF-aktivering sker i en fysiologisk sammenhæng, og at CAF-delpopulationernes heterogenitet opretholdes. Ifølge forskningsmålet kan CAF'er udledes af forskellige kilder, hvilket giver mulighed for at studere den mest pålidelige tilstand. Protokollen rapporteret her ville være værdifuldt for forskere, der søger at udføre en foreløbig evaluering af funktionaliteten af nye nanopartikler designet til at målrette CAF'er fra en murine brystkræft model. Isolerede CAF'er ville være nyttige til screening af de nanopartikler, der lover nok til at fortsætte til in vivoevaluering i dyremodeller af kræft. Dette vil være relevant i løbet af de første trin i nanopartikler produktion, kørsel nanoteknologi mod raffinement af nanopartikler design ved primært at overveje strategien for ligand immobilisering for at opnå optimale målretning egenskaber.
Protocol
1. Etablering af en syngeneic 4T1 model af brystkræft
BEMÆRK: Den nuværende protokol beskriver isolering af primære CAF'er fra en mus 4T1 brystsvulst. Den dyreundersøgelse, der er beskrevet her, er godkendt af det italienske sundhedsministerium (aut. nummer 110/2018-PR).
- Tumorcellekultur og implantation
- Optø 1 × 106 4T1-luc celler i en T75 kolbe med 10 mL af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% føtalt kvæg serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin (P/ S), og 1% L-glutamin. Tilføj Mycoplasma fjernelse agent (01:100) i kulturmediet.
BEMÆRK: 4T1-luc celler udtrykker stabilt luciferase og kan visualiseres ved bioluminescens (BLI) ved korrekt stimulering med D-luciferin. Dette gør det muligt in vivo overvågning af levedygtigheden og spredningen af tumorceller ved implantation i mus (Figur 1). - Hold cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet atmosfære indtil ~80% sammenløb ved at skifte mediet hver anden dag.
BEMÆRK: Fortsæt behandlingen med Mycoplasma removal agent i 1 uge (~ 2/3 passager) før injektion i mus for at sikre, at injicerede celler er mycoplasma-fri. - På dagen for proceduren skal celler, der anvender 1 minut trypsin-ethylendiamintetraacetisk syre (EDTA) (trypsin 1:250) i 5 min ved 37 °C. Stop trypsinaktiviteten ved at tilføje kulturmedium, tæl cellerne med trypanblå (1:1), og beregn antallet af celler/mL.
- Pipette volumen svarende til 1 × 106 celler og centrifuge i 5 min ved 400 × g. Hæld supernatanten af, og brug pelleten igen i 1 mL RPMI 1640 basismedie. Hold cellerne på is, indtil de er klar til injektion.
BEMÆRK: For hver mus er der brug for 1 ×10 5 celler; Men altid beregne for et overskud på 2 mus (svarende til 2 × 105 celler) for at lette sprøjten lastning. - En dag før operationen barberes pelsen på 8 BALB/c-mus (hunner, syv uger gamle) for at eksponere området af brystkirtlerne i maven på højre side. Brug en elektrisk barbermaskine og anvende et tyndt lag af depilatory creme i 4 min; derefter vaskes fløden væk med vand og et stykke papir.
- Inducer anæstesi ved kontinuerlig indånding af 2% isoflurane gas i ~ 5 min, og udføre en subkutan injektion i regionen af abdominal brystkirtler med en 27 G tuberkulin sprøjte. Drej nålen opad for at komme ind i huden subkutant; hold derefter huden opad og indsprøjt langsomt 100 μL celleopseedring (1 × 105 celler). Vend nålen lidt rundt, før sprøjten langsomt trækkes tilbage.
BEMÆRK: Husk at bringe celleaffjedringen til stuetemperatur 15 min før injektion.
- Optø 1 × 106 4T1-luc celler i en T75 kolbe med 10 mL af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% føtalt kvæg serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin (P/ S), og 1% L-glutamin. Tilføj Mycoplasma fjernelse agent (01:100) i kulturmediet.
- Tumorvækst og dissektion
- Ved 5 dage efter celleinjektionen injiceres 150 mg/kg D-luciferin intraperitoneally (100 μL) 5 min før billeddannelse. Fang BLI-billeder ved hjælp af en in vivo-billedsystemindstilling med 10 s eksponering, medium binning og f/stop ved 4. Definer tumorens selvlysende område som interesseområdet (ROI), og kvantificer det samlede signal i ROI (foton/sek/m2) ved hjælp af billedsoftware.
- Gentag proceduren for billeddannelse (1.2.1) hver 5. dag fra injektionen for at overvåge tumorvæksten i form af en stigning i BLI.
- For at etablere tumorvolumen skal du holde musen og udsætte dens mave. Brug calipers til at måle tumorlængde (L) og bredde (W) en gang om ugen. Beregn tumorvolumen (V) ved hjælp af ligning 1.
[V = (L x W2)/2] (1) - På 20 dage efter celle-injektion, ofre dyrene ved cervikal dislokation, adskille tumorer fra huden med en saks, og indsamle dem i en væv opbevaringsopløsning (se tabellen af materialer).
BEMÆRK: Tumorprøver kan straks anvendes til dissociation i enkelte celler (afsnit 2) eller opbevares ved 4 °C i op til 48 timer.
2. Tumor dissociation i enkelte celler
BEMÆRK: For følgende trin skal du bruge sterile reagenser og engangsartikler i en laminar flow hætte. Arbejde med 4 tumorer ad gangen.
- Placer tumorprøven i en petriskål, og fjern forsigtigt ethvert fragment af hud, fedt og nekrotiske områder ved hjælp af pincet og skalpel. Derefter reducere tumoren i små stykker på ca 1-2 mm og overføre dem til et rør (Figur 2A).
BEMÆRK: 4T1 tumorer bliver meget nekrotiske, mens de vokser, med en tendens til sårdannelse. Det er vigtigt at forsigtigt fjerne de nekrotiske områder for at undgå interferens af snavs med de næste trin. - Forbered en fordøjelsesblanding til tumor dissociation: bland 2,35 mL RPMI 1640 medium, 100 μL enzym D, 50 μL enzymeT R og 12,5 μL af enzym A. Soak tumorfragmenterne i opløsningen og tæt lukke røret.
BEMÆRK: De angivne mængder af fordøjelsen mix er gyldige for tumorer op til 1 g og kan justeres for større tumorer i henhold til deres vægt. 4T1 tumorer dyrket i 20 dage normalt er i en række 0,5-0,8 g. - Vend røret på hovedet og kontroller, at alle stykker tumor står i bunden af røret mod hætten. Fastgør røret til en mekanisk dissociator i det rigtige hus, og kør et specifikt dissociationsprogram designet til hårde tumorer (se producentens anvisninger).
BEMÆRK: Der kan være behov for specielle rør for at passe ind i dissociatoren. C-rør bærer en rotor inde i hætten for at fremme mekanisk dissociation af vævet. - Røret løsnes, det skal vedligeholdes på hovedet, og prøven inkuberes ved 37 °C i 40 min med skånsom rysten. Derefter skal du vedhæfte røret til dissociatoren i det rigtige hus og køre følgende specifikke dissociationsprogram designet til hårde tumorer to gange. Sørg for, at der ikke er store stykker væv i slutningen af proceduren (Figur 2B).
BEMÆRK: For at adskille tumoren kan andre enzymcocktails bruges til at nedbryde den ekstracellulære matrix. Men i denne protokol, en kommercielt tilgængelig Tumor Dissociation kit, der indeholder en optimeret enzym mix (enzymer D, R, A) og en semi-automatiseret dissociator, der mekanisk dissocierer vævet blev brugt. Denne kombination sikrede en korrekt nedbrydning af den ekstracellulære matrix sammen med vedligeholdelse af celleintegritet og celleoverflade epitoper. - Prøven filtreres gennem en 40 μm cellesnive i et 50 mL rør, filteret vaskes med 10 mL RPMI 1640 medium, og centrifuge røret i 7 min ved 300 × g. Hvis cellepillen fremstår rød, skal du lyse erythrocytter ved at tilsætte 1 mL Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) lysningsbuffer i 5 min ved stuetemperatur, vask med 10 mL RPMI 1640, overfør celleaffjedringen i et 15 mL rør og centrifuge igen.
- Resuspend pellet i 1 mL PBE buffer bestående af fosfat-buffered saltvand (PBS), 0,5% kvæg serum albumin (BSA), og 2 mM EDTA, og tælle cellerne med trypan blå (1:1). I tilfælde af celleklumper filtreres celleaffjedringen gennem en 70 μm cellesnak, tidligere gennemblødt med PBS.
BEMÆRK: Især når tumorer er store, er det vigtigt at kontrollere celletallet og i sidste ende at opdele hver tumorprøve i forskellige rør med ikke mere end 107 celler i hvert rør, før du fortsætter til trin 2.7. - Den døde cellefjernelsesbinder buffer forberedes ved at fortynde 20x bindende bufferlageropløsning (se materialetabellen) med sterilt dobbeltdestilleret vand. Vaske celler med 5 mL af 1× bindebuffer (Figur 2C).
BEMÆRK: Hold bufferen på 4 °C. - Centrifuge i 7 min ved 300 × g, og genbruge cellepillen med 0,1 mL af døde celle fjernelse mikroperler (se tabellen over materialer). Bland godt og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Under inkubationen med perler skal du forberede et magnetisk stativ under emhætten og hænge ferromagnetiske adskillelseskolonner (en kolonne i op til 107 celler) på den med spidserne pegende ned. Ekvilibrere kolonnerne med 0,5 mL kold 1× bindingsbuffer. Vent, indtil opløsningen er strømmet igennem under tyngdekraften.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at overskride antallet af celler pr. kolonne for at undgå enhver risiko for at størkne søjlesengen og reducere restitutionsudbyttet. Når du arbejder med mere end 107 celler, skal du enten bruge flere kolonner i henhold til det samlede antal celler eller bruge større kolonner. I sådanne tilfælde skal du justere de reagensmængder, der er beskrevet i følgende trin, til dem, der er angivet af producenten. - Ved inkubationens afslutning tilsættes 400 μL kold 1× bindingsbuffer til perle/celleaffjedring, hele volumenet lægges på kolonnen og opsamler spildevandet (svarende til umærkede celler) i et 15 mL rør.
- Vask kolonnen fire gange med 0,5 mL kold 1× bindende buffer, og opsamle det samlede spildevand (svarende til den levende cellefraktion) i samme rør.
- Tæl cellerne med trypan blå (1:1). 1 × 105 celler anbringes i to rør til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), og hold dem ved 4 °C indtil procesvalidering (se trin 4.1): Brug det første rør til at indstille analyseparametrene og områder med positivitet (kontrolrør) og det andet til biomarkøranalyse (prøverør). Brug de resterende celler til CAF'er -udtrækning (se afsnit 3).
BEMÆRK: Fjernelse af døde celler er vigtigt for at reducere ikke-specifikke reaktioner med mikroperlerne i afsnit 3. Men for at forbedre udbyttet, undgå fjernelse af døde celler, hvis andelen af døde celler er <20%.
3. Udvinding af primære CAF'er fra brystsvulst
BEMÆRK: For afsnit 3, skal du bruge musen Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit, der indeholder ikke-tumor-associeret fibroblast udtømning Cocktail og Tumor-Associated Fibroblast Mikroperler egnet til magnetisk mærkning af cellerne (se tabellen af materialer).
- Udtømning af ikke-kræft-associerede fibroblaster
- Fugt en 70 μm cellesnak med PBS, og filtrer celleaffjedringen for at fjerne eventuelle klumper. Derefter centrifugere cellerne i 10 min ved 300 × g og aspirere supernatanten.
BEMÆRK: Hvis en enkelt tumor blev opdelt i to prøver for trin 2.7, pool celleaffjedringen to og to, før du fortsætter med trin 3.1.2. - Resuspend pellet i 80 μL kold PBE buffer, og tilsæt 20 μL af ikke-tumor-associeret fibroblast udtømning Cocktail. Bland godt og inkuber ved 4 °C i 15 min i mørke.
- Under inkubationen med perler forberede ferromagnetiske udtømning kolonner (1 pr prøve) på en magnetisk stativ, og ekvilibrere kolonnerne med 2 mL kold PBE buffer. Vent, indtil opløsningen er strømmet igennem.
- Ved inkubationens afslutning tilsættes 400 μL kold PBE-buffer til perle-/celleaffjedringen, hele volumenet lægges på kolonnen og opsamler spildevandet (svarende til umærkede celler) i et 15 mL-rør.
- Vask kolonnen to gange med 2 mL kold PBE-buffer, og opsamle det samlede spildevand i samme rør. Centrifuge i 10 min ved 300 × g og genanvendes i 0,1 mL kold PBE buffer.
BEMÆRK: Udtømning af ikke-kræft-associerede fibroblaster drastisk reducerer den samlede mængde celler genvundet. Det er generelt nødvendigt og anbefales at samle celleaffjedring fra fire forskellige prøver for at opnå en synlig pellet og nok celler til trin 3.2. Dette vil sikre et optimalt udbytte. - Placer 20 μL af celleaffjedringen i et FACS-rør, og hold den ved 4 °C til procesvalidering (se afsnit 4). Brug de resterende celler til CAF-markering (se trin 3.2).
- Fugt en 70 μm cellesnak med PBS, og filtrer celleaffjedringen for at fjerne eventuelle klumper. Derefter centrifugere cellerne i 10 min ved 300 × g og aspirere supernatanten.
- Positivt udvalg af kræftrelaterede fibroblaster
- Tilsæt 20 μL tumor-associerede fibroblast mikroperler til 80 μL celle suspension. Bland godt og inkuber ved 4 °C i 15 min i mørke.
- Under inkubation med perler forberede ferromagnetiske adskillelse kolonner (1 pr prøve) på en magnetisk stativ, og ekvilibrere kolonnerne med 0,5 mL kold PBE buffer. Vent, indtil opløsningen er strømmet igennem.
- Ved inkubationens afslutning tilsættes 400 μL kold PBE-buffer til perle/celleaffjedringen, hele volumenet lægges på kolonnen og lader de umærkede celler strømme igennem i et 15 mL rør.
- Kolonnen vaskes tre gange med 0,5 mL kold PBE-buffer, og opsamle det samlede spildevand i samme rør.
BEMÆRK: Flow-through indeholder umærkede CD90.2-negative celler, som kan kasseres som ikke-kræft-associerede fibroblaster. - Fjern kolonnen fra magneten og læg den i et 1,5 mL rør. Tilsæt 1 mL kold PBE på kolonnen, og skub straks stemplet ind i kolonnen for at skylle cellerne ud.
- Centrifuge i 10 min ved 400 × g og genanvendes i 0,1 mL kold PBE buffer. Placer 20 μL celleaffjedring i et FACS-rør, og hold den ved 4 °C til procesvalidering (se afsnit 4).
BEMÆRK: Efter centrifugering kan pellet næppe være synlig, især når de oprindelige tumorer er små. Brug koniske bundcentrifugerør og pas på ikke at miste nogen celler, når du stræber efter supernatanten. - Fortynd de resterende celler i et passende volumen af Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F-12 suppleret med 15% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% P/S og 1% ikke-essentielle aminosyrer, og frø cellerne i en vævskulturplade.
- Kontroller celletætheden under et mikroskop, og læg pladen i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for at lade cellerne klæbe og vokse.
BEMÆRK: Hvis cellerne er for tætte, skal celleops suspensionen straks opdeles i to brønde af vævskulturpladen, før pladen placeres i inkubatoren.
4. Procesvalidering
- Flowcytometri
BEMÆRK: Punkt 4.1 kræver ikke sterile forhold og kan udføres uden for laminarhætten. Udfør afsnit 4.1 parallelt for prøver indsamlet i trin 2.11 (dissocieret tumor), trin 3.1.6 (efter udtømning af ikke-kræftrelaterede fibroblaster) og trin 3.2.6 (efter berigelse af kræftrelaterede fibroblaster).- Centrifuge facs rør fremstillet i trin 2.11, 3.1.6 og 3.2.6 i 10 min ved 300 × g. Kassér supernatanten.
BEMÆRK: Forbered mindst et ekstra rør, som indeholder ikke-farvede celler, der fungerer som en kontrol til at indstille parametrene til analyse. - I prøverør, resuspend celler i 88 μL af PBE, og tilsæt 2 μL anti-CD45 antistof konjugeret med fluorescein isothiocyanat (FITC, 1:50 fortynding, i henhold til fabrikantens anvisninger) og 10 μL anti-CD90.2 antistof konjugeret med fylaksythrin (PE, 1:10 fortynding, ifølge fabrikantens anvisninger). Bland grundigt og inkuber i 10 min ved 4 °C i mørke. I kontrolrøret (ikke farves) genbruge celler i 100 μL PBE. Inkubér i 10 min ved 4 °C i mørke for at replikere den procedure, der følges for antistofplettede celler.
BEMÆRK: Temperaturen og tidspunktet for inkubationen skal kontrolleres omhyggeligt, da en variation i sådanne variabler kan resultere i dårlig eller ikke-specifik farvning, hvilket ændrer resultaterne. - Når inkubationen er afsluttet, skal du udføre en vask ved at tilsætte 1 mL PBE. Centrifuge i 10 min ved 300 x g. Kassér supernatanten.
- Resuspendceller (alle rør) i 500 μL PBS.
- Bland godt og fortsæt med flowcytometrianalyse. Indstil kanalerne til at måle antistoffernes fluorescens (dvs. FITC og PE).
- Fra kontrolrøret skal du markere alle levedygtige celler ved at tegne en første port (P1) på plottet Fremad mod Side (FSC vs SSC). Inden for P1 skal du indstille en anden port (P2), der kun består af enkelte celler.
- Ved hjælp af antistoffernes specifikke fluorescenskanaler (dvs. FITC og PE) skal du sætte ordentlige porte til at skelne positivt farvede celler.
- Start analysen og registrer mindst 10.000 hændelser i P2. Læs signaler fra begge kanaler samtidigt.
BEMÆRK: Hvis det samlede antal celler er mindre end forventet, kan det være at foretrække at læse hele røret. - (VALGFRIT) Hvis der programmeres yderligere farvning med yderligere antistoffer/fluorophorer, skal du indstille en passende kompensationsmatrix, før analysen påbegyndes.
- Centrifuge facs rør fremstillet i trin 2.11, 3.1.6 og 3.2.6 i 10 min ved 300 × g. Kassér supernatanten.
- Overvågning af cellemorfologi og karakteristika
BEMÆRK: Når cellerne er sået, skal de håndteres under sterile forhold.- På dagen efter såning, visualisere cellerne under et optisk mikroskop for at kontrollere celle vedhæftning og morfologi. Aspirere supernatant og erstatte med frisk medium.
BEMÆRK: CAF'er er store spindelformede celler, som let kan skelnes fra den epitellignende struktur af 4T1 tumorceller. - Cellerne skal vedligeholdes ved 37 °C og 5 % CO2 i en befugtet atmosfære, hvilket ændrer mediet hver anden dag.
- Når cellerne når ~80% sammenløb (ca. 4-6 dage efter såning), skal cellerne løsnes ved hjælp af TrypLE Select-opløsningen (se materialetabellen) i 5 min ved stuetemperatur. Tilsæt frisk medium (4:1), centrifuge celleaffjedringen ved 400 × g i 5 min, og genbrug pellet i frisk medium.
- Opdel cellerne 1:2, og udvid kulturen, indtil antallet af celler, der er nødvendige for eksperimentet, er opnået.
- Ved hver passage skal du kontrollere cellemorfologi og vækst under et optisk mikroskop. Hvis cellemorfologi ikke er homogen (f.eks. kloner af små rundformede celler, der optræder i kulturen), analyseres en celleprøve efter flowcytometri som beskrevet i afsnit 4.1. Hvis homogen, gå videre til trin 4.2.7.
BEMÆRK: Ændringer i cellemorfologi kan indikere forurening med ikke-kræftrelaterede fibroblaster, som skal fjernes for at sikre kulturrenhed. - Analyser flowcytometriresultaterne, og fortsæt i overensstemmelse med et af følgende scenarier: (i) hvis der forekommer forurening af CD90.2-/CD45-celler, skal du samle alle cellerne og gentage den positive markering ved at følge trin 3.2; ii) hvis der også forekommer kontaminering af CD45+-celler, opsamles alle cellerne, og udtømningen gentages i trin 3.1 iii) hvis der ikke forekommer kontaminering (kun CD90.2+/CD45- celler er til stede), skal cellerne holdes i kultur og gå direkte til 4.2.7.
BEMÆRK: Da gentagelse af udtømningsprocessen med mikroperler vil reducere cellegendannelse, anbefales det kun, når celler ikke behøver at blive brugt med det samme. - Tæl cellerne med trypan blå (1:1), placer 5 × 105 celler i to FACS rør, og centrifuge i 10 min ved 300 × g. Kassér supernatanten, og brug pelleten i 0,5 mL blokerende buffer (PBS suppleret med 2% BSA, 2% gedeserum) i 15 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Et rør fungerer kun som en kontrol bestående af ikke-farvede celler, mens celler i det andet rør vil blive farves til flowcytometrianalyse. - Centrifuge i 10 min ved 300 × g, kassér supernatanten og genanvendes i 99 μL af blokerende buffer. Der tilsættes 1 μg anti-FAP-antistof til prøverøret og 1 mL blokeringsbuffer til kontrolrøret. Bland grundigt og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: FAP er en overflade markør for reaktiv tumor stroma og kan bruges til at identificere og karakterisere CAF'er. - Vask tre gange med PBS, centrifuge, og inkuber med det relevante sekundære antistof konjugeret med et fluorescerende farvestof (1 μg) i blokerende buffer i 15 min ved stuetemperatur.
- Tre gange med PBS, og analyser efter flowcytometri (følg trin 4.1.5 til 4.1.7 ved at indstille den relevante kanal til at detektere det anvendte fluorhore). Brug derefter cellerne til eksperimenter (trin 5.2).
- (VALGFRIT) Der fryses en celleprøve i 1 mL på 90 % FBS og 10 % dimethylsulfoxid (DMSO); opbevares ved -80 °C til videre brug.
- På dagen efter såning, visualisere cellerne under et optisk mikroskop for at kontrollere celle vedhæftning og morfologi. Aspirere supernatant og erstatte med frisk medium.
5. CAF'er, der er målrettet efter konstruerede Ferritin nanopartikler
BEMÆRK: En rekombinant variant af human ferritin heavy chain (HFn) blev brugt som bar nanopartikler eller blev konjugeret med målretning moieties. Her blev HFn nanopartikler funktionaliseret med den variable del af et anti-FAP-antistof (Fab@FAP) udarbejdet af NanoBioLab ved University of Milano-Bicocca ved to HFn:Fab@FAP molarforhold, 1:1 og 1:5, ifølge en tidligere beskrevet protokol32.
- Fluorescerende mærkning af HFn nanopartikler
BEMÆRK: Både nøgne og funktionaliserede HFn nanocages er fluorescerende mærket med FITC.- FITC-pulveret opløses i 99 % ethanol for at opnå en koncentration på 2 mg/mL.
BEMÆRK: Denne opløsning skal tilberedes frisk. - Inkuberes 50 μL af den forberedte opløsning (200 μg FITC) for hver 1 mg protein (dvs. 100 μL HFn ved 10 mg/mL). Der tilsættes 50 μL 1 M natriumbicarbonat (NaHCO3), og volumen justeres til 500 μL med 0,1 M NaHCO3.
BEMÆRK: Opskaler mængderne i henhold til de eksperimentelle behov. - Inkuber reaktionsblandingen ved stuetemperatur, i mørke og med kontinuerlig omrøring i 1 time.
- Fjern overskuddet af FITC fra konjugaten ved gelfiltrering ved hjælp af en spinafsaltingskolonne (7 kDa MWCO).
- Vurdere koncentrationen af det genvundne mærkede protein ved hjælp af et spektrofotometer. Skøn mængden af protein og farvestof ved at måle absorbansen ved henholdsvis 280 nm og ved 488 nm.
- FITC-pulveret opløses i 99 % ethanol for at opnå en koncentration på 2 mg/mL.
- Binding af HFn nanopartikler til CAF'er
BEMÆRK: Brug CAF'er fra senest passager 4-5 i kultur.- Placer 5 × 105 celler i hvert FACS-rør, centrifuge i 10 min ved 300 × g, og resuspend i 0,5 mL PBS, 0,3% BSA suppleret med 0,1 mg /mL af de forskellige præparater af nanopartikler (bar HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) tidligere mærket med FITC.
BEMÆRK: Kør hver betingelse i tredobling. Forbered et ekstra rør som en kontrol umærket prøve, som ingen nanopartikler tilsættes. - Inkuberes i 2 timer ved 4 °C i mørke, centrifuge, og vask tre gange i PBS.
- Resuspend celler med 0,5 mL PBS, bland godt, og analysere efter flow cytometri. Indstil kanalerne til at måle fluorescensen af FITC.
- Efter gating på levende enkeltceller, erhverve 20.000 begivenheder. Brug det styrede umærkede rør til at indstille porten til FITC-positivitet og opnå procentdelen af FITC+ hændelser (svarende til nanopartiklerbinding).
- Placer 5 × 105 celler i hvert FACS-rør, centrifuge i 10 min ved 300 × g, og resuspend i 0,5 mL PBS, 0,3% BSA suppleret med 0,1 mg /mL af de forskellige præparater af nanopartikler (bar HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) tidligere mærket med FITC.
6. Statistisk analyse og eksperimentelle replikeringer
- Dyr
- Udføre tre uafhængige eksperimenter af tumorvækst og CAFs isolation, ved hjælp af 8 dyr pr enkelt forsøg, som beskrevet i 1.1.5. For at optimere CAF'ernes isolationsudbytte skal du opdele det udskårne væv i undergrupper (n=4) og behandle dem efter trin, der er beskrevet i afsnit 2.
- HFn interaktion med celler
- Evaluere samspillet mellem funktionaliserede og ikke-funktionaliserede HFn med mål- og ikke-målceller (henholdsvis CAF'er og 4T1) med hensyn til procentdelen af positivt farvede celler ved fluorescerende mærket nanokager. Rapportér resultaterne som gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige eksperimenter.
- Statistisk analyse
- Hvis du vil beregne statistisk signifikans i cellebindingsforsøg med HFn og HFn-FAP, skal du bruge den almindelige envejs ANOVA-test.
Representative Results
In vivo model set-up for optimal CAFs isolation
Injektionen af 105 4T1-luc celler i bryst fedt pad af kvindelige BALB / c mus fører til vækst af en påviselig tumormasse på 5 dage efter implantation. Ved at måle tumorvolumen af calipers og tumorcelle levedygtighed af BLI, tumorvækst blev overvåget i en måned efter implantation. For at finde et offervindue, der er tilstrækkeligt til CAFs-isolation, blev der søgt et optimalt kompromis mellem højere tumorstørrelse og BLI på den ene side og en spirende tumorsår og nekrose på den anden side (Figur 1). Som en nekrotisk kerne vises 20 dage efter implantation, og det forstørres ved 25 og 30 dage (som dokumenteret af BLI billeder i Figur 1C), dag 20 blev indstillet som det tidspunkt at optimere celle opsving efter isolationsprocessen. Selv efter omhyggeligt at fjerne alle synlige nekrotiske områder under de første trin i tumorhåndtering ex vivo, blev der fundet en høj procentdel af døde celler i slutningen af dissociation i enkelte celler (Tabel 1). Da denne procentdel kan være relevant, især med stigningen i tumorstørrelse, er fjernelse af døde celler altid nødvendig, når du arbejder med 4T1-modellen.
Optimering af CAFs isolationsprocedure, kultur og karakterisering
To yderligere passager er nødvendige for at isolere befolkningen i CAF'er (CD90.2+ CD45-) fra panelet af indsamlede levedygtige celler: udtømning af ikke-tumor-associerede fibroblaster og berigelse af tumor-associerede fibroblaster (Figur 2). Udtømning perle cocktail effektivt fjerner CD45+ celler (tegner sig for 67,35% og 0,69% af de samlede celler før og efter udtømning, henholdsvis tabel 2), og blev altid brugt til at behandle en enkelt tumor i hver kolonne. Som vist i tabel 1faldt antallet af eluterede celler fra et gennemsnit på 3 × 106 til 1 × 105 efter udtømningstrinnet. På grund af dette massive fald i det samlede celletal er det praktisk at samle de indsamlede celler fra mindst 2 til maksimalt 4 tumorer i et enkelt rør, før du fortsætter med berigelsestrinnet. Ved at gøre dette, et tilstrækkeligt antal celler blev opnået til inkubation med tumor-associerede fibroblast perler og passerede gennem en enkelt adskillelse kolonne for at opnå et endeligt gennemsnit på 93% af CD90.2+ CD45- celler (Tabel 2).
Når seedet på væv kultur plader, disse genvundet celler knyttet til plast og afslørede en stor spindel-formet morfologi typisk for fibroblaster (Figur 3A,B) og forskellig fra 4T1 tumorceller (Figur 3D). Ikke samle tumorer efter udtømning forårsager cellulære udbytte med tumor-associerede fibroblast mikroperler at være for lav til at etablere en kultur. I andre tilfælde, når inkubationernes varighed og temperatur med mikroperler ikke opretholdes omhyggeligt, kan der forekomme en ikke-specifik binding. I sådanne tilfælde var berigelsestrinene mindre effektive, og der blev genvundet højere procentdele af CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45 - cd45- celler sammen med CD90.2+ CAF'erne (henholdsvis 5,97 ± 1,5 og 16,75 ± 1,1) (figur 4 og tabel 3). Disse forurenende celler var sandsynligvis ansvarlige for tilstedeværelsen i kulturen af små kloner med forskellige morfologi (Figur 4B, sorte pilespidser), der voksede hurtigere end CAF'er og sejrede over den primære CAF kultur (Figur 4C). Disse suboptimale resultater bekræftede vigtigheden af altid at dobbelttjekke både CD90.2- og CD45-udtryk samt cellemorfologi i slutningen af berigelsesprocessen og under cellevækst i kulturen.
Brug af isolerede celler til at evaluere CAF-målretningspotentialet for manipulerede nanodrugs
De nyisolerede CAF'er kan bruges til flere applikationer lige fra grundforskning til farmakologiske undersøgelser. Denne gruppes mål er at udvikle HFn nanocages, der specifikt kan målrette CAF'er. HFn blev funktionaliseret med et specifikt anti-FAP antistoffragment (HFn-FAP) ved to forskellige protein:antistofforhold (en lavere 1:1 og en højere 1:5), og deres binding med CAF'er blev testet. Da FAP blev brugt som overfladebiomarkør for pro-tumorigenic CAF'er, var det af grundlæggende betydning at kontrollere FAP-udtryk på isolerede CAF'er (Figur 3C). FAP udtryk blev fulgt over 5 passager i kultur for at bekræfte, at den primære CAF kultur fastholdt sine oprindelige egenskaber.
FAP-funktionalisering på HFn viste sig at bidrage til et betydeligt skift i retning af CAF-målretning sammenlignet med bar HFn, og den lavere mængde antistof (1:1) var nok til at observere denne effekt (Figur 5A). Dette blev dog ikke observeret med tumoren 4T1 celler, der anvendes til at oprette in vivo tumor model, hvori nøgne HFn viste højere binding end funktionaliseret HFn (Figur 5B). Dette skyldtes sandsynligvis fraværet af FAP-overekspression i 4T1-celler og den præferenceinteraktion af HFn med TfR1, som regulerer HFn-optagelse i celler, som bredt rapporteret af denne gruppe27,33. Disse resultater bekræfter nytten af at bruge primære kulturer af bryst CAF'er til foreløbigt at screene målretning kapacitet nanopartikler designet til at tackle tumor mikromiljø.
Figur 1: Etablering af 4T1 tumor model. Celler (105 celler/mus) blev sprøjtet ind i brystfedtpuden. Tumorvæksten blev efterfulgt i dag 5, 10, 15, 20, 25 og 30 efter implantation (A) ved at måle tumorvolumen med calipers og (B) ved bioluminescensbilleddannelse. Tumorvolumener og BLI udtrykkes som henholdsvis mm3 og tæller. Resultaterne rapporteres som gennemsnitlige ± SEM (n=6). (C) BLI ' repræsentative billeder der er indsamlet 5, 10, 15, 20, 25 og 30 dage efter celleimplantatering bekræfter tumorvækst indtil dag 25, hvor det ser ud til at nå et plateau. På sidste analysepunkt (30 dage) stiger BLI ikke sammenlignet med dag 25. Fra dag 20 begynder områder med nekrose og sårdannelse at blive synlige i den centrale del af tumoren. Farveskala: Min = 1.194, Maks . = 20.462. Forkortelser: BLI = bioluminescensbilleddannelse; SEM = standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Forberedelse af tumorprøve og flowcytometrikarakterisering af isolerede CAF'er. Tumorer blev fjernet og reduceret til (A)små stykker på ca. 1-2 mm ved hjælp af en skalpel; (B) enkeltcelleopsepension efter væv fordøjelse og mekanisk dissociation af en fjernet tumor; (C) cellepille, der er fremstillet efter lysis af røde blodlegemer; (D) flowcytometrianalyse af CD45 og CD90.2 udtryk i celler, der er opnået efter fjernelse af røde blodlegemer og døde celler , (E) efter udtømning af ikke-kræftrelaterede fibroblaster og (F) efter berigelse af kræftrelaterede fibroblaster, hvor størstedelen af cellerne er CD90,2+ CD45- (blåt rektangel). Forkortelser: CAF'er= kræftrelaterede fibroblaster; CD = klynge af differentiering; PE-A = phycoerythrin; FITC-A = områder af fluorescein isothiocyanat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Morfologisk analyse af CAF'er og FAP-udtryk. (A, B) CAFs morfologi blev kontrolleret i alle kulturpassager ved optisk mikroskopi (forskellige niveauer af sammenløb ved passage 2 og passage 5) og sammenlignet med (D) 4T1 tumorceller; skalabarer = 10 μm. (C) Fibroblast activation protein (FAP) udtryk blev evalueret ved flowcytometri i slutningen af isolationsprocessen på de indsamlede CD90.2+ CD45- celler for at bekræfte deres molekylære egenskaber. Der blev fastsat en fluorescenstærskel for ikke-farvede kontrolceller (rød graf) for at kvantificere den gennemsnitlige fluorescensintensitet og procentdelen af positive celler (FAP+) blandt antistofplettede celler (blå graf). Forkortelser: CAF'er= kræftrelaterede fibroblaster; FAP = fibroblast aktivering protein; CD = klynge af differentiering; MFI = middel fluorescensintensitet; Ab = antistof; FITC-A = område af fluorescein isothiocyanat; FAP+ = FAP-positive celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempel på en suboptimal CAFs-isoleringsproces. (A) Flowcytometrievaluering efter det endelige isolationstrin afslørede tilstedeværelsen af forurenende CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45- celler. (B) Disse celler kan ses som kloner med lille rund morfologi ved såning (sorte pilespidser og indsat i nederste venstre hjørne af panelet), at (C) sejrede over CAF'er efter den tredje passage i kulturen. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: CAF = kræftrelateret fibroblast; CD = klynge af differentiering; PE-A = phycoerythrin; FITC-A = områder af fluorescein isothiocyanat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Binding af HFn nanocages på CAF'er og 4T1. HFn nanocages var fluorescerende mærket med FITC, funktionaliseret med et anti-FAP antistoffragment (HFn-FAP) ved to forskellige proteinantistofforhold (1:1 og 1:5) og inkuberet med (A) mål-CAF'er og (B) 4T1-celler ved 4 °C i 2 timer. Bindingen blev evalueret ved flowcytometri. (A) HFn-FAP-binding med CAFF'er øges betydeligt ved begge antistoffragmentkoncentrationer med tre gange sammenlignet med bar HFn. (B) i modsætning hertil blev der observeret en signifikant højere binding af bar HFn i 4T1-celler, hvor bindingen ikke forstærkes af FAP-genkendelse. Resultaterne rapporteres som gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige eksperimenter. p = 0,0003; °° p = 0,0021; °°° p = 0,0008. Forkortelser: CAF'er= kræftrelaterede fibroblaster; FAP = fibroblast aktivering protein; HFn = rekombinant variant af human ferritin tung kæde, der anvendes som bar nanopartikler eller konjugeret; HFN-FAP = HFn nanopartikler funktionaliseret med den variable del af et anti-FAP antistof fremstillet ved to HFn:Fab@FAP molarforhold, 1:1 og 1:5. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Celletal (gennemsnitlig ± SD) | Udvindingsydelse i alt (pr. passage) | |
| Fjernet tumor (Post rød blodcelle fjernelse) | 1,27 x 108 ± 9,81 x 107 | 100% |
| Fjernet tumor (Post døde celle fjernelse) | 3,01 x 106 ± 9,61 x 105 | 2.38% |
| Post udtømning cocktail | 1,15 x 105 ± 4,95 x 104 | 0.11% (3.82%) |
| Efter berigelse | 3,00 x 104 ± 1,2 x 104 | 0.027% (26.09%) |
Tabel 1: Samlet celletal efter hvert trin i isolation af kræftrelaterede fibroblaster.
| Cellefordeling (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Fjernet tumor (Post døde celle fjernelse) | 1.81 ± 0,98 | 10.78 ± 4.51 | 56.57 ± 14.05 | 28.20 ± 17.57 |
| Post udtømning cocktail | 69.33 ± 16.75 | 0,14 ± 0,13 | 0,55 ± 0,63 | 39.89 ± 30.31 |
| Efter berigelse | 93.14 ± 3.3 | 0,09 ± 0,1 | 0,09 ± 0,08 | 6.69 ± 3.4 |
Tabel 2: Cellefordeling i henhold til udtryk af CD90.2 og CD45 efter hver passage af isolation af kræftrelaterede fibroblaster.
| Cellefordeling (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Postberigelse (ingen sammenlægning) | 75.80 ± 2.9 | 1.49 ± 0,4 | 5.97 ± 1.5 | 16.75 ± 1.1 |
Tabel 3: CD90.2- og CD45-udtryk af celler indsamlet efter et suboptimalt kræftrelateret fibroblastisolationseksperiment.
Discussion
CAF'er er ved at opstå som centrale aktører i remodeling ekstracellulære matrix, fremme metastaser progression, og begrænse adgangen til stoffet til tumor site34. Men på grund af deres heterogenitet, deres roller er stadig kontroversielle-nogle CAF'er er tumorigenic, mens nogle andre undertyper synes at have en tumor-undertrykkende rolle. I denne sammenhæng kan deres isolation være af ekstrem interesse for at kaste mere lys over deres meget omdiskutussionelle rolle i kræft progression, som vil have vigtige kliniske konsekvenser12,31. Desuden vil vellykket CAF-udvinding fra humane og prækliniske musetumormodeller også lette udviklingen af nye CAF-målretningslægemidler. Dette papir rapporterer en metode til effektivt at isolere og kultur primære CAF'er fra en syngeneic præklinisk model af brystkræft. Baseret på erfaring påvirker tre eksperimentelle trin for det meste protokollens succes.
Den første arbejder hurtigt for at undgå sammenlægning af celleophæng forbundet med risikoen for koagulation i kolonnen og aftagende celle efflux: faktisk, når celler, der passerede gennem kolonnen blev grupperet sammen, sandsynligheden for en suboptimal isolationsproces steg, og de endelige kulturer indeholdt "forurenende" celle kloner. Den anden er at samle celler fra forskellige tumorer efter udtømning passage for at sikre nok celler, der skal passeres igennem i den endelige berigelse trin. Det sidste kritiske spørgsmål er plating de ekstraherede celler ved høje celletætheder, sandsynligvis startende fra en enkelt brønd af 24-brønd plade til at øge cellevækst og koloni ekspansion for op til 4-5 passager. Hvis cellerne blev sået ved lave tætheder, udvidede de sig på den frie overflade og stoppede hurtigt med at replikere.
Flere undersøgelser har allerede beskrevet CAF ekstraktion metoder af både menneskelig og mus oprindelse, at studere deres rolle i at fremme kræft udvikling og invasivitet. Dette er blevet gjort i mange typer af tumorer, herunder brystkræft, modermærkekræft, cholangiocarcinom, og bugspytkirtel adenocarcinom35,36,37,38. På grund af manglen på specifikke CAF-markører og deres heterogenitet er resultaterne af disse processer dog stadig suboptimale.
Her blev de isolerede celler brugt til at validere CAF-målretningsevnen hos HFn nanocages, der blev funktionaliseret med anti-FAP rettet mod moietier. Anvendelsen af primærkulturer i CAF'er var en betydelig fordel, hvilket gjorde det muligt at validere nanostrategi ex vivo med et meget enklere og omkostningseffektivt bindende eksperiment end at gøre det direkte in vivo i denne indledende fase af nanodrugoptimering.
I den forstand kan ex vivo-test på CAF'er gå forud for in vivo dyreforsøg ved at tillade screening og udvælgelse af de mest lovende nanopartikler til optimal målretning af CAF. CAF-modellen, der præsenteres her, kan også anvendes til indledende effektundersøgelser, når nanopartikler indlæses med aktive lægemidler. Dyr vil først blive brugt senere til at evaluere biodistribution, farmakokinetik og effektundersøgelser.
Flere CAF-målretning nanodrugs er ved at blive udviklet, såsom ferritin nanocages til fotodynamisk behandling i brystkræft og peptid-baserede partikler til at levere doxorubicin i prostatakræft modeller39,40. Der er dog ikke mange undersøgelser, der har fokuseret på isolering af CAF'er som celleplatforme til nanodrugoptimering.
Denne protokol har nogle begrænsninger. For det første er det en tidskrævende protokol, der kræver forberedelse og køb af flere reagenser og materialer. For det andet, på grund af knapheden på CAF'er i 4T1 brysttumor, deres udbytte er lav. Nanopartikler eksperimenter bør planlægges og udføres, så snart det krævede cellenummer er opnået, da primære CAF'er gennemgår senescence og ikke kan opretholdes i kulturen i lang tid. Afslutningsvis kan denne metode til CAFs isolation, dyrkning og karakterisering være et kraftfuldt værktøj til at fremskynde udviklingen af nye målrettede nanomediciner i kampen mod kræft.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) under IG 2017-ID. 20172-projektet – P.I. Corsi Fabio. SM anerkender Pædiatrisk Klinisk Forskningscenter "Romeo og Enrica Invernizzi", der understøtter hendes position. AB takker AIRC (ID. 20172-projektet) og University of Milan for forskningsstipendi. LS og MS postdoctoral og ph.d.-stipendier er støttet af Universitetet i Milano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
| Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
| BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
| CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
| CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
| Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
| CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
| Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
| D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
| DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
| Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
| Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
| Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
| LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
| L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
| Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
| Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
| NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
| Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
| RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at - 20 °C. |
| Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
| TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
| Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
| T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
| Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
| 1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
| 15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
| 4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
| 50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |
References
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer. Breast. 30, 92-100 (2016).
- Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer. Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).
- Hui, L., Chen, Y.
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- LeBleu, V. S., Kalluri, R. A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact. Disease Models & Mechanisms. 11, (2018).
- Li, X. -Y., Hu, S. -Q., Xiao, L. The cancer-associated fibroblasts and drug resistance. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F.
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Costa, A., et al. Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer. Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).
- Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment. Advances Drug Delivery Reviews. 99, Part B 186-196 (2016).
- Chen, Q., et al. Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).
- Truffi, M., et al. Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).
- Tong, R., Langer, R.
- Kaps, L., Schuppan, D. Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers. Cells. 9 (9), 2027 (2020).
- Miao, L., et al. Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors. Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).
- Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).
- Falvo, E., et al. Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin. Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).
- Truffi, M., et al. Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer. Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).
- Cai, Y., et al. Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size. International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).
- Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R.
- Mazzucchelli, S., et al. Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity. Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).
- Yu, Q., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy. Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).
- Mertens, J. C., et al. Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma. Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).
- Kovács, D., et al. Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts. Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).
- Sitia, L., et al. Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax. Cells. 10 (2), 328 (2021).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells. Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).
- Dvořánková, B., Lacina, L., Smetana, K. Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research. Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).
- Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages. Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).
- Sha, M., et al. Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Zhen, Z., et al. Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control. Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).
- Ji, T., et al. Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery. Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).
