Summary
Denne artikkelen tar sikte på å gi en protokoll for isolering og kultur av primærkreft-assosierte fibroblaster fra en syngeneisk murine modell av trippel-negativ brystkreft og deres anvendelse for preklinisk studie av nye nanopartikler designet for å målrette svulstmikromiljøet.
Abstract
Kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er) er sentrale aktører i sammenheng med tumormikromiljøet. Til tross for at de er redusert i antall sammenlignet med tumorceller, regulerer CAF-er tumorprogresjon og gir beskyttelse mot antitumorimmunitet. Nye anticancer strategier tar sikte på å ombygge tumor mikromiljøet gjennom ablasjon av pro-tumorigenic CAFs eller omprogrammering av CAFs funksjoner og deres aktiveringsstatus. En lovende tilnærming er utviklingen av nanosized leveringsmidler som er i stand til å målrette CAF-er, og dermed tillate spesifikk levering av legemidler og aktive molekyler. I denne sammenhengen kan en mobilmodell av CAFer gi et nyttig verktøy for in vitro screening og foreløpig undersøkelse av slike nanoformuleringer.
Denne studien beskriver isolasjonen og kulturen til primær-CAF-er fra den nye 4T1-murinmodellen av trippelnegative brystkreft. Magnetiske perler ble brukt i en 2-trinns separasjonsprosess for å trekke ut CAF-er fra dissosierte svulster. Immunofenotypingskontroll ble utført ved hjelp av strømningscytometri etter hver passasje for å verifisere prosessutbyttet. Isolerte CAF-er kan brukes til å studere målrettingsevnen til forskjellige nanoformuleringer designet for å takle tumormikromiljøet. Fluorescerende merket H-ferritin nanocages ble brukt som kandidat nanopartikler for å sette opp metoden. Nanopartikler, enten nakne eller konjugert med en målrettingsligand, ble analysert for binding til CAF-er. Resultatene tyder på at ex vivo utvinning av bryst CAFs kan være et nyttig system for å teste og validere nanopartikler for spesifikk målretting av tumorigeniske CAF-er.
Introduction
I løpet av de siste tiårene har det blitt klart at å drepe tumorceller vanligvis ikke er tilstrekkelig til å utrydde malignitet, da tumormikromiljøet kan føre til tumorrelaps og indusere terapeutisk motstand1,2. Et nytt paradigme har da dukket opp: målretting av tumor stroma for å frata svulsten av støttende faktorer og dermed øke effekten av kjemoterapeutiske3,4,5. Spesielt er kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er) et interessant stromalt mål i mange solide svulster6,7. CAFs er en veldig heterogen gruppe celler som samhandler med kreftceller og celler i immunsystemet gjennom sekresjon av vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner; bygge opp og ombygge den ekstracellulære matrisen; og aktivere metastasedannelse8,9,10,11,12. Avhengig av tumortypen viser CAF-er pro-tumorogene funksjoner, mens andre undertyper av CAF-er ser ut til å ha tumor-undertrykkende funksjoner13,14. For bedre å avklare denne dikotomien er en grundig karakterisering av CAFs fra primære og metastatiske svulster viktig.
I denne sammenhengen har et fremvoksende forskningsfelt fokusert på utvikling av nanosized midler designet for å målrette og / eller ødelegge CAF-er ved å levere aktive molekyler og legemidler som er i stand til å ombygge tumormikromiljøet15,16,17,18. Flere typer nanopartikler er designet for å oppnå CAF-ablasjon av cytotoksiske legemidler, for å indusere CAF-målrettet fotodynamisk terapi, eller for å omprogrammere CAF-er ved å tilbakestille dem til en passiv tilstand eller indusere TNF-relatert apoptose indusert liganduttrykk, som induserer apoptose av nærliggende kreftceller16,19. Videre gir potensialet til mange nanopartikler å aktivt målrette spesifikke biologiske markører opphav til håpet om å velge CAF-delsett å målrette mot. Selv om dens absolutte spesifisitet for CAF fortsatt er stilt spørsmålstegn ved, er fibroblast aktiveringsprotein (FAP) et av de mest lovende målene for pro-tumorigogen stroma og utnyttes til å styre nanodrug levering, og dermed bane banen for utvikling av CAF-rettet nanotherapeutics20,21,22.
Denne artikkelen beskriver isolering av primære CAF-er fra en modell av murin brystkreft og rapporterer deres bruk i studiet av målrettingsevnen til nanopartikler konstruert for å gjenkjenne CAF-markøren, FAP. Ferritin nanocages brukes som kandidat nanosystemer for å sette opp metoden, da deres spesifisitet av levering kan formes av overflateeksponeringen av målretting av moieties23,24. Videre har ferritins vist seg å være gode biokompatible skyttelbusser for antitumorapplikasjoner, noe som utløser rask opphopning av nyttelasten i tumormassen25,26,27. Til dags dato har prekliniske studier av CAF-målrettede nanosystemer involvert in vitro-testing på fibroblastcellelinjer stimulert i kultur med transformerende vekstfaktor-beta for å indusere celleaktivering og uttrykket av noen immunofenotypiske trekk ved CAFs28,29. Denne metoden brukes vanligvis på udødelige cellelinjer (for eksempel NIH3T3, LX-2) og er ganske rask og enkel, noe som gir aktiverte celler om noen timer eller dager. En begrensning er at selv om in vitro stimulering induserer uttrykket av noen gener som tilskrives aktiverte myofibroblaster, kan den ikke helt rekapitulere alle de biologiske egenskapene til ekte CAFer, spesielt deres heterogenitet in vivo.
En annen strategi innebærer utvinning av primære CAF-er fra menneskelige eller musesvulstprøver30,31. Dette sikrer at CAF-aktivering skjer i en fysiologisk kontekst, og at heterogeniteten til CAF-delpopulasjoner opprettholdes. I henhold til forskningsmålet kan CAF-er være avledet fra forskjellige kilder, og dermed tilby muligheten til å studere den mest pålitelige tilstanden. Protokollen som rapporteres her ville være verdifull for forskere som søker å utføre en foreløpig evaluering av funksjonaliteten til nye nanopartikler designet for å målrette CAF-er fra en murin brystkreftmodell. Isolerte CAF-er vil være nyttige for screening av de nanopartiklene som er lovende nok til å fortsette med in vivo-evaluering i dyremodeller av kreft. Dette vil være relevant i løpet av de første trinnene i nanopartikkelproduksjon, drive nanoteknologiske stoffer mot raffinement av nanopartikkeldesign ved hovedsakelig å vurdere strategien for ligand immobilisering for å oppnå optimale målrettingsegenskaper.
Protocol
1. Etablering av en syngeneisk 4T1-modell av brystkreft
MERK: Den nåværende protokollen beskriver isolering av primære CAF-er fra en mus 4T1 brystsvulst. Dyrestudien beskrevet her er godkjent av det italienske helsedepartementet (aut. nummer 110/2018-PR).
- Tumorcellekultur og implantasjon
- Tine 1 × 106 4T1-luc celler i en T75 kolbe med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S) og 1% L-glutamin. Legg til Mycoplasma fjerning agent (1:100) i kulturmediet.
MERK: 4T1-luc celler uttrykker stabilt luciferase og kan visualiseres ved bioluminescens (BLI) ved riktig stimulering med D-luciferin. Dette gjør det mulig å overvåke levedyktigheten og spredningen av tumorceller ved implantasjon hos mus (figur 1). - Vedlikehold cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktig atmosfære frem til ~80 % samløp, ved å endre mediet annenhver dag.
MERK: Fortsett behandlingen med Mycoplasma fjerningsmiddel i 1 uke (~2/3 passasjer) før injeksjon hos mus for å sikre at injiserte celler er mykoplasmafrie. - På dagen for prosedyren løsner celler ved hjelp av 1 ml trypsin-etylendiamintetraketisk syre (EDTA) løsning (trypsin 1:250) i 5 min ved 37 °C. Stopp trypsinaktivitet ved å legge til kulturmedium, telle cellene med trypanblå (1:1), og beregne antall celler/ml.
- Pipette volumet tilsvarende 1 × 106 celler og sentrifuger i 5 min ved 400 × g. Hell av supernatanten, og resuspend pellet i 1 ml RPMI 1640 basemedium. Hold cellene på is til de er klare til injeksjon.
MERK: For hver mus er det nødvendig med 1 × 105 celler; Beregn imidlertid alltid for et overskudd på 2 mus (tilsvarende 2 × 105 celler) for å lette sprøytebelastningen. - En dag før operasjonen barberer du pelsen på 8 BALB/ c mus (hunn, syv uker gammel) for å eksponere området av magepattedyrkjertlene på høyre side. Bruk en elektrisk barbermaskin og påfør et tynt lag med depilatorisk krem i 4 min; Vask deretter kremet med vann og et stykke papir.
- Induser anestesi ved kontinuerlig innånding av 2% isoflurangass i ~ 5 min, og utfør en subkutan injeksjon i regionen av magepattedyrkjertlene med en 27 G tuberkulin sprøyte. Vri nålen oppover for å komme inn i huden subkutant; Hold deretter huden oppover og injiser sakte 100 μL celleoppheng (1 × 105 celler). Snu kanylen litt rundt før du langsomt trekker tilbake sprøyten.
MERK: Husk å bringe celleopphenget til romtemperatur 15 min før injeksjon.
- Tine 1 × 106 4T1-luc celler i en T75 kolbe med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S) og 1% L-glutamin. Legg til Mycoplasma fjerning agent (1:100) i kulturmediet.
- Tumorvekst og disseksjon
- Ved 5 dager etter celleinjeksjon injiserer du 150 mg/kg D-luciferin intraperitonealt (100 μL) 5 min før avbildning. Ta BLI-bilder ved hjelp av en in vivo-bildebehandlingssysteminnstilling 10 s eksponering, middels binning og f/stopp ved 4. Definer det lysende området av svulsten som interesseområdet (ROI), og kvantifisere det totale signalet i avkastningen (foton / sek / m2) ved hjelp av bildeprogramvare.
- Gjenta prosedyren for avbildning (1.2.1) hver 5.
- For å etablere tumorvolumet, hold musen og eksponer magen. Bruk kalipere til å måle tumorlengden (L) og bredden (W) en gang i uken. Beregn tumorvolumet (V) ved hjelp av ligning 1.
[V = (L x B2)/2] (1) - På 20 dager etter celleinjeksjon, ofre dyrene ved cervical dislokasjon, dissosier svulstene fra huden med saks, og samle dem i en vevslagringsløsning (se materialtabellen ).
MERK: Tumorprøver kan brukes umiddelbart for dissosiasjon i enkeltceller (avsnitt 2) eller oppbevares ved 4 °C i opptil 48 timer.
2. Tumor dissosiasjon i enkeltceller
MERK: Bruk sterile reagenser og engangsutstyr i en laminær strømningshette i følgende trinn. Arbeid med 4 svulster om gangen.
- Legg tumorprøven i en Petri-tallerken, og fjern forsiktig ethvert fragment av hud, fett og nekrotiske områder ved hjelp av pinsett og skalpell. Deretter reduserer du svulsten i små biter på ca. 1-2 mm og overfører dem til et rør (Figur 2A).
MERK: 4T1 svulster blir svært nekrotiske mens de vokser, med en tendens til sårdannelse. Det er viktig å forsiktig fjerne de nekrotiske områdene for å unngå forstyrrelser av rusk med de neste trinnene. - Forbered en fordøyelsesblanding for tumordissosiasjon: Bland 2,35 ml RPMI 1640 medium, 100 μL enzym D, 50 μL enzym R og 12,5 μL enzym A. Bløtlegg tumorfragmentene i løsningen og lukk røret tett.
MERK: De angitte volumene av fordøyelsesblanding er gyldige for svulster opp til 1 g og kan justeres for større svulster i henhold til vekten. 4T1 svulster dyrket i 20 dager er normalt i en rekkevidde på 0,5-0,8 g. - Snu røret opp ned, og kontroller at alle svulststykkene står i bunnen av røret mot hetten. Fest røret til en mekanisk dissosiator i riktig hus, og kjør et bestemt dissosiasjonsprogram designet for tøffe svulster (se produsentens instruksjoner).
MERK: Spesielle rør kan være nødvendig for å passe inn i dissosiatoren. C-rør bærer en rotor inne i hetten for å fremme mekanisk dissosiasjon av vevet. - Løsne røret, hold det opp ned og inkuber prøven ved 37 °C i 40 minutter med skånsom risting. Fest deretter røret til dissosiatoren i riktig hus, og kjør følgende spesifikke dissosiasjonsprogram designet for tøffe svulster to ganger. Pass på at det ikke er store vevsstykker på slutten av prosedyren (Figur 2B).
MERK: For å fjerne svulsten, kan andre enzymcocktailer brukes til å forringe den ekstracellulære matrisen. Men i denne protokollen ble et kommersielt tilgjengelig Tumor Dissociation-sett som inneholder en optimalisert enzymblanding (enzymer D, R, A) og en halvautomatisk dissosiator som mekanisk dissosierer vevet, brukt. Denne kombinasjonen sikret en riktig nedbrytning av den ekstracellulære matrisen sammen med vedlikehold av celleintegritet og celleoverflateepiller. - Filtrer prøven gjennom en 40 μm cellesil i et 50 ml rør, vask filteret med 10 ml RPMI 1640 medium, og sentrifuger røret i 7 min ved 300 × g. Hvis cellepelleten ser rød ut, lyser erytrocytter ved å tilsette 1 ml Ammonium-Klorid-kalium (ACK) lysbuffer i 5 min ved romtemperatur, vask med 10 ml RPMI 1640, overfør cellefjæringen i et 15 ml rør og sentrifuger igjen.
- Resuspend pellet i 1 ml PBE buffer sammensatt av fosfat-bufret saltvann (PBS), 0,5% bovint serum albumin (BSA), og 2 mM EDTA, og telle cellene med trypan blå (1:1). Ved celleklumper, filtrer cellefjæringen gjennom en 70 μm cellesil, tidligere gjennomvåt med PBS.
MERK: Spesielt når svulster er store, er det viktig å sjekke celleantallet og til slutt dele hver tumorprøve i forskjellige rør med ikke mer enn 107 celler i hvert rør før du går videre til trinn 2.7. - Klargjør bindingsbufferen for fjerning av døde celler ved å fortynne 20x bindingsbufferlagerløsningen (se materialtabellen) med sterilt dobbeltdestillert vann. Vask celler med 5 ml 1× bindingsbuffer (figur 2C).
MERK: Hold bufferen ved 4 °C. - Sentrifuge i 7 min ved 300 × g, og resuspend cellepellet med 0,1 ml dødcellefjerning mikrober (se materialtabellen). Bland godt og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Under inkubasjonen med perler, lag et magnetisk stativ under hetten og heng ferromagnetiske separasjonskolonner (en kolonne for opptil 107 celler) på den med spissene pekende ned. Likevekt kolonnene med 0,5 ml kald 1× bindingsbuffer. Vent til løsningen har strømmet gjennom under tyngdekraften.
MERK: Det er viktig å ikke overskride antall celler per kolonne for å unngå risiko for å koagulere kolonnesengen og redusere utvinningsutbyttet. Når du arbeider med mer enn 107 celler, kan du enten bruke flere kolonner i henhold til totalt antall celler eller bruke større kolonner. I slike tilfeller justerer du reagensvolumene som er beskrevet i følgende trinn, til de som er angitt av produsenten. - På slutten av inkubasjonen, tilsett 400 μL kald 1× bindingsbuffer til perle / celle suspensjon, last hele volumet på kolonnen, og samle avløpet (tilsvarende umerkede celler) i et 15 ml rør.
- Vask kolonnen fire ganger med 0,5 ml kald 1× bindingsbuffer, og samle det totale avløpet (tilsvarende levende cellefraksjon) i samme rør.
- Tell cellene med trypan blå (1:1). Plasser 1 × 105 celler i to rør for fluorescensaktivert cellesortering (FACS), og hold dem ved 4 °C til prosessvalidering (se trinn 4.1): Bruk det første røret til å stille inn analyseparametrene og områdene for positivitet (kontrollrør) og det andre for biomarkøranalyse (prøverør). Bruk de gjenværende cellene for CAFs uttrekking (se avsnitt 3).
MERK: Fjerning av døde celler er viktig for å redusere ikke-spesifikke reaksjoner med mikrobeadene i avsnitt 3. Men for å forbedre utbyttet, unngå fjerning av døde celler hvis andelen døde celler er <20%.
3. Ekstraksjon av primære CAF-er fra brystsvulst
MERK: For avsnitt 3, bruk musen Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit som inneholder Ikke-tumor-assosiert Fibroblast Depletion Cocktail og Tumor-Associated Fibroblast Microbeads egnet for magnetisk merking av cellene (se tabell over materialer).
- Uttømming av ikke-kreftrelaterte fibroblaster
- Fukt en 70 μm cellesil med PBS, og filtrer cellefjæringen for å fjerne klumper. Deretter sentrifugerer cellene i 10 min ved 300 × g og aspirerer supernatanten.
MERK: Hvis en enkelt svulst ble delt inn i to prøver for trinn 2.7, kan du slå sammen celleopphenget to og to før du fortsetter med trinn 3.1.2. - Resuspend pellet i 80 μL kald PBE buffer, og tilsett 20 μL ikke-tumor-assosiert fibroblast depletion cocktail. Bland godt og inkuber ved 4 °C i 15 minutter i mørket.
- Under inkubasjonen med perler, lag ferromagnetiske uttømmingskolonner (1 per prøve) på et magnetisk stativ, og likevekt kolonnene med 2 ml kald PBE-buffer. Vent til løsningen har strømmet gjennom.
- På slutten av inkubasjonen legger du til 400 μL kald PBE-buffer til perle/ cellefjæring, laster hele volumet på kolonnen og samler avløpet (tilsvarende umerkede celler) i et 15 ml rør.
- Vask kolonnen to ganger med 2 ml kald PBE-buffer, og samle det totale avløpet i samme rør. Sentrifuge i 10 min ved 300 × g og resuspend i 0,1 ml kald PBE-buffer.
MERK: Uttømming av ikke-kreftrelaterte fibroblaster reduserer drastisk den totale mengden celler som gjenopprettes. Det er generelt nødvendig og anbefales å samle cellesuspensjoner fra fire forskjellige prøver for å få en synlig pellets og nok celler for trinn 3.2. Dette vil sikre et optimalt utbytte. - Plasser 20 μL av cellefjæringen i et FACS-rør og hold den ved 4 °C for prosessvalidering (se avsnitt 4). Bruk de gjenværende cellene for CAF-valg (se trinn 3.2).
- Fukt en 70 μm cellesil med PBS, og filtrer cellefjæringen for å fjerne klumper. Deretter sentrifugerer cellene i 10 min ved 300 × g og aspirerer supernatanten.
- Positivt utvalg av kreftrelaterte fibroblaster
- Tilsett 20 μL tumor-assosiert fibroblastmikrobeader til 80 μL cellefjæring. Bland godt og inkuber ved 4 °C i 15 minutter i mørket.
- Under inkubasjon med perler, lag ferromagnetiske separasjonskolonner (1 per prøve) på et magnetisk stativ, og likevekt kolonnene med 0,5 ml kald PBE-buffer. Vent til løsningen har strømmet gjennom.
- På slutten av inkubasjonen, tilsett 400 μL kald PBE-buffer til perle / cellefjæring, last hele volumet på kolonnen, og la de umerkede cellene strømme gjennom i et 15 ml rør.
- Vask kolonnen tre ganger med 0,5 ml kald PBE-buffer, og samle det totale avløpet i samme rør.
MERK: Gjennomstrømningen inneholder umerkede CD90.2-negative celler, som kan kastes som ikke-kreftrelaterte fibroblaster. - Fjern kolonnen fra magneten og legg den i et 1,5 ml rør. Tilsett 1 ml kald PBE på kolonnen, og skyv stempelet umiddelbart inn i kolonnen for å skylle cellene ut.
- Sentrifuge i 10 min ved 400 × g og resuspend i 0,1 ml kald PBE-buffer. Plasser 20 μL cellefjæring i et FACS-rør og hold det ved 4 °C for prosessvalidering (se avsnitt 4).
MERK: Etter sentrifugering kan pelletsen knapt være synlig, spesielt når de opprinnelige svulstene er små. Bruk koniske nedre sentrifugerør og vær forsiktig så du ikke mister noen celler når du aspirerer supernatanten. - Fortynn de resterende cellene i et passende volum av Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM)/Hams F-12 supplert med 15% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% P / S og 1% ikke-essensielle aminosyrer, og frø cellene i en vevskulturplate.
- Kontroller celletettheten under et mikroskop, og legg platen i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 for å la cellene feste seg og vokse.
MERK: Hvis cellene er for tette, må du umiddelbart dele celleopphenget i to brønner på vevskulturplaten før du plasserer platen i inkubatoren.
4. Prosessvalidering
- Flowcytometri
MERK: Avsnitt 4.1 krever ikke sterile forhold og kan utføres utenfor laminær hetten. Utfør pkt. 4.1 parallelt for prøver samlet inn i trinn 2.11 (dissosiert svulst), trinn 3.1.6 (etter uttømming av ikke-kreftrelaterte fibroblaster) og trinn 3.2.6 (etter berikelse av kreftrelaterte fibroblaster).- Sentrifuger FACS-rørene tilberedt i trinn 2.11, 3.1.6 og 3.2.6 i 10 min ved 300 × g. Kast supernatanten.
MERK: Klargjør minst ett ekstra rør, som inneholder ubegrunnede celler som fungerer som en kontroll for å stille inn parametrene for analyse. - I prøverør er resuspendceller i 88 μL PBE, og tilsett 2 μL anti-CD45 antistoff konjugert med fluorescein isothiocyanate (FITC, 1:50 fortynning, i henhold til produsentens instruksjoner) og 10 μL anti-CD90.2 antistoff konjugert med fycoerythrin (PE, 1:10 fortynning, i henhold til produsentens instruksjoner). Bland grundig og inkuber i 10 min ved 4 °C i mørket. I kontrollrøret (unstained), resuspend celler i 100 μL av PBE. Inkuber i 10 min ved 4 °C i mørket for å gjenskape prosedyren som fulgte for antistofffargede celler.
MERK: Temperatur og tidspunkt for inkubasjon må kontrolleres nøye, da en variasjon i slike variabler kan føre til dårlig eller ikke-spesifikk farging, og dermed endre resultatene. - Etter å ha fullført inkubasjonstrinnet, utfør en vask ved å legge til 1 ml PBE. Sentrifuge i 10 min ved 300 x g. Kast supernatanten.
- Resuspendceller (alle rør) i 500 μL PBS.
- Bland godt og fortsett med strømningscytometrianalyse. Still inn kanalene for å måle fluorescensen til antistoffene (dvs. FITC og PE).
- Fra kontrollrøret merker du alle levedyktige celler ved å tegne en første port (P1) på plottet Fremover kontra Sidespredning (FSC vs SSC). Innenfor P1 angir du en ekstra port (P2) som bare består av enkeltceller.
- Bruk de spesifikke fluorescenskanalene til antistoffene (dvs. FITC og PE), sett riktige porter for å skjelne positivt fargede celler.
- Start analysen og registrer minst 10 000 hendelser i P2. Les signaler fra begge kanalene samtidig.
MERK: Hvis det totale antallet celler er mindre enn forventet, kan det være å foretrekke å lese hele røret. - (VALGFRITT) Hvis ytterligere farging med ytterligere antistoffer/fluoroforer programmeres, må du angi en passende kompensasjonsmatrise før du starter analysen.
- Sentrifuger FACS-rørene tilberedt i trinn 2.11, 3.1.6 og 3.2.6 i 10 min ved 300 × g. Kast supernatanten.
- Overvåking av cellemorfologi og egenskaper
MERK: Når cellene er sådd, må de håndteres under sterile forhold.- Dagen etter sådd visualiserer du cellene under et optisk mikroskop for å sjekke celleadhesjon og morfologi. Aspirer supernatanten og erstatt med friskt medium.
MERK: CAF-er er store spindelformede celler, som lett kan skille seg fra den epitellignende strukturen til 4T1 tumorceller. - Vedlikehold cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktig atmosfære, og endre mediet annenhver dag.
- Når cellene når ~80% samløp (ca. 4-6 dager etter sådd), løsne cellene ved hjelp av TrypLE Select-løsningen (se materialtabellen) i 5 minutter ved romtemperatur. Tilsett friskt medium (4:1), sentrifuger cellefjæringen ved 400 × g i 5 min, og resuspend pellet i friskt medium.
- Del cellene 1:2, og utvid kulturen til antall celler som trengs for eksperimentet er oppnådd.
- Ved hver passasje, sjekk cellemorfologi og vekst under et optisk mikroskop. Hvis cellemorfologi ikke er homogen (f.eks. kloner av små rundformceller som vises i kulturen), analyserer du et utvalg av celler ved strømningscytometri som beskrevet i avsnitt 4.1. Hvis det er homogent, går du videre til trinn 4.2.7.
MERK: Endringer i cellemorfologi kan indikere forurensning ved ikke-kreftrelaterte fibroblaster, som må fjernes for å sikre kulturrenhet. - Analyser strømningscytometriresultatene og fortsett i henhold til ett av følgende scenarier: (i) hvis forurensning av CD90.2-/CD45-celler oppstår, samle alle cellene og gjenta det positive utvalget ved å følge trinn 3.2; (ii) hvis forurensning av CD45+ celler også oppstår, samle alle cellene, og gjenta uttømmingen i trinn 3.1; (iii) hvis det ikke oppstår forurensning (bare CD90.2+/CD45-celler er til stede), hold cellene i kultur og fortsett direkte til 4.2.7.
MERK: Ettersom gjentakelse av uttømmingsprosessen med mikrober vil redusere cellegjenoppretting, anbefales det bare når celler ikke trenger å brukes umiddelbart. - Tell cellene med trypan blå (1:1), plasser 5 × 105 celler i to FACS rør, og sentrifuge i 10 min ved 300 × g. Kast supernatanten, og resuspend pellet i 0,5 ml blokkeringsbuffer (PBS supplert med 2% BSA, 2% geitserum) i 15 minutter ved romtemperatur.
MERK: Ett rør fungerer kun som en kontroll som består av uoppdagede celler, mens celler i det andre røret vil bli farget for strømningscytometrianalyse. - Sentrifuge i 10 min ved 300 × g, kast supernatanten og resuspend i 99 μL blokkeringsbuffer. Tilsett 1 μg anti-FAP-antistoff til prøverøret og 1 ml blokkeringsbuffer til kontrollrøret. Bland grundig og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
MERK: FAP er en overflatemarkør for reaktiv tumor stroma og kan brukes til å identifisere og karakterisere CAFs. - Vask tre ganger med PBS, sentrifuger og inkuber med riktig sekundært antistoff konjugert med et fluorescerende fargestoff (1 μg) i blokkeringsbuffer i 15 minutter ved romtemperatur.
- Vask tre ganger med PBS, og analyser ved strømningscytometri (følg trinn 4.1.5 til 4.1.7 ved å stille inn riktig kanal for å oppdage fluoroforen som brukes). Deretter bruker du cellene til eksperimenter (trinn 5.2).
- (VALGFRITT) Frys en prøve av celler i 1 ml 90% FBS og 10% dimetylsulfoksid (DMSO); oppbevare ved -80 °C for videre bruk.
- Dagen etter sådd visualiserer du cellene under et optisk mikroskop for å sjekke celleadhesjon og morfologi. Aspirer supernatanten og erstatt med friskt medium.
5. CAFs målretting av konstruerte Ferritin nanopartikler
MERK: En rekombinant variant av humant ferritin tungt kjede (HFn) ble brukt som bar nanopartikkel eller ble konjugert med målretting av moieties. Her ble HFn nanopartikler funksjonalisert med den variable delen av et anti-FAP-antistoff (Fab@FAP) utarbeidet av NanoBioLab ved University of Milano-Bicocca ved to HFn:Fab@FAP molarforhold, 1:1 og 1:5, ifølge en tidligere beskrevet protokoll32.
- Fluorescerende merking av HFn nanopartikler
MERK: Både nakne og funksjonaliserte HFn nanocages er fluorescerende merket med FITC.- Løs opp FITC-pulveret i 99% etanol for å oppnå en konsentrasjon på 2 mg / ml.
MERK: Denne løsningen skal tilberedes ferskt. - Inkuber 50 μL av den tilberedte oppløsningen (200 μg FITC) for hver 1 mg protein (dvs. 100 μL HFn ved 10 mg/ml). Tilsett 50 μL 1 M natriumbikarbonat (NaHCO3), og juster volumet til 500 μL med 0,1 M NaHCO3.
MERK: Skaler opp volumene i henhold til de eksperimentelle behovene. - Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur, i mørket og med kontinuerlig omrøring i 1 time.
- Fjern overskuddet av FITC fra konjugaten ved gelfiltrering ved hjelp av en spin desalting kolonne (7 kDa MWCO).
- Vurder konsentrasjonen av det gjenvunne merkede proteinet ved hjelp av et spektrofotometer. Beregn mengder protein og fargestoff ved å måle absorbansen ved henholdsvis 280 nm og ved 488 nm.
- Løs opp FITC-pulveret i 99% etanol for å oppnå en konsentrasjon på 2 mg / ml.
- Binding av HFn nanopartikler til CAF-er
MERK: Bruk CAF-er fra senest avsnitt 4–5 i kulturen.- Plasser 5 × 105 celler i hvert FACS-rør, sentrifuge i 10 min ved 300 × g, og resuspend i 0,5 ml PBS, 0,3% BSA supplert med 0,1 mg/ml av de forskjellige preparatene av nanopartikler (bare HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) tidligere merket med FITC.
MERK: Kjør hver betingelse i triplikat. Forbered et ekstra rør som en kontroll uten etikettprøve som ingen nanopartikler tilsettes. - Inkuber i 2 timer ved 4 °C i mørket, sentrifugen og vask tre ganger i PBS.
- Resuspend celler med 0,5 ml PBS, bland godt og analyser etter strømningscytometri. Still inn kanalene for å måle fluorescensen til FITC.
- Etter å ha stirret på levende enkeltceller, får du 20.000 hendelser. Bruk kontrollens umerkede rør for å stille inn porten til FITC-positivitet og oppnå prosentandelen fitc+ hendelser (tilsvarende nanopartikkelbinding).
- Plasser 5 × 105 celler i hvert FACS-rør, sentrifuge i 10 min ved 300 × g, og resuspend i 0,5 ml PBS, 0,3% BSA supplert med 0,1 mg/ml av de forskjellige preparatene av nanopartikler (bare HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) tidligere merket med FITC.
6. Statistisk analyse og eksperimentelle replikeringer
- Dyr
- Utfør tre uavhengige eksperimenter med tumorvekst og CAFs isolasjon, ved hjelp av 8 dyr per enkelt eksperiment, som beskrevet i 1.1.5. Hvis du vil optimalisere cafs isolasjonsutbytte, deler du det utskilte vevet inn i undergrupper (n=4) og behandler dem ved å følge trinnene som er beskrevet i avsnitt 2.
- HFn-interaksjon med celler
- Evaluer samspillet mellom funksjonalisert og ikke-funksjonalisert HFn med henholdsvis mål- og ikke-målceller (CAF-er og 4T1) når det gjelder prosentandelen av positivt fargede celler av fluorescerende merkede nanocages. Rapporter resultatene som gjennomsnittlig ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.
- Statistisk analyse
- For å beregne statistisk signifikans i cellebindingseksperimenter med HFn og HFn-FAP, bruk den vanlige enveis ANOVA-testen.
Representative Results
In vivo-modelloppsett for optimal CAFs-isolasjon
Injeksjonen av 105 4T1-luc celler i mammary fett puten av kvinnelige BALB / c mus fører til vekst av en påviselig tumormasse på 5 dager etter implantasjon. Ved å måle tumorvolumet med kalipere og tumorcellens levedyktighet av BLI, ble tumorveksten overvåket i en måned etter implantasjon. For å finne et offervindu som er tilstrekkelig for CAFs isolasjon, ble det søkt et optimalt kompromiss mellom høyere tumorstørrelse og BLI på den ene siden og en fremvoksende tumorsår og nekrose på den annen side (Figur 1). Ettersom en nekrotisk kjerne vises 20 dager etter implantasjon, og den forstørres etter 25 og 30 dager (som dokumentert av BLI-bilder i figur 1C), ble dag 20 satt som tidspunkt for å optimalisere cellegjenoppretting etter isolasjonsprosessen. Selv etter nøye fjerning av alle synlige nekrotiske områder under de første trinnene i tumorhåndtering ex vivo, ble det funnet en høy prosentandel av døde celler på slutten av dissosiasjon i enkeltceller (Tabell 1). Siden denne prosentandelen kan være relevant, spesielt med økningen i tumorstørrelse, er fjerning av døde celler alltid nødvendig når du arbeider med 4T1-modellen.
Optimalisering av CAFs isolasjonsprosedyre, kultur og karakterisering
To passasjer er nødvendig for å isolere populasjonen av CAFer (CD90.2+ CD45-) fra panelet av innsamlede levedyktige celler: uttømming av ikke-tumor-assosierte fibroblaster og berikelse av tumor-assosierte fibroblaster (Figur 2). Uttømmingsperlecocktailen fjerner effektivt CD45+ celler (som står for henholdsvis 67,35% og 0,69% av totale celler før og etter uttømming, henholdsvis tabell 2), og ble alltid brukt til å behandle en enkelt svulst i hver kolonne. Som vist i tabell 1falt antall eluterte celler fra et gjennomsnitt på 3 × 106 til 1 × 105 etter uttømmingstrinnet. På grunn av denne massive nedgangen i totalt cellenummer, er det praktisk å samle de innsamlede cellene fra minst 2 til maksimalt 4 svulster i et enkelt rør før du fortsetter med berikelsestrinnet. Ved å gjøre det ble det oppnådd et tilstrekkelig antall celler for inkubasjon med tumorrelaterte fibroblastperler og passert gjennom en enkelt separasjonskolonne for å oppnå et siste gjennomsnitt på 93% av CD90,2+ CD45- celler (Tabell 2).
Når de er sådd på vevskulturplater, gjenopprettet disse cellene festet til plasten og avslørte en stor spindelformet morfologi som er typisk for fibroblaster (Figur 3A,B) og forskjellig fra 4T1 tumorceller (Figur 3D). Ikke å samle svulster etter uttømming fører til at det cellulære utbyttet med tumor-assosierte fibroblastmikrober er for lave til å etablere en kultur. I andre tilfeller, når varigheten og temperaturen på inkubasjonene med mikrober ikke opprettholdes nøye, kan det oppstå noen ikke-spesifikke bindinger. I slike tilfeller var berikelsestrinnene mindre effektive og høyere prosentandeler av CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45- cellene ble gjenopprettet sammen med CD90.2+ CAF-ene (henholdsvis 5,97 ± 1,5 og 16,75 ± 1,1) (figur 4 og tabell 3). Disse forurensningscellene var sannsynligvis ansvarlige for tilstedeværelsen i kulturen av små kloner med forskjellig morfologi (Figur 4B, svarte pilspisser) som vokste raskere enn CAF-er og seiret over den primære CAF-kulturen (Figur 4C). Disse suboptimale resultatene bekreftet viktigheten av alltid å dobbeltsjekke både CD90.2- og CD45-uttrykket, samt cellemorfologi på slutten av berikelsesprosessen og under cellevekst i kulturen.
Bruk av isolerte celler for å evaluere CAF-målrettingspotensialet til konstruerte nanodrugs
De nyisolerte CAF-ene kan brukes til flere bruksområder som spenner fra grunnleggende forskning til farmakologiske studier. Denne gruppens mål er å utvikle HFn nanocages som spesifikt kan målrette CAF-er. HFn ble funksjonalisert med et spesifikt anti-FAP antistofffragment (HFn-FAP) ved to forskjellige protein:antistoffforhold (en lavere 1:1 og en høyere 1:5), og deres binding med CAFs ble testet. Ettersom FAP ble brukt som overflatebiomarkør for pro-tumorige CAF-er, var det av grunnleggende betydning å sjekke FAP-uttrykk på isolerte CAF-er (Figur 3C). FAP-uttrykket ble fulgt over 5 passasjer i kulturen for å bekrefte at den primære CAF-kulturen opprettholdt sine opprinnelige egenskaper.
FAP-funksjonalisering på HFn ble funnet å bidra til et betydelig skifte mot CAF-målretting sammenlignet med bare HFn, og den nedre mengden antistoff (1:1) var nok til å observere denne effekten (Figur 5A). Dette ble imidlertid ikke observert med tumor 4T1-cellene som brukes til å sette opp in vivo tumor-modellen, hvor bare HFn viste høyere binding enn funksjonalisert HFn (Figur 5B). Dette skyldtes mest sannsynlig fraværet av FAP-overekspression i 4T1-celler og fortrinnsvis interaksjon av HFn med TfR1, som regulerer HFn-opptak i celler, som mye rapportert av denne gruppen27,33. Disse resultatene bekrefter nytten av å bruke primære kulturer av bryst-CAFer for å foreløpig screene målrettingsevnen til nanopartikler designet for å takle tumormikromiljøet.
Figur 1: Etablering av 4T1 tumormodellen. Celler (105 celler/mus) ble injisert i fettputen hos pattedyret. Tumorvekst ble fulgt på dag 5, 10, 15, 20, 25 og 30 etter implantasjon (A) ved å måle tumorvolum med kalipere og (B) ved bioluminescensavbildning. Tumorvolumer og BLI uttrykkes som henholdsvis mm3 og teller. Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± SEM (n=6). (C) BLI representative bilder oppnådd 5, 10, 15, 20, 25 og 30 dager etter celleimplantasjon bekrefter tumorvekst til dag 25, når det ser ut til å nå et platå. Ved siste analysetidspunkt (30 dager) øker ikke BLI sammenlignet med dag 25. Fra dag 20 begynner områder med nekrose og sårdannelse å bli synlige i den sentrale delen av svulsten. Fargeskala: Min = 1 194, Maks = 20 462. Forkortelser: BLI = bioluminescensavbildning; SEM = standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tumorprøvepreparering og strømningscytometrikarakterisering av isolerte CAFer. Svulster ble utskilt og redusert til (A) små biter på ca. 1-2 mm ved hjelp av en skalpell; (B) encellet suspensjon etter vev fordøyelse og mekanisk dissosiasjon av en utskilt svulst; (C) cellepellet oppnådd etter lysis av røde blodlegemer; (D) strømning cytometri analyse av CD45 og CD90.2 uttrykk i celler oppnådd etter fjerning av røde blodlegemer og døde celler, (E) etter uttømming av ikke-kreft-assosierte fibroblaster, og (F) etter berikelse av kreft-assosierte fibroblaster, hvor de fleste celler er CD90.2+ CD45- (blå rektangel). Forkortelser: CAFs = kreft-assosierte fibroblaster; CD = differensieringsklynge; PE-A = arealet av phycoerythrin; FITC-A = områder av fluorescein isothiocyanate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfologisk analyse av CAF og FAP-uttrykk. (A, B) CAFs morfologi ble sjekket gjennom alle kulturpassasjer ved optisk mikroskopi (ulike nivåer av samløp ved passasje 2 og passasje 5) og sammenlignet med (D) 4T1 tumorceller; skalastenger = 10 μm. (C) Fibroblast aktiveringsprotein (FAP) uttrykk ble evaluert av strømningscytometri på slutten av isolasjonsprosessen på den innsamlede CD90,2+ CD45- celler for å bekrefte deres molekylære egenskaper. En fluorescensterskel ble satt på unstained kontrollceller (rød graf) for å kvantifisere gjennomsnittlig fluorescensintensitet og prosentandelen positive celler (FAP+) blant antistofffargede celler (blå graf). Forkortelser: CAFs = kreft-assosierte fibroblaster; FAP = fibroblast aktiveringsprotein; CD = differensieringsklynge; MFI = gjennomsnittlig fluorescensintensitet; Ab = antistoff; FITC-A = område av fluorescein isothiocyanate; FAP+ = FAP-positive celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på en sub-optimal CAFs isolasjonsprosess. (A) Flow cytometrievaluering etter det endelige isolasjonstrinnet avslørte tilstedeværelsen av forurensning CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45- celler. (B) Disse cellene kan sees på som kloner med liten rund morfologi ved såing (svarte pilspisser og innside i nedre venstre hjørne av panelet) som (C) seiret over CAFer etter den tredje passasjen i kulturen. Skalastenger = 10 μm. Forkortelser: CAF = kreftrelatert fibroblast; CD = differensieringsklynge; PE-A = arealet av phycoerythrin; FITC-A = områder av fluorescein isothiocyanate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Binding av HFn nanocages på CAF-er og 4T1. HFn nanocages ble fluorescerende merket med FITC, funksjonalisert med et anti-FAP antistofffragment (HFn-FAP) ved to forskjellige protein-antistoffforhold (1:1 og 1:5), og inkubert med (A) mål CAFs og (B) 4T1 celler ved 4 °C i 2 timer. Binding ble evaluert ved strømningscytometri. (A) HFn-FAP binding med CAF-er er betydelig økt ved begge antistoff fragmentkonsentrasjoner med tre ganger sammenlignet med bare HFn. (B) i kontrast, en betydelig høyere binding av bare HFn ble observert i 4T1 celler, hvor binding er ikke forbedret av FAP anerkjennelse. Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Forkortelser: CAFs = kreft-assosierte fibroblaster; FAP = fibroblast aktiveringsprotein; HFn = rekombinant variant av menneskelig ferritin tungt kjede som brukes som bar nanopartikkel eller konjugert; HFN-FAP = HFn nanopartikler funksjonalisert med den variable delen av et anti-FAP-antistoff fremstilt ved to HFn:Fab@FAP molarforhold, 1:1 og 1:5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Celletall (gjennomsnittlig ± SD) | Ekstraksjonsutbytte totalt (per passering) | |
| Utskilt svulst (Post rød blodlegeme fjerning) | 1,27 x 108 ± 9,81 x 107 | 100% |
| Utskilt svulst (Post dead cell removal) | 3,01 x 106 ± 9,61 x 105 | 2.38% |
| Cocktail etter uttømming | 1,15 x 105 ± 4,95 x 104 | 0.11% (3.82%) |
| Etterberikelse | 3,00 x 104 ± 1,2 x 104 | 0.027% (26.09%) |
Tabell 1: Totalt celleantall etter hvert trinn i isolasjon av kreftrelaterte fibroblaster.
| Cellefordeling (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Utskilt svulst (Post dead cell removal) | 1.81 ± 0,98 | 10.78 ± 4.51 | 56.57 ± 14.05 | 28.20 ± 17.57 |
| Cocktail etter uttømming | 69.33 ± 16.75 | 0,14 ± 0,13 | 0,55 ± 0,63 | 39.89 ± 30.31 |
| Etterberikelse | 93.14 ± 3.3 | 0,09 ± 0,1 | 0,09 ± 0,08 | 6.69 ± 3.4 |
Tabell 2: Cellefordeling i henhold til uttrykk for CD90.2 og CD45 etter hver passasje av isolering av kreftrelaterte fibroblaster.
| Cellefordeling (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Etterberikelse (ingen pooling) | 75.80 ± 2.9 | 1,49 ± 0,4 | 5,97 ± 1,5 | 16.75 ± 1.1 |
Tabell 3: CD90.2- og CD45-uttrykk for celler samlet inn etter et sub-optimalt kreftrelatert fibroblastisolasjonsforsøk.
Discussion
CAF-er dukker opp som nøkkelaktører i ombygging av ekstracellulær matrise, fremmer metastaseprogresjon og begrenser narkotikatilgangen til tumorstedet34. På grunn av deres heterogenitet er deres roller fortsatt kontroversielle - noen CAF-er er tumorigene, mens noen andre undertyper ser ut til å ha en tumor-undertrykkende rolle. I denne sammenhengen kan isolasjonen være av ekstrem interesse for å belyse deres mye omdiskuterte rolle i kreftprogresjon, noe som vil ha viktige kliniske implikasjoner12,31. Videre vil vellykket CAF-ekstraksjon fra menneskelige og prekliniske musesvulstmodeller også lette utviklingen av nye CAF-målrettede legemidler. Denne artikkelen rapporterer en metode for effektivt å isolere og dyrke primære CAF-er fra en preklinisk modell av brystkreft. Basert på erfaring påvirker tre eksperimentelle trinn for det meste suksessen til protokollen.
Den første jobber raskt for å unngå aggregering av cellesuspensjoner knyttet til risikoen for koagulering i kolonnen og bremse celleutløp: Faktisk, når celler som passerte gjennom kolonnen ble gruppert sammen, økte sannsynligheten for en sub-optimal isolasjonsprosess, og de endelige kulturene inneholdt "forurensning" cellekloner. Den andre er å samle celler fra forskjellige svulster etter uttømmingspassasjen for å garantere at nok celler skal passeres gjennom i det endelige berikelsestrinnet. Det endelige kritiske problemet er å plating de ekstraherte cellene ved høye celletettheter, mest sannsynlig fra en enkelt brønn av 24-brønnsplaten for å øke celleveksten og koloniutvidelsen i opptil 4-5 passasjer. Hvis cellene ble sådd ved lave tettheter, utvidet de seg på den frie overflaten og sluttet raskt å replikere.
Flere studier har allerede beskrevet CAF-ekstraksjonsmetoder av både menneskelig og mus opprinnelse, for å studere deres rolle i å fremme kreftutvikling og invasivitet. Dette har blitt gjort i mange typer svulster, inkludert brystkreft, melanom, cholangiokarsinom og bukspyttkjertel adenokarsinom35,36,37,38. På grunn av mangel på spesifikke CAF-markører og deres heterogenitet er resultatene av disse prosessene fortsatt under-optimale.
Her ble de isolerte cellene brukt til å validere CAF-målrettingsevnen til HFn nanocages funksjonalisert med anti-FAP-målrettingsmoieties. Bruken av primære kulturer av CAF-er var en betydelig fordel, slik at valideringen av nanostrategy ex vivo med et mye enklere og kostnadseffektivt bindingseksperiment enn å gjøre det direkte in vivo i denne foreløpige fasen av nanodrugoptimalisering.
I denne forstand kan ex vivo-testing på CAF-er gå foran in vivo-dyreforsøk ved å tillate screening og valg av de mest lovende nanopartiklene for optimal målretting av CAF. CAF-modellen som presenteres her kan også brukes til foreløpige effektstudier, ved lasting av nanopartikler med aktive legemidler. Dyr vil først bli brukt senere for å evaluere biodistribusjon, farmakokinetikk og effektstudier.
Flere CAF-målrettede nanodrugs utvikles, for eksempel ferritin nanocages for fotodynamisk terapi i brystkreft og peptidbaserte partikler for å levere doksorubicin i prostatakreftmodeller39,40. Imidlertid har ikke mange studier fokusert på isolering av CAF-er som celleplattformer for nanodrugoptimalisering.
Denne protokollen har noen begrensninger. For det første er det en tidkrevende protokoll som krever forberedelse og kjøp av flere reagenser og materialer. For det andre, på grunn av knappheten på CAF-er i 4T1 brystsvulsten, er utbyttet lavt. Nanopartikkelforsøk bør planlegges og utføres så snart det nødvendige cellenummeret er oppnådd, da primære CAFer gjennomgår senescence og ikke kan opprettholdes i kulturen i lang tid. Til slutt kan denne metoden for CAFs isolasjon, kultivering og karakterisering være et kraftig verktøy for å akselerere utviklingen av nye målrettede nanomedisiner i kampen mot kreft.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) under IG 2017-ID. 20172 prosjekt – P.I. Corsi Fabio. SM anerkjenner Pediatric Clinical Research Center "Romeo and Enrica Invernizzi" som støtter hennes posisjon. AB takker AIRC (ID. 20172 prosjekt) og University of Milan for stipendiatstilling. LS og MS postdoktor- og doktorgradsstipend støttes av Universitetet i Milano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
| Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
| BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
| CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
| CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
| Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
| CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
| Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
| D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
| DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
| Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
| Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
| Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
| LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
| L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
| Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
| Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
| NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
| Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
| RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at - 20 °C. |
| Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
| TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
| Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
| T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
| Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
| 1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
| 15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
| 4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
| 50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |
References
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer. Breast. 30, 92-100 (2016).
- Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer. Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).
- Hui, L., Chen, Y.
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- LeBleu, V. S., Kalluri, R. A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact. Disease Models & Mechanisms. 11, (2018).
- Li, X. -Y., Hu, S. -Q., Xiao, L. The cancer-associated fibroblasts and drug resistance. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F.
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Costa, A., et al. Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer. Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).
- Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment. Advances Drug Delivery Reviews. 99, Part B 186-196 (2016).
- Chen, Q., et al. Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).
- Truffi, M., et al. Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).
- Tong, R., Langer, R.
- Kaps, L., Schuppan, D. Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers. Cells. 9 (9), 2027 (2020).
- Miao, L., et al. Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors. Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).
- Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).
- Falvo, E., et al. Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin. Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).
- Truffi, M., et al. Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer. Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).
- Cai, Y., et al. Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size. International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).
- Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R.
- Mazzucchelli, S., et al. Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity. Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).
- Yu, Q., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy. Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).
- Mertens, J. C., et al. Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma. Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).
- Kovács, D., et al. Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts. Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).
- Sitia, L., et al. Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax. Cells. 10 (2), 328 (2021).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells. Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).
- Dvořánková, B., Lacina, L., Smetana, K. Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research. Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).
- Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages. Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).
- Sha, M., et al. Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Zhen, Z., et al. Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control. Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).
- Ji, T., et al. Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery. Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).
