Summary
Het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) is een robuust platform voor expressiescreening en productie van eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) voor biochemische, biofysische en structurele studies. Milligram hoeveelheden materiaal kunnen worden geproduceerd voor de meerderheid van PRMT's en andere eiwitten van belang die een eukaryotische expressie platform vereisen.
Abstract
Eiwit arginine methyltransferases (PRMTs) methylaat arginine residuen op een breed scala van eiwitten die een rol spelen in tal van cellulaire processen. PRMT's kunnen mono- of dimethylaat arginine guanidino groepen symmetrisch of asymmetrisch. De enzymologie van deze eiwitten is een complex en intensief onderzocht gebied dat milligramhoeveelheden recombinant eiwit van hoge kwaliteit vereist. Het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) met behulp van Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) en Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insectencellen is gebruikt voor expressie screening en productie van vele PRMT's, waaronder PRMT 1, 2 en 4 tot en met 9. Om tegelijkertijd te screenen op de expressie van meerdere constructies van deze eiwitten, waaronder domeinen en afgeknotte fragmenten, evenals de volledige eiwitten, hebben we schaalbare methoden toegepast met behulp van instelbare en programmeerbare meerkanaals pipetten, gecombineerd met 24- en 96-put platen en blokken. Over het algemeen maakten deze methodeaanpassingen een grootschalige generatie bacmide-DNA, recombinante virussen en eiwitexpressiescreening mogelijk. Het gebruik van kweekvaten met een hoog vulvolume van Sf9-celsuspensie hielp om ruimtebeperkingen in de productiepijplijn te overwinnen voor grootschalige eiwitproductie in één batch. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor de efficiënte en kosteneffectieve expressie van functionele PRST's voor biochemische, biofysische en structurele studies.
Introduction
Eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) methylaat arginine residuen in een monomethyl of symmetrisch/asymmetrisch dimethyl mode. De repetitieve RG/RGG/GRG-sequenties hebben bij de meeste PRMT 's de voorkeur en zijn te vinden in een grote verscheidenheid aan eiwitten1,2. Arginine gemethyleerde eiwitten zoals histonen of transcriptiefactoren en splicingfactoren reguleren transcriptie, splicing en chromatinestructuur3,4. Toenemende kennis van diverse regulatie van substraat- en cofactorgebruik, omzet en kinetiek van PRMT's, evenals de generatie van selectieve remmers, hebben mechanistisch licht geworpen op deze enzymen en hun complexen5,6. Niet alle PRMT-familieleden worden echter in dezelfde mate bestudeerd; PRMT9 werd bijvoorbeeld pas onlangs ontdekt als lid van de PRMT-familie1. Structuur- en enzymfunctiestudies voor deze eiwitten vereisen voldoende, vaak milligram, hoeveelheden recombinant eiwit om beschikbaar te zijn.
Het Escherichia coli (E. coli) prokaryotische expressiesysteem is meestal de eerste keuze voor expressiescreening met behulp van meerdere constructies voor een bepaald eiwit7,8,9. E.coli-gebaseerde expressie resulteert echter niet altijd in voldoende hoeveelheden PRMT-eiwitten in hun actieve vormen, zoals we met name hebben opgemerkt voor PRMT5 en PRMT7 (zie hieronder). Prst's die zich niet in E. coli uitdrukken of door de eukaryotische expressiemachines moesten worden geproduceerd, werden dus onderverdeeld in vectoren die geschikt waren voor de expressiescreening in het alternatieve baculovirusexpressievectorsysteem (BEVS). Terwijl E. coli-uitgedrukte monsters van PRMT1, PRMT3 en PRMT8 uitgebreid zijn gebruikt voor in vitro assays en kristallografie, vereisen andere PRMT's zoals PRMT5, waarvoor MEP50-bindende partner van zijn dual methyltransferase-domein vereist is, en PRMT's zoals PRMT7 en 9, insectencelexpressie om voldoende hoeveelheden actief eiwit te verkrijgen. Over het algemeen hebben de gestandaardiseerde methyltransferase-assays met gemiddelde doorvoer voor PRMT4, 5, 6, 7 en 9 de BEVS gebruikt in insectencellen6. Het baculovirusexpressievectorsysteem (BEVS) is een veelzijdig platform voor de productie van recombinante eiwitten die de eukaryotische expressiemachines vereisen die post-translationele modificaties mogelijk maken die essentieel zijn voor biochemische, biofysische en structurele studies10,11,12. Verschillende BEVS'en zijn commercieel beschikbaar gekomen sinds het eerste gemelde gebruik van baculovirussen in 1983 voor eiwitexpressie13. De meeste van deze protocollen gebruiken verschillende strategieën voor de overdracht van de expressie plasmide in insectencellen. Deze omvatten Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, enz. Ons protocol is gebaseerd op het meest gebruikte systeem in BEVS, het Bac-to-Bac-systeem14, dat is ontworpen om het gen /cDNA dat codeert voor het eiwit van belang (POI, hier de PRST's) over te brengen naar het baculovirusgenoom dat wordt gehandhaafd in een gespecialiseerde stam van E. coli via sitespecifieke omzetting15.
Kortom, de plasmide transfervector met het gen van belang werd omgezet in DH10Bac E. coli competente cellen om recombinant virale bacmid DNA te genereren. Aanhangend Sf9 cellen werden vervolgens getransfecteerd met bacmid DNA. Vier tot vijf dagen na transfectie werden de eerste recombinante baculovirussen die in het celkweekmedium werden uitgescheiden, teruggevonden en gelabeld als het P1-virus. De P1-baculovirusvoorraden werden vervolgens gebruikt voor virusversterking (d.w.z. generatie van P2-baculovirusvoorraden) en eiwitexpressiescreening. Op basis van de resultaten van de expressiescreening werden P2-virussen voor de beste expressieconstructie van het eiwit geïdentificeerd en gebruikt om suspensieculturen van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen (SCBIIS) te genereren voor de grootschalige eiwitproductie. Hier beschrijven we onze gedetailleerde protocollen en beschrijven we de beweegredenen achter onze reagens- en kweekvatkeuzes ter ondersteuning van onze strategie om een meer tijdsefficiënte, kostenefficiënte en schaalbare methodologie te ontwikkelen om voldoende hoeveelheden gewenste recombinante eiwitten te verkrijgen.
Protocol
OPMERKING: Het overzicht van de bevs-protocolstappen wordt beschreven in figuur 1.
1. Generatie van een recombinant bacmide DNA
- Voorbereiding van LB agar selectieve platen voor DH10Bac transformatie
- Bereid LB-agarplaten voor die: 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine, 10 μg/ml tetracycline, 200 μg/ml Bluo-gal en 40 μg/ml IPTG bevatten om te selecteren voor DH10Bac-transformatiemiddelen.
- Weeg 25 g voorgemengde LB bouillon en 13 g Bacto Agar en doe in een kolf van 2 L. Breng het volume op 1 L met gedestilleerd water en autoclaaf gedurende 15-30 minuten bij 121 °C.
- Zet een waterbad op 50 °C en koel de autoclaaf agar oplossing in het waterbad gedurende 40-60 minuten totdat het is afgekoeld tot 50-55 °C.
- Voeg aan de gekoelde oplossing gentamicine toe aan een eindconcentratie van 7 μg/ml, kanamycine aan een eindconcentratie van 50 μg/ml, tetracycline aan een eindconcentratie van 10 μg/ml, Bluo-gal aan een eindconcentratie van 200 μg/ml en IPTG aan een eindconcentratie van 40 μg/ml.
- Meng de agar-oplossing en aliquot 7-10 ml van het medium tot elke plaat van 60 mm met behulp van een pipet van 50 ml. Laat de platen op kamertemperatuur (2 uur) zitten om uit te harden. Omkeren, wikkelen en bewaren bij 4 °C. Platen met antibiotica zijn tot 4 weken stabiel.
- Transformatie van de plasmide in DH10Bac E. coli competente cellen
- Bereken het vereiste volume competente cellen.
- Ontdooi competente cellen op ijs, draai zachtjes naar beneden en resuspend terug door zachtjes te tikken.
- Gebruik een 12-kanaals pipet om 4 μL van de cellen in elke put van de 96-put PCR-plaat te doseren.
- Voeg ~ 0,3-0,5 μg recombinant plasmide-DNA toe aan de competente cellen en meng voorzichtig door te tikken. Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten op ijs.
- Schok het mengsel in een PCR-machine bij 42 °C gedurende 45 s. Koel op ijs gedurende 2 minuten.
- Verdeel 0,5 ml SOC-medium over elke put van de blokken met 96 putten (96-diepe put 2,4 ml).
- Gebruik een 12-kanaals pipet om de getransformeerde bacteriële suspensie over te brengen in de overeenkomstige put van het blok en bedek deze met een luchtporeplaat.
- Plaats het blok in een schudincubator op 37 °C met middelmatige agitatie (205 tpm) gedurende 4-5 uur.
- Verdeel 30-50 μL van de cultuur gelijkmatig over het oppervlak van de LB-agarplaat met steriele glasparels. Bewaar de rest van de cultuur bij 4 °C.
- Incubeer de platen bij 37 °C totdat de kleur van de blauw/witte kolonies waarneembaar is (40-48 uur). Gooi de cultuur weg wanneer er voldoende witte, grote kolonies op de plaat worden verkregen.
- Om ervoor te zorgen dat witte kolonies alleen recombinant bacmid DNA bevatten, moet één geïsoleerde witte kolonie opnieuw op verse LB-agarplaten met antibiotica, bluo-gal en IPTG worden gestreeld om het fenotype te verifiëren.
- Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C.
- Kies een geverifieerde witte kolonie uit een opnieuw gestreepte plaat voor de extractie van recombinant bacmid DNA.
- Isoleren van recombinant bacmide DNA
- Ent een enkele, geïsoleerde witte kolonie in 3 ml LB medium aangevuld met 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine en 10 μg/ml tetracycline in 24-putblokken (24-putblokken rond de bodem) en dek af met een luchtporevel.
- Groei 's nachts bij 37 °C met schudden bij 250 tpm.
- Centrifugeer de 24-putblokken gedurende 10 minuten op 2.100 x g. Decanteer het supernatant, keer het blok om en tik zachtjes op een absorberend tissuepapier. Voeg 250 μL oplossing 1 (celreanipatieoplossing) toe aan elke put.
- Sluit de blokken af met tapepads of andere afdichtingsfolies en plaats ze gedurende 5-10 minuten op een schudplatform bij 75 tpm. Controleer elke put om een goede cellysis te garanderen en resuspend indien nodig, met behulp van een tip van 1 ml.
- Voeg 250 μL oplossing 2 (cellysisoplossing) toe aan elke put, sluit de blokken af en plaats ze gedurende 30 s op een schudplatform bij 75 tpm (om kruisbesmetting van de monsters te voorkomen, 24-putblokken niet omkeren) gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 250 μL oplossing 3 (neutralisatieoplossing) toe, sluit de blokken af en plaats deze gedurende 30 s op het schudplatform bij 75 tpm. Een dikke witte neerslag van eiwit en E. coli genomisch DNA zal zich vormen. Leg het monster 10-15 minuten op ijs.
- Centrifugeer gedurende 60 min bij 2.100 x g bij 4 °C om het witte neerslagmateriaal stevig te pelleteren. Label tijdens het centrifugeren een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 0,8 ml absoluut isopropanol toe.
- Breng het supernatant voorzichtig over op de buis met isopropanol, vermijd wit neerslagmateriaal. Meng door de buis een paar keer voorzichtig om te keren en plaats vervolgens 5 tot 10 minuten op ijs. In dit stadium kan het monster 's nachts bij -20 °C worden bewaard.
- Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 14.000 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 0,5 ml 70% ethanol toe aan elke buis. Keer de buis meerdere keren om om de pellet te wassen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. (Optioneel: herhaal wassen)
- Breng monsters in de laminaire stromingskap om de steriliteit van het plasmidepreparaat te garanderen en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant.
OPMERKING: De pellet kan losraken van de bodem van de buis, dus let goed op de pellet bij het weggooien van het supernatant. - Droog de pellet 15 - 20 minuten aan de lucht in de laminaire stromingskap en los het DNA op in 50 μL gefilterde elutiebuffer, 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (zorg ervoor dat pellets niet te droog zijn).
- Aangezien recombinant bacmid DNA groter is dan 135 kb, om afschuiven van DNA te voorkomen, lost u de pellet op door zachtjes te tikken.
- Om de aanwezigheid van het gen van belang in bacmid DNA te verifiëren, stelt u de PCR-reactiemix in een 96-put PCR-plaat in.
- Bereid het PCR-mengsel als volgt voor: 1 μL buffer, 0,2 μL (elk 10 mM) dNTPs, 0,1 μL Taq DNA-polymerase, 0,1 μL (25 μM) voorwaartse en omgekeerde primers (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL bacmide DNA en 8 μL water.
- Voer versterking van de doelgenen uit met initiële denaturatie gedurende 2 minuten bij 95 °C, gevolgd door 25 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 55 °C voor 30 s en 72 °C gedurende 1 min/kb.
- Beëindig de reactie na een laatste verlenging gedurende 7 min bij 72 °C.
- Analyseer 10 μL van het versterkingsproduct op 1% (m/v) agarosegel die nucleïnezuurkleuringsoplossing door elektroforese bevat.
- Bewaar de geverifieerde bacmid DNAs bij 4 °C.
2. Generatie van recombinante baculovirusvoorraden
OPMERKING: Gebruik exponentieel groeiende Sf9-cellen met een levensvatbaarheid van 95% of meer voor elke stap van het baculovirusexpressieprotocol, inclusief celtransfectie voor baculovirusgeneratie, baculovirusvolumeversterking, eiwitexpressiescreening en eiwitproductie.
- Transfectie van Sf9-cellen met Bacmid DNA en transfectiereagentia (T.R.) zoals JetPrime of X-tremeGENE 9.
OPMERKING: Trypan Blue-kleuring en een hemocytometer kunnen worden gebruikt om levensvatbare celtellingen en % cel levensvatbaarheid te bepalen. Niet-levensvatbare cellen nemen de vlek op en lijken blauw onder de microscoop, terwijl levensvatbare cellen niet worden aangetast. Om de levensvatbaarheid van de cel te berekenen, wordt een totaal aantal cellen verkregen (niet-besmet en gekleurd) en wordt het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen en vermenigvuldigd met 100.- Verdun de exponentieel groeiende Sf9-cellen tot een uiteindelijke celdichtheid van 4 x 105 cellen/ml in serumvrije insectenmedia en giet in het steriele reagensreservoir.
- Gebruik een programmeerbare meerkanaals pipet om 0,5 ml van de verdunde Sf9-cellen in elke put van een 24-putplaat te zaaien.
- Label een put van de plaat als een controle (niet-getransfecteerd) en gebruik het als een controle om de getransfecteerde en niet-getransfecteerde cellen te vergelijken om te beoordelen op mogelijke tekenen van infecties.
- Nadat u de cellen in de platen hebt gezaaid, schommelt u de platen voorzichtig meerdere keren heen en weer om een gelijkmatige monolaag van cellen te garanderen. Draai de platen niet omdat de cellen in het midden van de put clusteren.
- Incubeer de platen ten minste 1 uur bij 27 °C om celbevestiging aan de kweekplaten mogelijk te maken.
- Meng de transfectie reagens flacon goed door elkaar. Voeg voor elke transfectie 2 μL van het transfectiereagens toe aan 100 μL van de transfectiebuffer. Elk ander niet-aangevuld insectenmedium kan ook worden gebruikt. Deponeer het verdunde transfectiereagens in een steriel reagensreservoir en meng het voorzichtig gedurende 10 s.
- Breng met behulp van een 12-kanaals pipet 102 μL van het verdunde transfectiereagens over in een steriele 96-microwellplaat.
- Breng 10 μL van een 0,2 μg/μL-oplossing van recombinant bacmide-DNA over in de overeenkomstige put van een 96-wells microwell-plaat en meng door de plaat voorzichtig van de zijkanten te schudden (tikken).
- Incubeer het transfectiemengsel gedurende 15-20 minuten om complexe vorming mogelijk te maken.
- Voeg met behulp van een verstelbare 6-kanaals pipet die is ontworpen voor overdracht tussen 96- en 24-putplaten, de transfectiemix toe aan de cellen dropwise in overeenkomstige putten van transfectieplaten en incubeer gedurende 4-5 uur bij 27 °C.
- Schommel de platen tijdens de incubatietijd voorzichtig meerdere keren heen en weer om de gelijkmatige verdeling van het transfectiemengsel over de celmonolaag te garanderen.
- Voeg 4-5 uur na transfectie 1,5 ml insectenserumvrij medium toe, aangevuld met 10% (v/v) finale van warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en antibioticum-antimycoticum tot 1% (v/v) eindvolume (100 eenheden/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 0,25 μg/ml ampère).
- Incubeer de cellen in een incubator van 27 °C gedurende 72-96 uur. Schommel indien mogelijk één keer per dag voorzichtig met de transfectieplaten.
- Zoek naar tekenen van infectie (SOI), duidelijk in getransfecteerde cellen bij 72-96 uur posttransfectie (Figuur 2). Houd er rekening mee dat de getransfecteerde cellen het virus gaan produceren en de cultuur verder infecteren; zoek dus naar de tekenen van infectie.
OPMERKING: Tekenen van infectie zijn structurele veranderingen in de insectencellen, zoals een toename van 25-50% in de celdiameter, vergrote celkernen, gelijkmatig afgeronde vorm, verlies van proliferatie en aanhechting aan het oppervlak van de kweekschaal, evenals een afname van de levensvatbaarheid van de cel (Figuur 2. Baculovirus Geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde Sf9-cellen).
3. Kleinschalige eiwitexpressiescreening en virusversterking
- Infectie van Sf9-cellen met P1 baculovirusvoorraden.
OPMERKING: 4-5 dagen na transfectie moeten tekenen van infectie zichtbaar zijn in de getransfecteerde cellen in vergelijking met de controlecellen (niet-overgetransfecteerde) cellen onder een omgekeerde microscoop. De eerste recombinante baculovirussen die in het celkweekmedium worden uitgescheiden, moeten klaar zijn om te verzamelen.- Zaad 2 x 105 exponentieel groeiende Sf9-cellen in serumvrije insectenmedia in elke put van de 24-putplaten in een totaal volume van 2 ml voor infectie met P1-virussen om het virusvolume te versterken (resulterend in de generatie van de P2-virussen).
- Nadat u de cellen in de platen hebt gepijpt, wiegt u de platen voorzichtig met heen en weer om een gelijkmatige monolaag te garanderen. Draai de platen niet omdat de cellen in het midden van de put clusteren.
- Incubeer de platen ten minste 1 uur op 27 °C om cellulaire hechting aan de plaat mogelijk te maken.
- Doseer 4 ml Sf9-cellen met een dichtheid van 3,5-4 x 106 in insectenserumvrij medium in elke put van 24-putblokken om te infecteren met P1-virussen voor de eiwitexpressiescreening.
OPMERKING: Label een put van de 24-put platen en 24-well blokken als controle en gebruik als een niet-geïnfecteerde controle voor vergelijking van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen bij het zoeken naar SOI. - Gebruik een programmeerbaar elektronisch meerkanaalskanaals om gelijktijdige verzameling van P1-virussen (stap 2.1.13), infectie van vers gezaaide Sf9-cellen (stap 3.1.1) en infectie van de suspensiecellen in de 24-putblokken (stap 3.1.4) met 150 μL P1-virussen mogelijk te maken.
- Draai de rest van de verzamelde P1 virale voorraden gedurende 15 minuten bij 17.970 x g,breng ze over in microcentrifugebuizen en bewaar ze in het donker bij 4 °C.
- Schommel de 24-putplaten (stap 3.1.1) voorzichtig op een zuigerschudder om een gelijkmatige verdeling van de toegevoegde P1-virussen over de celmonolaag te garanderen; herhaal dit een paar keer tijdens de incubatietijd.
- Bedek de 24-putblokken met de suspensiecultuur van geïnfecteerde Sf9-cellen (stap 3.1.4) met een luchtporiënvel.
- Incubeer de 24-putblokken bij 27 °C en schud bij 245 tpm gedurende 72-96 uur.
- Zoek naar SOI binnen 72-96 uur na infectietijd in de 24-putplaten met P2-virussen (stap 3.1.1) en in de 24-putblokken (stap 3.1.4) met geïnfecteerde cellen voor de expressiescreening.
OPMERKING: 4-5 dagen na infectie van Sf9-cellen met P1-virussen moet SOI duidelijk zijn in de geïnfecteerde cellen in vergelijking met de niet-geïnfecteerde controlecellen onder een omgekeerde microscoop. - Verzamel P2-virussen uit 24-putplaten, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 17.970 x g,breng ze over in microcentrifugebuizen en bewaar ze in het donker bij 4 °C.
- Spray na infectie na 72-96 uur over de 24-putblokken met 70% ethanol, breng in de laminaire stroomkap en controleer de celdichtheid en levensvatbaarheid in een paar putten door Trypan Blue-kleuring.
- Ga verder met eiwitzuivering als cellen tekenen van infectie hebben en de levensvatbaarheid bijna 70-75% is, zoals beoordeeld door Trypan Blue-kleuring.
- Pellet de cellen door de 24-putblokken gedurende 15 minuten bij 525 x g bij 4 °C te centrifugeren. Gooi het supernatant weg en strek de pellets grondig op in 1 ml lysisbuffer bestaande uit 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5% glycerol (v/v) en 1x proteaseremmercocktail (100x proteaseremmercocktail bestaat uit aprotinine 0,25 mg/ mL E-64 0,25 mg/ml).
- Bewaar de celsuspensie bij -80 °C voor de daaropvolgende testzuivering (zie 3.2.2).
- Eiwitzuivering uit bevroren celsuspensie in 24-put testexpressieblokken.
- Montage van het bindblok (figuur 3).
- Plaats 3 overlappende lagen parafilm op de bovenkant van het 96-diepe putblok (96-diepe put 2,4 ml).
- Plaats een 96-put filterplaat (filter microplaat, 96-well, polypropyleen met 25 μm ultra hoog moleculair gewicht polyethyleen membraan) op de bovenkant van het 96-diepe putblok.
- Duw de filterplaat naar beneden om de uiteinden in de parafilm te zetten om de filterplaat van het 96-put diepe blok af te sluiten.
- Breng 50 μL voorgequilibreerde 50% Ni-NTA harsmest over in elke put van de filterplaat.
- Testexpressieprocedure
- Plaats de bevroren celophanging (stap 3.1.15) aanwezig in 24-putblokken in een waterbad bij RT gedurende 5-10 minuten en schud vervolgens bij 450 tpm gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer de 24-putblokken gedurende 15 minuten op 3.275 x g.
- Breng met behulp van een meerkanaals pipet de ontruimde lysaten over in een filterplaat met 50 μL voorgequilibreerde 50% Ni-NTA harsmest (stap 3.2.1.4) en sluit de filterplaat af met een 96-put dopmat (96-put dopmat, voor gebruik met vierkante put, 2 ml).
OPMERKING: Gebruik een paar elastiekjes om het bindblok bij elkaar te houden tijdens incubatie- en centrifugeerstappen. - Plaats het beveiligde bindblok gedurende 45-60 minuten in een rotator in een koude ruimte om ontruimde lysaten met Ni-NTA-hars te incuberen.
- Til na incubatie de filterplaat voorzichtig op en verwijder de parafilmlaag van het oppervlak van het 96-diepe putblok (stap 3.2.1.1).
- Plaats de filterplaat terug op het 96-diepe putblok en draai het beveiligde bindblok 2 min naar beneden bij 235 x g.
- Was bond Ni-NTA hars 2x met 2 ml wasbuffer bestaande uit 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glycerol en 15 mM imidazol.
- Draai het blok elke keer gedurende 5 minuten met wasbuffer op 235 x g om volledige verwijdering van restvloeistof te garanderen.
- Breng de filterplaat over op de bovenkant van de 96-put PCR-plaat met 10 μL 4x laadkleurstof.
- Voeg 40 μL elutiebuffer (25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) toe aan elke put van de filterplaat en incubeer gedurende 5 minuten.
- Draai het blok om eiwitten in de 96-well PCR-plaat te elute op 235 x g gedurende 10 minuten.
- Sluit de 96-put PCR plaat af met een hoge temperatuur bestendig tappad en verwarm bij 98 °C gedurende 3 min.
- Laad 15 μL geëuteerde eiwitmonsters in de standaard Laemmli-buffer op 4-20% SDS-PAGE-gel naast de eiwitladder en voer de gel uit met een standaard lopende buffer die SDS bevat.
- Beits de gel met Coomassie blauw en de-stain met water. Analyseer de resultaten van testexpressie om de beste expressieconstructies voor grootschalige productie te identificeren.
- Montage van het bindblok (figuur 3).
4. Preparaten van de met baculovirus geïnfecteerde insectencellen (SCBIIC) voor eiwitproductie
- Splits 4 dagen voor de geplande productietijd exponentieel groeiende Sf9-cellen tot een uiteindelijke celdichtheid van 2 x10 6 cellen/ml in 125 ml / 250 ml / 500 ml Erlenmeyer glazen shakekolven met schotten in 50 ml / 100 ml / 200 ml insectserumvrij medium met 1% (v/v) definitief antibioticum-antimycoticum.
- Voeg 0,150 ml / 0,300 ml / 0,6 ml geschikte P2-virussen toe, incubeer geïnfecteerde cellen bij 165 tpm op een orbitale shaker met een slag van één inch en bij een lagere temperatuur van 25 °C om de celdeling te vertragen.
- Controleer na 4 dagen na infectie cellen onder een microscoop op SOI en ga verder met de productie als de levensvatbaarheid van de cel zoals geverifieerd met Trypan Blue-vlek bijna 70-75% is.
5. Sf9-celpreparaten voor grootschalige eiwitproductie
- Bereken 4 dagen voor de geplande productietijd het vereiste volume Sf9-cellen voor grootschalige eiwitproductie.
- Zaad 2 L van exponentieel groeiende Sf9-cellen in Insect Serum-Free Medium tot een celdichtheid van 1 x 106 cellen /ml in 2,8 L Fernbach shakekolven.
- Incubeer kolven bij 27 °C met schudset bij 150 tpm.
OPMERKING: Om bacteriële besmetting in de Sf9-celcultuur te voorkomen, gebruikt u gentamicine tot een eindconcentratie van respectievelijk 10 μg/ml of penicilline/streptomycine tot respectievelijk 50 U/ml en 50 μg/ml.
6. Infectie van de Sf9-cellen met SCBIIS voor de grootschalige eiwitproductie
- Splits 2 L of 4 L exponentieel groeiende Sf9-cellen in Insect Serum-Free Medium tot een uiteindelijke celdichtheid van 4 x 106 cellen/ml in 2,5 L Tunair shakekolven of 5 L reagensflessen.
- Voeg 10-12 ml/l van de met baculovirus geïnfecteerde suspensiecultuur (SCBIIC) toe.
- Incubeer de geïnfecteerde cultuur van Sf9-cellen op een shaker met 145 tpm bij de lagere temperatuur van 25 °C (om de celdeling te vertragen) gedurende 72-96 uur.
- Controleer na 72 uur na infectie de cellen onder een microscoop op SOI en beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen.
- Meestal daalt de levensvatbaarheid van Sf9-cellen na ongeveer 72 uur na infectie tot 70%-75% (gemeten met trypanblauwe vlek). Oogst geïnfecteerde Sf9-cellen in een polypropyleenfles van 1 L door centrifugeren bij 900 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Resuspendeer de celkorrel verzameld uit 1 L van de productiecelcultuur met 20-25 ml 1x PBS door zachtjes te wervelen en over te brengen in 50 ml conische buizen.
- Draai de celsuspensie gedurende 15 minuten op 900 x g en gooi de PBS-oplossing weg.
- Resuspendeer de gewassen celkorrel met 20-25 ml van de suspensiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 1x proteaseremmercocktail) en vlamvries in vloeibare stikstof; bewaren bij −80 °C tot zuivering.
OPMERKING: Zuiveringsprocedures voor de PRMT's zijn in detail beschreven in het door sgc gepubliceerde document6.
Representative Results
Een overzicht van het BEVS-protocol is beschreven in figuur 1. Meerdere expressieconstructies van PRST's, waaronder full-length, domeinen en afgekapte fragmenten, werden gegenereerd in het Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) volgens interne strategieën met een poging om het slagingspercentage te verhogen voor het identificeren van oplosbare en stabiele eiwitten met een relatief hoog expressieniveau7,9. Geïnteresseerde lezers worden aangemoedigd om de definities en methodologie van de SGC te herzien om een "fragment" te ontwerpen als het segment van de gensequentie dat is opgenomen in een expressiekloon, "domein" als een pfam-geannoteerd structureel domein en "construct" als het fragment gekloond in een expressievector, die allemaal in detail zijn beschreven in een eerdere publicatie7. Expressieconstructies van PRMT's die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn voor de productie van de polyhistidine-gelabelde eiwitten gekloond in de pFBOH-MHL-vector, een afgeleide van de pFastBac1-vector. In figuur 4presenteren we SDS-PAGE-analyse van de met zijn gelabelde oplosbare constructies van PRMT1, 2, 4-9 gezuiverd uit pellets verzameld na 4 ml productie in Sf9-cellen (stap 3.1.4). Full-length (FL) PRMT1 en PRMT9 worden niet gepresenteerd in deze gel, aangezien FL PRMT1 is geproduceerd uit E. coli, en FL PRMT9 geproduceerd door BEVS is gezuiverd door Flag-tag6. De afgeknotte constructies van PRMT1, FL PRMT4 en alle PRMT8-constructies vertonen een relatief hoge opbrengst, maar eiwiteluaten bevatten fracties van co-gezuiverde verontreinigingen. Deze constructies vereisen verdere optimalisatie van de zuiveringsprotocollen. Er zijn dus aanvullende benaderingen nodig om de zuiverheid van deze eiwitten uit opschakproducties te verbeteren, zoals een vermindering van de hoeveelheid nikkelparels in het stadium van de incubatie met een verduidelijkt lysaat; een verhoging van de imidazolconcentraties in de wasbuffers; decolleté van de His-tag met TEV protease, gevolgd door toepassing op een Ni-affiniteitshars; en aanvullende zuiveringsstappen zoals grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie. De constructies van PRMT2 vertonen een aanzienlijk lagere opbrengst in vergelijking met andere eiwitten en full-length PRMT2-eiwitten, vergezeld van een sterke verontreinigingsband. Scale-up productie en twee stappen van zuiveringen zoals IMAC en grootte-uitsluiting bevestigden een laag expressieniveau voor deze constructie, samen met de aanhoudende aanwezigheid van de co-zuiverende verontreiniging voor het FL-eiwit. Pure eiwitten zijn verkregen voor het PRMT5-complex dat is geproduceerd en gezuiverd met zijn obligate bindende partner, MEP50. De afgeknotte constructie van PRMT9 heeft bijna twee of drie keer lager expressieniveau, dicht bij 1,5 mg/L, in vergelijking met andere PRMT's. Niettemin zijn de recombinante virale voorraden van deze constructie gebruikt voor de opschalproductie, werden diffracerende kristallen verkregen en werd de structuur voor dit eiwit opgelost, samen met PRMT4, 6 en 7 (figuur 5).
Voor de opschafproducties werden de overeenkomstige P2-virussen gebruikt om de suspensiecultuur van Sf9-insectencellen te infecteren. Deze stap genereert 50/100/200 ml met baculovirus geïnfecteerde cellen die geïnfecteerde cellen en P3-virussen in het supernatant bevatten. Voor de grootschalige eiwitproductie werden 2 L Sf9-cellen gekweekt in elk van de 2,8 L Fernbach-schudkolven bij 150 tpm, 27 °C (figuur 6). Op de dag van productie > 2 L Sf9-cellen (levensvatbaarheid van cellen 97%) in 2,5 L Tunair shakekolven of 4 L in 5 L reagensflessen werden verdund tot een celdichtheid van 4 x 106/ml. Deze cellen werden rechtstreeks geïnfecteerd met 10-12 ml/l suspensiekweek van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen en geïncubeerd bij een verlaagde temperatuur van 25 °C bij 145 tpm. Infectie van de productiebatch rechtstreeks met een suspensiecultuur van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen verminderde aanzienlijk moeizame en tijdrovende stappen in de versterking van het virusvolume, met uitzondering van de extra behandeling van de geïnfecteerde cellen, en voorkwam vermindering van titer- en virusdegradatie. Het onderhoud en de opschafproductie van SF9-celkweek zijn uitgevoerd in de kweekvaten met een hoog vulvolume om een grootschalige eiwitproductie in één batch aan te nemen (figuur 6).
Full-length PRMT 4, 5 (in complex met MEP50), 6, 7, en 9 eiwitten geproduceerd uit het Baculovirus gemedieerde productieplatform zijn gebruikt voor kinetische karakterisering en remmer compound screening op de SGC6. Kristalstructuren werden opgelost en afgezet in de Protein Data Bank (PDB) voor de volledige of afgeknotte vormen van de eiwitten PRMT 4, 6, 7 en 9 met verschillende chemische sondes en remmers. Expressieplasmiden voor deze PRST's werden gedeponeerd in de Addgene plasmid repository (Addgene is een distributiepartner van de SGC, https://www.addgene.org/) en zijn beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap (Figuur 5).
Figuur 1: Schematisch overzicht van de stappen van het baculovirus expressieproces Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Baculovirus Geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde Sf9-cellen. Tekenen van infectie zijn structurele veranderingen in de insectencellen, zoals een toename van 25-50% in de celdiameter, vergrote celkernen, gelijkmatig afgeronde vorm, verlies van proliferatie en aanhankelijkheid aan het oppervlak van de kweekschaal, evenals een afname van de levensvatbaarheid van de cel. Witte schaalbalk 200 μm. De hier gepresenteerde tekenen van infectie zijn hetzelfde voor de getransfecteerde cellen met behulp van zowel transfectiereagentia, JetPrime en X-tremeGene 9. Het getoonde voorbeeld is voor het JetPrime transfectie reagens. (A) Niet-geïnfecteerde Sf9-cellen als besturingselement. (B) Met baculovirus geïnfecteerde Sf9-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Bindplaatassemblage voor snelle zuivering van testexpressie-eiwitten. Zie tekst voor meer informatie, stappen 3.2.1-2 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Resultaten van de screening van eiwitexpressie. Eiwitexpressiescreeningsresultaten van de baculovirusgemedieerde eiwitproductie in 4 ml Sf9-suspensiecultuur die is geïnfecteerd met overeenkomstige P1-recombinante virussen voor verschillende PRMT's en het PRMT5-MEP50-complex. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Samenvatting van expressieconstructies voor PRMT4, 6, 7 en 9 gebruikt voor kristalstructuurstudies bij het Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). De kristalstructuren werden opgelost en afgezet in de Protein Data Bank (PDB) voor de volledige lengte of afgeknotte vormen van eiwitten PRMT 4, 6, 7 en 9 met verschillende chemische sondes en remmers. Expressieplasmiden voor deze PRCT's werden gedeponeerd in de Addgene plasmid repository en zijn beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap (Addgene is een distributiepartner van de SGC, https://www.addgene.org/). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Sf9 insectencelonderhoud en eiwitproductie in de verschillende kweekvaten: (A) 2,8 L Fernbach kolf voor celonderhoud en eiwitproductie. Het gebruik van het vulvolume van 72% verhoogt de doorvoersnelheid met 2,5 keer in één schudplatform. (B) Tunair shakekolven (slechts 9 van de 10 kolven zijn op deze foto weergegeven) en reagensflessen met een vulvolume van 80% verhogen de productiecapaciteit van het schudplatform drastisch. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Een van de voordelen van BEVS in insectencellen is het vermogen van de post-translationele modificatiemachines om complexere modificaties zoals fosforylering, myristoylatie en glycosylatie mogelijk te maken. Samen met het zeer efficiënt vouwen van zoogdiereiwitten vergemakkelijken deze modificaties grote hoeveelheden gemodificeerd en gevouwen eiwit dat geschikt is voor fysiologisch relevante downstreamexperimenten16.
Hier beschreven we gedetailleerde protocollen van de BEVS met de nadruk op kritische elementen voor succesvolle expressiescreening van meerdere constructies van PRMT-eiwitten en grootschalige PRMT-eiwitproductie in het Baculovirus-expressieplatform: 1) Het gebruik van regelmatige, aanpasbare en programmeerbare meerkanaalspipetten om de biologische materialen over te brengen tussen 24- en 96 - putcelkweekplaten en -blokken in de stadia van bacmide-DNA- en virusgeneratie; een verzameling van de recombinante virussen, versterking van virale volumes van de recombinante virussen en voorbereiding van de screeningsblokken voor eiwitexpressie. 2) Hoge prestaties en kosteneffectieve transfectiereagentia voor de generatie van recombinante virussen. 3) Suspensiecultuur van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen (SCBIIC) voor grootschalige eiwitproductie. 4) Gebruik van hooggevulde 2,8 L Fernbach shakekolven om de Sf9-suspensiecultuur te behouden en 2,5 L Tunair-shakekolven en 5 L reagensflessen voor de grootschalige eiwitproductie.
Speciale overwegingen en redenen voor de transformatie- en transfectiestappen.
Hoewel een commercieel protocol aanbeveelt om 100 μL competente cellen te gebruiken voor één transformatie14,is de transformatie-efficiëntie van commerciële DH10Bac E. coli competente cellen zo hoog als 1 x10 8 kve/ μg DNA, dus we gebruiken slechts 4 μL. Dit is genoeg voor elke transformant om geïsoleerde witte recombinante kolonies te verkrijgen voor de bacmide DNA-isolatie. Aanhangende Sf9-cellen in de 24-put transfectieplaat werden gezaaid met een celdichtheid van 2 x10 5 /ml in 0,5 ml serumvrije insectenmedia. Dit volume is voldoende om een gelijkmatige dekking van het werkoppervlak van de put te garanderen. Tegelijkertijd verdunt het de transfectiemix niet te veel, wat de transfectie-efficiëntie verbetert. Transfectiereagentia zijn niet giftig voor de Sf9-cellen en media-uitwisseling is niet nodig. In plaats van een mediawissel wordt na 4-5 uur na transfectietijd nog eens 1,5 ml media met 10% (v/v) FBS in de transfectieplaat toegevoegd om de celgroei te vergemakkelijken. De transfectie-efficiëntie van beide transfectiereagentia is hoog. Toch verschijnen met X-tremeGene 9 de tekenen van infectie in de getransfecteerde cellen (figuur 2) 10-12 uur eerder dan bij het JetPrime-reagens, dus we kiezen tussen deze reagentia, afhankelijk van het werkschema van de volgende stappen in de protocollen, wat enige flexibiliteit biedt in het algehele proces.
Eiwittestexpressiescreening kan worden opgezet met P2-virussen als de hoeveelheid van de initiële recombinante virussen, verzameld uit de transfectieplaat en gelabeld als P1, een beperkende factor is om te gebruiken voor de eiwitexpressiescreening.
Overwegingen bij het verplaatsen van kleine naar grote cultuurvolumes.
Historisch gezien werd aangenomen dat optimale celgroei een hoog luchtruim vereist in de suspensiecultuur van Sf9-celonderhoud en opschalproducties. In 2014 werd echter gemeld dat het hoge luchtruim in kweekschepen minder kritisch is dan eerder werd gedacht17. Een kweekvat dat is opgezet met behulp van de juiste aangepaste schudsnelheid naar de orbitale worp van het schudplatform, zal voldoende zuurstofoverdracht bieden, zelfs in de suspensiecultuur met een hoog vulvolume door kleine luchtbellen voor een langere tijd te creëren en te behouden. Met deze aanpak kunnen in de handel verkrijgbare insectencellen met een hogere schudsnelheid worden gekweekt binnen een normaal bereik van de verdubbelingstijd van de cellen zonder dat dit ten koste gaat van de hoge levensvatbaarheid van de cellen.
Zo zijn we 6 jaar geleden begonnen met het verhogen van het suspensiekweekvolume in een schudkolf tijdens celonderhoud en introduceerden we een ander type kweekvat voor eiwitproductie terwijl we de schudomstandigheden aanpasten en controleerden (figuur 6). Om optimale omstandigheden in deze kweekvaten vast te stellen, hebben we de Sf9-celkweekparameters bewaakt, zoals celverdubbelingstijd, samen met cel levensvatbaarheid, grootte en vorm, staat van aggregatie en infecteerbaarheid van cellen.
Bijvoorbeeld, voor Sf9 cel onderhoud, in de 2.8 L Fernbach shake kolven, kweek we 2 L in plaats van 0.8 L van de Sf9 suspensiecellen schudden bij 150 tpm bij 27 °C en de levensvatbaarheid van de cel is meestal dicht bij 99%, met gelijkmatig gevormde gezonde delende cellen. Voor de opschamproductie infecteren we 4 L cellen in 5 L reagensflessen die op hoge snelheid schudden als 145 tpm bij een verlaagde temperatuur van 25 °C. De meest gebruikte incubators met een ingebouwd schudplatform kunnen 6 x 2,8 L schudkolven of 6 x 5 L reagensflessen of 10 x 2,5 L Tunair-shakekolven bevatten. De capaciteit van het ene schudplatform, als we Fernbach-schudkolven en reagensflessen vullen tot 1/3 versus tot het hoge vulvolume van de vaten, is dus 4,8 L versus 12 L met 2,8 L Fernbach-schudkolven en 10 L versus 24 L met 5 L reagensflessen (figuur 6). Het onderhoud van de ophangcelcultuur en de opschafproductie in de kweekvaten met een hoog vulvolume hebben ons geholpen de beperkingen van de productievolumes te overwinnen en een grootschalig platform te adopteren. Dit is dus zeer nuttig voor laboratoria zonder toegang tot bioreactoren en/of beperkte ruimte in de productiepijplijnen.
Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor de productie en zuivering van eiwitconstructies met verschillende affiniteitstags door geschikte harsen te gebruiken en zuiveringsbuffers te wijzigen, zoals is beschreven in het sgc-gepubliceerde paper6 voor de met vlag getagde full-length eiwitten van PRMT4, 7, 9 en het His-tagged PRMT5-MEP50-complex en PRMT6. Hoewel we een BEVS-protocol beschrijven voor de PRMT-familie van eiwitten, kan dezelfde aanpak worden toegepast op elke andere eiwitfamilie.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs willen Dalia Barsyte-Lovejoy bedanken voor het nemen van de tijd om waardevolle feedback en kritische opmerkingen te geven over het manuscript en al onze SGC-collega's die werkten met de PRMT-eiwitfamilie, uitgedrukt vanuit het Baculovirus Expression Vector System.
De SGC is een geregistreerde liefdadigheidsinstelling (nummer 1097737) die fondsen ontvangt van AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada via Ontario Genomics Institute [OGI-196], de EU en EFPIA via de Joint Undertaking Innovative Medicines Initiative 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (ook bekend als EMD in Canada en de VS), Pfizer, Takeda en de Wellcome Trust [106169/ZZ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
| 24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
| 4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
| 50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
| 96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
| 96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
| Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
| Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
| Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
| Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
| Beckman JLA 8.1000 | |||
| Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
| Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
| Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
| ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
| dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
| E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
| E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
| Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
| Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
| Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
| I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
| InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
| Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
| JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
| Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
| Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
| Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
| Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
| mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
| Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
| New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
| RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
| Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
| RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
| Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
| Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
| Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
| Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
| Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
| VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
| VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
| VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
| VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
| X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and relevance of arginine methylation. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S.
- Lorton, B. M., Shechter, D.
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
- Frankel, A., Brown, J. I. Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs. Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).
- Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. Chemical probes for protein arginine methyltransferases. Methods. 175, 30-43 (2020).
- Savitsky, P., et al. High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience. Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).
- Gileadi, O., et al. Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation. New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).
- Graslund, S., et al.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
- Jarvis, D. L.
- Shrestha, B., et al. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).
- Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).
- Invitrogen Life Technologies. Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , Invitrogen Life Technologies. Carlsbad. (2010).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).
- Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. Protein Production Using the Baculovirus Expression System. Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).
- Rieffel, S., et al. Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX. 1, 155-161 (2014).
