Summary
바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.
Abstract
단백질 아르기닌 메틸 전달효소 (PRMTs) 메틸레이트 아르기닌 잔류물은 수많은 세포 과정에서 역할을 하는 다양한 단백질에 대한 잔류물. PRMT는 대칭 또는 비대칭으로 아르기닌 구니디노 그룹을 모노 또는 유정 할 수 있습니다. 이 단백질의 효소학은 고품질 재조합 단백질의 밀리그램 양을 요구하는 복잡하고 강렬하게 조사된 지역입니다. 이 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 사인폴리오폴리에드로바이러스(AcMNPV) 및 스포드옵테라 검거다 9(Sf9) 곤충 세포를 채택하여 PRMT 1, 2, 4를 포함한 많은 PRMT의 발현 선별 및 생산에 사용되어 왔다. 도메인 및 잘린 단편뿐만 아니라 전신 단백질을 포함한 이러한 단백질의 여러 구조의 발현을 동시에 선별하기 위해 24- 및 96 웰 플레이트 및 블록과 결합된 조정 가능하고 프로그래밍 가능한 멀티채널 파이펫을 활용하는 확장 가능한 방법을 적용했습니다. 전반적으로, 이러한 방법 조정은 박미드 DNA, 재조합 바이러스 및 단백질 발현 스크리닝의 대규모 생성을 가능하게 했다. Sf9 세포 현탁액의 높은 채우기 볼륨배양 용기를 사용하여 단일 배치 대규모 단백질 생산을 위한 생산 파이프라인의 공간 한계를 극복하는 데 도움이 되었습니다. 여기에서는 생화학, 생물리학적 및 구조 연구를 위한 기능PRMT의 효율적이고 비용 효율적인 발현을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
단메틸 또는 대칭/비대칭 디메틸 방식으로 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT) 메틸레이트 아르기닌 잔류물. 반복적인 RG/RGG/GRG 서열은 대부분의 PRMT에 의해 매우 선호되며 다양한 단백질1,2에서발견된다. 히스톤 또는 전사 인자 및 접합 인자와 같은 아르기닌 메틸화 단백질은 전사, 접합 및 크로마틴구조를조절3,4. 기판 및 공동 요인 활용, 회전율 및 PRMT의 운동학의 다양한 조절에 대한 지식 증가뿐만 아니라 선택적 억제제의 생성은 이러한 효소및복합체5,6에기계론적 빛을 발산했다. 그러나, 모든 PRMT 가족 구성원은 같은 정도로 공부; 예를 들어 PRMT9는 최근에 PRMT 패밀리1의구성원으로 만 발견되었습니다. 이러한 단백질에 대한 구조 및 효소 기능 연구는 충분한, 종종 밀리그램, 재조합 단백질의 양을 사용할 수 있어야합니다.
대장균(대장균) 원생발식 시스템은 일반적으로 주어진 단백질7,8,9에대한 다중 구조를 활용한 발현 스크리닝을 위한 첫 번째 선택이다. 그러나, 대장균계 발현은 PRMT5 및 PRMT7에 대해 특별히 언급했듯이 항상 활성 형태로 PRMT 단백질의 충분한 양을 초래하지는 않습니다(아래 참조). 따라서, 대장균에서 발현하지 못하거나 진핵식 기계에 의해 제조될 필요가 있는 PRMT는 대체 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)에서 발현 스크리닝에 적합한 벡터로 스캐닝되었다. 대장균이 PRMT1, PRMT3 및 PRMT8의 샘플을 발현하는 동안, PRMT3 및 PRMT8은 체외 세포 및 결정학, 이중 메틸 트랜스퍼라제 도메인의 MEP50 결합 파트너를 필요로 하는 PRMT5와 같은 다른 PRMT, 그리고 PRMT7 및 9와 같은 PRMT, 충분한 양의 활성 수량을 얻기 위하여 필요한 곤충 세포 발현을 필요로 합니다. 전반적으로, PRMT4, 5, 6, 7 및 9에 대한 표준화된 중간 처리량 메틸트랜스퍼라제 소약은 곤충 세포6에서BEVS를 이용하였다. 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조연구에 필수적인 번역 후 변형을 가능하게 하는 진핵발현 기계를 필요로 하는 재조합 단백질을 생산하는 다목적 플랫폼이다10,11,12. 몇몇 BEVS는 단백질 발현(13)을위해 1983년에 바쿨로바이러스의 처음 보고된 사용 이후 상업적으로 유효하게 되었습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 곤충 세포로 플라스미드 발현의 전송을 위한 다른 전략을 채택합니다. 여기에는 박-투-박, 플래시박, 바쿨로골드 브라이트, 바벡터-3000, 바매직, 박팍 등이 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 BEVS에서 가장 일반적으로 사용되는 시스템을 기반으로, Bac-to-Bac시스템(14)은관심있는 단백질(POI, 여기 PRMT)을 사이트별전도를통해 대장균의 특수한 균주로 유지되도록 설계된 유전자/cDNA를 전관하도록 설계되었다.
간단히, 관심 있는 유전자를 함유하는 플라스미드 전달 벡터는 재조합 바이러스 박미드 DNA를 생성하기 위해 DH10Bac E. 대장균 유능한 세포로 변형되었다. 부착Sf9 세포는 그 때 박미드 DNA로 감염되었다. 4~5일 후, 세포배양 배지로 분비된 초기 재조합 바큘로바이러스는 P1 바이러스로 회수및 표지되었다. P1 바큘로바이러스 주식은 바이러스 증폭(즉, P2 바쿨로바이러스 주식의 생성) 및 단백질 발현 스크리닝에 사용하였다. 발현 스크리닝 결과에 기초하여, 단백질의 최상의 발현 구조를 위한 P2 바이러스를 확인하여 대규모 단백질 생산을 위한 바쿨로바이러스 감염 곤충 세포(SCBIIS)의 현탁액 배양을 생성하는 데 사용되었다. 여기에서는 당사의 상세한 프로토콜을 설명하고 시약 및 배양 용기 선택의 근거를 설명하여 원하는 재조합 단백질을 충분한 수량을 얻기 위해 보다 시간 효율적이고 비용 효율적이며 확장 가능한 방법론을 개발하는 전략을 지원합니다.
Protocol
참고: BEVS 프로토콜 단계의 개요는 그림 1에설명되어 있습니다.
1. 재조합 박미드 DNA의 생성
- DH10Bac 변환을 위한 LB 한천 선택 판의 준비
- 50 μg/mL 카나마이신, 7 μg/mL 젠타미신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 200 μg/mL 블루로갈, 40 μg/mL IPTG가 포함된 LB 아가 플레이트를 준비하여 DH10Bac 변환제를 선택합니다.
- 미리 혼합 된 LB 국물 25 g와 바토 아가 13 g의 무게와 2 L 플라스크에 넣어. 121°C에서 15-30분 동안 증류수와 오토클레이브로 부피를 1L로 가져옵니다.
- 50°C에서 수조를 설정하고 50-55 °C로 냉각 될 때까지 40- 60 분 동안 수조에서 오토클레이브 된 천용액을 식힙니다.
- 냉각된 용액에 젠타미신을 7 μg/mL의 최종 농도에 추가하고, 가나마이신을 50 μg/mL의 최종 농도에, 10 μg/mL의 최종 농도에 테트라사이클린, 블루골갈은 최종 농도 200 μg/mL, IPTG를 최종 농도에 40μg/mL로 추가한다.
- 50mL 파이펫을 사용하여 매질의 천용액과 알리쿼트 7-10mL를 각 60mm 플레이트에 혼합한다. 접시가 실온(2시간)에 앉아서 경화시키게 합니다. 반전, 랩 및 저장 4 °C. 항생제를 함유한 플레이트는 최대 4주 동안 안정적입니다.
- DH10박 대장균 유능한 세포로 플라스미드의 변형
- 유능한 셀의 필요한 볼륨을 계산합니다.
- 얼음에 유능한 세포를 해동하고 부드럽게 회전하고 부드러운 도청으로 다시 중단합니다.
- 12채널 파이펫을 사용하여 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 세포의 4 μL을 분배합니다.
- ~ 0.3-0.5 μg의 재조합 플라스미드 DNA를 유능한 세포에 넣고 두드려 부드럽게 섞습니다. 10-15 분 동안 얼음에 혼합물을 배양.
- 45s에 대한 42 °C에서 PCR 기계에서 혼합물을 열 충격. 얼음에 2 분 동안 식힙니다.
- 96웰 블록(96-deep well 2.4 mL)의 각 웰에 SOC 배지0.5mL을 분배합니다.
- 12채널 파이펫을 사용하여 변형된 세균 현탁액을 블록의 해당 우물로 옮기고 에어포어 시트로 덮습니다.
- 블록을 4-5 h에 대한 중간 동요 (205 rpm)와 함께 37 °C에서 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.
- 멸균 유리 구슬을 사용하여 LB 한천 판의 표면에 배양30-50 μL을 균등하게 퍼뜨리는다. 나머지 배양을 4°C에 저장합니다.
- 파란색/흰색 콜로니의 색상이 식별 될 때까지 37 °C에서 플레이트를 배양 (40-48 h). 충분한 흰색, 큰 식민지가 접시에 얻을 때 문화를 폐기.
- 백색 식민지가 재조합 bacmid DNA만 포함되도록 하기 위하여는, 항생제, bluo-gal 및 IPTG를 포함하는 신선한 LB 한 천 접시에 1개의 고립된 백색 식민지를 재줄이 그형을 확인하기 위하여.
- 37 °C에서 48 h에 대한 인큐베이션.
- 재조합 바미드 DNA의 추출을 위해 다시 줄무늬 접시에서 검증 된 흰색 식민지 하나를 선택합니다.
- 분리 재조합 박미드 DNA
- 단 하나, 절연 된 흰색 식민지를 LB 중간 크기의 3mL로 접종하여 50 μg / mL 카나마이신, 7 μg / mL 젠타미신 및 24 웰 블록 (24 웰 블록 라운드 바닥)에서 10 μg / mL 테트라 사이클린을 보충하고 에어포어 시트로 덮습니다.
- 250 rpm에서 흔들면서 하룻밤 사이에 37 °C에서 자랍니다.
- 원심 분리기 24 웰 블록에서 2,100 x g에서 10 분 동안. 상체를 데수화하고 블록을 반전시키고 흡수성 티슈 페이퍼를 부드럽게 누릅니다. 각 웰에 용액 1(셀 리서스펜션 용액)의 250 μL을 추가합니다.
- 테이프 패드 또는 기타 밀봉 필름으로 블록을 밀봉하고 5-10 분 동안 75 rpm의 흔들리는 플랫폼에 배치하십시오. 각 우물을 확인하여 적절한 셀 용해를 확인하고 필요한 경우 1mL 팁을 사용하여 다시 중단하십시오.
- 각 우물에 250 μL(셀 용액)을 추가하고, 블록을 밀봉하고, 30s(시료의 교차 오염을 피하기 위해, 24웰 블록을 반전하지 않음)에 대해 75 rpm의 흔들림 플랫폼에 배치하여 4분 동안 실온에서 인큐베이팅합니다.
- 용액 3(중화 용액)의 250 μL을 추가하고 블록을 밀봉하고 흔들림 플랫폼에 30s로 놓습니다. 단백질과 대장균 게놈 DNA의 두꺼운 백색 침전이 형성됩니다. 샘플을 얼음 위에 10-15분 간 놓습니다.
- 4°C에서 2,100 x g에서 60분 동안 원심분리기를 사용하여 백색 침전물 물질을 단단히 pellet합니다. 원심 분리 하는 동안, 새로운 미세 원심 분리 기 튜브를 레이블 및 절대 이소 프로 판 올의 0.8 mL를 추가.
- 상체를 이소프로판올이 함유된 튜브로 부드럽게 이송하여 백색 침전 물질을 피합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전한 다음 얼음 위에 5~10분 동안 놓습니다. 이 단계에서, 샘플은 하룻밤 -20 °C에서 저장 될 수있다.
- 원심 분리기 는 4 °C에서 14,000 x g에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 각 튜브에 70 %의 에탄올의 0.5 mL을 추가합니다. 튜브를 여러 번 반전하여 펠릿을 씻으십시오. 상온에서 14,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. (선택 사항: 반복 세척)
- 플라스미드 제제의 멸균을 보장하고 가능한 한 많은 상체를 제거하기 위해 라미나르 플로우 후드 내부에 샘플을 가져옵니다.
참고: 펠릿은 튜브 의 바닥에서 빠질 수 있으므로 상퍼를 버릴 때 펠릿을 주의 깊게 관찰하십시오. - 15-20분 동안 라미나르 플로우 후드 내부의 펠릿을 공기 건조시키고 여과된 용출 버퍼, 10mM Tris-Cl, pH 8.5의 50 μL에서 DNA를 용해시킵니다(펠릿이 과도하게 건조되지 않았는지 확인하십시오).
- 재조합 박미드 DNA는 크기가 135 kb보다 크므로 DNA의 전단을 피하기 위해 부드러운 도청으로 펠릿을 녹입니다.
- 박미드 DNA에 대한 관심 유전자의 존재를 확인하기 위해, 96웰 PCR 플레이트에 PCR 반응 믹스를 설정한다.
- 다음과 같이 PCR 믹스를 준비하십시오: 완충의 1μL, dNTPs의 0.2 μL (10 mMM 각), Taq DNA 폴리머라제의 0.1 μL, 0.1 μL (25 μM) 전방 및 역 프라이머 (BACV2FWD: tattccggattattcatcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc, 1 μL 의 바미드 DNA 및 8 μL의 물.
- 95°C에서 2분 동안 초기 내분으로 표적 유전자의 증폭을 수행하고, 30초동안 94°C의 25사이클, 30초동안 55°C, 1분/kb에 72°C가 그 뒤를 이었다.
- 72°C에서 7분 동안 최종 연장 후 반응을 종료한다.
- 증폭 제품의 10 μL을 전기포고증에 의한 핵산 염색 용액을 함유한 아가로즈 겔을 1% (w/v) 분석한다.
- 검증된 박미드 DN을 4°C에 저장합니다.
2. 재조합 바큘로바이러스 주식의 세대
참고: 바쿨로바이러스 생성, 바큘로바이러스 볼륨 증폭, 단백질 발현 스크리닝 및 단백질 생산을 위한 세포 형질 전환을 포함하여 바쿨로바이러스 발현 프로토콜의 모든 단계에 대해 95% 이상 생존력을 가진 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포를 사용합니다.
- 제트프라임 또는 X-tremeGENE 9와 같은 박미드 DNA 및 트랜스페션 시약(T.R.)을 가진 Sf9 세포의 배설.
참고: Trypan Blue 염색 및 혈혈계를 사용하여 셀 수와 셀 생존 가능성을 결정할 수 있습니다. 실행 불가능한 세포는 얼룩을 취하고 실행 가능한 세포가 얼룩지지 않은 채로 남아 있는 동안 현미경의 밑에 청색으로 나타납니다. % 세포 생존가능성을 계산하기 위해, 총 세포 수가 얻어져(얼룩이 없는 염색) 및 실행 가능한 세포 수는 총 세포 수로 나누어지고 100을 곱한다.- 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포를 혈청 없는 곤충 매체에서 4 x 105 세포/mL의 최종 세포 밀도로 희석하고 멸균 시약 저장소에 부어 넣습니다.
- 24웰 플레이트의 각 웰에 희석된 Sf9 세포의 0.5mL를 시드하는 프로그래밍 가능한 멀티채널 파이펫을 사용합니다.
- 플레이트의 우물을 대조군(trans감염되지 않은)으로 라벨을 부착하고 감염의 잠재적 징후를 평가하기 위해 감염및 비감염된 세포를 비교하는 대조군으로 사용합니다.
- 세포를 접시에 파종한 후, 접시를 여러 번 부드럽게 흔들어 세포의 단층도 보장합니다. 셀이 우물의 중심으로 클러스터되므로 플레이트를 소용돌이지 마십시오.
- 배양 판에 세포 부착을 허용하기 위해 적어도 1 h에 대해 27°C에서 플레이트를 배양한다.
- 트랜스펙트 시약 바이알을 잘 섞는다. 각 트랜스펙트에 대해, 트랜스펙트 시약의 2 μL을 트랜스펙트 버퍼의 100 μL에 추가합니다. 다른 보충 되지 않은 곤충 매체도 사용할 수 있습니다. 희석된 형질 전환 시약을 멸균 시약 저장소에 보관하고 10s에 부드럽게 섞습니다.
- 12채널 파이펫을 사용하여 희석된 월화 시약의 102 μL을 멸균 96 마이크로웰 플레이트로 이송합니다.
- 재조합 바미드 DNA의 0.2 μg/μL 용액의 10 μL을 96웰 마이크로웰 플레이트의 해당 우물로 옮기고 양면에서 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합한다.
- 복잡한 형성을 가능하게 하기 위해 15-20 분 동안 형체 혼합물을 배양합니다.
- 96-24웰 플레이트 사이를 전송하도록 설계된 조정 가능한 6채널 파이펫을 사용하여, 세포에 경질 혼합물을 분리하여 해당 경질 플레이트의 해당 우물에 추가하고 27°C에서 4-5h의 배양한다.
- 배양 시간 동안 플레이트를 여러 번 부드럽게 흔들어 세포 단층 위에 배분 혼합물의 균일한 분포를 보장합니다.
- 4-5 회제 후, 1.5mL의 곤충 혈청 프리 배지를 10% (v/v) 최종 열불불성 태아소 혈청과 항생제 항마이코틱의 최종 부피(페니실린 100단위/mL, 100μg/mL, 연쇄상 구균 0.25mL)로 첨가한다.
- 72-96 h용 27°C 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 가능하면 하루에 한 번 부드럽게 전환 판을 흔들어 주세요.
- 감염의 징후를 찾습니다 (SOI), 72-96 h 후 트랜스페션에서 전염 된 세포에서 분명(그림 2). 감염된 세포가 바이러스를 생성하기 시작하고 배양을 더 감염시킬 것이라는 점을 명심하십시오. 따라서 감염의 징후를 찾습니다.
참고: 감염의 징후는 세포 직경의 25-50% 증가, 확대된 세포 핵, 균일하게 둥근 형상, 배양 접시 표면에 대한 증식 및 준수의 손실, 세포 생존율 의 감소 와 같은 곤충 세포의 구조적 변화이다(도2. 바쿨로바이러스 감염 및 감염되지 않은 Sf9 세포).
3. 작은 - 스케일 단백질 발현 스크리닝 및 바이러스 증폭
- P1 바쿨로바이러스 주식을 가진 Sf9 세포의 감염.
참고: 4-5 일 경과 후, 감염의 표시는 반전된 현미경의 밑에 통제 (transtrans감염되지 않은) 세포에 비교될 때 전염된 세포에서 분명해야 합니다. 세포 배양 배지로 분비된 초기 재조합 바큘로바이러스는 수집할 준비가 되어 있어야 한다.- 종자 2 x105 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포는 P1 바이러스감염에 대한 총 24웰 플레이트의 24웰 플레이트의 각 우물로 혈청이 없는 곤충 매체로 바이러스 부피를 증폭시키는 결과(P2 바이러스의 생성의 결과).
- 플레이트에 세포를 파이프를 넣은 후, 플레이트를 부드럽게 흔들어 앞뒤로 움직여 균일한 단층이 되도록 합니다. 셀이 우물의 중심으로 클러스터되므로 플레이트를 소용돌이지 마십시오.
- 플레이트에 세포 준수를 허용하기 위해 플레이트를 최소 1h에 대해 27°C에서 배양합니다.
- Sf9 세포의 4mL을 3.5-4 x 106의 밀도로 곤충 혈청 이없는 배지에 24웰 블록의 각 웰에 분배하여 단백질 발현 스크리닝을 위한 P1 바이러스에 감염시다.
참고: SOI를 찾고 있을 때 감염되지 않은 세포와 감염되지 않은 세포의 비교를 위해 24웰 플레이트와 24웰 블록 중 하나를 대조군으로 표시하고 감염되지 않은 대조군으로 사용하십시오. - P1 바이러스(단계 2.1.13), 갓 시드된 Sf9 세포의 감염(3.1.1) 감염, P1 바이러스의 150μL을 가진 24웰 블록(Step 3.4)에서 현탁세포의 감염을 동시에 수집할 수 있도록 프로그래밍 가능한 전자 멀티채널을 사용합니다.
- 수집된 P1 바이러스 성 주식의 나머지 부분을 17,970 x g에서15 분 동안 스핀 다운하고 마이크로 센심 분리튜브로 옮기고 4 ° C에서 어둠 속에서 저장하십시오.
- 보답 셰이커에 24웰 플레이트(Step 3.1.1)를 부드럽게 흔들어 세포 단층 위에 추가된 P1 바이러스의 균등한 분포를 보장합니다. 인큐베이션 시간 동안 이 것을 몇 번 반복합니다.
- 에어포어 시트로 감염된 Sf9 세포(3.1.4단계)의 현탁액 배양으로 24웰 블록을 덮는다.
- 27°C에서 24웰 블록을 배양하고 72-96 h의 경우 245rpm에서 흔들어 보배합니다.
- P2 바이러스를 가진 24웰 플레이트(Step 3.1.1)와 발현 스크리닝을 위한 감염된 세포를 가진 24웰 블록(Step 3.1.4)에서 감염 시간 후 72-96h 이내에 SOI를 찾아본다.
참고: P1 바이러스를 가진 Sf9 세포의 감염 후에 4-5 일, SOI는 반전된 현미경의 밑에 비감염된 통제 세포에 비교될 때 감염된 세포에서 분명해야 합니다. - 24웰 플레이트에서 P2 바이러스를 수집하고 원심분리기는 17,970 x g에서15분 동안 원심분리기를 수집하여 미세원심분리관으로 옮기고 4°C에서 어둠 속에서 보관하십시오.
- 72-96 h 에서 감염 후, 70 % 에탄올24 웰 블록 에탄올을 통해 스프레이, 라미나르 흐름 후드에 가져와, Trypan 블루 염색에 의해 몇 우물에서 세포 밀도와 생존가능성을 확인합니다.
- 세포가 감염의 징후가 있고 생존가능성이 Trypan Blue 염색에 의해 평가된 대로 70-75%에 가까우면 단백질 정화로 진행하십시오.
- 15 분 동안 4 °C에서 525 x g에서 24 웰 블록을 원심 분리하여 세포를 펠렛. 25m Tris pH 8.0으로 구성된 용해 버퍼 1mL에서 상체를 폐기하고 펠릿을 철저히 다시 중단하고, 300 mM NaCl, 0.6 % NP-40, 2 mM imidazole, 5 % 글리세롤 (v /v) 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일 (100x 프로테아제 억제제 칵테일은 아프로틴 0.25 mg /mL, leupeptin 0.25 mg/mL; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin A.mL; pepstatin A.mL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin A.25 mg; pepstatin A.25 mg; pepstatin A.mL; pepstatin A.ml; E-64 0.25 mg/mL).
- 후속 시험 정화를 위해 셀 서스펜션을 -80°C에 저장합니다(3.2.2 참조).
- 24웰 테스트 발현 블록에서 냉동 세포 서스펜션으로부터 단백질 정제.
- 바인딩 블록의 어셈블리(도 3).
- 96-deep 웰 블록(96-deep well 2.4 mL)의 상단에 파라필름 3겹겹으로 배치합니다.
- 96웰 필터 플레이트(필터 마이크로플레이트, 96웰, 폴리프로필렌 25μm 초고분자량 폴리에틸렌 멤브레인)을 96-딥 웰 블록 위에 놓습니다.
- 필터 플레이트를 아래로 밀어 파라필름에 팁을 고정하여 96웰 의 깊은 블록에서 필터 플레이트를 밀봉합니다.
- 사전 평형 50% Ni-NTA 수지 슬러리의 50 μL을 필터 플레이트의 각 웰에 옮기.
- 테스트 식 프로시저
- 5-10 분 동안 RT의 수조에 24 웰 블록에 존재하는 냉동 셀 서스펜션 (3.1.15 단계)을 놓고 20 분 동안 450 rpm에서 흔들어줍니다.
- 원심 분리기 는 15 분 동안 3,275 x g에서 24 웰 블록.
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 클리어리리를 50μL의 50μL를 포함하는 필터 플레이트로 옮기고 50% Ni-NTA 수지 슬러리(3.2.1.4단계)를 포함하고 필터 플레이트를 96웰 캡 매트(96웰 캡 매트, 사각형 과 2mL와 함께 사용)로 밀봉한다.
참고: 몇 개의 고무 밴드를 사용하여 인큐베이션 및 원심 분리 단계에서 바인딩 블록을 함께 유지합니다. - 45-60분 동안 보안 바인딩 블록을 콜드 룸의 회전에 넣고 Ni-NTA 수지로 클리어된 용액을 배양합니다.
- 인큐베이션 후, 필터 플레이트를 조심스럽게 들어 올려 96-딥 웰 블록(3.2.1.1 단계)의 표면에서 파라필름 층을 제거합니다.
- 필터 플레이트를 96-deep 웰 블록 위에 다시 놓고 235 x g에서 2 분 동안 고정 바인딩 블록을 회전하십시오.
- 워시 본드 Ni-NTA 수지 2x와 2mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤, 15m imidazole로 구성된 세탁 버퍼 2mL.
- 235 x g에서 5 분 동안 세척 버퍼로 블록을 회전하여 잔류 액체를 완전히 제거하십시오.
- 4배 적재염의 10μL을 포함하는 96웰 PCR 플레이트 의 상단에 필터 플레이트를 옮김한다.
- 용출 버퍼 40 μL(25m Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤, 500mM imidazole)을 필터 플레이트의 각 웰에 넣고 5분 동안 인큐베이트합니다.
- 블록을 아래로 회전하여 단백질을 10분 동안 235 x g의 96웰 PCR 플레이트로 밀어 넣습니다.
- 고온 내성 탭 패드와 열로 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하여 98°C에서 3분 동안 가열하십시오.
- 단백질 사다리 옆에 있는 4-20% SDS-PAGE 젤에 표준 Laemmli 버퍼에 15 μL의 eluted 단백질 샘플을 적재하고 SDS를 포함하는 표준 실행 버퍼로 젤을 실행합니다.
- 쿠마시 블루와 드 스테인물로 젤을 더럽습니다. 테스트 식의 결과를 분석하여 대규모 생산을 위한 최상의 표현 구인을 식별합니다.
- 바인딩 블록의 어셈블리(도 3).
4. 단백질 생산을 위한 바쿨로바이러스 감염 곤충 세포(SCBIIC)의 제제
- 예정된 생산 시간 4일 전에, 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포를 2 x 106 세포/mL의 최종 세포 밀도로 분할하여 125mL/250mL/500mL/500mL 에렌마이어 유리 쉐이크 플라스크로 50mL/100mL/200mL의 곤충 혈청-프리 배지(100mL)를 함유하고 있다.
- 적절한 P2 바이러스의 0.150 mL / 0.300 mL / 0.6 mL을 추가하고, 1 인치 스트로크를 가진 궤도 셰이커에 165 rpm에서 감염된 세포를 배양하고 25 °C의 낮은 온도에서 세포 분열을 느리게한다.
- 4일 감염 후, SOI현미경으로 세포를 확인하고 Trypan Blue 얼룩으로 확인된 세포 생존가능성이 70~75%에 가까우면 생산을 진행한다.
5. 대규모 단백질 생산을 위한 Sf9 세포 제제
- 예정된 생산 시간 4일 전에 대규모 단백질 생산을 위해 Sf9 세포의 필요한 부피를 계산합니다.
- 종자 2 L은 곤충 혈청 프리 배지에서 Sf9 세포를 기하급수적으로 성장시키는 세포밀도에서 1 x 106 셀/mL의 세포 밀도로 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크에 있다.
- 150 rpm에서 흔들림 세트와 27 °C에서 인큐베이션 플라스크.
참고: Sf9 세포 배양에서 세균 오염을 방지하기 위해 젠타미신을 10 μg/mL 또는 페니실린/연쇄절제술신에서 각각 50개의 U/mL 및 50 μg/mL의 최종 농도로 사용합니다.
6. 대규모 단백질 생산을 위한 SCBIIS를 가진 Sf9 세포의 감염
- 2.5 L 툰에어 쉐이크 플라스크 또는 5 L 시약 병에 4 x 106 세포/mL의 최종 세포 밀도로 곤충 혈청 없는 매체에서 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포의 2 L 또는 4 L을 분할한다.
- 바쿨로바이러스감염 곤충세포(SCBIIC) 현탁액 배양의 10-12mL/L을 추가한다.
- 72-96h에 대해 25°C의 낮은 온도 (세포 분열을 늦추기 위해)에서 145 rpm으로 셰이커에 Sf9 세포의 감염된 배양을 배양합니다.
- 72 h 감염 후, SOI에 대 한 현미경에서 세포를 확인 하 고 세포 생존가능성을 평가.
- 일반적으로, 약 72 h 감염 후, Sf9 세포의 생존력은 70%-75%로 떨어집니다(Trypan Blue 얼룩을 사용하여 측정). 4°C에서 15분 동안 900 x g에서 원심분리로 1L 폴리프로필렌 병에 감염된 Sf9 세포를 수확하십시오.
- 부드럽게 소용돌이와 50 mL 원문 튜브로 전송하여 1 x PBS의 20-25 mL의 생산 세포 배양의 1 L에서 수집 된 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 셀 서스펜션을 900 x g에서 15분 동안 회전시키고 PBS 용액을 폐기하십시오.
- 서스펜션 버퍼의 20-25 mL (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 % 글리세롤, 1 x 프로테아제 억제제 칵테일)로 세척 된 세포 펠릿을 다시 중단하고 액체 질소에서 플래시 동결; 정제 될 때까지 - 80 °C에서 저장합니다.
참고: PrMT에 대한 정화 절차는 SGC 출판 논문6에서자세히 설명되었습니다.
Representative Results
BEVS 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에설명되어 있습니다. 상사 전략에 따라 전신, 도메인 및 잘린 단편을 포함한 PRMT의 다중 발현 구조는 상대적으로 높은 발현 수준7,9로수용성 및 안정적인 단백질을 식별하는 성공률을 높이기 위한 시도로 사내 전략에 따라 생성되었다. 관심 있는 독자는 표현 클론에 통합된 유전자 서열의 세그먼트로서 "단편"을 설계하는 SGC의 정의 및 방법론, PFAM-인음응구조 영역으로 "도메인", 표현 벡터에 복제된 단편으로 "구성"을 검토하는 것이좋습니다. 본 프로토콜에 제시된 PRMT의 발현 구조는 pFBOH-MHL 벡터로 복제된 폴리히스티딘 태그 단백질의 생산을 위한 것으로, 이는 pFASTBac1 벡터의 유도체이다. 도 4에서는,Sf9 세포에서 4mL의 생산 후 수집된 펠릿으로부터 정제된 PRMT1, 2, 4-9의 그의 태그된 용용 구조에 대한 SDS-PAGE 분석을 제시한다(단계 3.1.4). FL PRMT1은 대장균에서생산되었기 때문에 전체 길이(FL) PRMT1 및 PRMT9는 이 젤에 제시되지 않으며, BEVS에서 생산된 FL PRMT9는 플래그 태그6에의해 정제되었다. PRMT1, FL PRMT4 및 모든 PRMT8 구조의 잘린 구조는 상대적으로 높은 수율을 나타내지만 단백질 용출에는 정수된 오염 물질의 분수를 함유하고 있습니다. 이러한 구조는 정화 프로토콜의 추가 최적화가 필요합니다. 따라서 추가 접근법은 이러한 단백질의 순도를 개선하여 명확한 용액을 가진 배양 단계에서 니켈 구슬의 양을 감소하는 등의 스케일 업 생산에서 이러한 단백질의 순도를 향상시키는 데 필요합니다. 세척 버퍼에서 이미다졸 농도의 증가; TEV 프로테아제와 그의 태그의 분열, Ni-선호도 수지에 응용 프로그램 다음; 및, 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피와 같은 추가 정화 단계. PRMT2의 구조는 강한 오염 물질 밴드를 동반다른 단백질과 전체 길이 PRMT2 단백질에 비해 상당히 낮은 수율을 보여줍니다. 스케일업 생산 및 IMAC 및 크기 배제와 같은 2단계의 정제는 FL 단백질에 대한 공동 정화 오염물질의 지속적인 존재와 함께 이 구조에 대한 낮은 발현 수준을 확인하였다. 순수 단백질은 의무결합 파트너인 MEP50을 통해 제조 및 정제된 PRMT5 복합체를 위해 수득되었습니다. PRMT9의 잘린 구조는 다른 PRMT에 비해 거의 2 배 또는 3 배 낮은 발현 수준을 가지고, 1.5 mg / L에 가까운. 그럼에도 불구하고, 본 구조의 재조합 바이러스주들은 스케일업 생산에 사용되어 왔으며, 변형 결정이 얻어졌으며, 이 단백질에 대해 PRMT4, 6,7(도 5)과함께 구조가 해결되었다.
스케일업 생산을 위해, 해당 P2 바이러스는 Sf9 곤충 세포의 현탁액 배양을 감염시키기 위하여 이용되었다. 이 단계는 상체에 감염된 세포 및 P3 바이러스를 포함하는 바쿨로바이러스 감염한 세포의 50/100/200 mL를 생성합니다. 대규모 단백질 생산을 위해, 2L의 Sf9 세포는 각각 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크에서 150 rpm, 27°C(도6)에서배양되었다. 생산 당일, Sf9 세포의 2L (세포 생존가능성 > 97%) 2.5 L Tunair 쉐이크 플라스크 또는 5 L 시약 병에 4 L에서4 L은 4 x 10 6/mL의 세포 밀도로 희석되었다. 이들 세포는 바쿨로바이러스감염 곤충 세포의 현탁액 배양 10-12mL/L에 직접 감염되었고, 145rpm에서 25°C의 낮은 온도에서 배양되었다. 바쿨로바이러스감염곤충세포의 현탁액 배양으로 직접 생산 배치의 감염은 감염된 세포의 추가 처리를 제외하고 바이러스 부피 증폭의 힘들고 시간이 많이 소요되는 단계를 현저히 감소시키고, 티터 및 바이러스 분해감소를 피하였다. SF9 세포 배양 유지 및 스케일업 생산은 1배치(도6)에서대규모 단백질 생산을 채택하기 위해 고용량의 배양용기에서 수행되었다.
전체 길이 PRMT 4, 5 (MEP50복합체), 바쿨로바이러스 매개 생산 플랫폼에서 생성된 6, 7 및 9단백질은 SGC6에서운동 특성화 및 억제제 화합물 스크리닝에 사용되어 왔다. 결정 구조는 다양한 화학 프로브 및 억제제와 함께 PRMT 4, 6, 7 및 9의 단백질의 전체 길이 또는 잘린 형태에 대해 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 해결및 증착되었다. 이러한 PRMT에 대한 발현 플라스미드는 Addgene plasmid 저장소에 증착되었다(Addgene은 SGC, https://www.addgene.org/ 의 분배 파트너) 연구커뮤니티(도 5)에사용할 수 있다.
그림 1: 바쿨로바이러스 발현 프로세스의 단계에 대한 회로도 개요는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 바쿨로바이러스 감염 및 감염되지 않은 Sf9 세포. 감염의 징후는 세포 직경의 25-50% 증가, 확대된 세포 핵, 균일하게 둥근 모양, 증식 의 손실 및 배양 접시 표면에 대한 준수와 같은 곤충 세포의 구조적 변화뿐만 아니라 세포 생존도의 감소입니다. 흰색 스케일 바 200 μm. 여기에 제시된 감염의 표시는 전염 시약, JetPrime 및 X-tremeGene 9를 둘 다 사용하여 전염된 세포에 대해 동일합니다. 표시된 특정 예는 JetPrime 트랜스펙트 시약용입니다. (A)감염되지 않은 Sf9 세포를 대조군으로 한다. (B)바쿨로바이러스 감염 Sf9 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 시험 발현 단백질의 신속한 정제를 위한 결합 플레이트 어셈블리. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오, 단계 3.2.1-2이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단백질 발현 스크리닝 결과. 다른 PRMT 및 PRMT5-MEP50 복합체에 대한 상응하는 P1 재조합 바이러스에 감염된 Sf9 서스펜션 배양의 4mL에서 바쿨로바이러스 매개 단백질 생산의 단백질 발현 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 토론토(SGC)의 구조 적유학 컨소시엄에서 결정 구조 연구에 사용되는 PRMT4, 6, 7 및 9에 대한 발현 구조요약. 결정 구조는 다양한 화학 프로브 및 억제제와 함께 전체 길이 또는 잘린 형태의 단백질 PRMT 4, 6, 7 및 9에 대해 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 해결및 증착되었다. 이러한 PRMT에 대한 발현 플라스미드는 Addgene plasmid 저장소에 증착되었고 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다 (Addgene은 SGC의 유통 파트너입니다, https://www.addgene.org/). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: Sf9 곤충 세포 유지 및 단백질 생산은 상이한 배양 용기에서: (A)2.8 L Fernbach 플라스크 세포 유지 및 단백질 생산을 위한. 72%의 충진볼륨을 사용하면 하나의 흔들림 플랫폼에서 처리량 비율이 2.5배 증가합니다. (B)Tunair 쉐이크 플라스크(이 그림에 10점 만9플라스크만 제시)와 80%의 필볼륨이 있는 시약병은 흔들림 플랫폼의 생산 능력을 크게 증가시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
곤충 세포에서 BEVS의 장점 중 하나는 인산화, myristoylation 및 글리코실화와 같은 보다 복잡한 변형을 가능하게 하기 위해 번역 후 변형 기계의 기능에 중점을 둡트합니다. 포유류 단백질의 고효율 접이식과 함께, 이러한 수정은 생리학적으로 관련된 다운스트림실험(16)에적합한 다량의 변형 및 접힌 단백질을 용이하게 한다.
여기서, 우리는 BAculovirus 발현 플랫폼에서 PRMT 단백질의 다중 구조와 대규모 PRMT 단백질 생산의 성공적인 발현 을 위한 중요한 요소를 강조하는 BEVS의 상세한 프로토콜을 기술했습니다: 1) 24-96 사이 생물학 물질을 전송하기 위하여 정규적이고 조정 가능하고 프로그래밍 가능한 멀티채널 파이펫의 사용 - 잘 세포 배양 판 및 블록의 단계에서 잘 세포 배양 판 및 블록; 재조합 바이러스의 컬렉션, 재조합 바이러스의 바이러스 볼륨의 증폭 및 단백질 발현 스크리닝 블록의 준비. 2) 재조합 바이러스의 생성을 위한 고성능 및 비용 효율적인 트랜스페션 시약. 3) 대규모 단백질 생산을 위한 바쿨로바이러스 감염 곤충 세포(SCBIIC)의 현탁액 배양. 4) 고용량 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크의 활용은 Sf9 서스펜션 배양및 2.5 L Tunair 쉐이크 플라스크 및 대규모 단백질 생산을 위한 5L 시약 병을 유지한다.
변환 및 전환 단계에 대한 특별한 고려 사항 및 근거.
상용 프로토콜은 하나의 변환14에관능적 인 세포의 100 μL을 사용하는 것이 권장하지만, 상용 DH10Bac E. 대장균 유능한 세포의 변환 효율은 1 x 108 cfu / μg DNA만큼 높기 때문에 우리는 단지 4 μL을 사용합니다. 이것은 박미드 DNA 격리를 위한 고립된 백색 재조합 식민지를 얻기 위하여 각 변환제에 대 한 충분합니다. 24웰 의 형질 전환 판에서 부착된 Sf9 세포는 혈청없는 곤충 매체의 0.5 mL에서 2 x 105 /mL의 세포 밀도로 종자하였다. 이 볼륨은 우물의 작동 표면의 커버리지를 보장하기에 충분합니다. 동시에, 그것은 형질 혼합물을 너무 많이 희석하지 않으므로 형질 효율을 향상시킵니다. 경질 시약은 Sf9 세포에 무독성이며, 미디어 교환은 필요하지 않습니다. 미디어 변화 대신, 10%(v/v) FBS를 함유한 1.5mL의 추가 미디어가 세포 성장을 용이하게 하기 위해 4-5시간 후 트랜스페션 시간에 트랜스페션 플레이트에 추가됩니다. 두 형질 전환 시약의 트랜스페트 효율이 높습니다. 여전히, X-tremeGene 9를 사용하면, 전염된세포(그림 2)에서감염의 징후가 JetPrime 시약보다 10-12h 일찍 나타나므로, 우리는 프로토콜의 다음 단계의 작업 일정에 따라 이러한 시약 중에서 선택하여 전체 공정에서 약간의 유연성을 제공한다.
단백질 시험 발현 스크리닝은 P2 바이러스로 설정할 수 있으며, 초기 재조합 바이러스의 양이 P1로 분류되고, 단백질 발현 스크리닝에 사용하는 제한인자가 된다.
작은 볼륨에서 큰 문화 볼륨으로 이동할 때 고려 사항.
역사적으로, 최적의 세포 성장은 Sf9 세포 유지 보수 및 스케일 업 생산의 현탁액 배양에 높은 공기 공간을 필요로 한다고 믿었다. 그러나 2014년에는 배양선박의 높은 공공이 이전에 생각했던17개보다덜 중요하다고 보고되었다. 흔들리는 플랫폼의 궤도 던지기로 적절하게 조정된 흔들림 속도를 사용하여 설정된 배양 용기는 작은 기포를 장시간 생성하고 유지하여 고용량 서스펜션 배양에서도 충분한 산소 전달을 제공한다. 이러한 접근법으로, 시판되는 곤충 세포는 높은 세포 생존가능성을 희생하지 않고 세포의 두 배시간 내에 더 높은 흔들림 속도로 배양될 수 있다.
따라서, 6년 전, 세포 유지 과정에서 흔들리는 플라스크에서 서스펜션 배양량을 늘리기 시작했고, 흔들리는 상태를 조정 및 모니터링하면서 단백질 생산을 위한 다양한 유형의 배양용기를 도입하였다(그림6). 이러한 배양 용기에 최적의 조건을 확립하기 위해 세포 생존가능성, 크기 및 모양, 응집 상태 및 세포의 감염가능성과 함께 세포 두 배로 증가하는 세포 배양 파라미터를 모니터링했습니다.
예를 들어, Sf9 세포 유지보수의 경우, 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크에서, 우리는 Sf9 서스펜션 세포의 0.8 L 대신 에 2 L을 배양하고 27°C에서 150 rpm에서 흔들리는 세포 생존가능성은 대부분 99%에 가깝고, 균등하게 모양의 건강한 분할 세포를 갖는다. 스케일업 생산을 위해, 25°C의 낮은 온도에서 145rpm으로 고속으로 흔들리는 5L 시약 병에 4L의 세포를 감염시킵니다. 내장 된 흔들림 플랫폼이있는 가장 일반적으로 사용되는 인큐베이터는 6 x 2.8 L 쉐이크 플라스크 또는 6 x 5 L 시약 병 또는 10 x 2.5 L Tunair 쉐이크 플라스크를 보유 할 수 있습니다. 따라서, 하나의 흔들림 플랫폼의 용량은, 우리가 Fernbach 쉐이크 플라스크및 시약병을 1/3으로 채우면 선박의 고충부가 2.8 L 펀바흐 쉐이크 플라스크및 10 L 대 24 L을 사용하여 5 L 시약병을 사용한다(그림6). 높은 충진량을 가진 배양 용기의 현탁액 세포 배양 유지 및 스케일업 생산은 생산량의 한계를 극복하고 대규모 플랫폼을 채택하는 데 도움이 되었습니다. 따라서, 이것은 생산 파이프라인의 생물 반응기 및/또는 제한된 공간에 접근할 수 없는 실험실에 매우 유용합니다.
이 프로토콜은 PRMT4, 7, 9, 및 그의 태그가 지정된 PRMT5-MEP50 복합체 및 PRMT66의 플래그 태그 전길이 단백질에 대해 SGC 간행논문6에 설명된 바와 같이 적절한 수지를 활용하고 정제 완충제를 수정함으로써 다양한 친화성 태그를 가진 단백질 구조의 생산 및 정화에 용이하게 적응될 수 있다. 우리는 단백질의 PRMT 가족을 위한 BEVS 프로토콜을 기술하더라도, 동일 접근은 그밖 단백질 가족에 적용될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템에서 표현된 PRMT 단백질 가족과 함께 일한 원고와 모든 SGC 동료에 대한 귀중한 피드백과 비판적 의견을 제공하는 데 시간을 내어 달리아 바르시테-러브조이에게 감사를 표하고자 합니다.
SGC는 애브비로부터 기금을 받는 등록 자선 단체(1097737 번호)입니다. 바이엘 AG, 보링거 잉겔하임, 제넨테크, 온타리오 유전체 연구소 [OGI-196]를 통해 유전체 캐나다 [OGI-196], 혁신적인 의약품 이니셔티브 를 통해 EU와 EFPIA 2 공동 착수 [EUbOPEN 보조금 875510], 얀센, 머크 KGaA (일명 캐나다와 미국에서 EMD), 화이자, 다케다 및 웰컴 트러스트 106169 [Z4].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
| 24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
| 4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
| 50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
| 96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
| 96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
| Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
| Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
| Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
| Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
| Beckman JLA 8.1000 | |||
| Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
| Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
| Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
| ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
| dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
| E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
| E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
| Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
| Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
| Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
| I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
| InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
| Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
| JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
| Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
| Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
| Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
| Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
| mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
| Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
| New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
| RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
| Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
| RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
| Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
| Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
| Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
| Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
| Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
| VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
| VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
| VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
| VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
| X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |
References
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- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
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