Summary
Baculovirus expression vector system (BEVS) er en robust plattform for expression screening og produksjon av protein arginin metyltransferaser (PRMTs) som skal brukes til biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier. Milligram mengder materiale kan produseres for de fleste PRMTs og andre proteiner av interesse som krever en eukaryotisk uttrykksplattform.
Abstract
Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på et bredt utvalg av proteiner som spiller roller i mange cellulære prosesser. PRMTs kan enten mono- eller dimetylat arginin guanidino grupper symmetrisk eller asymmetrisk. Enzymologien til disse proteinene er et komplekst og intenst undersøkt område som krever milligram mengder rekombinant protein av høy kvalitet. Baculovirus expression vector system (BEVS) som bruker Autographa californica flere nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) og Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektceller har blitt brukt til expression screening og produksjon av mange PRMTs, inkludert PRMT 1, 2 og 4 til 9. For samtidig å screene for uttrykk for flere konstruksjoner av disse proteinene, inkludert domener og avkortede fragmenter samt proteiner i full lengde, har vi brukt skalerbare metoder ved hjelp av justerbare og programmerbare flerkanals pipetter, kombinert med 24- og 96-brønnsplater og blokker. Samlet sett gjorde disse metodejusteringene det mulig med en storskala generasjon bacmid-DNA, rekombinante virus og screening av proteinuttrykk. Bruk av kulturfartøy med et høyt fyllvolum av Sf9 cellefjæring bidro til å overvinne plassbegrensninger i produksjonsrørledningen for enkelt batch storskala proteinproduksjon. Her beskriver vi detaljerte protokoller for effektivt og kostnadseffektivt uttrykk for funksjonelle PRMTer for biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier.
Introduction
Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på en monometyl- eller symmetrisk/asymmetrisk dimetylmote. De repeterende RG / RGG / GRG-sekvensene er svært foretrukket av de fleste PRMTs og finnes i et bredt utvalg av proteiner1,2. Arginin metylerte proteiner som histoner eller transkripsjonsfaktorer og skjøtefaktorer regulerer transkripsjon, skjøting og kromatinstruktur3,4. Økende kunnskap om mangfoldig regulering av substrat- og kofaktorutnyttelse, omsetning og kinetikk av PRMTs, samt generering av selektive inhibitorer, har kastet mekanistisk lys over disse enzymene og deres komplekser5,6. Imidlertid studeres ikke alle PRMT-familiemedlemmer i samme grad; PRMT9 ble for eksempel bare nylig oppdaget å være medlem av PRMT-familien1. Struktur- og enzymfunksjonsstudier for disse proteinene krever tilstrekkelig, ofte milligram, mengder rekombinant protein for å være tilgjengelig.
Escherichia coli (E. coli) prokaryotisk uttrykkssystem er vanligvis førstevalget for expression screening ved hjelp av flere konstruksjoner for et gitt protein7,8,9. E. coli-basertuttrykk resulterer imidlertid ikke alltid i tilstrekkelige mengder PRMT-proteiner i deres aktive former, som vi spesielt har nevnt for PRMT5 og PRMT7 (se nedenfor). Dermed ble PRMTs som ikke klarte å uttrykke seg i E. coli eller måtte produseres av eukaryotic expression machinery subcloned i vektorer som passer for uttrykket screening i det alternative baculovirus expression vector system (BEVS). Mens E. coli uttrykte prøver av PRMT1, PRMT3 og PRMT8 har blitt brukt mye for in vitro-analyser og krystallografi, har andre PRMT-er som PRMT5, som krever MEP50 bindende partner for sitt doble metyltransferasedomene, og PRMTs som PRMT7 og 9, nødvendiggjøre insektcelleuttrykk for å oppnå tilstrekkelige mengder aktivt protein. Totalt sett har standardisert medium-gjennomstrømning metyltransferaseanalyser for PRMT4, 5, 6, 7 og 9 brukt BEVS i insektceller6. Baculovirus expression vector system (BEVS) er en allsidig plattform for å produsere rekombinante proteiner som krever eukaryotisk uttrykk maskineri som muliggjør post-translasjonelle modifikasjoner avgjørende for biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier10,11,12. Flere BEVSs har blitt kommersielt tilgjengelige siden den første rapporterte bruken av baculovirus i 1983 for proteinuttrykk13. De fleste av disse protokollene bruker forskjellige strategier for overføring av uttrykket plasmid til insektceller. Disse inkluderer Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Vår protokoll er basert på det mest brukte systemet i BEVS, Bac-to-Bac-systemet14, som er designet for å overføre genet / cDNA-kodingen av proteinet av interesse (POI, her PRMTs) til baculovirusgenomet opprettholdt i en spesialisert stamme av E. coli via stedsspesifikk transposisjon15.
Kort sagt ble den plasmidoverføringsvektoren som inneholder genet av interesse forvandlet til DH10Bac E. coli kompetente celler for å generere rekombinant viral bacmid DNA. Adherent Sf9 celler ble deretter transfektert med bacmid DNA. Fire til fem dager etter transfeksjon ble de første rekombinante baculovirusene utskilt i cellekulturmediet gjenopprettet og merket som P1-viruset. P1-bakulovirusbestandene ble deretter brukt til virusforsterkning (dvs. generering av P2-bakulovirusbestander) og proteinuttrykksscreening. Basert på resultatene fra uttrykksscreening ble P2-virus for den beste uttrykkskonstruksjonen av proteinet identifisert og brukt til å generere suspensjonskulturer av baculovirusinfiserte insektceller (SCBIIS) for den store proteinproduksjonen. Her beskriver vi våre detaljerte protokoller og beskriver begrunnelsen bak våre reagens- og kulturfartøyvalg for å støtte vår strategi om å utvikle en mer tidseffektiv, kostnadseffektiv og skalerbar metodikk for å oppnå tilstrekkelige mengder ønskede rekombinante proteiner.
Protocol
MERK: Oversikten over BEVS-protokolltrinnene er beskrevet i figur 1.
1. Generering av et rekombinant bacmid-DNA
- Forberedelse av LB agar selektive plater for DH10Bac transformasjon
- Forbered LB agarplater som inneholder: 50 μg/ml kanamycin, 7 μg/ml gentamicin, 10 μg/ml tetracyklin, 200 μg/ml Bluo-gal og 40 μg/ml IPTG for å velge DH10Bac transformanter.
- Vei 25 g premixed LB kjøttkraft og 13 g Bacto Agar og sett i 2 L kolbe. Ta volumet til 1 L med destillert vann og autoklav i 15-30 min ved 121 °C.
- Sett et vannbad ved 50 °C og avkjøl den autoklavede agarløsningen i vannbadet i 40-60 min til den er avkjølt ned til 50-55 °C.
- Til den avkjølte løsningen, tilsett gentamicin til en endelig konsentrasjon på 7 μg/ml, kanamycin til en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml, tetracyklin til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml, Bluo-gal til en endelig konsentrasjon på 200 μg/ml og IPTG til en endelig konsentrasjon på 40 μg/ml.
- Bland agaroppløsningen og aliquot 7-10 ml av mediet til hver 60 mm plate ved hjelp av en 50 ml pipette. La platene sitte ved romtemperatur (2 t) for å herdes. Inverter, pakk inn og oppbevar ved 4 °C. Plater som inneholder antibiotika er stabile i opptil 4 uker.
- Transformasjon av plasmid til DH10Bac E. coli kompetente celler
- Beregn det nødvendige volumet av kompetente celler.
- Tine kompetente celler på is, spinn forsiktig ned og resuspend tilbake ved forsiktig tapping.
- Bruk en 12-kanals pipette til å dispensere 4 μL av cellene i hver brønn på den 96-brønns PCR-platen.
- Tilsett ~ 0,3-0,5 μg rekombinant plasmid DNA til de kompetente cellene og bland forsiktig ved å tappe. Inkuber blandingen på is i 10-15 min.
- Varmsjokk blandingen i en PCR-maskin ved 42 °C i 45 s. Slapp av på isen i 2 min.
- Dispenser 0,5 ml SOC medium til hver brønn av 96-brønnsblokkene (96-dyp brønn 2,4 ml).
- Bruk en 12-kanals pipette for å overføre den transformerte bakterielle suspensjonen til blokkens tilsvarende brønn og dekk den med et airpore-ark.
- Plasser blokken i en ristende inkubator ved 37 °C med middels agitasjon (205 o/min) i 4-5 timer.
- Spred jevnt 30-50 μL av kulturen over overflaten av LB agarplaten ved hjelp av sterile glassperler. Oppbevar resten av kulturen ved 4 °C.
- Inkuber platene ved 37 °C til fargen på de blå/hvite koloniene er merkbar (40-48 t). Kast kulturen når nok hvite, store kolonier oppnås på platen.
- For å sikre at hvite kolonier bare inneholder rekombinant bacmid DNA, re-stripe en isolert hvit koloni på friske LB agar plater som inneholder antibiotika, bluo-gal, og IPTG for å verifisere fenotypen.
- Inkuber i 48 timer ved 37 °C.
- Velg en verifisert hvit koloni fra en re-stripet plate for utvinning av rekombinant bacmid DNA.
- Isolerer rekombinant bacmid-DNA
- Inokuler en enkelt, isolert hvit koloni i 3 ml LB-medium supplert med 50 μg/ml kanamycin, 7 μg/ml gentamicin og 10 μg/ml tetracyklin i 24-brønns blokker (24-brønns blokker rund bunn) og dekk med airpore-ark.
- Vokse ved 37 °C over natten med risting ved 250 o/min.
- Sentrifuger 24-brønnsblokkene på 2100 x g i 10 min. Dekanter supernatanten, snu blokken og trykk forsiktig på et absorberende vevspapir. Tilsett 250 μL oppløsning 1 (celle resuspension løsning) til hver brønn.
- Forsegle blokkene med tapeputer eller andre tetningsfilmer og plasser dem på en risteplattform ved 75 rpm i 5-10 min. Kontroller hver brønn for å sikre riktig cellelys, og resuspend om nødvendig, ved hjelp av en 1 ml spiss.
- Tilsett 250 μL oppløsning 2 (cellelyseoppløsning) til hver brønn, forsegle blokkene og legg dem på en risteplattform ved 75 o/min i 30 s (for å unngå krysskontaminering av prøvene, ikke inverter 24-brønns blokker) som inkuberer ved romtemperatur i 4 minutter.
- Tilsett 250 μL oppløsning 3 (nøytraliseringsløsning), forsegle blokkene og plasser dem på risteplattformen ved 75 o/min i 30 s. Et tykt hvitt bunnfall av protein og E. coli genomisk DNA vil dannes. Legg prøven på is i 10-15 min.
- Sentrifuge i 60 min ved 2100 x g ved 4 °C for å tett pelletse det hvite bunnfallet. Under sentrifugering, merk et nytt mikrocentrifugerør og tilsett 0,8 ml absolutt isopropanol.
- Overfør forsiktig supernatanten til røret som inneholder isopropanol, og unngå hvitt bunnfallmateriale. Bland ved å snu røret forsiktig et par ganger og legg deretter på is i 5 til 10 min. På dette stadiet kan prøven lagres ved -20 °C over natten.
- Sentrifuger prøven i 15 min ved 14 000 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten og tilsett 0,5 ml 70% etanol til hvert rør. Snu røret flere ganger for å vaske pelletsen. Sentrifuge i 5 min ved 14.000 x g ved romtemperatur. (Valgfritt: gjentatt vask)
- Ta med prøver inne i laminær strømningshetten for å sikre plasmidpreparatets sterilitet og fjerne så mye av supernatanten som mulig.
MERK: Pelletsen kan løsne fra bunnen av røret, så pass forsiktig på pelletsen når du kaster supernatanten. - Lufttørk pelletsen inne i laminær strømningshette i 15 - 20 min og løs opp DNA-et i 50 μL filtrert elutionbuffer, 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (sørg for at pellets ikke er overtørket).
- Siden rekombinant bacmid DNA er større enn 135 kb i størrelse, for å unngå skjæring av DNA, oppløs pellet ved forsiktig tapping.
- For å verifisere tilstedeværelsen av genet av interesse for bacmid DNA, sett opp PCR-reaksjonsblandingen i en 96-brønns PCR-plate.
- Forbered PCR-blandingen på følgende måte: 1 μL buffer, 0,2 μL (10 mM hver) dNTPer, 0,1 μL Taq DNA-polymerase, 0,1 μL (25 μM) av fremre og omvendte primere (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL bacmid DNA og 8 μL vann.
- Utfør forsterkning av målgenene med innledende denaturering i 2 min ved 95 °C, etterfulgt av 25 sykluser på 94 °C i 30 s, 55 °C i 30 s og 72 °C i 1 min/kB.
- Avslutt reaksjonen etter en endelig forlengelse i 7 min ved 72 °C.
- Analyser 10 μL av forsterkningsproduktet på 1% (w/ v) agarose gel som inneholder nukleinsyrefargingsløsning ved elektroforese.
- Oppbevar de verifiserte bacmid-DNAene ved 4 °C.
2. Generering av rekombinante baculovirusbestander
MERK: Bruk eksponentielt voksende Sf9-celler med en levedyktighet på 95% eller større for ethvert trinn i baculovirusuttrykksprotokollen, inkludert celletransfeksjon for baculovirusgenerering, baculovirusvolumforsterkning, proteinuttrykksscreening og proteinproduksjon.
- Transfeksjon av Sf9-celler med Bacmid DNA og transfeksjonsreagenser (T.R.) som JetPrime eller X-tremeGENE 9.
MERK: Trypan Blå farging og et hemocytometer kan brukes til å bestemme levedyktige celleantall og % celle levedyktighet. Ikke-levedyktige celler tar opp flekken og vises blå under mikroskopet mens levedyktige celler forblir unstained. For å beregne % celle levedyktighet oppnås et totalt celleantall (unstained og farget), og det levedyktige celleantallet deles på det totale celleantallet og multipliseres med 100.- Fortynn de eksponentielt voksende Sf9-cellene til en endelig celletetthet på 4 x 105 celler / ml i serumfrie insektmedier og hell i det sterile reagensreservoaret.
- Bruk en programmerbar flerkanals pipette til å frø 0,5 ml av de fortynnede Sf9-cellene i hver brønn på en 24-brønnsplate.
- Merk en brønn av platen som en kontroll (utransfected) og bruk den som en kontroll for å sammenligne de transfekterte og ikke-transfekterte cellene for å vurdere for potensielle tegn på infeksjoner.
- Etter å ha sådd cellene inn i platene, rock platene forsiktig frem og tilbake flere ganger for å sikre en jevn monolayer av celler. Ikke virvle platene fordi cellene vil klynge seg inn i midten av brønnen.
- Inkuber platene ved 27 °C i minst 1 time for å tillate celletilbehør til kulturplatene.
- Bland godt transfeksjonsreagens hetteglasset. For hver transfeksjon legger du til 2 μL av transfeksjonsreagenset til 100 μL av transfeksjonsbufferen. Ethvert annet unsupplemented insekt medium kan også brukes. Deponer det fortynnede transfeksjonsreagenset i et sterilt reagensreservoar og bland forsiktig i 10 s.
- Bruk en 12-kanals pipette og overfør 102 μL av det fortynnede transfeksjonsreagenset til en steril 96-mikrowellplate.
- Overfør 10 μL av en 0,2 μg/μL løsning av rekombinant bacmid DNA til tilsvarende brønn av en 96-brønns mikrowellplate og bland ved å forsiktig riste (banke) platen fra sidene.
- Inkuber transfeksjonsblandingen i 15-20 min for å muliggjøre kompleks dannelse.
- Bruk en justerbar 6-kanals pipette designet for overføring mellom 96- og 24-brønnsplater, tilsett transfeksjonsblandingen på cellene dråpevis i tilsvarende brønner av transfeksjonsplater og inkuber i 4-5 timer ved 27 °C.
- Gyng platene forsiktig frem og tilbake flere ganger i inkubasjonstiden for å sikre jevn fordeling av transfeksjonsblandingen over cellemonolayeren.
- 4-5 h etter transfeksjon, tilsett 1,5 ml insektsserumfritt medium supplert med 10% (v/ v) slutt på varmeinaktivert foster bovint serum og antibiotika-antimykotika til 1% (v / v) sluttvolum (100 enheter / ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin og 0,25 μg/ml amfotericin B).
- Inkuber cellene i en 27 °C inkubator i 72-96 timer. Gyng transfekksjonsplatene forsiktig en gang om dagen når det er mulig.
- Se etter tegn på infeksjon (SOI), tydelig i transfekerte celler ved 72-96 h posttransfeksjon (Figur 2). Husk at de transfekterte cellene vil begynne å produsere viruset og ytterligere infisere kulturen; Se derfor etter tegn på infeksjon.
MERK: Tegn på infeksjon er strukturelle endringer i insektcellene, for eksempel en 25-50% økning i cellediameteren, forstørrede cellekjerner, jevnt avrundet form, tap av spredning og overholdelse av kulturfatoverflaten, samt en reduksjon i celle levedyktighet (Figur 2. Baculovirus Infiserte og uinfiserte Sf9 celler).
3. Liten - skala proteinuttrykk screening og virusforsterkning
- Infeksjon av Sf9 celler med P1 baculovirus aksjer.
MERK: 4-5 dager etter transfeksjon bør tegn på infeksjon være tydelig i de transfekterte cellene sammenlignet med kontrollcellene (utransfekterte) celler under et invertert mikroskop. De første rekombinante baculovirusene som utskilles i cellekulturmediet, bør være klare til å samle.- Frø 2 x 105 eksponentielt voksende Sf9-celler i serumfrie insektmedier i hver brønn av 24-brønnsplatene i et totalt volum på 2 ml for infeksjon med P1-virus for å forsterke virusvolumet (noe som resulterer i generering av P2-virusene).
- Etter å ha rørt cellene inn i platene, rock platene forsiktig, ved hjelp av frem og tilbake bevegelse for å sikre en jevn monolayer. Ikke virvle platene fordi cellene vil klynge seg inn i midten av brønnen.
- Inkuber platene ved 27 °C i minst 1 time for å tillate cellulær overholdelse av platen.
- Dispenser 4 ml Sf9-celler med en tetthet på 3,5-4 x 106 i insektsserumfritt medium i hver brønn på 24-brønns blokker for å infisere med P1-virus for proteinuttrykksscreening.
MERK: Merk en brønn av 24-brønnsplatene og 24-brønnsblokkene som kontroll og bruk som en uinfisert kontroll for sammenligning av infiserte og ikke-infiserte celler når du leter etter SOI. - Bruk en programmerbar elektronisk flerkanals for å tillate samtidig innsamling av P1-virus (trinn 2.1.13), infeksjon av nyseedede Sf9-celler (trinn 3.1.1) og infeksjon av suspensjonscellene i 24-brønnsblokkene (trinn 3.1.4) med 150 μL P1-virus.
- Spinn ned resten av de innsamlede P1 virale lagrene i 15 min ved 17,970 x g, overfør dem til mikrocentrifuge rør og lagre i mørket ved 4 °C.
- Gyng forsiktig de 24-brønnsplatene (trinn 3.1.1) på en gjengjeldende shaker for å sikre en jevn fordeling av de ekstra P1-virusene over cellemonolayeren; gjenta dette noen ganger i inkubasjonstiden.
- Dekk 24-brønnsblokkene med suspensjonskulturen til infiserte Sf9-celler (trinn 3.1.4) med et airpore-ark.
- Inkuber 24-brønnsblokkene ved 27 °C, rist ved 245 o/min i 72-96 timer.
- Se etter SOI innen 72-96 timer etter infeksjonstid i 24-brønnsplatene med P2-virus (trinn 3.1.1) og i 24-brønnsblokkene (trinn 3.1.4) med infiserte celler for uttrykksscreening.
MERK: 4-5 dager etter infeksjon av Sf9-celler med P1-virus, bør SOI være tydelig i de infiserte cellene sammenlignet med de ikke-infiserte kontrollcellene under et invertert mikroskop. - Samle P2 virus fra 24-brønns plater, sentrifuge i 15 min ved 17,970 x g, overfør dem til mikrocentrifuge rør og lagre i mørket ved 4 °C.
- Ved 72-96 h etter infeksjon, spray over 24-brønns blokkene med 70% etanol, ta inn i laminær strømningshette, og kontroller celletettheten og levedyktigheten i noen få brønner av Trypan Blue farging.
- Fortsett til proteinrensing hvis cellene har tegn på infeksjon og levedyktighet er nær 70-75% som vurdert av Trypan Blue farging.
- Pellet cellene ved å sentrifugere 24-brønnsblokkene ved 525 x g ved 4 °C i 15 minutter. Kast de supernatante og re-suspendere pelletsene grundig i 1 ml lysisbuffer som består av 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5 % glyserol (v/v) og 1x proteasehemmercocktail (100x proteasehemmercocktail består av aprotinin 0,25 mg/ml, leupeptin 0,25 mg/ml, pepstatin A 0,25 mg/ml; E-64 0,25 mg/ml).
- Oppbevar cellesuspensjonen ved -80 °C for påfølgende testrensing (se 3.2.2).
- Proteinrensing fra frossen cellefjæring i 24-brønns testuttrykksblokker.
- Montering av bindingsblokken (figur 3).
- Plasser 3 overlappende lag med parafilm på toppen av den 96-dype brønnblokken (96-dyp brønn 2,4 ml).
- Plasser en 96-brønns filterplate (filtermikroplate, 96-brønns polypropylen med 25 μm ultrahøy molekylvekt polyetylenmembran) på toppen av den 96-dype brønnblokken.
- Trykk filterplaten ned for å feste tuppene inn i parafilmen for å forsegle filterplaten fra den 96-brønns dype blokken.
- Overfør 50 μL forhåndsoverveid 50% Ni-NTA harpiksslam til hver brønn på filterplaten.
- Test uttrykksprosedyre
- Plasser den frosne cellefjæringen (trinn 3.1.15) til stede i 24-brønns blokker i et vannbad på RT i 5-10 min, og rist deretter ved 450 rpm i 20 minutter.
- Sentrifuger 24-brønnsblokkene på 3275 x g i 15 min.
- Bruk en flerkanals pipette til å overføre de fjernede lysatene til en filterplate som inneholder 50 μL forhåndsoverveid 50% Ni-NTA harpiksslam (trinn 3.2.1.4) og forsegle filterplaten med en 96-brønns hettematte (96-brønns hettematte, for bruk med firkantet brønn, 2 ml).
MERK: Bruk noen gummibånd for å holde bindingsblokken sammen under inkubasjons- og sentrifugeringstrinn. - Plasser den sikrede bindingsblokken i 45-60 min i en rotator i et kaldt rom for å inkubere ryddede lysater med Ni-NTA-harpiks.
- Etter inkubasjon løfter du filterplaten forsiktig og fjerner parafilmlaget fra overflaten av den 96-dype brønnblokken (trinn 3.2.1.1).
- Sett filterplaten tilbake på toppen av den 96-dype brønnblokken og spinn ned den sikrede innbindingsblokken i 2 minutter ved 235 x g.
- Vask binding Ni-NTA harpiks 2x med 2 ml vaskebuffer som består av 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glyserol og 15 mM imidazol.
- Spinn ned blokken med vaskebuffer hver gang i 5 min ved 235 x g for å sikre fullstendig fjerning av restvæske.
- Overfør filterplaten på toppen av den 96-brønns PCR-platen som inneholder 10 μL 4x lastefargestoff.
- Tilsett 40 μL elutionbuffer (25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glyserol, 500 mM imidazol) til hver brønn på filterplaten og inkuber i 5 min.
- Spinn ned blokken for å unngå proteiner i 96-brønns PCR-platen ved 235 x g i 10 minutter.
- Forsegle PCR-platen med 96 brønner med høy temperaturbestandig tappepute og varme ved 98 °C i 3 minutter.
- Last 15 μL eluted proteinprøver i standard Laemmli buffer på 4-20% SDS-PAGE gel ved siden av proteinstigen og kjør gelen med standard løpebuffer som inneholder SDS.
- Flekk gelen med Coomassie blå og de-flekk med vann. Analyser resultatene av testuttrykket for å identifisere de beste uttrykkskonstruksjonene for storskala produksjon.
- Montering av bindingsblokken (figur 3).
4. Preparater av de baculovirusinfiserte insektcellene (SCBIIC) for proteinproduksjon
- 4 dager før planlagt produksjonstid, del eksponentielt voksende Sf9-celler til en endelig celletetthet på 2 x 106 celler / ml i 125 ml / 250 ml / 500 ml Erlenmeyer glass shake kolber med baffles i 50 ml / 100 ml / 200 ml insektsserumfritt medium som inneholder 1% (v / v) endelig antibiotika-antimykotisk.
- Tilsett 0,150 ml / 0,300 ml / 0,6 ml passende P2-virus, inkuber infiserte celler ved 165 o/min på en orbital shaker med et 1-tommers slag og ved en lavere temperatur på 25 °C for å bremse celledelingen.
- Ved 4 dager etter infeksjon, sjekk celler under et mikroskop for SOI og fortsett til produksjon hvis cellens levedyktighet som verifisert med Trypan Blue-flekken er nær 70-75%.
5. Sf9 cellepreparater for storskala proteinproduksjon
- 4 dager før planlagt produksjonstid, beregn det nødvendige volumet av Sf9-celler for storskala proteinproduksjon.
- Frø 2 L eksponentielt voksende Sf9 celler i Insect Serum-Free Medium til en celletetthet på 1 x 106 celler / ml i 2,8 L Fernbach riste kolber.
- Inkuber kolber ved 27 °C med risting satt til 150 o/min.
MERK: For å forhindre bakteriell forurensning i Sf9-cellekulturen, bruk gentamicin til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 10 μg/ml eller penicillin/streptomycin til henholdsvis 50 U/ml og 50 μg/ml.
6. Infeksjon av Sf9-cellene med SCBIIS for den store proteinproduksjonen
- Split 2 L eller 4 L eksponentielt voksende Sf9 celler i Insect Serum-Free Medium til en endelig celle tetthet på 4 x 106 celler / ml i 2,5 L Tunair shake kolber eller 5 L reagensflasker.
- Tilsett 10-12 ml/l av den baculovirusinfiserte insektcellen (SCBIIC) suspensjonskulturen.
- Inkuber den infiserte kulturen til Sf9-celler på en shaker med 145 rpm ved lavere temperatur på 25 °C (for å bremse celledelingen) i 72-96 timer.
- Ved 72 timers etter infeksjon, sjekk celler under et mikroskop for SOI og vurder cellens levedyktighet.
- Vanligvis, etter ca 72 h etter infeksjon, faller levedyktigheten til Sf9-celler til 70% -75% (målt ved hjelp av Trypan Blue-flekk). Høst infiserte Sf9-celler i en 1 L polypropylenflaske ved sentrifugering ved 900 x g i 15 min ved 4 °C.
- Resuspend cellepellet samlet fra 1 L av produksjonscellekulturen med 20-25 ml 1x PBS ved å forsiktig virvle og overføre til 50 ml koniske rør.
- Snurr ned cellefjæringen ved 900 x g i 15 minutter og kast PBS-løsningen.
- Resuspend den vaskede cellepellet med 20-25 ml av suspensjonsbufferen (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% glyserol, 1x proteasehemmercocktail) og blitsfrysing i flytende nitrogen; oppbevare ved −80 °C til rensing.
MERK: Renseprosedyrer for PRMT-ene er beskrevet i detalj i SGC publisert artikkel6.
Representative Results
En oversikt over BEVS-protokollen er beskrevet i figur 1. Flere uttrykkskonstruksjoner av PRMT-er, inkludert full lengde, domener og avkortede fragmenter, ble generert ved Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) i henhold til interne strategier med et forsøk på å øke suksessraten for å identifisere løselige og stabile proteiner med et relativt høyt uttrykksnivå7,9. Interesserte lesere oppfordres til å gjennomgå SGCs definisjoner og metodikk for å designe et "fragment" som segmentet av gensekvensen innlemmet i en uttrykksklone, "domene" som et PFAM-kommentert strukturelt domene, og "konstruere" som fragmentet klonet i en uttrykksvektor, som alle er beskrevet i detalj i en tidligere publikasjon7. Uttrykkskonstruksjoner av PRMTs presentert i denne protokollen er for produksjon av polyhistidin-taggede proteiner klonet inn i pFBOH-MHL-vektoren, som er et derivat av pFastBac1-vektoren. I figur 4presenterer vi SDS-PAGE-analyse av de hismerkede løselige konstruksjonene til PRMT1, 2, 4-9 renset fra pellets samlet etter 4 ml produksjon i Sf9-celler (trinn 3.1.4). Full lengde (FL) PRMT1 og PRMT9 er ikke presentert i denne gelen, siden FL PRMT1 er produsert fra E. coli, og FL PRMT9 produsert fra BEVS har blitt renset av Flag-tag6. De avkortede konstruksjonene til PRMT1, FL PRMT4 og alle PRMT8-konstruksjonene viser et relativt høyt utbytte, men protein eluates inneholder brøkdeler av korensede forurensninger. Disse konstruksjonene krever ytterligere optimalisering av renseprotokollene. Ytterligere tilnærminger er derfor nødvendig for å forbedre renheten til disse proteinene fra oppskaleringsproduksjoner, for eksempel en reduksjon i mengden nikkelperler på inkubasjonens stadium med en avklart lysat; en økning av imidazolkonsentrasjonene i vaskebufferne; spalting av His-tag med TEV-protease, etterfulgt av anvendelse på en Ni-affinitetharpiks; og ytterligere rensetrinn som størrelsesekskludering og ionutvekslingskromatografi. Konstruksjonene av PRMT2 viser betydelig lavere utbytte sammenlignet med andre proteiner og PRMT2-protein i full lengde ledsaget av et sterkt forurensningsbånd. Oppskaleringsproduksjon og to trinn med rensing som IMAC og størrelsesekskludering bekreftet et lavt uttrykksnivå for denne konstruksjonen sammen med vedvarende tilstedeværelse av korensende forurensning for FL-proteinet. Rene proteiner er oppnådd for PRMT5-komplekset produsert og renset med sin obligatoriske bindende partner, MEP50. Den avkortede konstruksjonen til PRMT9 har nesten to eller tre ganger lavere uttrykksnivå, nær 1,5 mg/l, sammenlignet med andre PRMT-er. Likevel har de rekombinante virusbestandene i denne konstruksjonen blitt brukt til oppskaleringsproduksjon, diffracting krystaller ble oppnådd, og strukturen ble løst for dette proteinet sammen med PRMT4, 6 og 7 (Figur 5).
For oppskaleringsproduksjonene ble de tilsvarende P2-virusene brukt til å infisere suspensjonskulturen til Sf9 insektceller. Dette trinnet genererer 50/100/200 ml baculovirusinfiserte celler som inneholder infiserte celler og P3-virus i supernatanten. For den store proteinproduksjonen ble 2 L Sf9-celler dyrket i hver av 2,8 L Fernbach risteflasker ved 150 o/min, 27 °C (figur 6). På produksjonsdagen > 2 L Sf9-celler (celle levedyktighet > 97%) i 2,5 L Tunair shake kolber eller 4 L i 5 L reagensflasker ble fortynnet til en celletetthet på 4 x 106/ ml. Disse cellene ble smittet direkte med 10-12 ml / l suspensjonskultur av baculovirusinfiserte insektceller og inkubert ved en senket temperatur på 25 °C, ved 145 o/min. Infeksjon av produksjonspartiet direkte med en suspensjonskultur av baculovirus-infiserte insektceller reduserte betydelig arbeidskrevende og tidkrevende trinn i virusvolumforsterkning, unntatt den ekstra håndteringen av de infiserte cellene, og unngikk reduksjon i titer og virusforringelse. SF9 cellekulturvedlikehold og oppskaleringsproduksjon er gjort i kulturfartøyene med høyt fyllvolum for å vedta en storskala proteinproduksjon i den ene batchen (figur 6).
Full lengde PRMT 4, 5 (i kompleks med MEP50), 6, 7 og 9 proteiner produsert fra Baculovirus mediert produksjonsplattform har blitt brukt til kinetisk karakterisering og inhibitor sammensatt screening ved SGC6. Krystallstrukturer ble løst og deponert i Protein Data Bank (PDB) for full lengde eller avkortede former for proteinene PRMT 4, 6, 7 og 9 med ulike kjemiske sonder og inhibitorer. Uttrykksplasmider for disse PRMT-ene ble deponert i Addgene plasmid-repositoriet (Addgene er en distribuerende partner for SGC, https://www.addgene.org/) og er tilgjengelig for forskningsmiljøet (Figur 5).
Figur 1: Skjematisk oversikt over trinnene i baculovirusuttrykksprosessen Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Baculovirus Infiserte og uinfiserte Sf9-celler. Tegn på infeksjon er strukturelle endringer i insektcellene, for eksempel en 25-50% økning i cellediameteren, forstørrede cellekjerner, jevnt avrundet form, tap av spredning og overholdelse av kulturrettens overflate, samt en reduksjon i celle levedyktighet. Hvit skala bar 200 μm. Tegn på infeksjon presentert her er de samme for de transfekterte cellene ved hjelp av både transfeksjonsreagenser, JetPrime og X-tremeGene 9. Det spesielle eksemplet som vises er for JetPrime-transfeksjonsreagensen. (A) Uinferte Sf9-celler som en kontroll. (B) Baculovirus-infiserte Sf9 celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bindingsplatemontering for rask rensing av testuttrykksproteiner. Se tekst for mer informasjon, trinn 3.2.1-2 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Resultater av screening av proteinuttrykk. Proteinuttrykk screening resultater av baculovirus mediert protein produksjon i 4 ml Sf9 suspensjon kultur infisert med tilsvarende P1 rekombinante virus for ulike PRMTs og PRMT5-MEP50 komplekset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammendrag av uttrykkskonstruksjoner for PRMT4, 6, 7 og 9 som brukes til krystallstrukturstudier ved Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Krystallstrukturene ble løst og deponert i Protein Data Bank (PDB) for full lengde eller avkortede former for proteiner PRMT 4, 6, 7 og 9 med ulike kjemiske sonder og inhibitorer. Uttrykksplasmider for disse PRMT-ene ble deponert i Addgene plasmid-depotet og er tilgjengelige for forskningsmiljøet (Addgene er en distribuerende partner for SGC, https://www.addgene.org/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sf9 insektcellevedlikehold og proteinproduksjon i de ulike kulturfartøyene: (A) 2,8 L Fernbach-kolbe for cellevedlikehold og proteinproduksjon. Bruken av 72% påfyllingsvolum øker gjennomstrømningshastigheten med 2,5 ganger i en risteplattform. (B) Tunair shake kolber (bare 9 kolber av 10 presenteres på dette bildet) og reagensflasker med et 80% fyllvolum øker risteplattformens produksjonskapasitet drastisk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
En av fordelene med BEVS i insektceller sentrerer seg om evnen til postoversettelsesmodifikasjonsmaskineriet for å muliggjøre mer komplekse modifikasjoner som fosforylering, myristoylering og glykosylering. Sammen med den svært effektive foldingen av pattedyrproteiner, letter disse modifikasjonene høye mengder modifisert og brettet protein egnet for fysiologisk relevante nedstrømseksperimenter16.
Her beskrev vi detaljerte protokoller fra BEVS med vekt på kritiske elementer for vellykket uttrykksscreening av flere konstruksjoner av PRMT-proteiner og storskala PRMT-proteinproduksjon i Baculovirusuttrykksplattformen: 1) Bruk av vanlige, justerbare og programmerbare flerkanalspipetter for å overføre de biologiske materialene mellom 24- og 96 - brønncellekulturplater og blokker på stadier av bacmid DNA og virusgenerering; en samling av rekombinante virus, forsterkning av virusvolumer av rekombinante virus og fremstilling av proteinuttrykksscreeningsblokkene. 2) Høy ytelse og kostnadseffektive transfeksjonsreagenser for generering av rekombinante virus. 3) Suspensjon kultur av baculovirus-infiserte insektceller (SCBIIC) for storskala proteinproduksjon. 4) Utnyttelse av høyt fyllvolum 2,8 L Fernbach risteflasker for å opprettholde Sf9 suspensjon kultur og 2,5 L Tunair shake kolber og 5 L reagensflasker for storskala protein produksjon.
Spesielle hensyn og begrunnelse for transformasjons- og transfeksjonstrinnene.
Selv om en kommersiell protokoll anbefaler å bruke 100 μL kompetente celler for en transformasjon14, er transformasjonseffektiviteten til kommersielle DH10Bac E. coli kompetente celler så høyt som 1 x 108 cfu / μg DNA, så vi bruker bare 4 μL. Dette er nok for hver transformant å oppnå isolerte hvite rekombinante kolonier for bacmid DNA-isolasjon. Adherent Sf9-celler i 24-brønns transfeksjonsplaten ble sådd med en celletetthet på 2 x 105 / ml i 0,5 ml serumfrie insektmedier. Dette volumet er nok til å sikre jevn dekning av brønnens arbeidsflate. Samtidig fortynner det ikke transfeksjonsblandingen for mye, noe som forbedrer transfeksjonseffektiviteten. Transfeksjonsreagenser er ikke giftige for Sf9-cellene, og medieutveksling er ikke nødvendig. I stedet for en medieendring legges ytterligere 1,5 ml medier som inneholder 10% (v / v) FBS til transfeksjonsplaten etter 4-5 timer etter transfeksjonstid for å lette celleveksten. Transfeksjonseffektiviteten til begge transfeksjonsreagensene er høy. Likevel, med X-tremeGene 9, vises tegn på infeksjon i de transfekterte cellene (figur 2) 10-12 timer tidligere enn med JetPrime-reagenset, så vi velger mellom disse reagensene avhengig av arbeidsplanen for de neste trinnene i protokollene, noe som gir litt fleksibilitet i den generelle prosessen.
Screening av proteintestuttrykk kan settes opp med P2-virus hvis mengden av de første rekombinante virusene, samlet inn fra transfeksjonsplaten og merket som P1, er en begrensende faktor å bruke til proteinuttrykksscreening.
Hensyn ved flytting fra små til store kulturvolumer.
Historisk ble det antatt at optimal cellevekst krever et høyt luftrom i suspensjonskulturen for Sf9-cellevedlikehold og oppskaleringsproduksjoner. I 2014 ble det imidlertid rapportert at høyt luftrom i kulturfartøy er mindre kritisk enn tidligere antatt17. Et kulturfartøy satt opp ved hjelp av riktig justert ristehastighet til risteplattformens banekast vil gi tilstrekkelig oksygenoverføring selv i høyfyllvolumfjæringskulturen ved å skape og opprettholde små luftbobler i lengre tid. Med denne tilnærmingen kan kommersielt tilgjengelige insektceller dyrkes med høyere ristehastighet innenfor et normalt område av cellenes doblingstid uten å ofre høy celle levedyktighet.
For 6 år siden begynte vi derfor å øke fjæringskulturvolumet i en ristende kolbe under cellevedlikehold og introduserte en annen type kulturfartøy for proteinproduksjon mens vi justerte og overvåket risteforholdene (Figur 6). For å etablere optimale forhold i disse kulturfartøyene overvåket vi Sf9-cellekulturparametrene som celledoblingstid sammen med celle levedyktighet, størrelse og form, aggregeringstilstand og infektivitet av celler.
For eksempel, for Sf9 cellevedlikehold, i 2,8 L Fernbach riste kolber, kulturer vi 2 L i stedet for 0,8 L av Sf9-suspensjonscellene som rister ved 150 rpm ved 27 ° C og celle levedyktighet mesteparten av tiden er nær 99%, med jevnt formede sunne skilleceller. For oppskaleringsproduksjon infiserer vi 4 L celler i 5 L reagensflasker som rister i høy hastighet som 145 o/min ved en senket temperatur på 25 °C. De mest brukte inkubatorene med en innebygd risteplattform kan holde 6 x 2,8 L risteflasker eller 6 x 5 L reagensflasker, eller 10 x 2,5 L Tunair shakeflasker. Dermed er kapasiteten til den ene risteplattformen, hvis vi fyller Fernbach risteflasker og reagensflasker til 1/3 versus det høyefyllingsvolumet på fartøyene, 4,8 L versus 12 L ved hjelp av 2,8 L Fernbach risteflasker og 10 L versus 24 L ved hjelp av 5 L reagensflasker (Figur 6). Vedlikehold av suspensjonscellekultur og oppskalering av produksjonen i kulturfartøyene med høyt fyllingsvolum har hjulpet oss med å overvinne begrensninger i produksjonsvolumene og ta i bruk en storskala plattform. Dermed er dette svært nyttig for laboratorier uten tilgang til bioreaktorer og / eller begrenset plass i produksjonsrørledningene.
Denne protokollen kan enkelt tilpasses for produksjon og rensing av proteinkonstruksjoner med forskjellige affinitetskoder ved å bruke passende harpikser og modifisere rensebuffere som beskrevet i SGC-publisert papir6 for flaggmerkede proteiner i full lengde av PRMT4, 7, 9 og det His-tagged PRMT5-MEP50-komplekset og PRMT6. Selv om vi beskriver en BEVS-protokoll for PRMT-familien av proteiner, kan den samme tilnærmingen brukes på enhver annen proteinfamilie.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dalia Barsyte-Lovejoy for å ha tatt seg tid til å gi verdifulle tilbakemeldinger og kritiske kommentarer til manuskriptet og alle våre SGC-kolleger som jobbet med PRMT-proteinfamilien uttrykt fra Baculovirus Expression Vector System.
SGC er en registrert veldedighetsorganisasjon (nummer 1097737) som mottar midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gjennom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gjennom Innovative Medicines Initiative 2 Joint Foretak [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (aka EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
| 24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
| 4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
| 50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
| 96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
| 96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
| Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
| Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
| Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
| Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
| Beckman JLA 8.1000 | |||
| Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
| Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
| Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
| ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
| dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
| E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
| E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
| Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
| Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
| Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
| I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
| InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
| Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
| JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
| Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
| Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
| Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
| Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
| mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
| Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
| New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
| RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
| Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
| RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
| Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
| Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
| Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
| Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
| Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
| VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
| VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
| VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
| VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
| X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and relevance of arginine methylation. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S.
- Lorton, B. M., Shechter, D.
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
- Frankel, A., Brown, J. I. Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs. Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).
- Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. Chemical probes for protein arginine methyltransferases. Methods. 175, 30-43 (2020).
- Savitsky, P., et al. High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience. Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).
- Gileadi, O., et al. Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation. New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).
- Graslund, S., et al.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
- Jarvis, D. L.
- Shrestha, B., et al. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).
- Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).
- Invitrogen Life Technologies. Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , Invitrogen Life Technologies. Carlsbad. (2010).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).
- Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. Protein Production Using the Baculovirus Expression System. Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).
- Rieffel, S., et al. Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX. 1, 155-161 (2014).
