Summary
Baculovirusudtryksvektorsystemet (BEVS) er en robust platform for ekspressionsscreening og produktion af proteinalgininmethyletransferaser (PRMT'er), der skal anvendes til biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser. Milligram mængder materiale kan produceres for de fleste PRMT'er og andre proteiner af interesse, der kræver en eukaryote udtryksplatform.
Abstract
Protein arginin methyltransferaser (PRMTs) methylat argininrester på en bred vifte af proteiner, der spiller roller i mange cellulære processer. PRMT'er kan enten mono- eller dimethylat arginin guanidinogrupper symmetrisk eller asymmetrisk. Enzymologien af disse proteiner er et komplekst og intenst undersøgt område, der kræver milligrammængder af rekombinant protein af høj kvalitet. Baculovirus-ekspressionsvektorsystemet (BEVS), der anvender autografa californica multipel nukleopolyhedrovirus (AcMNPV) og Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektceller, er blevet brugt til ekspressionsscreening og produktion af mange PRMT'er, herunder PRMT 1, 2 og 4 til 9. For samtidig at screene for ekspressionen af flere konstruktioner af disse proteiner, herunder domæner og afkortede fragmenter samt proteiner i fuld længde, har vi anvendt skalerbare metoder ved hjælp af justerbare og programmerbare multikanalpipetter kombineret med 24- og 96-brønds plader og blokke. Samlet set muliggjorde disse metodejusteringer en storstilet generation af bacmid-DNA, rekombinant virus og proteinudtryksscreening. Brug af kulturskibe med et stort fyldvolumen af Sf9-celleaffjedring bidrog til at overvinde pladsbegrænsninger i produktionspipelinen til enkeltbatchproteinproduktion i stor skala. Her beskriver vi detaljerede protokoller for et effektivt og omkostningseffektivt udtryk for funktionelle PRMT'er til biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser.
Introduction
Proteinalgininmethyletransferaser (PRMT' er) methylatalgininrester på en monomethyl- eller symmetrisk/asymmetrisk dimethylemode. De gentagne RG/RGG/GRG-sekvenser foretrækkes i høj grad af de fleste PRMT'er og findes i en lang række proteiner1,2. Arginin methylerede proteiner såsom histoner eller transskriptionsfaktorer og splejsningsfaktorer regulerer transskription, splejsning og kromatinstruktur3,4. Øget viden om forskellige regulering af substrat og cofaktor udnyttelse, omsætning, og kinetik af PRMTs, samt generering af selektive hæmmere, har kastet mekanistisk lys over disse enzymer og deres komplekser5,6. Det er dog ikke alle PRMT-familiemedlemmer, der studeres i samme omfang; prmt9 blev først for nylig opdaget at være medlem af PRMT-familien1. Struktur- og enzymfunktionsundersøgelser for disse proteiner kræver tilstrækkelige, ofte milligram, mængder rekombinant protein til rådighed.
Det prokaryote udtrykssystem Escherichia coli (E. coli) er normalt det første valg til ekspressionsscreening ved hjælp af flere konstruktioner for et givet protein7,8,9. E. coli-baseretudtryk resulterer imidlertid ikke altid i tilstrækkelige mængder PRMT-proteiner i deres aktive former, som vi især har bemærket for PRMT5 og PRMT7 (se nedenfor). Prmts, der ikke kunne udtrykke sig i E. coli eller skulle fremstilles af den eukaryote udtryksmaskine, blev således omstænket til vektorer, der var egnede til ekspressionscreening i det alternative baculovirusudtrykvektorsystem (BEVS). Mens E. coli udtrykte prøver af PRMT1, PRMT3 og PRMT8 er blevet anvendt i vid udstrækning til in vitro-assays og krystallografi, kræver andre PRMT'er som PRMT5, som kræver MEP50-bindende partner for sit dobbelte methyltransferasedomæne og PRMT'er som PRMT7 og 9, insektcelleudtryk for at opnå tilstrækkelige mængder aktivt protein. Samlet set har de standardiserede medium-throughput methyltransferase assays for PRMT4, 5, 6, 7 og 9 udnyttet BEVS i insektceller6. Baculovirus-ekspressionens vektorsystem (BEVS) er en alsidig platform til fremstilling af rekombinante proteiner, der kræver den eukaryote ekspressionsmaskine, der muliggør postoversættelsesændringer, der er afgørende for biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser10,11,12. Flere BEVS'er er blevet kommercielt tilgængelige siden den første rapporterede brug af baculovirus i 1983 til proteinudtryk13. De fleste af disse protokoller anvender forskellige strategier for overførsel af udtrykket plasmid i insektceller. Disse omfatter Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK osv. Vores protokol er baseret på det mest anvendte system i BEVS, Bac-to-Bac system14, som er designet til at overføre genet / cDNA kodning af protein af interesse (POI, her PRMTs) i baculovirus genom opretholdes i en specialiseret stamme af E. coli via site-specifikke gennemførelse15.
Kort, plasmid overførsel vektor, der indeholder genet af interesse blev omdannet til DH10Bac E. coli kompetente celler til at generere rekombinant viral bacmid DNA. Klæbende Sf9 celler blev derefter transfected med bacmid DNA. Fire til fem dage efter transfekten blev de første rekombinante baculovirus, der blev udskillet i cellekulturmediet, genvundet og mærket som P1-virus. P1-baculoviruslagrene blev derefter anvendt til virusforstærkning (dvs. generering af P2-baculoviruslagre) og screening af proteinudtryk. Baseret på resultaterne af ekspressionen blev P2-vira til det bedste udtrykskonstruktion af proteinet identificeret og brugt til at generere suspensionskulturer af baculovirusinficerede insektceller (SCBIIS) til den store proteinproduktion. Her beskriver vi vores detaljerede protokoller og beskriver rationalet bag vores valg af reagens- og kulturbeholder for at understøtte vores strategi om at udvikle en mere tidseffektiv, omkostningseffektiv og skalerbar metode til at opnå tilstrækkelige mængder ønskede rekombinante proteiner.
Protocol
BEMÆRK: Oversigten over BEVS-protokoltrinnene er beskrevet i figur 1.
1. Generation af en rekombinant bacmid DNA
- Forberedelse af LB agar selektive plader til DH10Bac transformation
- Der fremstilles LB agarplader med indhold af: 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyklin, 200 μg/mL Bluo-gal og 40 μg/mL IPTG for at vælge DH10Bac transformanter.
- 25 g forblandet LB-bouillon og 13 g Bacto Agar afvejes og lægges i 2 L-kolbe. Volumenet bringes op på 1 L med destilleret vand og autoklave i 15-30 minutter ved 121 °C.
- Sæt et vandbad ved 50 °C, og afkøl autoklaveret agaropløsning i vandbadet i 40- 60 minutter, indtil det afkøles til 50-55 °C.
- Til den afkølede opløsning tilsættes gentamicin til en endelig koncentration på 7 μg/mL, kanamycin til en endelig koncentration på 50 μg/mL, tetracyklin til en endelig koncentration på 10 μg/mL, Bluo-gal til en endelig koncentration på 200 μg/mL og IPTG til en endelig koncentration på 40 μg/mL.
- Agaropløsningen og aliquot 7-10 ml af mediet blandes til hver 60 mm plade med en 50 mL pipette. Lad pladerne sidde ved stuetemperatur (2 timer) for at hærde. Inverter, pak ind og opbevar ved 4 °C. Plader, der indeholder antibiotika, er stabile i op til 4 uger.
- Omdannelse af plasmid til DH10Bac E. coli kompetente celler
- Beregn den krævede mængde kompetente celler.
- Tø kompetente celler på is, forsigtigt spin ned og genbruges tilbage ved blid banke.
- Brug en 12-kanals pipette til at dispensere 4 μL af cellerne i hver brønd på 96-brønds PCR-pladen.
- Tilsæt ~ 0,3-0,5 μg rekombinant plasmid DNA til de kompetente celler og bland forsigtigt ved at trykke. Inkubat blandingen på is i 10-15 min.
- Blandingen opvarmes i en PCR-maskine ved 42 °C i 45 s. Chill på is i 2 min.
- Dispenser 0,5 mL SOC medium til hver brønd af 96-brøndsblokkene (96-dyb brønd 2,4 mL).
- Brug en 12-kanals pipette til at overføre den transformerede bakterieophæng til den tilsvarende brønd i blokken og dække den med et airpore-ark.
- Blokken anbringes i en rysteinkubator ved 37 °C med medium omrøring (205 omdrejninger) i 4-5 timer.
- 30-50 μL af kulturen fordelt jævnt over overfladen af LB agarpladen ved hjælp af sterile glasperler. Resten af kulturen opbevares ved 4 °C.
- Pladerne inkuberes ved 37 °C, indtil farven på de blå/hvide kolonier er synlig (40-48 timer). Kassér kulturen, når der opnås nok hvide, store kolonier på pladen.
- For at sikre, at hvide kolonier kun indeholder rekombinant bacmid DNA, re-streak en isoleret hvid koloni på friske LB agar plader, der indeholder antibiotika, bluo-gal, og IPTG at kontrollere fænotype.
- Inkuberes i 48 timer ved 37 °C.
- Vælg en verificeret hvid koloni fra en re-stribet plade til udvinding af rekombinant bacmid DNA.
- Isolere rekombinant bacmid DNA
- En enkelt, isoleret hvid koloni podes i 3 ml LB-medium suppleret med 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin og 10 μg/mL tetracyklin i 24-brøndsblokke (24-brønds blokke rund bund) og dækkes med et airporeark.
- Vokse ved 37 °C natten over med rysten ved 250 omdrejninger i minuttet.
- Centrifuge 24-brønds blokkene ved 2.100 x g i 10 min. Dekanter supernatanten, vend blokken, og tryk forsigtigt på et absorberende silkepapir. Der tilsættes 250 μL opløsning 1 (cellerepensionsopløsning) til hver brønd.
- Forsegl blokkene med båndpuder eller andre tætningsfilm og læg dem på en rysteplatform ved 75 omdrejninger i minuttet i 5-10 minutter. Kontroller hver brønd for at sikre korrekt celle lysis, og genbruges om nødvendigt ved hjælp af en 1 mL spids.
- Der tilsættes 250 μL opløsning 2 (celle lysisopløsning) til hver brønd, forsegles blokkene, og der anbringes på en rysteplatform ved 75 omdrejninger i 30 s (for at undgå krydskontaminering af prøverne må der ikke inverteres 24-brønds blokke) inkuberes ved stuetemperatur i 4 min.
- Der tilsættes 250 μL opløsning 3 (neutraliseringsopløsning), blokkene forsegles, og der anbringes på rysteplatformen ved 75 omdrejninger i 30 s. En tyk hvid bundfald af protein og E. coli genomisk DNA vil danne. Prøven anbringes på is i 10-15 minutter.
- Centrifuge i 60 min ved 2.100 x g ved 4 °C for at fast pellet det hvide bundfald materiale. Under centrifugering mærkes et nyt mikrocentrifugerør, og der tilsættes 0,8 mL absolut isopropanol.
- Overfør forsigtigt supernatanten til røret, der indeholder isopropanol, og undgå hvidt bundfaldsmateriale. Bland ved forsigtigt at vende røret et par gange og læg derefter på is i 5 til 10 minutter. På dette stadium kan prøven opbevares ved -20 °C natten over.
- Prøven centrifugeres i 15 minutter ved 14.000 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten og tilsæt 0,5 mL 70% ethanol til hvert rør. Vend røret flere gange for at vaske pelleten. Centrifuge i 5 min ved 14.000 x g ved stuetemperatur. (Valgfrit: gentag vask)
- Bring prøver inde i laminar flow hætten for at sikre plasmid præparatets sterilitet og fjerne så meget af supernatanten som muligt.
BEMÆRK: Pellet kan løsne sig fra bunden af røret, så hold øje med pellet, når du kasserer supernatanten. - Lufttørre pellet inde i laminar flow hætte i 15 - 20 min og opløse DNA i 50 μL filtreret elution buffer, 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (sørg for, at pellets ikke er over-tørret).
- Da rekombinant bacmid DNA er større end 135 kb i størrelse, for at undgå klipning af DNA, opløse pellet ved blid tappe.
- For at kontrollere tilstedeværelsen af genet af interesse i bacmid DNA, der er nedsat PCR reaktion mix i en 96-godt PCR plade.
- Pcr-blandingen fremstilles på følgende måde: 1 μL buffer, 0,2 μL (10 mM hver) dNTP'er, 0,1 μL Taq DNA polymerase, 0,1 μL (25 μM) fremad- og bakprimtalere (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL bacmid DNA og 8 μL vand.
- Udrette målgenerene med indledende denaturering i 2 minutter ved 95 °C efterfulgt af 25 cyklusser på 94 °C for 30 s, 55 °C for 30 s og 72 °C i 1 min/kb.
- Reaktionen afsluttes efter en sidste forlængelse i 7 min ved 72 °C.
- 10 μL af forstærkningsproduktet analyseres på 1% (w/v) agarosegel indeholdende nukleinsyrepletopløsning ved elektroforese.
- De verificerede bacmid-DNA'er opbevares ved 4 °C.
2. Generering af rekombinante baculoviruslagre
BEMÆRK: Brug eksponentielt voksende Sf9-celler med en levedygtighed på 95% eller derover til ethvert trin i baculovirusudtryksprotokollen, herunder celletransfekt til baculovirus-generation, baculovirusvolumenforstærkning, proteinudtryksscreening og proteinproduktion.
- Transfekt af Sf9-celler med Bacmid DNA og transfekturereagenser (T.R.) såsom JetPrime eller X-tremeGENE 9.
BEMÆRK: Trypan Blå farvning og et hæmocytometer kan bruges til at bestemme levedygtige celletal og % celle levedygtighed. Ikke-levedygtige celler optage pletten og vises blå under mikroskopet, mens levedygtige celler forbliver uhæmmet. For at beregne % celle levedygtighed, en samlet celletal er opnået (unstained og farves) og levedygtige celletal divideres med det samlede celletal og ganges med 100.- De eksponentielt voksende Sf9-celler fortyndes til en endelig celletæthed på 4 x 105 celler/mL i serumfrie insektmedier og hældes i det sterile reagensreservoir.
- Brug en programmerbar multikanalpipette til at frøe 0,5 mL af de fortyndede Sf9-celler i hver brønd på en 24-brønds plade.
- Label en brønd af pladen som en kontrol (uoversat) og bruge det som en kontrol til at sammenligne de transfected og ikke-transfected celler til at vurdere for potentielle tegn på infektioner.
- Efter såning af cellerne i pladerne, forsigtigt rock pladerne frem og tilbage flere gange for at sikre en jævn monolayer af celler. Du må ikke hvirvle pladerne, fordi cellerne vil klynge ind i midten af brønden.
- Pladerne inkuberes ved 27 °C i mindst 1 time for at give mulighed for celletilbehør på dyrkningspladerne.
- Bland godt transfection reagens hætteglas. For hver transfekt tilsættes 2 μL transfektreagens til 100 μL af transfektbufferen. Ethvert andet ikke-forsynet insektmedium kan også bruges. Aflejr det fortyndede transfektreagens i et sterilt reagensreservoir, og bland forsigtigt i 10 s.
- Ved hjælp af en 12-kanals pipette overføres 102 μL af det fortyndede transfektreagens til en steril 96-microwell plade.
- 10 μL af en 0,2 μg/μL opløsning af rekombinant bacmid-DNA overføres til den tilsvarende brønd på en 96-brønds mikrobomplade og blandes ved forsigtigt at ryste (trykke) pladen fra siderne.
- Inkubat transfektureblandingen i 15-20 minutter for at muliggøre kompleks dannelse.
- Ved hjælp af en justerbar 6-kanals pipette, der er konstrueret til overførsel mellem 96- og 24-brøndsplader, tilsættes transfektureblandingen på cellerne dråbevis til tilsvarende brønde af transfektureplader og inkuberes i 4-5 timer ved 27 °C.
- Sten forsigtigt pladerne frem og tilbage flere gange i inkubationstiden for at sikre jævn fordeling af transfektblandingen over cellemonomeren.
- 4-5 timer efter transfekt tilsættes 1,5 mL insektserumfrit medium suppleret med 10% (v/v) endelig varmeinaktiveret føtalt kvægserum og antibiotisk antimykotisk til 1% (v/v) slutvolumen (100 enheder/mL penicillin 100 μg/mL streptomycin og 0,25 μg/mL amphotericin B).
- Cellerne inkuberes i en 27 °C inkubator i 72-96 timer. Rock forsigtigt transfektpladerne en gang om dagen, når det er muligt.
- Se efter tegn på infektion (SOI), tydeligt i transfected celler ved 72-96 timer efter transinfektion(figur 2). Husk, at de transfected celler vil begynde at producere virus og yderligere inficere kulturen; således kigge efter tegn på infektion.
BEMÆRK: Tegn på infektion er strukturelle ændringer i insektcellerne, såsom en 25-50% stigning i cellediameteren, forstørrede cellekerner, ensartet afrundet form, tab af spredning og overholdelse af kulturens skåloverflade samt et fald i celle levedygtighed (Figur 2. Baculovirus inficerede og uinficerede Sf9 celler).
3. Screening af proteiner i lille skala og virusforstærkning
- Infektion af Sf9 celler med P1 baculovirus bestande.
BEMÆRK: 4-5 dage efter transfekten skal der være tegn på infektion i de transfected celler sammenlignet med kontrolcellerne (ikke-transficerede) under et omvendt mikroskop. Den første rekombinant baculovirus udskilles i cellen kultur medium bør være klar til at indsamle.- Frø 2 x 105 eksponentielt voksende Sf9 celler i serum-fri insekt medier i hver brønd af de 24-brønd plader i et samlet volumen på 2 mL for infektion med P1 vira til at forstærke virus volumen (resulterer i generering af P2 vira).
- Efter pipettering cellerne i pladerne, forsigtigt rock pladerne, ved hjælp af frem og tilbage bevægelse for at sikre en jævn monolayer. Du må ikke hvirvle pladerne, fordi cellerne vil klynge ind i midten af brønden.
- Pladerne inkuberes ved 27 °C i mindst 1 time for at gøre det muligt at klæbe cellulært til pladen.
- Dispenser 4 mL Sf9-celler med en tæthed på 3,5-4 x 106 i insektserumfrit medium i hver brønd på 24-brønds blokke for at inficere med P1-vira til proteinudtryksscreening.
BEMÆRK: Mærk en brønd af 24-brøndspladerne og 24-brøndsblokkene samt kontrol og brug som en uinficeret kontrol til sammenligning af inficerede og ikke-inficerede celler, når du leder efter SOI. - Brug en programmerbar elektronisk multikanal til at tillade samtidig indsamling af P1-vira (trin 2.1.13), infektion af nyseedede Sf9-celler (trin 3.1.1) og infektion af suspensionscellerne i 24-brøndsblokkene (trin 3.1.4) med 150 μL P1-vira.
- Resten af de indsamlede P1-viruslagre skal spindes ned i 15 minutter ved 17.970 x g, overføre dem til mikrocentrifugerør og opbevare dem i mørke ved 4 °C.
- Rokke forsigtigt de 24-brønds plader (trin 3.1.1) på en frem- og tilbagegående shaker for at sikre en jævn fordeling af de tilsatte P1-vira over cellemonomeren; gentage dette et par gange i inkubationstiden.
- Dæk 24-brøndsblokkene med suspensionskulturen af inficerede Sf9-celler (trin 3.1.4) med et airpore-ark.
- 24-brøndsblokkene inkuberes ved 27 °C, ryster ved 245 omdrejninger i minuttet i 72-96 timer.
- Kig efter SOI inden for 72-96 timer efter infektion tid i 24-brønd plader med P2-vira (trin 3.1.1) og i 24-godt blokke (trin 3.1.4) med inficerede celler til udtrykket screening.
BEMÆRK: 4-5 dage efter infektion af Sf9-celler med P1-vira, soi bør være tydeligt i de inficerede celler i forhold til de ikke-inficerede kontrol celler under et omvendt mikroskop. - P2-vira indsamles fra 24-brøndsplader, centrifuge i 15 minutter ved 17.970 x g,overføres til mikrocentrifugerør og opbevares i mørke ved 4 °C.
- Ved 72-96 h efter infektion, spray over 24-godt blokke med 70% ethanol, bringe ind i laminar flow hætte, og kontrollere celletæthed og levedygtighed i et par brønde ved Trypan Blue farvning.
- Fortsæt til proteinrensning, hvis cellerne har tegn på infektion og levedygtighed er tæt på 70-75% som vurderet ved Trypan Blue farvning.
- Cellerne centrifugerer 24-brøndsblokkene ved 525 x g ved 4 °C i 15 min. Supernatanten kasseres, og pellets suspenderes grundigt i 1 mL lysisbuffer bestående af 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5% glycerol (v/v) og 1x protease inhibitorcocktail (100x proteaseinhæmmercocktail består af aprotinin 0,25 mg/mL, leupeptin 0,25 mg/mL, pepstatin A 0,25 mg/mL; E-64 0,25 mg/mL).
- Celleaffjedringen opbevares ved -80 °C med henblik på efterfølgende rensning af prøven (se 3.2.2).
- Proteinrensning fra frossen celleaffjedring i 24-brønds testudtryksblokke.
- Samling af bindingsblokken (figur 3).
- Placer 3 overlappende lag af parafilm på toppen af den 96-dybe brøndblok (96-dyb brønd 2,4 mL).
- Placer en 96-brønds filterplade (filtermikroplade, 96-brønd, polypropylen med 25 μm ultrahøj molekylvægt polyethylenmembran) på toppen af den 96 dybe brøndblok.
- Skub filterpladen ned for at fastgøre spidserne ind i parafilmen for at forsegle filterpladen fra den 96-brønd dybe blok.
- 50 μL forbehandlet 50% Ni-NTA harpiks gylle overføres til hver brønd på filterpladen.
- Test af udtryksprocedure
- Placer den frosne celle suspension (trin 3.1.15) til stede i 24-brønd blokke i et vandbad på RT i 5-10 min, derefter ryste ved 450 omdrejninger i minuttet i 20 min.
- Centrifuge de 24-brønd blokke på 3.275 x g i 15 min.
- Ved hjælp af en multikanalpipette overføres de ryddede lysater til en filterplade, der indeholder 50 μL for ekvilibreret 50% Ni-NTA harpiks gylle (trin 3.2.1.4) og forsegler filterpladen med en 96-brønds kapselmåtte (96-brønds hættemåtte, til brug med firkantet godt, 2 mL).
BEMÆRK: Brug et par elastikker til at holde bindingsblokken sammen under inkubations- og centrifugeringstrin. - Placer den sikrede bindingsblok i 45-60 minutter i en rotator i et kølerum for at inkubere ryddede lysater med Ni-NTA harpiks.
- Efter inkubation løftes filterpladen forsigtigt, og parafilmlaget fjernes fra overfladen af den 96 dybe brøndblok (trin 3.2.1.1).
- Placer filterpladen tilbage oven på den 96 dybe brøndblok, og drej den sikrede indbindingsblok ned i 2 min ved 235 x g.
- Vask obligation Ni-NTA harpiks 2x med 2 mL vaskebuffer bestående af 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol og 15 mM imidazol.
- Drej blokken ned med vaskebuffer hver gang i 5 min ved 235 x g for at sikre fuldstændig fjernelse af restvæske.
- Filterpladen overføres oven på PCR-pladen på 96 brønd, der indeholder 10 μL 4x belastningsfarvestof.
- Der tilsættes 40 μL elueringsbuffer (25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) til hver brønd af filterpladen og inkuberes i 5 min.
- Spin ned blokken til elute proteiner i 96-brønd PCR plade på 235 x g i 10 min.
- Den 96-brønds PCR-plade forsegles med højtemperaturbestandig tappad og opvarmes ved 98 °C i 3 min.
- 15 μL eluterede proteinprøver indlæses i laemmlibufferen, der er standard, på 4-20% SDS-PAGE-gel ved siden af proteinstigen, og gelen køres med standardløbsbuffer, der indeholder SDS.
- Plette gelen med Coomassie blå og de-pletten med vand. Analyser resultaterne af testudtryk for at identificere de bedste udtrykskonstruktioner til storproduktion.
- Samling af bindingsblokken (figur 3).
4. Præparater af de baculovirusinficerede insektceller (SCBIIC) til proteinproduktion
- 4 dage før den planlagte produktionstid split eksponentielt voksende Sf9 celler til en endelig celletæthed på 2 x 106 celler / mL i 125 mL / 250 mL / 500 mL Erlenmeyer glas ryste kolber med bafler i 50 mL / 100 mL / 200 mL insekt serumfri medium indeholdende 1% (v/ v) endelig antibiotika-antimykotisk.
- Der tilsættes 0,150 mL / 0,300 mL / 0,6 mL passende P2-vira, inkuber inficerede celler ved 165 omdrejninger i minuttet på en orbital shaker med et en-tommers slagtilfælde og ved en lavere temperatur på 25 °C for at bremse celledelingen.
- På 4 dage efter infektion, kontrollere celler under et mikroskop for SOI og fortsætte med at produktionen, hvis cellen levedygtighed som verificeret med Trypan Blue pletten er tæt på 70-75%.
5. Sf9 cellepræparater til storstilet proteinproduktion
- 4 dage før den planlagte produktionstid skal du beregne den krævede mængde Sf9-celler til storstilet proteinproduktion.
- Frø 2 L af eksponentielt voksende Sf9 celler i Insect Serum-Free Medium til en celletæthed på 1 x 106 celler / mL i 2,8 L Fernbach ryste kolber.
- Kolber i 27 °C med rystelse indstillet til 150 omdrejninger i minuttet.
BEMÆRK: For at undgå bakteriel kontaminering i Sf9-cellekulturen skal der anvendes gentamicin til en endelig koncentration på henholdsvis 10 μg/mL eller penicillin/streptomycin til henholdsvis 50 U/mL og 50 μg/mL.
6. Infektion af Sf9-cellerne med SCBIIS til den store proteinproduktion
- Split 2 L eller 4 L af eksponentielt voksende Sf9 celler i Insect Serum-Free Medium til en endelig celletæthed på 4 x 106 celler / mL i 2,5 L Tunair ryste kolber eller 5 L reagensflasker.
- Tilsæt 10-12 mL/l af den baculovirus-inficerede insektcelle (SCBIIC) suspensionskultur.
- Inkuber den inficerede kultur af Sf9-celler på en shaker med 145 omdrejninger i minuttet ved den lavere temperatur på 25 °C (for at bremse celledeling) i 72-96 timer.
- Ved 72 timer efter infektion skal du kontrollere celler under et mikroskop for SOI og vurdere celle levedygtighed.
- Normalt, efter ca 72 timer efter infektion, levedygtigheden af Sf9 celler falder til 70%-75% (målt ved hjælp af Trypan Blue plet). Inficerede Sf9-celler høstes i en 1 L polypropylenflaske ved centrifugering ved 900 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Resuspend cellepille indsamlet fra 1 L af produktionen cellekultur med 20-25 mL 1x PBS ved forsigtigt hvirvlende og overføre til 50 mL koniske rør.
- Drej celleaffjedringen ned ved 900 x g i 15 minutter, og kassér PBS-opløsningen.
- Genbrug den vaskede celle pellet med 20-25 mL af suspensionen buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 1x protease inhibitor cocktail) og flash fryse i flydende nitrogen; opbevares ved −80 °C indtil rensning.
BEMÆRK: Rensningsprocedurerne for PRMT'erne er beskrevet detaljeret i det offentliggjorte dokument6fra SGC .
Representative Results
En oversigt over BEVS-protokollen er skitseret i figur 1. Flere udtrykskonstruktioner af PRMT'er, herunder domæner i fuld længde og afkortede fragmenter, blev genereret på Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) i henhold til interne strategier med et forsøg på at øge succesraten for at identificere opløselige og stabile proteiner med et relativt højt udtryksniveau7,9. Interesserede læsere opfordres til at gennemgå SGC's definitioner og metode til at designe et "fragment" som segmentet for gensekvensen indarbejdet i et udtryk klon, "domæne" som en PFAM-kommenteret strukturelle domæne, og "konstruere" som fragmentet klonet i et udtryk vektor, som alle er blevet beskrevet i detaljer i en tidligere publikation7. Ekspressionskonstruktioner af PRMT'er, der præsenteres i denne protokol, er til produktion af de polyhistidinmærkede proteiner, der er klonet til pFBOH-MHL-vektoren, som er afledt af pFastBac1-vektoren. I figur 4præsenterer vi SDS-PAGE-analyse af de his-mærkede opløselige konstruktioner af PRMT1, 2, 4-9 renset fra pellets indsamlet efter 4 mL produktion i Sf9-celler (trin 3.1.4). PRMT1 og PRMT9 i fuld længde er ikke præsenteret i denne gel, da FL PRMT1 er fremstillet af E. coli, og FL PRMT9 fremstillet af BEVS er blevet renset af Flag-tag6. De afkortede konstruktioner af PRMT1, FL PRMT4 og alle PRMT8-konstruktionerne viser et relativt højt udbytte, men proteineluter indeholder fraktioner af rensede forurenende stoffer. Disse konstruktioner kræver yderligere optimering af rensningsprotokollerne. Der er således behov for yderligere metoder til at forbedre renheden af disse proteiner fra opskaleringsproduktioner, såsom en reduktion i mængden af nikkelperler på inkubationsstadiet med et afklaret lysat; en forøgelse af imidazolkoncentrationerne i vaskebufferne kavalergang af His-tag med TEV protease, efterfulgt af ansøgning om en Ni-affinitet harpiks; og yderligere rensningstrin såsom størrelsesudelukkelse og ionbytningskromatografi. Konstruktionerne af PRMT2 viser betydeligt lavere udbytte sammenlignet med andre proteiner og PRMT2-protein i fuld længde ledsaget af et stærkt forurenende bånd. Opskaleringsproduktion og to trin af rensninger som IMAC og størrelsesudelukkelse bekræftede et lavt udtryksniveau for denne konstruktion sammen med den vedvarende tilstedeværelse af det medrensende forurenende stof til FL-proteinet. Der er opnået rene proteiner til PRMT5-komplekset, der er produceret og renset med dets forpligtende bindepartner, MEP50. Den afkortede konstruktion af PRMT9 har næsten to eller tre gange lavere udtryksniveau, tæt på 1,5 mg/l, sammenlignet med andre PRMT'er. Ikke desto mindre er de rekombinante virale lagre af denne konstruktion blevet brugt til opskaleringsproduktion, diffrerende krystaller blev opnået, og strukturen blev løst for dette protein sammen med PRMT4, 6 og 7 (Figur 5).
Til opskaleringsproduktionerne blev de tilsvarende P2-vira brugt til at inficere suspensionskulturen i Sf9 insektceller. Dette trin genererer 50/100/200 mL baculovirus-inficerede celler, der indeholder inficerede celler og P3-vira i supernatanten. Til den store proteinproduktion blev 2 L Sf9-celler dyrket i hver af 2,8 L Fernbach-shakekolber ved 150 omdrejninger i minuttet, 27 °C (figur 6). På produktionsdagen var 2 L sf9-celler (cellegabilitet > 97 %) I 2,5 L Tunair-rystekolber eller 4 L i 5 L blev reagensflasker fortyndet til en celletæthed på 4 x 106/mL. Disse celler blev inficeret direkte med 10-12 mL/L suspensionskultur af baculovirusinficerede insektceller og inkuberet ved en sænket temperatur på 25 °C ved 145 omdrejninger i minuttet. Infektion i produktionspartiet direkte med en suspensionskultur af baculovirusinficerede insektceller reducerede betydeligt besværlige og tidskrævende trin i virusvolumenforstærkning, bortset fra ekstra håndtering af de inficerede celler, og undgik reduktion i titer- og virusforringelse. SF9 cellekultur vedligeholdelse og opskalering produktion er blevet gjort i kulturen fartøjer med en høj fylde volumen til at vedtage en storstilet proteinproduktion i den ene batch (Figur 6).
PRMT 4, 5 i fuld længde (i kompleks med MEP50), 6, 7 og 9 proteiner fremstillet af den baculovirus medierede produktionsplatform er blevet brugt til kinetisk karakterisering og hæmmer sammensatte screening på SGC6. Krystalstrukturer blev løst og deponeret i Protein Data Bank (PDB) for fuld længde eller afkortede former af proteinerne PRMT 4, 6, 7 og 9 med forskellige kemiske sonder og hæmmere. Udtryksplasmider for disse PRMT'er blev deponeret i Addgene plasmid-lageret (Addgene er distributionspartner for SGC, https://www.addgene.org/) og er tilgængelige for forskersamfundet (Figur 5).
Figur 1: Skematisk oversigt over trinnene i baculovirusudtryksprocessen Klik her for at få vist en større version af dette tal.
Figur 2: Baculovirus inficerede og uinficerede Sf9-celler. Tegn på infektion er strukturelle ændringer i insektcellerne, såsom en 25-50% stigning i cellediameteren, forstørrede cellekerner, ensartet afrundet form, tab af spredning og overholdelse af kulturens skåloverflade samt et fald i celle levedygtighed. Hvid skala 200 μm. De tegn på infektion, der præsenteres her, er de samme for de transfected celler ved hjælp af både transfekt reagenser, JetPrime og X-tremeGene 9. Det viste eksempel er jetprimetransfektens reagens. (A)Uinficerede Sf9-celler som et kontrolelement. (B) Baculovirus-inficerede Sf9-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Indbindingsplademontering til hurtig rensning af testudtryksproteiner. Yderligere oplysninger finder du i trin 3.2.1-2 Klik her for at få vist en større version af dette tal.
Figur 4:Resultaterne af screeningen af proteinudtryk. Proteinudtryksscreeningsresultater af den baculovirusmedierede proteinproduktion i 4 mL Sf9-suspensionskultur inficeret med tilsvarende P1-rekombinantvirus til forskellige PRMT'er og PRMT5-MEP50-komplekset. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Resumé af udtrykskonstruktioner for PRMT4, 6, 7 og 9, der anvendes til krystalstrukturstudier på Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Krystalstrukturerne blev løst og deponeret i Protein Data Bank (PDB) for den fulde længde eller afkortede former af proteiner PRMT 4, 6, 7 og 9 med forskellige kemiske sonder og hæmmere. Expression plasmids for disse PRMT'er blev deponeret i Addgene plasmid-lageret og er tilgængelige for forskersamfundet (Addgene er en distributionspartner for SGC, https://www.addgene.org/). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Bevarelse af insektceller og proteinproduktion i de forskellige kulturbeholdere: (A) 2,8 L Fernbach-kolbe til cellevedligeholdelse og proteinproduktion. Brugen af 72% fyldvolumen øger gennemløbshastigheden med 2,5 gange i en rysteplatform. (B) Tunair shakekolber (kun 9 kolber ud af 10 er præsenteret på dette billede) og reagensflasker med en påfyldningsvolumen på 80% øger drastisk rysteplatformens produktionskapacitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
En af fordelene ved BEVS i insektceller er centreret om evnen til den post-translationelle modifikation maskiner til at muliggøre mere komplekse ændringer såsom fosforylering, myristoylering, og glykosylering. Sammen med den meget effektive foldning af pattedyrproteiner letter disse modifikationer store mængder modificeret og foldet protein, der er egnet til fysiologisk relevante downstream-forsøg16.
Her beskrev vi detaljerede protokoller for BEVS, der understreger kritiske elementer til vellykket ekspressionsscreening af flere konstruktioner af PRMT-proteiner og storstilet PRMT-proteinproduktion i Baculovirus-udtryksplatformen: 1) Brugen af regelmæssige, justerbare og programmerbare multikanalpipetter til at overføre de biologiske materialer mellem 24- og 96 - brøndcellekulturplader og blokke på stadierne af bacmid DNA og virusgenerering; en samling af rekombinant virus, forstærkning af virale mængder af rekombinant virus og forberedelse af proteinudtryksscreeningsblokkene. 2) Højtydende og omkostningseffektivt transfekt reagenser til fremstilling af rekombinante vira. 3) Suspensionskultur af baculovirusinficerede insektceller (SCBIIC) til storstilet proteinproduktion. 4) Udnyttelse af højfyldningsvolumen 2,8 L Fernbach-rystekolber til opretholdelse af Sf9-affjedringskultur og 2,5 L Tunair-rystekolber og 5 L reagensflasker til storproteinproduktion.
Særlige overvejelser og begrundelser for transformations- og transinfektionstrinnene.
Selv om en kommerciel protokol anbefaler at anvende 100 μL kompetente celler til en transformation14, er transformationseffektiviteten af kommercielle DH10Bac E. coli-kompetente celler helt oppe på 1 x 108 cfu / μg DNA, så vi bruger kun 4 μL. Dette er nok for hver transformant til at opnå isolerede hvide rekombinant kolonier for bacmid DNA isolation. Klæbende Sf9-celler i 24-brønds transfektpladen blev seedet ved en celletæthed på 2 x 105 / mL i 0,5 mL Serum-Free Insect Media. Dette volumen er nok til at sikre jævn dækning af brøndens arbejdsflade. Samtidig fortynder det ikke transfektblandingen for meget, hvilket øger transfekteffektiviteten. Transfektreagenser er ikke-giftige for Sf9-cellerne, og medieudveksling er ikke nødvendig. I stedet for en medieændring tilføjes yderligere 1,5 mL medier, der indeholder 10% (v/v) FBS, i transfekturepladen ved 4-5 timers post-transinfektionstid for at lette cellevæksten. Transfekteffektiviteten af begge transfektreagenser er høj. Stadig, med X-tremeGene 9, vises tegn på infektion i de transfected celler (Figur 2) 10-12 timer tidligere end med JetPrime reagens, så vi vælger mellem disse reagenser afhængigt af arbejdsplanen for de næste trin i protokollerne, hvilket giver en vis fleksibilitet i den samlede proces.
Screening af proteintestudtryk kan sættes op med P2-vira, hvis mængden af de oprindelige rekombinante vira, der er indsamlet fra transfekturepladen og mærket som P1, er en begrænsende faktor, der skal anvendes til proteinudtryksscreeningen.
Overvejelser, når du flytter fra små til store kulturmængder.
Historisk set blev det antaget, at optimal cellevækst kræver et højt luftrum i suspensionskulturen af Sf9-cellevedligeholdelse og opskaleringsproduktioner. I 2014 blev det imidlertid rapporteret, at højt luftrum i kulturfartøjer er mindre kritisk end tidligere antaget17. En kulturbeholder, der er oprettet ved hjælp af passende justeret rystehastighed til rysteplatformens kredsløbskast, vil give tilstrækkelig iltoverførsel selv i højfyldningsvolumenaffjedringskulturen ved at skabe og opretholde små luftbobler i længere tid. Med denne tilgang kan kommercielt tilgængelige insektceller dyrkes ved en højere rystehastighed inden for et normalt område af cellernes fordoblingstid uden at ofre høj celle levedygtighed.
For 6 år siden begyndte vi således at øge suspensionskulturvolumenet i en rystekolbe under cellevedligeholdelse og introducerede en anden type dyrkningsbeholder til proteinproduktion, mens vi justerede og overvågede rysteforholdene (Figur 6). For at etablere optimale forhold i disse kulturkar overvågede vi Sf9-cellekulturparametrene såsom cellesplitningstid sammen med celle levedygtighed, størrelse og form, aggregeringstilstand og infektiøsitet af celler.
For eksempel, for Sf9 celle vedligeholdelse, i 2,8 L Fernbach ryste kolber, vi kultur 2 L i stedet for 0,8 L af Sf9 suspension celler ryster ved 150 omdrejninger ved 27 °C og celle levedygtighed det meste af tiden er tæt på 99%, med jævnt formede sunde dividere celler. Til opskaleringsproduktion inficerer vi 4 L celler i 5 L reagensflasker, der ryster ved høj hastighed som 145 omdrejninger i minuttet ved en sænket temperatur på 25 °C. De mest almindeligt anvendte inkubatorer med indbygget rysteplatform kan rumme 6 x 2,8 L shakekolber eller 6 x 5 L reagensflasker eller 10 x 2,5 L Tunair-shakekolber. Således er kapaciteten på den ene rysteplatform, hvis vi fylder Fernbach shakeflasker og reagensflasker til 1/3 i forhold til beholdernes store påfyldningsvolumen, 4,8 L mod 12 L ved hjælp af 2,8 L Fernbach-rystekolber og 10 L mod 24 L ved hjælp af 5 L reagensflasker (Figur 6). Suspension cellekultur vedligeholdelse og opskalering produktion i kulturen fartøjer med en høj-fyld volumen har hjulpet os med at overvinde begrænsninger i produktionen mængder og vedtage en storstilet platform. Dette er således meget nyttigt for laboratorier uden adgang til bioreaktorer og / eller begrænset plads i produktionspipelinerne.
Denne protokol kunne let tilpasses til produktion og rensning af proteinkonstruktioner med forskellige affinitetsmærker ved at anvende passende harpikser og ændre rensningsbuffere, som det er beskrevet i SGC offentliggjort papir6 for de flagmærkede proteiner i fuld længde af PRMT4, 7, 9 og Hans-mærkede PRMT5-MEP50-kompleks og PRMT6. Selvom vi beskriver en BEVS-protokol for PRMT-familien af proteiner, kan den samme tilgang anvendes på enhver anden proteinfamilie.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dalia Barsyte-Lovejoy for at have taget sig tid til at give værdifuld feedback og kritiske kommentarer til manuskriptet og alle vores SGC-kolleger, der arbejdede med PRMT-proteinfamilien udtrykt fra Baculovirus Expression Vector System.
SGC er en registreret velgørenhedsorganisation (nummer 1097737), der modtager midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gennem Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gennem Joint Undertaking 2 (EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (alias EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
| 24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
| 4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
| 50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
| 96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
| 96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
| Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
| Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
| Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
| Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
| Beckman JLA 8.1000 | |||
| Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
| Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
| Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
| ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
| dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
| E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
| E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
| Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
| Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
| Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
| I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
| InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
| Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
| JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
| Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
| Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
| Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
| Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
| mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
| Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
| New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
| RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
| Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
| RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
| Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
| Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
| Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
| Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
| Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
| VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
| VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
| VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
| VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
| X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and relevance of arginine methylation. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S.
- Lorton, B. M., Shechter, D.
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
- Frankel, A., Brown, J. I. Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs. Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).
- Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. Chemical probes for protein arginine methyltransferases. Methods. 175, 30-43 (2020).
- Savitsky, P., et al. High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience. Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).
- Gileadi, O., et al. Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation. New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).
- Graslund, S., et al.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
- Jarvis, D. L.
- Shrestha, B., et al. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).
- Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).
- Invitrogen Life Technologies. Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , Invitrogen Life Technologies. Carlsbad. (2010).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).
- Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. Protein Production Using the Baculovirus Expression System. Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).
- Rieffel, S., et al. Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX. 1, 155-161 (2014).
