Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Proteomisk profil av EPS-urin gjennom FASP fordøyelse og datauavhengig analyse

Published: May 8, 2021 doi: 10.3791/62512
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1, 4, 1
1Research Centre for Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Graecia University of Catanzaro, 2Department of Health Science, Magna Graecia University of Catanzaro, 3Romolo Hospital, 4Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Graecia University of Catanzaro

Summary

Her presenterer vi en optimalisert fordøyelsesprotokoll på filteret med detaljert informasjon om følgende: protein fordøyelse, peptidrensing og datauavhengig anskaffelsesanalyse. Denne strategien brukes til analyse av uttrykte prostatiske sekreter-urinprøver og tillater høy proteomdekning og lav manglende verdi etikettfri profilering av urinproteomet.

Abstract

Filterassistert prøveprotokoll (FASP) er mye brukt til proteomics prøvepreparering fordi det gjør det mulig å konsentrere fortynnede prøver, og det er kompatibelt med et bredt utvalg av vaskemidler. Nedenfra-og-opp-proteomiske arbeidsflyter som FASP er i økende grad avhengige av LC-MS/MS-metoder utført i datauavhengig analysemodus (DIA), en skannemetode som tillater dyp proteomdekning og lav forekomst av manglende verdier.

I denne rapporten vil vi gi detaljer om en arbeidsflyt som kombinerer en FASP-protokoll, et dobbelt StageTip-rensetrinn og LC-MS/MS i DIA-modus for urinproteomkartlegging. Som modellprøve analyserte vi uttrykte prostatiske sekreter (EPS)-urin, en prøve samlet inn etter en digital rektal eksamen (DRE), som er av interesse for oppdagelsesstudier av prostatakreftbiomarkør.

Introduction

Den konstante utviklingen av proteomiske teknologier lover å ha en betydelig innvirkning på å hjelpe sykdomsdiagnose og prediksjon av respons på behandling ved å gi høyoppløselige kart over viktige molekylære effektorer tilstede i et bredt utvalg av prøver som vev og biofluider. Fra et analytisk synspunkt tilbyr urin flere fordeler som enkel innsamling og stor stabilitet av proteomet med hensyn til andre biofluider1. Proteomisk analyse av urin er av spesiell interesse for biomarkøroppdagelsesstudier på urologiske kreftformer, siden det tillater ikke-invasiv prøvetaking i nærheten av vev av interesse2. Spesielt er en prøve som ser ut til å være lovende for å studere prostatarelaterte patologier EPS-urin3,4 (dvs. en urinprøve samlet inn etter en digital rektal eksamen (DRE)). Denne sistnevnte operasjonen før prøveinnsamling beriker urin med prostataspesifikke proteiner. EPS-urin er en god kandidat til å undersøke lidelser relatert til prostatakjertelen5 inkludert prostatakreft (PCa), siden gjennom DRE kan proteiner utskilt av svulsten helles i urinprøven, noe som øker sjansen for å oppdage kreftvevsspesifikke proteiner.

En avgjørende rolle i å tillate deteksjon og kvantifisering av potensielle proteinbiomarkører spilles av massespektrometri (MS). I løpet av de siste to tiårene har MS-baserte protokoller for proteomisk analyse gjort det mulig å oppdage et stadig økende antall proteiner i en enkelt LC-MS/MS-kjøring takket være kontinuerlige forbedringer i MS-instrumentering og i dataanalyseprogramvare6.

MS-basert proteomisk prøvepreparering innebærer generelt enzymatisk fordøyelse av proteinblandingen, som kan oppnås via et bredt spekter av protokoller som: fordøyelse i løsningen, MStern blotting7,suspensjonsfangst (S-felle)8, solidfaseforbedret prøvepreparering (SP3)9, in-StageTip fordøyelse10 og filterassistert prøvepreparering (FASP)11. Alle protokoller kan brukes til urinproteomikk, selv om resultatene kan variere med hensyn til antall identifiserte proteiner og peptider og når det gjelder reproduserbarhet12.

I dette arbeidet var vår oppmerksomhet fokusert på analysen av EPS-urin av FASP-protokollen. FASP-protokollen ble opprinnelig designet for å analysere proteiner hentet fra vev og cellekulturer, men bruken ble deretter utvidet til analyse av andre prøvetyper, for eksempel urin13. Med hensyn til enkel fordøyelse i løsningen FASP er en mer fleksibel proteomisk tilnærming14, siden ved å oppnå effektiv fjerning av vaskemidler og andre forurensninger som salter fra proteinblandingen før enzymatisk fordøyelse15, tillater det valg av optimale proteinløsningsforhold. Videre er en ekstra egenskap ved FASP at den gir et middel for prøvekonsentrasjon. Dette er spesielt interessant for urinproteomisk analyse, fordi det gjør det mulig å starte fra relativt store prøvevolumer (hundrevis av mikroliter). I lys av potensialet i FASP-protokollen har flere studier fokusert oppmerksomheten på arbeidsflytautomatisering, med sikte på å redusere eksperimentell variasjon og behandle et forhøyet antall prøver parallelt16.

I arbeidsflyten vår etterfølges FASP av LC-MS/MS-anskaffelse i datauavhengig analyse (DIA), som gir høy proteomdekning, god kvantitativ presisjon og lav forekomst av manglende verdier. DIA-tilnærmingen er en sensitiv metode der alle ioner velges for MS/MS-hendelser, motsatt av hva som skjer i dataavhengig analyse (DDA) der bare ioner med høyest intensitet fragmenteres. Massespektrometeret, som opererer i DIA-modus, utfører skannesykluser med forskjellig isolasjonsbredde som dekker hele m / z forløperområdet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å reprodusere et høyt antall peptider per enhetstid, noe som gir et proteomisk øyeblikksbilde avprøven 17. Videre har data generert av DIA en annen interessant egenskap: muligheten for en posteriorianalyse 18. DIA-data er mer komplekse enn de som er innhentet av DDA, fordi MS/MS-spektra i DIA er et resultat av samtidig isolering av flere forløperioner i hvert m/z-vindu 19. Disentangling kompositt MS / MS spektra i distinkte og spesifikke peptid signaler oppnås ved hjelp av to grunnleggende elementer: et spektral bibliotek og en dedikert programvare for dataanalyse. Spektralbiblioteket genereres av et dataavhengig eksperiment, som vanligvis involverer peptidfraksjonering for å maksimere proteomdekningen, som gir en liste over tusenvis av eksperimentelt bestemte forløperioner og MS /MS-spektra av peptider som kan påvises i prøven som vurderes. Dataanalyseprogramvaren bruker i stedet informasjonen i spektralbiblioteket til å tolke DIA-dataene ved å generere spesifikke ekstraherte ionkromatogrammer som tillater peptiddeteksjon og kvantifisering. Selv om biblioteksfri DIA-dataanalyse nå er mulig, gir bibliotekbasert DIA fortsatt bedre resultater når det gjelder proteomdekning20.

Prøveprepareringsprotokollen her beskrevet (figur 1) består av følgende trinn: et sentrifugeringstrinn (for å fjerne celleavfall), FASP-fordøyelse, StageTip rensing21, kvantifisering av proteiner og DIA-analyse. Denne protokollen er designet for analyse av EPS-urin i sammenheng med biomarkøroppdagelse av prostatakreft, men den kan brukes til proteomisk analyse av enhver urinprøve.

Protocol

Studien ble godkjent av Institutional Ethical Committee ved Magna Graecia University of Catanzaro, RP 41/2018. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som deltok i studien.

1. Prøvepreparering

  1. Sentrifuger EPS-urinprøver innen 2 timer ved innsamling ved 2100 x g i 10 minutter ved romtemperatur (RT). Oppbevar supernatanten ved -80 °C til bruk.

2. Prøve tining

  1. Overfør prøven fra -80 °C til -20 °C dagen før fordøyelsen.
  2. Før prøvebehandling, overfør prøven i 15-20 minutter ved 4 °C og deretter ved RT.

3. Reagensforberedelse for FASP

  1. På samme dag, forberede følgende løsninger: urea buffer, 50 mM iodoacetamid (IAA) i urea buffer, 50 mM triethylammonium bikarbonat og 500 mM dithiothreitol (DTT).
  2. Forbered ureabuffer (urea 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): For 10 ml, vei 4800 mg urea og oppløs den i riktig mengde HPLC-vann etter tilsetning av 1 ml 1 M Tris pH 8. Et volum på 800 μL urea er nødvendig for hver prøve.
  3. Forbered 500 mM dithiothreitol (DTT): løs opp 38,5 mg DTT i 500 μL HPLC-vann. For hver prøve er det nødvendig med 66,7 μL DTT.
  4. Forbered 50 mM IAA i Urea Buffer: løs opp 9,25 mg IAA i 1 ml ureabuffer. For hver prøve er det nødvendig med 50 μL IAA.
  5. Forbered 50 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB). Tilsett 150 μL 1 M TEAB til 2,85 ml HPLC-vann. For hver prøve er det nødvendig med 460 μL TEAB.
  6. Forbered en løsning av trypsin (100 ng/μL) i HPLC-vann. Denne oppløsningen kan oppbevares ved -80 °C og tines umiddelbart før bruk. For hver prøve er det nødvendig med 2 μL (200 ng).

4. Protein fordøyelse av FASP

  1. Fortynn 500 μL av hver EPS-urinprøve med 66,7 μL 10 % (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), 66,7 μL 500 mM DTT og 33,3 μL 1 M Tris pH 8 for å løse proteiner og redusere disfiledebindinger. Inkuber 10 minutter ved 95 °C med skånsom risting.
  2. Tilsett 300 μL fortynnet EPS-urinprøve på filterenheten (10 kDa) og sentrifuge ved 14 000 x g i 20 minutter.
  3. Tilsett 200 μL ureabuffer i filteret og sentrifugen ved 14 000 x g i 15 minutter. Gjenta dette trinnet, og kast deretter gjennomstrømningen.
  4. Tilsett 50 μL IAA-oppløsning og sentrifuge ved 6000 x g i 25 minutter.
  5. Tilsett 200 μL ureabuffer og sentrifuge ved 14 000 x g i 20 minutter. Gjenta dette trinnet, og kast deretter gjennomstrømningen.
  6. Tilsett 200 μL 50 mM trietylammoniumbikarbonatbuffer (TEAB) og sentrifuge ved 14 000 x g i 20 minutter. Gjenta dette trinnet.
  7. Overfør filterenheten til et nytt oppsamlingsrør.
  8. Tilsett 60 μL 50 mM TEAB buffer og 200 ng trypsin og inkuber prøven i en termoblander ved 37 °C over natten.
    MERK: For å unngå prøvefordampning under inkubering over natten, pakk hver filterenhet med et lag aluminiumsfolie og deretter et lag med parafilm.
  9. Etter trypsininkubasjon, tilsett 140 μL vann og sentrifuger hetteglasset ved 14.000 x g i 25 minutter for å samle volumet av fordøyelse (180-200 μL).

5. Reagenspreparat for SCX-rensing

  1. Forbered 1 ml vask 1 (0,5% maursyre (FA) og 20% acetonitril (ACN)) som følger: Tilsett 50 μL 10% FA og 200 μL 100% ACN til 750 μL HLPC vann. For hver prøve er det nødvendig med 100 μL vask 1.
  2. Forbered 1,5 ml vask 2 (0,5% FA og 80% ACN) som følger: Tilsett 75 μL 10 % FA og 1,2 ml 100 % ACN til 225 μL HPLC-vann. For hver prøve er det nødvendig med 190 μL vask 2.
  3. Forbered 100 μL elutingsløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% ACN): tilsett 25 μL 2 M AA og 20 μL 100% ACN til 55 μL HPLC-vann.
  4. Forbered trinntips på følgende måte.
    1. Pakk en 200 μL pipettespiss med et lag SCX-harpiks med en stump sprøytenål (måler 16). Sett StageTip inn i et mikrocentrifugelokk som tidligere er gjennomboret for å imøtekomme mikrokolumnen.
    2. Monter lokket på en 2 ml mikrosenter som det originale lokket ble fjernet fra. Micro-SPE sentrifugalenheten som nettopp er montert, skal passe inn i en sentrifuge på benken. Siden perforerte lokk er kjedelige å forberede, kan de brukes flere ganger.

6. SCX rensing

  1. Fortynn 30 μL av hver prøve til 120 μL ved hjelp av vask 2.
  2. Kondisjoner StageTip ved å tilsette 50 μL vask 1 på toppen av ekstraksjonsharpiksen og sentrifugen ved 400 x g i 2 minutter. Siden strømningsmotstanden avhenger av hvor sterkt ekstraksjonsharpiksen ble pakket inn i pipettespissen, kan sentrifugeringshastigheten måtte justeres for å oppnå en strømningshastighet på 20-30 μL / min. Prøv å ikke la spissen være tørr under prøvelasting og vasking.
  3. Likevekt StageTip med 50 μL vask 2 og sentrifuger ved 400 x g i 2 minutter.
  4. Last den fortynnede prøven (120 μL) med lavere spinnhastighet.
  5. Vask StageTip med 50 μL vask 2 og sentrifuger ved 400 x g i 2 minutter. Gjenta med 50 μL vask 1.
    MERK: Etter denne vasken må harpiksen være helt tørr.
  6. Elute peptidblanding med 7 μL eluate oppløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% av ACN) langsomt ved hjelp av lavere spinnhastighet.
  7. Tilsett 27 μL 0,1 % FA for å fortynne AA og for å få en prøve for LC-MS/MS foreløpig injeksjon. Den endelige fortynning til 34 μL vil resultere i et 1: 1 volumetrisk forhold mellom urin og peptidoppløsning (1 μL renset fordøye vil tilsvare 1 μL original urinprøve).

7. Protein kvantifisering etter ekstern standard ved hjelp av DDA analyse (Figur 2)

  1. Bestem proteinmengden i prøver ved å injisere 2 μL av det resulterende peptidsammendraget i LC-MS/MS og interpolere det resulterende totale peptidområdet med en kalibreringskurve bygget som følger:
  2. Forbered fem forskjellige HeLa-fordøyeløsninger (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) ved hjelp av en HeLa-sammendragslager (100 μg/μL).
  3. Injiser hver Hela-løsning i duplikat (2 μL).
  4. Angi LC-MS/MS-metoden.
    1. Injiser 2 μL av de fem HeLa peptidblandingene og separer peptider gjennom en lineær gradient på 75 minutter med en strømningshastighet på 230 nL/minutt på en 15 cm, 75 μm i.d kolonne fullpakket med 3 μm C18 silikapartikler. Bruk en binær gradering som utgjøres av mobil fase A (0,1 % AKTIVA, 2 % ACN) og mobil fase B (0,1 % AKTIVA og 80 % av ACN).
    2. Utfør gradient elution ved å øke mobil fase B-innhold fra 6% til 42% på 60 minutter og fra 42% til 100% i ytterligere 8 minutter. Vedlikehold i 5 minutter 100 % B, og flytt deretter tilbake til 0 % B på to minutter.
    3. Bruk i DDA-modus ved hjelp av en topp-12-metode og sett MS full skanneområde til 350-1800 m / z, oppløsning 70,000, ACG-mål 1e6 og maksimal injeksjonstid 50 ms. Sett massevinduet for forløperionisolasjon på 1,6 m/z, oppløsning 35 000, ACG-mål 1e5, maksimal injeksjonstid 120 ms, HCD-fragmentering ved 25 NCE (normalisert kollisjonsenergi) og dynamisk ekskludering 15 sekunder.
  5. Analyser råfiler ved hjelp av Sequest som søkemotor, og HUMAN Uniprot Complete proteinsekvens som database. I eksperimentene som presenteres her, ble databasen lastet ned i mars 2016 og inneholdt 42.013 sekvenser.
    1. Bruk følgende innstillinger: MS-toleranse 15 ppm, MS/MS-toleranse 0,02 Da, trypsin som enzym ved å angi to tapte spaltingssteder. Sett karbiamidometylering av lysin, serin, treonin, tyrosin (+57.021) og oksidasjon av metioniner som dynamiske modifikasjoner og karbamidometylering av cysteiner (+57.021) som statiske modifikasjoner. Bruk avskjæringen av falsk oppdagelsesrate (FDR) for peptider og proteinidentifikasjon til 0,01 og filtrer ut med trakter.
    2. Beregn toppområdet for alle MS1 peptidsignaler. Beregn det totale arealet av peptidene.
  6. Injiser 2 μL peptidblandinger hentet fra EPS-urinprøver ved hjelp av samme LC-MS/MS-metode som brukes til HeLa-prøvene, og analyser råfilen ved hjelp av de samme parameterne som brukes for HeLa-databehandling.
  7. Beregn total intensitet av peptidsignaler ved å summere arealverdier for alle identifiserte peptider og interpolere den eksterne standardkurven. Dette vil gi en akseptabel estimering av peptidmengden som er tilstede i EPS-urinproteinfordøyelsen.

8. Reagensforberedelse for C18 StageTip-protokollen

  1. Forbered 500 μL oppløsning A (0,1% trifluoroedsyre (TFA), 50% ACN): tilsett 250 μL 100% ACN og 10 μL 5% TFA til 240 μL HPLC-vann.
  2. Forbered 2 ml løsning B (0,1 % TFA): Tilsett 40 μL 5 % TFA til 1960 μL HPLC-vann.
  3. Forbered 100 μL eluting løsning (0,1% FA, 50% ACN): tilsett 1 μL 10% FA og 50 μL 100% ACN til 49 μL HPLC vann.
  4. Forbered trinntips som beskrevet tidligere. I dette tilfellet brukes C18-ekstraksjonsdisker.

9. SCX/C18 StageTip-protokoll

MERK: Rens EPS-urinfordøyd etter C18 StageTip-protokollen for å fjerne salter.

  1. Start fra 2 μg peptider (som kvantifisert av den foreløpige injeksjonen). Fortynn fordøyelsesoppløsningen 4 ganger i vask 2 SCX og fortsett som beskrevet ovenfor (i avsnittet "SCX rensing"). Elute peptidblandingen med 7 μL eluateoppløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% av ACN) langsomt ved hjelp av en lavere spinnhastighet (5 μL / min strømningshastighet).
  2. Acidifiser SCX-eluatet med 150 μL 0,1% trifluoroeddiksyre (TFA) for å oppnå en pH lavere enn 3 og en konsentrasjon av organisk løsningsmiddel under 5%.
  3. Kondisjoner C18 StageTip med 50 μL oppløsning A og sentrifuge ved 400 x g i 2 minutter. Likevekt C18 StageTip med 50 μL oppløsning B og sentrifugering ved 400 x g i 2 minutter.
  4. Last prøven på scenespissen langsomt ved hjelp av en lavere spinnhastighet.
  5. Vask C18 StageTip med 50 μL oppløsning B og sentrifuge.
  6. Eliut peptidblandingen langsomt med 10 μL elutionløsning ved hjelp av lavere spinnhastighet.
  7. Tørk eluatet (10 μL) ved 30 °C i en vakuumsentrifuge i 3 minutter. Tilsett 47 μL 0,1% FA. Forventet peptidkonsentrasjon vil være 40 ng / μL. Analyser av LC-MS / MS i DIA-modus.

10. DIA-analyse (figur 3)

  1. nanoLC-separasjon: Skill peptidblandingen ved hjelp av en lineær gradient på 140 minutter med en strømningshastighet på 230 nL/min på en 15 cm, 75 μm ID-kolonne fullpakket med 3 μm C18 silikapartikler.
    1. Utfør gradient elution med 230 nL / minutt strømningshastighet og øk mobil fase B-innhold fra 3% til 25% på 90 minutter, deretter fra 25% til 40% på 30 minutter og til slutt fra 40% til 100% på 8 minutter.
    2. Etter 10 minutter ved 100% B, likevekt kolonnen med mobil fase A i 15 min.
  2. Massespektrometriske parametere: Utfør DIA-analyse ved hjelp av en metode som bruker følgende skannesyklus: (i) en MS-hendelse med full skanning med en oppløsning på 17 500 (AGC-mål 1e6, maksimal injeksjonstid 50 ms) etterfulgt av (ii) 20 vinduer med 20 m/z isolasjonsbredde, fra m/z 350, (ii) 5 vinduer med 50 m/z isolasjonsbredde og (iv) 1 vindu ved 200 m/z isolasjonsbredde, og avslutter skanneområdet til DIA ved 1200 m/z. Utfør DIA-skanninger med oppløsning 35 000 (AGC-mål 5e5, maksimal injeksjonstid 120 ms og 25 NCE).

11. Høy-pH reversert fase C18 fraksjonering for bibliotekgenerering

MERK: Pool EPS-urin representative prøver i en mengde høyere enn 10 μg for å bygge et dataavhengig bibliotek for DIA-analyse ved hjelp av følgende prosedyre:

  1. Forsure peptidblandingen (11 μg) med 0,2% av TFA og last den resulterende løsningen på en C18 StageTip fullpakket med to lag ekstraksjonsskiver for å tillate høyere kapasitet. Vi anslo lastekapasiteten til en enkelt mikrodisk (fra en 16 gauge sprøytenål) å være i 5-10 μg-området.
  2. Tilstand og likevekt stasjonær fase som allerede beskrevet for C18 rensing.
  3. Utfør peptidfraksjonering trinnvis elution (n = 10) fra høy pH reversert fase C18 ved hjelp av elutionløsninger som inneholder 0,2% ammoniumhydroksid, 10 mM TEAB og økende v/v-konsentrasjoner av ACN (4 %, 8 %, 12 %, 16 %, 20 %, 24 %, 28 %, 32 %, 40 %, 80 %).
  4. Analyser de 10 fraksjonene ved hjelp av de samme kromatografiske parametrene til DIA-metoden. Bruk massespektrometeret i DDA-modus ved hjelp av innstillingene som tidligere ble vedtatt for den foreløpige analysen (se "Protein kvantifisering etter ekstern standard ved hjelp av DDA-analyse").

12. Dataanalyse

  1. Generer spektralbiblioteket ved å importere proteinidentifikasjonsresultatene hentet fra DDA LC-MS/MS-eksperimenter med høy reversert fase C18-fraksjonering i en programvare dedikert til DIA-analyse.
  2. Sett minimum og maksimum antall fragmentioner som brukes til identifisering og kvantifisering til henholdsvis 3 og 6. Filtrer de oppnådde resultatene med en Q-verdi på 0,01.
  3. Importer DIA raw-filer og knytt til hver RAW-fil den samme FASTA-filen som brukes til å opprette spektralbiblioteket.
  4. Sett minimum og maksimum antall unike peptider som brukes til protein kvantifisering til henholdsvis 1 og 10.
  5. Beregn intensiteten for hvert protein ved å summere fragmentiontoppområdet.
  6. Generer en matrise med intensiteten av de kvantifiserte proteinene i hver prøve.

Representative Results

Denne protokollen for urinproteomisk analyse inkluderer følgende trinn: FASP-fordøyelse, estimering av proteinmengde via ekstern standardkalibrering, dobbel StageTip-rensing (SCX og C18) og LC-MS/MS-analyse i DIA-modus.

Etter protein fordøyelsen utføres foreløpige injeksjoner etter StageTip SCX rensing av de resulterende peptidene. LC-MS / MS raw-filer behandles for å oppnå antall identifiserte peptider, antall identifiserte proteiner og området med påviste peptider. Det totale arealet oppnådd ved å summere alle identifiserte peptider brukes til å estimere proteininnhold via interpolering til en ekstern standard: et HeLa-proteinsammendrag injisert på fem forskjellige mengder (henholdsvis 2, 5, 15, 50, 150 ng). Proteinmengden for de seks prøvene som ble analysert i denne studien varierte fra prøve til prøve, og viste en gjennomsnittsverdi på 78 ng/μL.

Etter proteinestimering renses 2 μg fordøyde proteiner fra hver prøve av sekvensiell SCX og C18 StageTip før DIA-analyse. Spektralbiblioteket for søking av DIA-data opprettes etter høy-pH reversert fasefraksjonering og DDA LC-MS/MS-analyse av et representativt utvalg (f.eks. et utvalg). Ved hjelp av parametrene beskrevet ovenfor har vi identifisert og kvantifisert, kumulativt, 2387 proteingrupper i de seks EPS-urinprøvene som vurderes (Supplerende tabell 1 og figur 4).

For å evaluere fra et kvalitativt synspunkt relevansen av listen over identifiserte og kvantifiserte proteiner, ble den oppnådde matrisen sammenlignet med en liste over 624 proteiner som tidligere ble identifisert i direkte- EPS22, en prøve samlet inn i en mer invasiv prosedyre, som har vist seg å være en kilde til interessante kandidat prostatakreft biomarkører. Totalt ble 508 av 624 proteiner vellykket oppdaget av vår FASP / DIA-protokoll på EPS-urin.

Figure 1
Figur 1: Proteomisk arbeidsflyt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representasjon av vårt eksperimentelle design for protein kvantifisering basert på ekstern standard (HeLa digest). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Viktige trinn iDIA-analyse: (i) utarbeidelse av spektralbiblioteket gjennom høy-pH reversert fasefraksjonering og DDA-analyse, (ii) prøveanalyse ved hjelp av DIA-tilnærmingen, (iii) dataanalyse av Spectronaut. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Rangert plott for de påviste EPS-urinproteinene. Noen få utvalgte treff er merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell 1: Representativ tabell over kvantifiserte proteiner i seks EPS-urinprøver i Spectronaut. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

I dette arbeidet presenteres en strategi for å analysere EPS-urinprøver. FASP-protokollen er et ideelt valg for urinproteomikk fordi den tillater prøvekonsentrasjon før enzymatisk fordøyelse. Faktisk, ved hjelp av denne arbeidsflyten, kan flere hundre mikroliter urin lastes på et enkelt filter og behandles. Videre gir fordøyelsen på filteret relativ frihet i valg av denatureringsforhold. I vårt arbeid oppnås protein denaturering ved å fortynne urinprøver i en buffer som inneholder Tris, SDS og DTT (sluttkonsentrasjon: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Proteiner denatureres effektivt umiddelbart etter opptining av prøven, for å unngå uønsket nedbrytning ved aktive proteaser. Den opprinnelige FASP-protokollen er forbedret ved å øke volumet av vasker fra 100 μL til 200 μL. På denne måten oppnås bedre fjerning av rester, spesielt vaskemidler fra filteret.

Etter enzymatisk fordøyelse utføres proteinestimering etter ekstern standard ved hjelp av en rask LC-MS/MS, dataavhengig metode før de siste trinnene i protokollen, som består av dobbel StageTip-rensing og LC-MS/MS-analyse i DIA-modus, på likt startmateriale for alle prøver (2 μg).

Allsidigheten til FASP er knyttet til DIA-tilnærmingen, en sensitiv metode som gir et lavt antall manglende verdier17. I vårt arbeid ble 2387 proteiner identifisert og kvantifisert, slik at en detaljert proteomisk profil av EPS-urin kunne trekkes. Identifisering og kvantifisering av 2387 proteiner var mulig gjennom generering av et rikt spektralbibliotek, oppnådd via høy-pH reversert fraksjonering av peptider, og ved vår DIA-metode, rettet mot et bredt m / z forløperområde. Denne arbeidsflyten identifiserte over 80% av proteiner som tidligere ble funnet i direkte EPS-analyse, og viste at en betydelig brøkdel av EPS-urinproteomet faktisk er avledet fra uttrykte prostatiske sekreter, og er dermed en rik kilde til prostatavevsspesifikke proteiner26.

Til slutt parer vår eksperimentelle design allsidigheten til FASP med følsomheten til DIA for å få et rikt kart over urinproteomet. Denne strategien anbefales for å analysere EPS-urinprøver, men bruken kan utvides til urinproteomikk generelt, eller til og med til andre prøvetyper.

Disclosures

Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 to MG) og av POR Calabria FESR 2014-2020, aksjon 1.2.2, "INNOPROST".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris HCL pH 8.0 Lonza 51238
2-iodoacetamide for synthesis Merck 8047440100
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade VWR 83640.290
Ammonium acetate Fluka 9690
ammonium hydroxide solution Sigma 30501
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water Merck 318612-500ML
Dithiothreitol Amresco 0281-25G
Empore Cation 47mm Extraction Disks Microcolumn 2251
Empore Disk C18 Varian 12145004
Formic acid optima Fisher Scientific A117-50
Hela Protein Digest Standard Fisher Scientific 88329
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane MERCK MRCPRT010
sodium dodecyl sulfate solution Merck 71736-500ML
Thiethylammonium bicarbonate buffer Merck T7408-100ML
trifluoroacetic acid Riedel-de Haën 34957
Trypsin from porcine pancreas Merck T6567-1MG
Urea Merck U6504-500G
Water HPLC gradient grade Fisher Scientific W/0106/17
Proteome Discoverer 1,4 Thermo Fisher Scientific
Spectronaut 14.0 Biognosys

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hüttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).
  2. Roobol, M. J., Carlsson, S. V. Risk stratification in prostate cancer screening. Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).
  3. Principe, S., et al. Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine. Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).
  4. Kim, Y., et al. Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer. Nature Communications. 7, 1-10 (2016).
  5. Drake, R. R., et al. Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease. Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).
  6. Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research. Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).
  7. Berger, S. T., et al. MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).
  8. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).
  9. Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  10. Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).
  11. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  12. Ding, H., et al. Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
  13. Zhao, M., et al. A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  14. Wiśniewski, J. R. Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols. Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).
  15. Wiśniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).
  16. Yu, Y., et al. Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics. Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).
  17. Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).
  18. Liu, Y., Hüttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research. Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).
  19. Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments. Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).
  20. Muntel, J., et al. Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).
  21. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  22. Kim, Y., et al. Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).
  23. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  24. Thongboonkerd, V. Practical points in urinary proteomics. Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).
  25. Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics. Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).
  26. Drake, R. R., et al. In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).

Tags

Biokjemi utgave 171
Proteomisk profil av EPS-urin gjennom FASP fordøyelse og datauavhengig analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prestagiacomo, L. E., Gabriele, C.,… More

Prestagiacomo, L. E., Gabriele, C., Morelli, P., Rota, M. A., Alba, S., Cuda, G., Damiano, R., Gaspari, M. Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62512, doi:10.3791/62512 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter