This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Proteomisk profil av EPS-urin gjennom FASP fordøyelse og datauavhengig analyse
Chapters
Summary May 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en optimalisert fordøyelsesprotokoll på filteret med detaljert informasjon om følgende: protein fordøyelse, peptidrensing og datauavhengig anskaffelsesanalyse. Denne strategien brukes til analyse av uttrykte prostatiske sekreter-urinprøver og tillater høy proteomdekning og lav manglende verdi etikettfri profilering av urinproteomet.
Transcript
FASP-protokollen er en interessant tilnærming til urinproteomikken din på grunn av kompatibiliteten med sterkt denaturerende buffere og på grunn av dens evne til å konsentrere prøven på filteret, noe som er kritisk for fortynnede proteinprøver. FASP-protokollen kombinert med datauavhengig analyse massespektrometri gjør at vi kan oppnå dyp proteomdekning i EPS-urin, som er urin samlet inn etter digital rektal eksamen. Vi bruker for tiden metoden du er i ferd med å se i en biomarkøroppdagelsesinnsats på prostatakreft.
Prosedyren vil bli vist av Licia Prestagiacomo, Paola Morelli og Caterina Gabriele. Sentrifuger EPS-urinprøver innen to timer etter innsamling i 10 minutter ved 2100 RCF ved romtemperatur. Oppbevar deretter supernatantene på minus 80 grader celsius til bruk.
Kast prøvene på is, eller ved fire grader. For å akselerere prosedyren kan du overføre prøvene fra minus 80 til minus 20 på dagen før fordøyelsen. Som lagerløsninger trenger du 500 millimolar DTT, 10% SDS, en molar Tris buffer ved pH åtte.
Fortynn 500 mikroliter av hver EPS-urinprøve med 67 mikroliter SDS, 67 mikroliter DTT og 33 mikroliter Tris-buffer. Inkuber ved 95 grader celsius i 10 minutter med mild risting. Monter sentrifugalfilterenheten med en 10 000 Dalton molekylvekt avskåret.
Tilsett deretter 300 mikroliter fortynnet EPS-urinprøve til filteret. Sentrifuge ved 14.000 g i ca. 20 minutter. Du kan avbryte prosedyren midlertidig etter 15 minutter eller så for å sjekke om filtreringen går jevnt.
Fortsett til hele løsningen har gått gjennom filteret. Tilsett deretter 200 mikroliter ureabuffer og sentrifuge ved 14 000 g i 15 minutter. Gjenta dette trinnet en gang til.
Når gjennomstrømningen er i ferd med å berøre filteret, tømmer du samlingen Eppendorf ved å pipette ut gjennomstrømningen. Proteiner er trygge på filteret. For cysteinalkylering, lag en iodoacetamidoppløsning umiddelbart før bruk.
Vei ca 10 milligram iodoacetamid i et tall Eppendorf hetteglass og oppløs det i ureabuffer ved en konsentrasjon på 9,25 milligram per ml, eller i molaritetsbetingelser, 50 millimolar. Tilsett 50 mikroliter iodoacetamidoppløsning til hvert filter og sentrifuger ved 6000 g i 25 minutter. Den lavere sentrifugeringshastigheten gjør at filtrene ikke går tørre.
Etter proteinalkylering, vask filtrene med to påfølgende 200 mikroliter aliquots av urea buffer og sentrifuge ved 14.000 g i 20 minutter. Kast gjennomstrømningen. Tilsett 200 mikroliter 50 millimolar tre etylammoniumbikarbonatbuffer og sentrifuger ved 14 000 g i 20 minutter.
Gjenta dette trinnet. Etter å ha fullført den siste bikarbonatvasken, overfør filterenheten til et nytt oppsamlingsrør. Tilsett deretter 60 mikroliter 50 millimolar TEAB-buffer.
Tilsett en mikroliter trypsinoppløsning i en konsentrasjon på 200 nanogram per mikroliter trypsin. Alternativt kan du forberede fordøyelsesbufferen for alle prøver i et Eppendorf-hetteglass og distribuere 61 mikroliter av fordøyelsesbufferen til hvert filter. Hvis du bruker en ThermoMixer for å unngå prøvefordampning under inkubering over natten, pakk inn hver filterenhet med et lag aluminiumsfolie, og deretter et lag med parafilm.
Inkuber prøvene ved 37 grader over natten. Neste morgen overfører du filtrene til en benk topp sentrifuge for et veldig kort spinn. Etter spinning åpner du Eppendorf-lokkene og tilsetter 140 mikroliter vann.
Sentrifuger hetteglassene på 14.000 g i 25 minutter, for å samle peptidene. Det innsamlede volumet skal være rundt 190 mikroliter. For å fjerne spor av SDS fra fordøyelsen, anbefales sterk kationutvekslingsrensing av peptidene før LC-MS-MS.
Forbered mikrokolumnholderne ved å piercing Eppendorf lokk med et skarpt verktøy som et par pinsett eller saks. Holderen vil imøtekomme mikrokolumnen under sentrifugering. Siden de er kjedelige å forberede, kan holdere brukes flere ganger.
Bruk en stump og en nål, fjern en plakett av riktig ekstraksjonsskive. Ekstraksjonsskiver er myke polymere materialer som inneholder sorbente partikler. I dette tilfellet er sorbenten laget av partikler med sterke kationutvekslingsegenskaper.
Tilpass plakket i en pipettespiss på 200 mikroliter. Bruk et stempel til å skyve pluggen mot enden av spissen. Den lille platen skal skyves fast, men unngå overdreven styrke.
Sett spissen inn i holderen og monter spin microcolumn med et to milliliter Eppendorf hetteglass som det opprinnelige lokket ble fjernet fra. Pluggen fra en måler 16 nål vil ha en lastekapasitet på omtrent fem mikrogram peptider. Kondisjoner mikrokolumnen med to påfølgende vasker.
Riktig hastighet avhenger av hvor sterkt du skyver platen inn i pipettespissen. Ta sikte på å oppnå en strømning i rekkefølgen 20 til 30 mikroliter per minutt. Prøv å ikke la spissen gå tørr under vask og under prøvelasting.
Fortynn prøven fem ganger i vaskeoppløsning to og last inn resultatene i oppløsning med lavere hastighet. Sikt på en strømningshastighet på ca. 15 til 20 mikroliter per minutt. Kast om nødvendig gjennomstrømningen.
Vask bort gjenværende vaskemidler. La deretter platen gå tørr før peptidution. Overfør mikrokolonnen til et rent 1,5 Eppendorf-rør og tilsett straks eluenten.
Som vil være syv mikroliter av en 500 millimolar ammoniumacetatoppløsning som inneholder 20% acetonitril. Fortynn eluatet med 27 mikroliter 0,1% maursyre for å redusere prosentandelen organisk løsningsmiddel og injiser deretter to mikroliter av den resulterende løsningen i LC-MS-MS med deteksjon i dataavhengig modus. Detaljer om LC-MS-oppsettet som brukes i denne protokollen, vil bli gitt senere i videoen.
Når du har utført databasesøk og peptidfeilintegrasjon, beregner du det totale toppområdet. Sammenlign den deretter med en ekstern standardkurve for å estimere peptidkonsentrasjon i FASP-sammendraget. Etter å ha estimert peptidmengde, rens en ny aliquot av FASP-fordøye som tilsvarer to mikrogram peptider ved to påfølgende StageTip-rensinger som beskrevet her.
LC-MS-oppsettet som brukes i denne protokollen, er basert på direkte injeksjon i den analytiske kolonnen. Hvis du bruker et system med en overlappingskolonne, kan du unngå trinnet med frakoblet C18-rensing. Husk å bruke dedikerte nåler og stempler for hvert kromatografiske materiale.
Etter å ha unndratt peptidene fra C18 Stage Tip med 10 mikroliter eluent, fordamper du delvis eluate i en vakuum sentrifuge i noen minutter, og prøver å unngå full fordampning. Tilsett deretter 47 mikroliter 0,1 % maursyre og legg den resulterende løsningen i et HPLC-hetteglass for LC-MS-analyse. Systemet som brukes her, er basert på direkte innlasting av kolonneeksempel uten å bruke en overlappingskolonne.
Analytiske søyler er internt laget ved å trekke en 75 mikrometer ID kapillær etter å ha fjernet et stykke polyamidbelegg. Den resulterende spissen kan være forsiktig formet med en keramisk kutter. Kapillæren plasseres deretter i en pakkebombe og pakkes med en 50 milligram per ml isopropanolslam av C18 tre mikrometer stasjonære fasepartikler.
Et gasstrykk på mellom 10 og 20 bar nitrogen eller helium er nødvendig. Du kan bruke alternative eller kommersielle kromatografikolonner som kjører ved submikroliter per minutt-strømningshastighet. Sett sammen kolonnen på et T-stykke.
De to andre endene er koblet til høyspennings strømforsyningen og til HPLC-sløyfen. Vurder den optimale sprayspenningen ved å kjøre systemet ved isokratisk strømning. Start deretter analysen.
Skill peptidene over en to timer lang kromatografigradient som vist. Datainnsamlingen vil bestå av en rask fullstendig MS-tjenesteskanning etterfulgt av 26 MS-MS-skanninger på forløpervinduer med variabel bredde. Starter i 20 m / z bredde, for de første 20 vinduene som vil dekke et m / z-område fra 350 til 750 Thompson.
Deretter flytter du til en bredde på 50 m/z for følgende fem vinduer og slutter med en enkelt MS-MS-skanning, med en isolasjonsbredde på 200 Thompson. Smalere bredder står for en mer befolket region av spekteret når det gjelder tilstedeværelse av peptidforløpere. For DIA-analyse trenger du et spektralbibliotek.
For å generere et spektralbibliotek kan du utføre noen dataavhengige eksperimenter på det samme LC-MS-MS-systemet du har brukt til DIA-anskaffelse ved hjelp av samme kromatografigradient. Eksempelfraksjonering vil øke proteomdekningen. Trinntips kan brukes til prøvefraksjonering.
Sterk kationutveksling og grunnleggende omvendt fase er to gyldige alternativer. Start med de 10 mikrogram av et basseng med flere FASP-sammendrag. Forsure prøven ved hjelp av 0,2 % TFA endelig konsentrasjon.
Last inn peptidene på C18 Stage Tips med høy kapasitet. Bruk flere plater i tilfelle høye peptidmengder. For 10 mikrogram materiale anbefales to plater.
Utfør C18-rensing som beskrevet tidligere. Forbered flere hetteglass for eluate oppsamling. Så mange som antall brøker.
I dette tilfellet produseres 10 brøker trinnvis elution. Etter den siste vasken legger du til 20 mikroliter av den første eluenten. 0,2 % ammoniumhydroksid, 10 millimolar TEAB, 4 %acetonitril.
Etter å ha unndratt den første brøkdelen i den første Eppendorf, flytter du stage tip til neste oppsamlings hetteglass. Fortynn i 20 mikrolitertrinn ved bruk som eluent, 0,2% av ammoniumhydroksid, 10 millimolar TEAB, og deretter økende mengde acetonitril. Når du har fraksjonert utvalgs- og dataavhengige eksperimenter på hver brøk, genererer du spektralbiblioteket ved databasesøk etter MS-MS-data.
Biblioteket vil deretter bli importert i en programvare som er i stand til DIA-dataanalyse for protein kvantifisering basert på minst ett unikt peptid tildelt av minst tre overganger. Forvent å dekke et bredt spekter av urinproteomet. Denne figuren viser identifisering og kvantifisering av proteiner over et overflodsområde, som spenner over fem størrelsesordener.
Arbeidsflyten her som presenteres kombinerer konsentrasjonsfordelen og allsidigheten til FASP-protokollen med følsomheten til DIA-skannemodus. Denne kombinasjonen gir et rikt kart over urinproteomet. Siden analyseoppsettet vårt ikke inkluderer bruk av en overlappingskolonne, ble FASP-sammendraget renset av både sterk kationutveksling og omvendt fasefasetips.
Det omvendte fasetrinntipstrinnet kan utelates når en overlappingskolonne er koblet direkte til analysekolonnen. Bruken av denne arbeidsflyten anbefales for å analysere EPS-urinprøver, men bruken kan utvides til urinproteomikk generelt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
