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Modifications de la méthode de Langendorff pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes

Published: May 13, 2021 doi: 10.3791/62514
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiology, Bejing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 2Department of Cardiology, Bejing Chuiyangliu Hospital

Summary

Ce protocole décrit les modifications de la méthode de Langendorff, y compris la profondeur de la canulation de l’aorte pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes.

Abstract

Un seul cardiomyocyte est un outil essentiel dans les études au niveau cellulaire et subcellulaire de la biologie cardiaque et des maladies en tant qu’unité fondamentale de contraction et d’activité électrique. Par conséquent, l’isolement des cardiomyocytes viables et de haute qualité du cœur est l’étape expérimentale initiale et la plus cruciale. En comparant les différents protocoles d’isolement des cardiomyocytes de souris adultes, la perfusion rétrograde de Langendorff est la méthode la plus efficace et la plus reproductible rapportée dans la littérature, en particulier pour isoler les myocytes ventriculaires. Cependant, l’isolement des myocytes auriculaires de qualité du cœur perfusé reste difficile, et peu de rapports d’isolement réussis sont disponibles. La résolution de ce problème compliqué est extrêmement importante car, outre les maladies ventriculaires, les maladies auriculaires représentent une grande partie des maladies cardiaques. Par conséquent, d’autres investigations au niveau cellulaire pour révéler les mécanismes sont justifiées. Dans cet article, un protocole basé sur la méthode de perfusion rétrograde de Langendorff est introduit et certaines modifications de la profondeur de la canulation de l’aorte et les étapes pouvant affecter le processus de digestion pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires ont été apportées simultanément. De plus, il est confirmé que les cardiomyocytes isolés se prêtent à l’examen de la pince patch.

Introduction

Les maladies cardiaques sont l’une des principales causes mondiales de mortalité1. Pour faire face à ce fardeau pour le système de santé, une compréhension approfondie de la physiologie et de la pathologie du cœur est essentielle. Outre la préparation de l’animal entier et du cœur intact, la préparation cellulaire est un autre outil indispensable pour l’étude fonctionnelle et de la maladie2. En appliquant la pince à patch, l’imagerie calcique, la biologie moléculaire et d’autres technologies avancées, les chercheurs peuvent obtenir plus d’informations sur les propriétés électrophysiologiques, l’homéostasie du calcium, les voies de signalisation, les états métaboliques et les transcriptions de gènes dans un seul cardiomyocyte (CM). Ceci est extrêmement utile pour révéler les mécanismes physiologiques et pathologiques du processus de la maladie cardiaque3,4,5,6,7. Pour la recherche animale, des espèces allant des petits animaux (p. ex., souris, rats et cochons d’Inde) aux grands animaux (p. ex., lapins et chiens) peuvent être utilisées. Les petits animaux sont généralement préférés, en particulier les souris, car ils se prêtent à la manipulation génétique et à la manipulation de modèles de maladie8,9,10.

Les techniques de CM isolés de manière aiguë ont connu une longue période de développement et continuent d’évoluer11. La perfusion rétrograde de Langendorff est la méthode d’isolement des CM la plus efficace et la plus reproductible appliquée chez le rat et la souris, en particulier pour isoler les myocytes ventriculaires (VM)12,13,14,15. Cependant, les rapports de myocytes auriculaires isolés avec succès sont rares16,17,18. D’autres recherches sur les deux niveaux de l’ensemble de l’organe / système et du cellulaire / subcellulaire pour révéler les mécanismes et explorer de nouvelles approches thérapeutiques sont justifiées parce que la fibrillation auriculaire (FA), le type d’arythmie le plus courant, devient de plus en plus répandue dans le monde entier, et les modalités de traitement actuelles dans les thérapies pharmacologiques et l’ablation cardiaque restent inefficaces chez environ 40% à 50% des patients atteints de FA19 . L’isolement réussi des CM de souris adultes est la première étape de l’étude cellulaire. Deux méthodes d’isolement principales peuvent être utilisées : les méthodes chunk et Langendorff. Dans la méthode de perfusion de Langendorff, la digestion des tissus dépend de la solution enzymatique délivrée par les artères coronaires et leurs branches aux lits capillaires. Une bonne profondeur de canulation de l’aorte qui peut éviter de pénétrer dans les valves aortiques et de bloquer l’artère coronaire est la condition préalable à la réalisation d’un tel schéma de perfusion, qui est également l’étape essentielle pour une digestion efficace et un rendement VM idéal. Par conséquent, il est raisonnable de supposer que la profondeur de la canulation de l’aorte peut également affecter la perfusion du vaisseau atria et finalement affecter le rendement am. Pour tester cette hypothèse, la canulation de l’aorte à différentes profondeurs a été effectuée et les rendements AM correspondants ont été comparés. Les données ont montré que la profondeur de canulation de l’aorte est directement liée au rendement de la FA. Ici, un protocole permettant d’isoler simultanément les AM et les VM est introduit.

Protocol

Des souris mâles adultes C57BL/6 pesant de 20 à 30 g, âgées de 8 à 10 semaines ont été achetées au Centre animalier de la Capital Medical University, à Beijing, en Chine. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de la Capital Medical University et ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire proposé par l’Institut des ressources animales et publié par les National Institutes of Health. Excel et Origin 8.5 ont été utilisés pour l’acquisition et l’analyse de données. Les données sont présentées comme des moyens ± et de l’ED, pour l’évaluation statistique, le test t de Student a été utilisé et P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

1. Préparation de la solution et de l’appareil de perfusion

  1. Assemblez un appareil Langendorff à débit constant (disponible dans le commerce ou fabriqué par vous-même). La figure 1 fournit un schéma simple.
  2. Préparer les solutions en fonction des réactifs indiqués dans les tableaux 1 et 2.
  3. Allumez le bain-marie circulant et ajustez une température d’entrée appropriée (42,7 °C dans notre laboratoire) pour vous assurer que l’écoulement du système de circulation des perfusats de la canule atteint 37 °C.
  4. Nettoyez le système de perfusion en faisant circuler de l’eau désionisée. Si une condition stérile est requise, faites passer de l’éthanol à 75% dans le système de perfusion pendant 15 minutes, suivi d’eau désionisée (au moins 10 cycles pour éviter les effets de toxicité de l’alcool sur le cœur).
  5. Mesurez le temps et le volume d’un cycle du système de circulation du perfusat pour déterminer combien de millilitres de solution de Tyrode oxygénée doivent être chargés à l’étape de perfusion suivante.
  6. Stérilisez tous les outils chirurgicaux dans la méthode souhaitée.
  7. Réglez le débit du système de perfusion de perfusat à 4 mL/min.
  8. Préparez deux boîtes de Petri propres de 35 mm - l’une contenant la solution de Tyrode (boîte de Petri 1), l’autre contenant la solution 1 (boîte de Petri 2).
  9. Préparer une seringue de 1 mL remplie de solution 1 et une aiguille de canule en acier émoussée de 20 G avec une encoche d’où la distance est de 1 mm à la pointe. Préparez un nœud lâche avec une suture 3-0 à l’arbre de la canule. Régulez le champ de vision du stéréomicroscope et assurez-vous que l’extrémité de la canule se trouve sous la surface liquide de la boîte de Pétri 2.

2. Préparation des animaux

  1. Administrer de l’héparine (concentration, 1 000 UI/mL; 0,2 mL/souris) par voie intrapéritonéale aux souris pour éviter les caillots sanguins. Après 10 min, anesthésiez les souris avec du pentobarbital sodique (50 mg/kg, injection de P.I.) et assurez-vous que les souris cessent de répondre aux pincements de la queue et des orteils. Effectuer une luxation cervicale 20 min après l’administration d’héparine.
  2. Transférez les souris sur la plate-forme chirurgicale, fixez les souris en position couchée, stérilisez la poitrine avec de l’éthanol à 75% et séchez-la avec de la gaze ou de la serviette.

3. Excision cardiaque et canulation de l’aorte

  1. Soulevez la peau du xiphoïde avec une pince à tissu et faites une incision latérale mineure à travers la peau avec des ciseaux à tissu. Effectuez une dissection émoussée entre la peau et le fascia et étendez l’incision de la peau en forme de V vers les aisselles des deux côtés.
    1. Continuez la même trace d’incision à travers la cage thoracique, puis déviez la cage thoracique vers le haut en serrant le sternum avec une pince tissulaire pour exposer complètement le cœur et les poumons.
  2. Décollez le péricarde à l’aide d’une pince incurvée. Déchirez le thymus des deux côtés par deux pinces incurvées si elles recouvrent les grands vaisseaux. Tirez doucement la base du cœur vers la queue avec une pince incurvée jusqu’à ce qu’un vaisseau sanguin en forme de « Y » (l’aorte et ses artères ramifiées) puisse être vu.
  3. Pour réserver différentes longueurs de l’aorte à la canulation et à la comparaison, transectez l’aorte à l’artère carotide commune gauche (ligne verte sur la figure 2) et coupez l’artère brachiocéphale en même temps chez certaines souris. Transect au niveau de l’aorte ascendante chez d’autres souris (ligne noire sur la figure 2).
    REMARQUE: Pour ceux qui sont nouveaux dans cette procédure, cette étape peut également être effectuée sous un microscope stéréoscopique.
  4. Excisez le cœur et immergez-vous immédiatement dans la boîte de Pétri 1 pour laver et pomper le sang résiduel.
  5. Transférer le cœur dans la boîte de Petri 2 et couper tout surplus de tissu à l’aide de ciseaux à iris fins si nécessaire. Pour ceux qui sont nouveaux dans cette procédure, faites cette étape sous le stéréomicroscope pour éviter de couper par erreur l’aorte ou d’autres structures cardiaques.
  6. Poussez la seringue pour expulser les bulles d’air avant la canulation de l’aorte. Effectuez une canulation rétrograde de l’aorte à l’aide de deux pinces à attacher droites (mâchoires lisses) sous le stéréomicroscope. Assurez-vous que tout le processus de canulation se trouve sous la surface du liquide.
  7. Évitez de pénétrer dans les valves aortiques et ajustez les profondeurs à l’aorte ascendante (la souris que l’aorte a été transectée à l’artère carotide commune gauche) et à la racine aortique (la souris que l’aorte a été transectée à l’aorte ascendante), respectivement.
    REMARQUE: La profondeur de la canulation de l’aorte (appelée simplement profondeur) est définie ici comme la position où la pointe de la canule est dans l’aorte ou où l’aorte est ligaturée.
  8. Ligaturez l’aorte avec la suture pré-nœud 3-0 à l’encoche de la canule. Appuyez doucement sur le contenu de la seringue pour rincer le sang résiduel.
    REMARQUE: Le sang quittera les artères coronaires et l’effuse des veines dorsales si la profondeur est correctement positionnée. Le cœur et les appendices auriculaires vont se dilater et devenir pâles.
  9. Retirez et connectez la canule à l’appareil Langendorff. Encore une fois, prenez soin d’éviter que des bulles d’air ne pénètrent dans le cœur.
    REMARQUE: Sachez que le temps entre la thoracotomie et la perfusion initiale ne doit pas dépasser 5 min.

4. Perfusion cardiaque

  1. Tout d’abord, amorcer et perfuser la solution de Tyrode oxygénée pendant environ 10 s (le volume de liquide courant 10 s dans le système utilisé dans ce protocole est d’environ 0,7 mL) s’il y a du sang résiduel dans les oreillettes, puis passer à la solution 1. Cependant, il suffit de perfuser avec la solution 1 S’il n’y a pas de sang résiduel dans les oreillettes. Perfuser le cœur pendant environ 2 min.
  2. Passez à la solution 3. Aspirer environ 2,5 mL de solution 3 avec un tuyau en polyéthylène stérile à usage unique et le préchauffer au bain-marie pour une utilisation ultérieure, le reste étant utilisé pour la perfusion pendant environ 11 à 12 minutes. Jeter la solution 3 perfusée dans les 2 premières minutes. Recycler le reste dans les réservoirs de perfusat par la pompe péristaltique pour le réutiliser jusqu’à ce que la digestion soit terminée.
  3. Terminez la digestion lorsque le cœur devient enflé et devient légèrement pâle et flasque (texture spongieuse) ou une empreinte existe si le myocarde est doucement pincé à l’aide d’une pince dentée.

5. Isolement cellulaire et réintroduction du calcium

  1. Retirez les ventricules et les oreillettes avec des pinces et placez-les dans différentes boîtes de Pétri. Ajouter la solution préavertée 3 aux boîtes de Pétri.
  2. Triturez le tissu en une texture trouble avec des pinces émoussées et pipettez doucement le tissu pour une digestion uniforme. Évitez d’introduire des bulles d’air.
  3. Transférer le tissu digéré trouble avec la pipette dans la solution 4 pour arrêter l’activité enzymatique restante, puis centrifuger pendant 20 s à 192×g. Retirez le surnageant et ajoutez la solution 5 dans les sédiments cellulaires et la pipette pour disperser uniformément les cellules.
  4. Réintroduire le calcium par étapes afin d’éviter le paradoxe du calcium et la surcharge en calcium. Ajouter progressivement un total de 50 μL 100 mM/L CaCl2 (à 5 min d’intervalle de 5 μL, 10 μL, 15 μL et 20 μL, respectivement) à la suspension cellulaire.

6. Stockage des cellules

  1. Pour l’étude de la pince patch, stockez les cellules dans la solution de Tyrode. Pour d’autres études cellulaires, stocker les cellules dans la solution 6.
  2. Pour assurer l’exactitude des résultats des études fonctionnelles aiguës (p. ex., étincelles Ca2+, ondes Ca2+, libération de Ca2+, fuite ca2+ et enregistrements de pinces à patch), terminez ce type d’expériences fonctionnelles dans les 6 prochaines heures.

Representative Results

Cet article, où la pointe de la canule est positionnée dans l’aorte, qui est définie comme la profondeur de la canulation de l’aorte (appelée simplement profondeur), représente également l’endroit où l’aorte est ligaturée. L’AM et la VM isolées à partir d’un cœur canulé et ligaturé à l’aorte ascendante sont représentées comme AMAA et VMAA, respectivement. De plus, la FA et la VM isolées à partir d’un cœur canulé et ligaturé à la racine aortique sont représentées comme AMAR et VMAR, respectivement. La figure 2 montre la vue d’ensemble de l’aorte et les positions de transsection. En outre, la figure 3 montre les profondeurs et les lieux de ligature qui correspondent aux positions de transsection de l’aorte. La profondeur était associée à la perfusion des oreillettes et des appendices auriculaires. Les deux appendices auriculaires sont gonflés lorsque l’extrémité de la canule se trouve à l’aorte ascendante, ce qui indique une perfusion atriase suffisante. Cependant, à la racine aortique, la perfusion des oreillettes est insuffisante et les deux appendices auriculaires sont essuyés (Figure 4). La morphologie et la viabilité de la CM qui sont isolées des cœurs cannulés à différentes profondeurs après la réintroduction du calcium (Figure 5). Les morphologies cellulaires d’AMAA, AMAR, VMAA et VMAR sont sous microscope confocal avant et après la réintroduction du calcium. Les AM sont en forme de fuseau, tandis que les VM sont en forme de tige avec des extrémités rectangulaires. De plus, les AM et les VM ont des membranes intactes, des contours clairs, des sarcomères striés clairs et des surfaces lisses (Figure 6). La viabilité cellulaire a été évaluée par coloration au bleu de trypan. Les cellules normales avec des membranes intactes peuvent exclure le bleu de trypan et ne seront pas colorées, tandis que l’activité de perte de cellules accumulera rapidement du bleu de trypan par voie intracellulaire (Figure 7). Les AM et les VM ont été placées dans différentes diapositives d’objets pour effectuer le comptage des cellules. Les rendements totaux de la FA et le pourcentage de CM viables en forme de fuseau (taux de survie) ont été déterminés en transférant 10 μL de la suspension cellulaire à une lame d’objet et comptés sous un microscope à contraste de phase inversé à 4 × 10 champs de vision. La même méthode a été utilisée pour déterminer les rendements totaux des machines virtuelles (en forme de tige) et le pourcentage de machines virtuelles viables. Cette méthode est préférée à l’utilisation d’un hémocytomètre, car les CM ne se répartissaient pas facilement dans la zone de comptage de l’hémocytomètre en raison de leur taille et de leur forme. Un graphique à barres (figure 8) montre les taux de survie de l’AMAA, de l’AMAR, du VMAA et du VMAR avant et après la réintroduction du calcium. Chaque valeur représente la moyenne ± SD de 10 souris. Avant la réintroduction du calcium, les taux de survie de l’AMAA sont significativement plus élevés que ceux de l’AMAR (70,9 % ± 2,8 % et 41,0 % ± 5,2 %, respectivement; p < 0,01). Après la réintroduction du calcium, les taux de survie de l’AMAA sont significativement plus élevés que ceux de l’AMAR (69,4 % ± 3,0 % et 37,7 % ± 4,9 %, respectivement; p < 0,01).

Les taux de survie vmAA ne différaient pas de ceux de l’AIMV (89,5 % ± 2,7 % vs 88,1 % ± 2,6 %, respectivement; p > 0,05) avant la réintroduction du calcium. De même, les taux de survie vmAA ne différaient pas de ceux de l’ARMV (82,2 % ± 1,9 % vs 82,9 % ± 1,6 %, respectivement; p > 0,05) après réintroduction du calcium.

Un cœur canulé en profondeur comme le recommandait ce protocole (à l’aorte ascendante), un rendement viable en VM et ENM d’environ 4,1 millions et environ 180 000, respectivement, après réintroduction du calcium. L’enregistrement par pince de patch à cellules entières du courant de sodium (Figure 9A, B) et des densités de courant (Figure 9C) dans la FA et la VM isolées confirme que la qualité de la cellule a satisfait aux exigences des expériences électrophysiologiques. L’anatomie de l’aorte (figure 10) montre que l’ostium du vaisseau auriculaire est proche de la racine aortique et est adjacent à l’ostium de l’artère coronaire (AC). Le tableau 3 montre la distance entre l’extrémité de la canule et l’ostium CA des cœurs cannulés et ligaturés à l’aorte ascendante et à la racine aortique, respectivement.

Figure 1
Graphique 1. Schéma d’un système Langendorff modifié assemblé. Ce système est économique et portable pour les utilisateurs. Il comporte deux parties de tubes en plastique - une pour l’eau (diamètre intérieur, 8 mm) et une pour le perfusat (diamètre intérieur, 1,5 mm) - dont l’extrémité distale est reliée à un robinet d’arrêt médical PE à trois voies avec une serrure Luer. Une bouteille en verre contenant de l’eau et avec un bouchon en caoutchouc forme d’échangeur de chaleur. Le perfusat est pompé dans le tube en plastique de l’échangeur de chaleur par la pompe péristaltique et sort du robinet d’arrêt à trois voies relié à la canule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Aorte et tissus autour. Une structure de vaisseau sanguin en forme de « Y » est l’aorte et ses branches : l’artère brachiocéphale (flèche 1) et l’artère carotide commune gauche (flèche 2). Transecter l’aorte entre l’artère carotide commune gauche (ligne verte) et couper simultanément l’artère brachiocéphale chez certaines souris; transect à l’aorte ascendante (ligne noire) chez d’autres souris (stéréomicroscope 10 × 2 grossissement). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Vue frontale du cœur cannulé. La ligne courbe noire représente le bord incisif de l’aorte qui a été transecté entre l’artère carotide commune gauche. La ligne courbe rouge représente le bord incisif de l’aorte transectée au niveau de l’aorte ascendante. La ligne droite représente l’endroit où l’aorte a été ligaturée : noir à l’aorte ascendante et rouge à la racine aortique (stéréomicroscope 10 × 2 grossissement). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. État de perfusion des cœurs cannulés. Les oreillettes sont suffisamment perfusées et les deux appendices auriculaires sont gonflés dans le cœur (A) cannulés et ligaturés au niveau de l’aorte ascendante. Cependant, les deux appendices auriculaires sont essuyés dans le cœur (B) canulés et ligaturés à la racine aortique, ce qui indique une mauvaise perfusion des oreillettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. Évaluation de la morphologie cellulaire et de la viabilité après réintroduction du calcium. Les AM (A) et les VM (B) isolés du cœur cannulés et ligaturés au niveau de l’aorte ascendante sont représentés respectivement par AGA et VMAA. Les AM (C) et les VM (D) isolés du cœur cannulés et ligaturés à la racine aortique sont représentés respectivement par APAR et VMAT. Les CM de haute qualité sont quiescents et ont des membranes intactes, des contours clairs, des sarcomères striés clairs et une surface cellulaire lisse. Les AM sont en forme de fuseau, tandis que les VM sont en forme de tige ou de brique avec des extrémités rectangulaires. Les CM qui se contractent spontanément ou contiennent des blebs dans la membrane sont de mauvaise qualité, et ceux qui rétrécissent en une forme sphérique sont des cellules mortes. Un champ de vision aléatoire (microscope à fluorescence, grossissement de 10 × 10 ; barres d’échelle, 100 μm). AM = myocyte auriculaire, VM = myocyte ventriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Graphique 6. Morphologie cellulaire au microscope confocal avant et après la réintroduction du calcium. Avant la réintroduction du calcium, AMAA (A) et AMAR (C) sont en forme de fuseau avec des contours clairs, des sarcomères striés et des surfaces membranaires lisses. Après réintroduction du calcium, AMAA (B) et AMAR (D) sont également en forme de fuseau avec des contours clairs, des sarcomères striés et des surfaces membranaires lisses. Avant la réintroduction du calcium, le VMAA (E) et le VMAR (G) sont en forme de tige ou de brique avec des contours clairs, des sarcomères striés et des surfaces de membrane lisses avec des extrémités rectangulaires. Après réintroduction du calcium, vmaa (F) et VMAR (H) sont également en forme de tige ou de brique avec des contours clairs, des sarcomères striés et des surfaces membranaires lisses avec des extrémités rectangulaires (huile de microscope confocale, grossissement 63 × 10; barres d’échelle, 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Graphique 7. Évaluation de la viabilité cellulaire. Les cellules endommagées qui perdent de l’activité sont colorées par le bleu de trypan. En revanche, les cellules viables ne peuvent pas être colorées par le bleu de trypan (microscope à fluorescence, grossissement 4 × 10; barres d’échelle, 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Graphique 8. Graphique à barres montrant les taux de survie d’AMAA, AMAR, VMAA et VMAR avant et après la réintroduction du calcium. CR = réintroduction du calcium. Chaque valeur représente la moyenne ± SD de 10 souris. p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Solution Contenu (concentration finale en mmol/L, sauf indication contraire) renommé
Solution de perfusion (solution 1) 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurine, 5 Glucose, 10 2,3-butanedione monoxime (BDM) Qui peut être conservé pendant 3 jours à 4 °C. Le glucose, la taurine et le BDM sont ajoutés le jour de l’expérience. Préparer 200 mL de solution de perfusion pour chaque cœur.
Solution de Tyrode (solution 2) 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glucose Qui peut être conservé pendant 3 jours à 4 °C. CaCl2 et glucose sont ajoutés le jour de l’expérience, ajuster le pH à 7,3-7,4 avec du NaOH saturé à température ambiante (28-30 ° C) avec un PH-mètre.

Tableau 1. Solutions pour l’isolation CM de souris adultes.

Solution Contenu renommé
Solution de digestion(solution 3) Solution de 25 mL 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25 mg de collagénase II, 50 μL (2,5 % 10×) de trypsine pour chaque cœur
Arrêter la solution 1(solution 4) Solution de 9 mL 1, 1 mL FBS (Sérum fœtal bovin), 4μL 100 mM/L CaCl2 pour chaque cœur
Arrêter la solution 2(solution 5) Solution de 9,5 mL 1, 0,5 mL FBS (Sérum fœtal bovin), 4μL 100 mM/L CaCl2 pour chaque cœur
Solution de remise en suspension cellulaire(solution 6) Solution de 13 mL 1, 7μL 1M/L caCl2, BSA (albumine sérique de taureau) à une dose pouvant former une fine couche recouvrant la surface du liquide pour chaque cœur

Tableau 2. Solutions pour l’isolation et le stockage CM de souris adultes.

Figure 9
Graphique 9. Courbes courant-tension des canaux sodiques. Des techniques de pince de patch à cellules entières ont été utilisées pour enregistrer les courants de sodium des cardiomyocytes isolés en mode de serrage de tension. Le protocole de serrage de tension est indiqué dans l’encart. Les courants de sodium enregistrés à partir de l’AM (A) et de la VM (B) sont affichés. Les densités actuelles à des potentiels de −45 mV, −40 mV et −35 mV sont significativement plus élevées en AM (−32,71 ± 1,597 pA/pF, -31,49 ± 1,820 pA/pF et −29,34 ± 1,939 pA/pF, respectivement ; n = 10) qu’en VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± 1,560 pA/pF et −21,86 ± 1,381 pA/pF, respectivement ; n = 8 ; P < 0,05). (C) Les courbes I-V montrent les densités de courant de sodium qui ont été normalisées à la capacité cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Graphique 10. Origine et distribution du vaisseau auriculaire. Le vaisseau auriculaire (flèche 1) et l’AC (flèche 2) dans le panneau A. Le panneau B examine de plus près le vaisseau auriculaire (flèche 3). C) Il existe deux osties de tailles différentes; l’un (flèche 4) correspond au vaisseau auriculaire qui a irrigué les appendices auriculaires, et l’autre (flèche 5) correspond à l’AC (stéréomicroscope 10 × 5 grossissement). CA = artère coronaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le numéro de série des souris 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
La profondeur de la canulation de l’aorte est à l’aorte ascendante 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7
La profondeur de la canulation de l’aorte est à la racine aortique 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0

Tableau 3. Distance entre l’extrémité de la canule et l’artère coronaire ostium. Les cœurs des souris C57BL/6 (n = 20) ont été utilisés pour canuler et ligaturer l’aorte aux profondeurs de l’aorte ascendante et de la racine aortique, respectivement. L’aorte est anatomisée et la distance entre l’extrémité de la canule et l’ostium CA a été mesurée. La distance est mesurée en millimètres, et les signes positifs ou négatifs représentent la pointe de la canule au-dessus et au-dessous de l’ostium CA, respectivement.

Discussion

La CM unique est un outil précieux et indispensable dans les études au niveau cellulaire de la fonction cardiaque et des maladies20. Par conséquent, l’isolement des CM viables des cœurs est l’étape initiale et la plus cruciale. La qualité cellulaire est l’un des déterminants importants de la réussite des expériences, en particulier dans les expériences optiques et électrophysiologiques. Par rapport aux CM d’autres animaux, les MC de rongeurs sont plus vulnérables à l’ischémie et à l’hypoxie en raison d’une concentration plus élevée d’ions sodium intracellulaires, ce qui favorise l’afflux de calcium par l’échangeur Na+/Ca2+221. De plus, le nombre d’AM est bien inférieur à celui des VM ; ainsi, une isolation réussie est extrêmement difficile à réaliser. La méthode langendorff est excellente pour isoler les souris VMs22, mais le taux de réussite dans l’isolement des AM est faible et peu de rapports sont disponibles. La bonne profondeur de canulation de l’aorte est également un facteur essentiel pour produire des VM idéales en dehors de la température, de l’activité enzymatique, du pH et de la qualité de l’eau utilisées pour la préparation des tampons. Le principe de la méthode Langendorff repose sur la perfusion rétrograde du cœur. Lors de la perfusion, la valve aortique est fermée; ainsi, le perfusat est forcé dans les artères coronaires, délivrant une solution enzymatique à travers les branches des vaisseaux, et le tissu myocardique est digéré uniformément. Pour obtenir ce type de schéma de circulation, l’aorte doit réserver suffisamment de longueur pour la canulation et la ligature, la pointe de la canule ne doit pas non plus pénétrer dans les valves aortiques ou bloquer l’ostium CA. Ainsi, il est raisonnable de spéculer que la profondeur de la canulation de l’aorte est également associée à la perfusion des oreillettes, ce qui affecte l’efficacité de la digestion des oreillettes et les rendements de la FA de la même manière. Le protocole présenté ici a confirmé l’hypothèse, et les étapes cruciales pour optimiser le rendement cellulaire ainsi que les suggestions sont notées ci-dessous.

À l’étape 1.9, pour mieux sécuriser l’aorte, une canule émoussée de 20 G avec une encoche (ou une rainure circonférentielle) d’où la distance est de 1 mm à la pointe est recommandée. D’après nos expériences, la taille de la canule qui est un peu plus grande que le diamètre de l’aorte a été trouvée pour empêcher la pointe de la canule de percer les valves aortiques pendant la canulation parce que l’aorte, en s’appuyant sur son élasticité intrinsèque, peut s’insérer parfaitement dans la canule et produire un frottement, ce qui agit comme un facteur de protection lors du réglage de la profondeur de canulation vers l’avant ou vers l’arrière. En termes de position de l’encoche, le cœur glissera facilement pendant la canulation à cause de la gravité s’il est trop près de la pointe de la canule. Inversement, l’espace pour ajuster la profondeur de canulation et la position de ligature sera très limité si trop loin. Compte tenu de ces circonstances, il est préférable de transecter l’aorte entre l’artère carotide commune gauche (comme la ligne verte de la figure 2) pour s’assurer que l’aorte est suffisamment longue et peut être canulée et ligaturée à l’aorte ascendante à l’étape 3.3. Alors que la transectisation à l’aorte ascendante, la longueur réservée à la canulation au moins pourrait fixer l’extrémité de la canule près de la racine aortique et ne pénétrera pas dans les valves aortiques après ligature. L’anatomie de l’aorte et la mesure de la distance entre l’extrémité de la canule et l’ostium CA indiquent que la transectisation de l’aorte entre l’artère carotide commune gauche est une position idéale pour obtenir une profondeur de canulation aorscale appropriée.

La profondeur de canulation s’est avérée associée à la perfusion des oreillettes, qui à son tour agit comme un indicateur de profondeur. La figure 4 montre que la perfusion des oreillettes est bonne lorsque la profondeur est à l’aorte ascendante et que les deux appendices auriculaires sont gonflés. Cependant, la perfusion des oreillettes est insuffisante lorsque la profondeur est à (ou s’approche) de la racine aortique et que les deux appendices auriculaires sont essuyés. Le nombre total et viable d’AM produit à partir des appendices auriculaires gonflés était plus élevé (figure 8). Ces résultats indiquent que la profondeur de canulation de l’aorte peut affecter la perfusion et la digestion des oreillettes et des appendices auriculaires d’une certaine manière et finalement affecter le rendement et la qualité de la FA. On a déduit que le rendement et la qualité de la FA étaient associés à la distribution des récipients qui alimentent les atriums. L’étude de Fernández et al.23 a démontré diverses anomalies dans l’origine et l’évolution de l’AC de la souris. Ils ont constaté que les AC ostia étaient très variables et n’étaient pas tous situés dans le sinus aortique. Certains AC peuvent provenir anormalement au-dessus des sinus aortiques, appelés ostium à décollage élevé. Certains CA peuvent provenir du même sinus aortique, et l’ostium du vaisseau de l’oreillette est juste à proximité. L’anatomie de l’aorte dans la présente étude (Figure 10) est également cohérente avec la découverte de Fernández. C’est peut-être la raison pour laquelle les tentatives d’isolement de la FA par la méthode langendorff ont été largement infructueuses si la profondeur de canulation n’est pas appropriée. Ainsi, la pointe de la canule aura plus de chances de bloquer l’ostium du vaisseau de l’oreillette qui est adjacent à l’ostium CA si l’espace disponible entre la pointe de la canule et l’ostium CA. En revanche, la perfusion et le rendement cellulaire du ventricule n’étaient guère affectés tant que les valves aortiques n’étaient pas pénétrées par l’extrémité de la canule. C’est probablement parce que les AC qui fournissent du sang au ventricule ont une plus grande ostie et plus d’origines. Si un ostium a été obstrué par la canule, la perfusion ventriculaire peut être compensée par un autre AC ou la circulation collatérale, tandis que le vaisseau sanguin qui alimente l’oreillette est plutôt petit et n’a pas de substitut. Ainsi, l’influence de la profondeur dans la canulation de l’aorte est importante.

D’autres facteurs et dépannages notables dans le processus de digestion et de stockage des cellules sont énumérés comme suit. Tout d’abord, envisagez de perfuser la solution de Tyrode oxygénée à l’étape 4.1 pour que le muscle se contracte et pompe le sang résiduel si le sang dans les oreillettes n’a pas été précipité après la ligature de l’aorte. Cela peut aider à éviter l’effet indésirable du ca2+ et d’autres matériaux libérés par les érythrocytes endommagés. Deuxièmement, infuser une solution sans ca2+ à l’avance pour dissocier la connexion et élargir l’espace entre les cellules peut améliorer l’efficacité de la digestion enzymatique, car les disques intercalés entre les CM sont des jonctions intercellulaires dépendantes du calcium. Cependant, le temps doit être limité à 3-5 min pour éviter le phénomène du paradoxe du calcium24. Une solution enzymatique mélangée est recommandée. La collagénase de type II perturbe le réseau de matrice extracellulaire et la trypsine aide à éliminer le matériau granulaire qui reste à la surface de la cellule si la digestion de la collagénase II est incomplète. Cela garantit une surface cellulaire lisse, ce qui est essentiel pour former un joint GΩ dans l’enregistrement de la pince de patch. Néanmoins, la concentration de trypsine doit être contrôlée dans la plage appropriée pour éviter la digestion excessive et les lésions cellulaires, car elle peut dégrader la protéine membranaire. L’utilisation de la collagénase de type II seule pour améliorer le rendement cellulaire peut souvent entraîner une digestion excessive des tissus, et les CM isolés seront intolérants au calcium après une exposition prolongée à la collagénase25. L’utilisation du 2,3-butanedione monoxime (BDM), une substance qui prévient la contraction spontanée en inhibant la myosine ATPase et en empêchant la formation de ponts croisés, est toujours controversée26,27,28,29. Selon l’expérience antérieure, l’ajout de BDM est nécessaire pour ce protocole. La solution enzymatique est préparée avec la solution 1 bien que la solution 1 ne contienne pas de calcium et que du calcium soit ajouté pour activer l’enzyme. L’avantage de l’ajout de BDM dans la solution de perfusion comprend (1) l’inhibition de la contraction des myocytes et la réduction de la consommation d’oxygène pendant la perfusion de la solution enzymatique et (2) la prévention de l’hypoxie des myocytes et l’amélioration de la qualité des myocytes isolés. Certaines études ont rapporté que le BDM peut avoir une influence négative potentielle sur les propriétés électriques cellulaires. Cependant, les résultats de l’enregistrement du courant de sodium par la pince de patch à cellules entières n’ont pas indiqué d’effet indésirable. Dans l’étape de stockage cellulaire (étape 6), de nombreuses études ont choisi le tampon KB, une solution sans calcium mais à forte concentration de potassium, dans laquelle les cellules peuvent maintenir un meilleur état car elles sont dans des conditions polarisées et métaboliques faibles. Cependant, le glycocalyx de la membrane cellulaire se séparera de la bicouche lipidique en l’absence de calcium exogène pendant un certain temps et la perméabilité de la membrane augmentera, affectant l’analyse fonctionnelle ultérieure30,31,32.

Toutes les techniques d’isolement des myocytes peuvent être essentiellement classées actuellement en digestion en morceaux (un petit morceau de tissu) dans une solution enzymatique ou en perfusion d’AC avec une solution enzymatique (la perfusion de Langendorff)22. Par rapport à la méthode de Langendorff, la méthode de digestion des morceaux est plus facile à effectuer et est également couramment utilisée pour isoler les CM dans de nombreux laboratoires. Cependant, cette méthode produit normalement un faible rendement de CM de mauvaise qualité à partir de tissus adultes22. De plus, les cellules isolées par cette méthode peuvent ne pas convenir à la réalisation d’expériences comparatives. Par exemple, lors de l’analyse des effets médicamenteux spécifiques au type de cellule entre la FA et la VM, l’impact de différentes conditions d’isolement ne peut être négligé ou exclu. En effet, le myocarde et la densité tissulaire du ventricule sont beaucoup plus épais et plus denses que celui de l’oreillette, ce qui entraîne des temps de digestion et des concentrations enzymatiques différents. En outre, une agitation et un pipetage excessifs des tissus pendant la digestion endommageront les cellules et auront un impact significatif sur les études fonctionnelles. De plus, de nombreuses études antérieures ont montré que les AM sont plus vulnérables au calcium. Cependant, les AM isolés par le protocole actuel peuvent tolérer la réintroduction du calcium de gradient, probablement parce que le tissu est facile à rompre à la fin du processus de digestion. Ainsi, les dommages mécaniques sont moindres, alors que les cellules subiraient plus de dommages mécaniques car les étapes de la méthode du morceau nécessitent une rupture répétée et centrifuge. Plus récemment, Ackers et al.33 ont rapporté une méthode simplifiée et sans Langendorff pour l’isolement de myocytes et de non-myocytes cardiaques viables. Les VM et les fibroblastes peuvent être isolés efficacement, mais la quantité de VM n’a pas été mentionnée. Cependant, ce protocole présente plusieurs limitations. Tout d’abord, la distribution des vaisseaux sanguins cardiaques peut avoir des variations pour les différences individuelles et la souche de souris, et la profondeur de canulation recommandée ne peut pas garantir un isolement réussi des AM pour chaque fois. Deuxièmement, pour ceux qui sont nouveaux à cette procédure peut prendre un certain temps pour pratiquer la transsection de l’aorte et la canulation de l’aorte rétrograde. Enfin, cette méthode n’a pas été testée dans d’autres modèles de maladies cardiaques, sauf chez des souris en bonne santé et âgées. Par conséquent, il faudra des ajustements dans les concentrations enzymatiques et le temps de digestion en raison de l’étendue de la fibrose du cœur. L’inconvénient des différentes conditions de digestion rencontrées dans la méthode du morceau ne sera pas un problème dans la méthode de Langendorff dans laquelle la solution enzymatique est répartie uniformément dans le tissu par les lits de vaisseaux.

En résumé, les protocoles pour l’isolement simultané d’une seule FA et VM décrits ici ont démontré que la profondeur de canulation de l’aorte appropriée peut améliorer efficacement la perfusion de l’oreillette et le rendement de la FA. Les CM isolés par cette méthode sont de haute qualité, possèdent une bonne tolérance au calcium et ont été appliqués avec succès à l’enregistrement de la pince de patch et à la manipulation du calcium (libération de Ca2+ et mesure des ondes Ca2+ par le système IonOptix) dans l’équipe34. On s’attend à ce que le protocole d’isolement puisse être utilisé pour la préparation cellulaire dans une série d’investigations cellulaires et subcellulaires, ce qui aidera à approfondir la compréhension de la physiologie et de la pathologie cardiaques. Il est important de noter qu’il permettra la découverte de mécanismes et de méthodes d’intervention plus pertinents sur le plan clinique des maladies cardiaques.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) et de la Fondation des sciences naturelles de Beijing (n ° 7192051). Contributions de l’auteur : Bai et Liu ont conçu et conçu le projet. Wen et Ruan ont fourni de précieux conseils pour les expériences. Wu et Linling Li ont effectué les travaux expérimentaux et ont joué un rôle clé dans l’acquisition, l’analyse et l’interprétation des données. Li a participé à l’assemblage de l’appareil Langendorff. Peng, Zhang, Wang et Yang ont participé à la préparation des réactifs et des solutions avant l’expérience. Wu a écrit l’article.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich 31550
Bull Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Collagenase type II Worthington 43D14160
Excel data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS) Zhejiang Tianhang Biotechnology 150207
Glucose Sigma-Aldrich G7528
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
KHCO3 Sigma-Aldrich 237205
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
Origin 8.5 OriginLab, Northampton, MA,US data acquisition and analysis
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
Sodium pentobarbital Shanghai Reagent Factory 810923
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Trypan blue Solarbio C0040
Trypsin Invitrogen 15090046
Water bath JULABO ED (v.2)

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References

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Médecine Numéro 171 cardiomyocyte isolement Langendorff souris adulte myocyte auriculaire myocyte ventriculaire anatomie canulation profondeur position de ligature
Modifications de la méthode de Langendorff pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes
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Wu, K., Li, L. L., Li, Y. K., Peng,… More

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