Summary
Bu protokol, yetişkin farelerden atriyal ve ventrikül miyositlerinin eşzamanlı izolasyonu için aort kanülasyonunun derinliğini de içeren Langendorff yönteminin modifikasyonlarını açıklar.
Abstract
Tek bir kardiyomiyosit, temel bir kasılma ve elektriksel aktivite birimi olarak kardiyak biyoloji ve hastalıkların hücresel ve hücre altı düzeydeki çalışmalarında hayati bir araçtır. Bu nedenle, kalpten uygulanabilir, yüksek kaliteli kardiyomiyositleri izole etmek ilk ve en önemli deneysel adımdır. Yetişkin farelerin kardiyomiyositlerini izole etmek için çeşitli protokolleri karşılaştıran Langendorff retrograd perfüzyon, literatürde bildirilen en başarılı ve tekrarlanabilir yöntemdir, özellikle ventrikül miyositlerini izole etmek için. Bununla birlikte, perfüzyonlu kalpten kaliteli atriyal miyositlerin izole edilmesi zor olmaya devam eder ve birkaç başarılı izolasyon raporu mevcuttur. Bu karmaşık sorunun çözümü son derece önemlidir, çünkü ventrikül hastalığı dışında, atriyal hastalık kalp hastalıklarının büyük bir kısmını oluşturur. Bu nedenle, mekanizmaları ortaya çıkarmak için hücresel düzeyde daha fazla araştırma yapılmasını garanti eder. Bu yazıda Langendorff retrograd perfüzyon yöntemine dayalı bir protokol getirilmiş ve aort kanülasyonu derinliğinde bazı değişiklikler ile atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için sindirim sürecini etkileyebilecek adımlar aynı anda yapılmıştır. Ayrıca, izole kardiyomiyositlerin kelepçe incelemesini düzeltmeye uygun olduğu doğrulanmaktadır.
Introduction
Kardiyak hastalık mortalitenin önde gelen küresel nedenlerinden biridir1. Sağlık sistemi üzerindeki bu yükü gidermek için kalbin fizyolojisinin ve patolojisinin derinlemesine anlaşılması esastır. Tüm hayvan ve sağlam kalp hazırlığının yanı sıra, hücresel hazırlık fonksiyonel ve hastalık çalışması için bir başka vazgeçilmez araçtır2. Yama kelepçesi, kalsiyum görüntüleme, moleküler biyoloji ve diğer ileri teknolojileri uygulayarak, araştırmacılar tek bir kardiyomiyositte (CM) elektrofizyolojik özellikler, kalsiyum homeostaz, sinyal yolları, metabolik durumlar ve gen transkripsiyonları hakkında daha fazla bilgi edinebilirler. Bu, kardiyak hastalık sürecinin fizyolojik ve patolojik mekanizmalarını ortaya çıkarmada son derece yararlıdır3,4,5,6,7. Hayvan araştırmaları için, küçük (örneğin, fareler, sıçanlar ve kobaylar) büyük (örneğin, tavşanlar ve köpekler) hayvanlara kadar çeşitli türler kullanılabilir. Küçük hayvanlar genellikle tercih edilir, özellikle fareler, çünkü genetik ve hastalık modeli manipülasyonu8,9,10'a elverişlidirler.
Akut olarak izole edilmiş CD'lerin teknikleri uzun bir gelişim döneminden geçmiştir ve hala gelişmektedir11. Langendorff retrograd perfüzyonu, özellikle ventrikül miyositlerini (VM) izole etmek için sıçanlarda ve farelerde uygulanan en başarılı ve tekrarlanabilir CD izolasyon yöntemidir 12,13,14,15. Bununla birlikte, başarıyla izole edilmiş atriyal miyositlerin (AM) raporları azdır16,17,18. Mekanizmaları ortaya çıkarmak ve yeni terapötik yaklaşımları araştırmak için tüm organ /sistemin hem seviyeleri hem de hücresel/alt hücre üzerinde daha fazla araştırma garanti edilir, çünkü en yaygın aritmi türü olan atriyal fibrilasyon (AF) küresel olarak giderek yaygınlaşmaktadır ve af hastalarının yaklaşık% 40-50'sinde hem farmakolojik tedavilerde hem de kardiyak ablasyonda mevcut tedavi yöntemleri etkisiz kalmaktadır19 . Başarılı yetişkin fare CD'leri izolasyonu hücresel çalışma için ilk adımdır. İki birincil yalıtım yöntemi kullanılabilir: öbek ve Langendorff yöntemleri. Langendorff perfüzyon yönteminde doku sindirimi koroner arterler ve dalları tarafından kılcal yataklara teslim edilen enzim çözeltisine bağlıdır. Aort kapaklarına nüfuz etmeyi ve koroner arter ostiasını bloke etmeyi önleyebilecek uygun bir aort kanülasyon derinliği, verimli sindirim ve ideal VM verimi için de temel adım olan böyle bir perfüzyon desenine ulaşmanın ön koşuludur. Bu nedenle, aort kanülasyonunun derinliğinin atria gemisinin perfüzyonunu benzer şekilde etkileyebileceğini ve son olarak verimini etkileyebileceğini varsaymak mantıklıdır. Bu hipotezi test etmek için farklı derinliklerde aort kanülasyonu yapıldı ve buna karşılık gelen verimleri karşılaştırıldı. Veriler, aort cannülasyon derinliğinin verimi ile doğrudan ilişkili olduğunu gösterdi. Burada, AM'leri ve VM'leri aynı anda yalıtmak için bir protokol getirilmiştir.
Protocol
Yetişkin erkek C57BL/6 20-30 g ağırlığında, 8-10 haftalık fareler, Çin'in Pekin kentindeki Capital Medical Üniversitesi Hayvan Merkezi'nden satın alındı. Tüm deneysel prosedürler Capital Medical University Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Hayvan Kaynakları Enstitüsü tarafından önerilen ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Veri toplama ve analiz için Excel ve Origin 8.5 kullanılmıştır. Veriler SD ± araçlar olarak sunulmaktadır, istatistiksel değerlendirme için Öğrencinin t testi kullanılmış ve P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
1. Çözelti ve perfüzyon aparatı hazırlama
- Sabit bir akış Langendorff aparatı (ticari olarak kullanılabilir veya kendi kendine yapılmış) monte edin. Şekil 1 basit bir şema sağlar.
- Çözeltileri Tablo 1 ve Tablo 2'de verilen reaktiflere göre hazırlayın.
- Dolaşımdaki su banyoyu açın ve perfüzyon sirkülasyon sisteminin kanülden çıkışının 37 °C'ye ulaştığından emin olmak için uygun bir giriş sıcaklığını (laboratuvarımızda 42,7 °C) ayarlayın.
- Deiyonize suyu sirkülasyona sokarak perfüzyon sistemini temizleyin. Steril bir durum gerekiyorsa, perfüzyon sisteminden% 75 etanol'ü 15 dakika boyunca çalıştırın, ardından deiyonize su (kalp üzerindeki alkol toksisitesi etkilerini önlemek için en az 10 döngü).
- Aşağıdaki perfüzyon adımında kaç mililitre oksijenli Tyrode çözeltisinin yüklendiğini belirlemek için perfüzyon sirkülasyon sisteminin bir döngüsü için zamanı ve hacmi ölçün.
- Tüm cerrahi aletleri istenilen yöntemde sterilize edin.
- Perfüzyon perfüzyon sisteminin akış hızını 4 mL/dk olarak ayarlayın.
- Tyrode çözeltisi (Petri kabı 1), diğeri çözelti 1 (Petri kabı 2) içeren iki temiz 35 mm Petri kabı hazırlayın.
- Çözelti 1 ile doldurulmuş 1 mL şırınga ve mesafenin 1 mm'den uğula kadar olduğu yerden bir çentik ile 20 G künt çelik kanül iğnesi hazırlayın. Kavun şaftına 3-0 dikişli gevşek bir düğüm hazırlayın. Stereomikroskopun görüntüleme alanını düzenleyin ve kanül ucunun Petri kabının sıvı yüzeyinin altında olduğundan emin olun 2.
2. Hayvan hazırlığı
- Kan pıhtılarını önlemek için farelere intraperitoneal olarak heparin (konsantrasyon, 1.000 IU/ mL; 0.2 mL / fare) uygular. 10 dakika sonra, fareleri sodyum pentobarbital (50 mg / kg, I.P. enjeksiyonu) ile uyuşturun ve farelerin kuyruk / toe sıkışmalarına yanıt vermeyi bıraktığından emin olun. Heparin işleminden 20 dk sonra servikal çıkık gerçekleştirin.
- Fareleri cerrahi platforma aktarın, fareleri sırtüstü bir pozisyonda sabitlayın, göğsü% 75 etanol ile sterilize edin ve gazlı bez veya peçete ile kurulayın.
3. Kalp eksizyon ve aort cannülasyonu
- Xiphoid derisini doku asarı ile kaldırın ve doku makası ile deriden küçük bir yanal kesi yapın. Cilt ve fasya arasında künt bir diseksiyon gerçekleştirin ve cildin kesisini V şeklinde her iki taraftaki aksiillaya doğru uzatın.
- Göğüs kafesinden aynı kesi izine devam edin ve ardından, kalbi ve akciğerleri tamamen açığa çıkarmak için sternumu doku tokalarıyla kenetleyerek göğüs kafesini yukarı doğru saptırın.
- Kavisli bir asa kullanarak perikardiyumu soyun. Timus bezini büyük damarları kaplıyorsa iki kavisli kümes tarafından her iki tarafa doğru yırtın. "Y" şeklinde bir kan damarı (aort ve dal arterleri) görülene kadar kalbin tabanını kavisli tokalarla kuyruğa doğru hafifçe çekin.
- Kanülasyon ve karşılaştırma için aortu farklı uzunluklarda ayırmak için, sol ortak karotid arterdeki aortu transekte edin ( Şekil 2'de yeşil çizgi) ve bazı farelerde braşiyofalik arteri aynı anda kesin. Diğer farelerde yükselen aortta transekt ( Şekil 2'de siyah çizgi).
NOT: Bu prosedüre yeni başlayanlar için bu adım stereoskopik mikroskop altında da yapılabilir. - Kalbi çıkar ve kalan kanı yıkamak ve pompalamak için petri kabı 1'e hemen daldır.
- Kalbi Petri kabı 2'ye aktarın ve gerekirse ince iris makası kullanarak fazla dokuları kesin. Bu prosedüre yeni başlayanlar için, aortu veya diğer kalp yapılarını yanlışlıkla kesmemek için stereomikroskop altında bu adımı yapın.
- Şırındırı aort kaülasyonundan önce hava kabarcıklarını dışarı çıkarmak için itin. Stereomikroskop altında iki düz bağlı önseçim (pürüzsüz çene) yardımıyla retrograd aort cannülasyonu gerçekleştirin. Tüm cannülasyon işleminin sıvı yüzeyin altında olduğundan emin olun.
- Aort kapaklarına nüfuz etmekten kaçının ve derinlikleri sırasıyla yükselen aorta (aortu sol ortak karotid arterde transekte edildiği fare) ve aort köküne (aortun yükselen aortta transekte edildiği fare) ayarlayın.
NOT: Aort cannülasyonunun derinliği (basitçe derinlik olarak adlandırılır) burada, canül ucunun aortta olduğu veya aortun liglendiği konum olarak tanımlanır. - Aortu, düğüm öncesi 3-0 dikişi ile kaven çentiğine bağla. Artık kanı durulamak için şırınd içeriğine hafifçe bastırın.
NOT: Derinlik düzgün bir şekilde konumlandırılırsa kan koroner arterleri terk eder ve sırt damarlarından effuse yapar. Kalp ve atriyal ekler genişleyecek ve soluklaşacaktır. - Kalıtı çıkarın ve Langendorff cihazına bağlayın. Bir kez daha, kalbe giren hava kabarcıklarından kaçınmaya özen edin.
NOT: Torakotomiden ilk perfüzyona kadar olan sürenin 5 dakikayı geçmemesi gerektiğini unutmayın.
4. Kalp perfüzyonu
- İlk olarak, asal ve perfüz oksijenli Tyrode'un çözeltisi yaklaşık 10 s (bu protokolde kullanılan sistemde 10 s çalışan sıvı hacmi yaklaşık 0,7 mL'dir) ve eğer atriada artık kan varsa, çözelti 1'e geçin. Bununla birlikte, atria'da artık kan yoksa, çözelti 1 ile perfuse. Kalbi yaklaşık 2 dakika boyunca perfuse edin.
- Çözüm 3'e geçin. Tek kullanımlık steril polietilen pipet ile yaklaşık 2,5 mL çözelti 3 emin ve daha sonra kullanmak üzere su banyosunda ön ısıtma yapın, geri kalanı yaklaşık 11-12 dakika perfüzyon için kullanılır. İlk 2 dakikada perfüzyonlu çözelti 3'e atın. Sindirim tamamlanana kadar geri kalanını peristaltik pompa ile perfüzyon rezervuarlarına geri dönüştürerek yeniden kullanıma sürsün.
- Kalp şişip hafif soluk ve sarkık hale geldiğinde (süngerimsi doku) veya miyokard dişli bir tokma kullanılarak hafifçe sıkıştırılırsa bir baskı varsa sindirimi sonlandırın.
5. Hücre izolasyonu ve kalsiyumun yeniden tanıtılması
- Ventrikülleri ve artriyeleri çıkarın ve farklı Petri tabaklarına yerleştirin. Petri tabaklarına önceden ısıtılan çözelti 3'e ekleyin.
- Dokuyu künt forseps ile bulanık bir dokuya dönüştür ve eşit sindirim için dokuyu hafifçe pipetle. Hava kabarcıklarını tanıtmaktan kaçının.
- Kalan enzim aktivitesini tutuklamak için pipetle bulanık sindirilmiş dokuyu çözelti 4'e aktarın ve ardından 192×g'de 20 sn santrifüj. Üstnatantı çıkarın ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için hücre tortusuna ve pipet içine çözelti 5 ekleyin.
- Kalsiyum paradoksu ve kalsiyum aşırı yüklenmesini önlemek için kalsiyuma adım adım yeniden giriş. Hücre süspansiyonu için kademeli olarak toplam 50 μL 100 mM/L CaCl2 (sırasıyla 5 μL, 10 μL, 15 μL ve 20 μL'lik her 5 dakikalık aralıkta) ekleyin.
6. Hücre depolama
- Yama kelepçesi çalışması için hücreleri Tyrode'un çözeltisinde saklayın. Diğer hücresel çalışmalar için hücreleri çözelti 6'da saklayın.
- Akut fonksiyonel çalışmaların (örneğin, Ca2+ kıvılcımları, Ca2+ dalgaları, Ca2+ salınımı, Ca2+ sızıntısı ve yama kelepçesi kayıtları) sonuçlarının doğruluğunu sağlamak için, bu tür fonksiyonel deneyleri sonraki 6 saat içinde bitirin.
Representative Results
Aort canülasyonunun derinliği (basitçe derinlik olarak adlandırılır) olarak tanımlanan aort ucunun aorta yerleştiği bu makale, aortun nerede liglendiğini de temsil eder. Yükselen aortta konserve ve liglenmiş bir kalpten izole edilen ve VM sırasıyla AMAA ve VMAA olarak temsil edilir. Ayrıca, aort kökünde konserve ve liglenmiş bir kalpten izole edilen ve VM sırasıyla AMAR ve VMAR olarak temsil edilir. Şekil 2'de aort ve transeksiyon pozisyonlarına genel bakış göstermektedir. Ayrıca Şekil 3 , aort transeksiyon pozisyonlarına karşılık gelen derinlikleri ve ligasyon yerlerini göstermektedir. Derinlik, atriyya ve atriyal eklerin perfüzyonu ile ilişkiliydi. Kanül ucu yükselen aortta olduğunda her iki atriyal ek de şişirilir ve bu da yeterli atria perfüzyonunu gösterir. Bununla birlikte, aort kökünde atria perfüzyonu yetersizdir ve her iki atriyal ek de wizened edilir (Şekil 4). Kalsiyumun yeniden kazandırılmasından sonra farklı derinliklerde konserve kalplerden izole edilen CM morfolojisi ve canlılığı (Şekil 5). AMAA, AMAR, VMAA ve VMAR hücre morfolojileri kalsiyum reintrodüksiyondan önce ve sonra konfokal mikroskop altındadır. AM'ler mil şeklindeyken, VM'ler dikdörtgen uçlu çubuk şeklindedir. Ayrıca, AM'ler ve VM'ler sağlam membranlara, net konturlara, açık çizgili sarkomlara ve pürüzsüz yüzeylilere sahiptir (Şekil 6). Hücre canlılığı trypan mavisi boyama ile değerlendirildi. Sağlam zarlara sahip normal hücreler trippan mavisini dışlayabilir ve lekelenmez, hücre kaybı aktivitesi hücre içi olarak hızlı bir şekilde trippan mavisi biriktirir (Şekil 7). AM'ler ve VM'ler hücre sayımını gerçekleştirmek için farklı nesne slaytlarına yerleştirildi. AM'nin toplam verimi ve uygulanabilir mil şeklindeki CD'lerin yüzdesi (sağkalım oranı), hücre süspansiyonunun 10 μL'si bir nesne slaydına aktarılarak belirlendi ve 4 × 10 görüş alanında ters faz kontrastı mikroskobu altında sayıldı. Aynı yöntem VM'lerin toplam verimini (çubuk şeklinde) ve uygulanabilir VM'lerin yüzdesini belirlemek için de kullanılmıştır. Bu yöntem hemositometre kullanmak yerine tercih edilir, çünkü CD'ler büyüklükleri ve şekilleri nedeniyle hemositometrenin sayım alanına kolayca dağıtılmamıştır. Çubuk grafik (Şekil 8), kalsiyumun yeniden girişi öncesi ve sonrası AMAA, AMAR, VMAA ve VMAR'ın sağkalım oranlarını gösterir. Her değer, 10 fareden ortalama ± SD'sini temsil eder. Kalsiyum yeniden girişten önce, AMAA'nın sağkalım oranları AMAR'dan önemli ölçüde daha yüksektir (% 70.9 ±% 2.8 ve% 41.0 ±% 5.2; s < 0,01). Kalsiyum reintrodüksiyondan sonra, AMAA'nın sağkalım oranları AMAR'dan önemli ölçüde daha yüksektir (% 69.4 ±% 3.0 ve% 37.7 ±% 4.9; s < 0,01).
VMAA sağkalım oranları VMAR'ınkilerden farklı değildi (%89,5 ± %2,7 ile %88,1 ± %2,6; s > 0.05) kalsiyumun yeniden kazandırılmasıdan önce. Benzer şekilde, VMAA sağkalım oranları VMAR'ınkilerden farklı değildi (%82,2 ± %1,9 ile %82,9 ± %1,6; s > 0.05) kalsiyumun yeniden kazandırılmasından sonra.
Bu protokolün önerdiği gibi derinlikte bir kalp (yükselen aortta), kalsiyumun yeniden tanıtılmasından sonra sırasıyla yaklaşık 4.1 milyon ve yaklaşık 180.000 uygulanabilir VM ve verimi. İzole ve VM'deki sodyum akımının (Şekil 9A, B) ve akım yoğunluklarının (Şekil 9C) tüm hücre yama kelepçesi kaydı, hücre kalitesinin elektrofizyolojik deneyler için gereksinimleri karşıladığını doğrulamamaktadır. Aortu anatomisi (Şekil 10), atriyal damarın ostiumunun aort köküne yakın olduğunu ve koroner arterin (CA) ostium'una bitişik olduğunu göstermektedir. Tablo 3 , sırasıyla yükselen aort ve aort kökünde konserve ve liglenmiş kalplerin CA ostium'una, canül ucundan ca ostium'una olan mesafeyi gösterir.
Şekil 1. Birleştirilmiş değiştirilmiş Langendorff sisteminin şematik diyagramı. Bu sistem kullanıcılar için ekonomik ve taşınabilirdir. Su için iki parça plastik boru -bir (iç çap, 8 mm) ve perfüzyon için bir parçası vardır (iç çap, 1,5 mm) distal ucu Luer kilitli bir PE tıbbi üç yönlü stopcock'a bağlanır. Su içeren ve ısı eşanjörü olarak kauçuk durduruculu bir cam şişe. Perfüzyon, peristaltik pompa tarafından ısı eşanjöründeki plastik boruya pompalanır ve kanüle bağlı üç yönlü stopcock'tan çıkar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Aort ve dokular etrafta. "Y" şeklindeki kan damarı yapısı aort ve dallarıdır: braşiyofalik arter (ok 1) ve sol ortak karotid arter (ok 2). Aortu sol ortak karotis arter (yeşil çizgi) arasında transekte edin ve aynı anda bazı farelerde braşiyofalik arteri kesin; diğer farelerde yükselen aortta (siyah çizgi) transekte edin (stereomikroskop 10 × 2 büyütme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Konserve kalbin ön görünümü. Siyah kavisli çizgi, sol ortak karotid arter arasında transekte edilen aortu incisal kenarını temsil eder. Kırmızı kavisli çizgi, yükselen aortta transekte edilen aortu incisal kenarını temsil eder. Düz çizgi aortun nerede lige edildiğini temsil eder: yükselen aortta siyah ve aort kökünde kırmızı (stereomikroskop 10 × 2 büyütme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Konserve kalplerin perfüzyon durumu. Atria yeterince perfüzyonludur ve her iki atriyal uzantı da kalpte şişirilir (A) yükselen aortta kanüle edilir ve liglenir. Bununla birlikte, her iki atriyal ek de kalpte (B) kanüle edilir ve aort kökünde liglenir, bu da zayıf atria perfüzyonunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Kalsiyum reintrodüksiyon sonrası hücre morfolojisi ve canlılık değerlendirmesi. Kalpten izole edilen AM'ler (A) ve VM'ler (B) sırasıyla AMAAs ve VMAA'lar olarak temsil edilir. Kalpten izole edilen AM'ler (C) ve VM'ler (D) aort kökünde konserve ve liglenmiş olarak sırasıyla AMAR ve VMAR olarak temsil edilir. Yüksek kaliteli CD'ler sessizdir ve sağlam zarlara, net konturlara, açık çizgili sarkomlara ve pürüzsüz bir hücre yüzeye sahiptir. AM'ler mil şeklindeyken, VM'ler dikdörtgen uçlu çubuk veya tuğla şeklindedir. Kendiliğinden büzülen veya zarda bleb içeren CD'ler düşük kalitededir ve küresel bir şekle küçülenler ölü hücrelerdir. Rastgele bir görüş alanı (floresan mikroskop, 10 × 10 büyütme; ölçek çubukları, 100 μm). = atriyal miyosit, VM = ventrikül miyosit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Kalsiyum reintrodüksiyondan önce ve sonra konfokal mikroskop altında hücre morfolojisi. Kalsiyum yeniden giriş öncesi, AMAA (A) ve AMAR (C) net konturlar, çizgili sarkomlar ve pürüzsüz membran yüzeyleri ile mil şeklindedir. Kalsiyum yeniden giriş yaptıktan sonra, AMAA (B) ve AMAR (D) de net konturlar, çizgili sarkomlar ve pürüzsüz membran yüzeyleri ile mil şeklindedir. Kalsiyum yeniden giriş öncesi, VMAA (E) ve VMAR (G) çubuk şeklindedir ve açık konturlar, çizgi sarkıtları ve dikdörtgen uçlu pürüzsüz membran yüzeyleri ile tuğla şeklindedir. Kalsiyum yeniden giriş yaptıktan sonra, VMAA (F) ve VMAR (H) ayrıca şeffaf konturlar, çizgili sarkomlar ve dikdörtgen uçlu pürüzsüz membran yüzeyleri (konfokal mikroskop yağı, 63 × 10 büyütme; ölçek çubukları, 50 μm) ile çubuk veya tuğla şeklindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Hücre canlılığı değerlendirmesi. Aktivitesini kaybeden hasarlı hücreler trippan mavisi ile lekelenir. Buna karşılık, canlı hücreler tripan mavisi (floresan mikroskop, 4 × 10 büyütme; ölçek çubukları, 100 μm) ile lekelenemez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8. Amaa, AMAR, VMAA ve VMAR'ın kalsiyumun yeniden girişi öncesi ve sonrası sağkalım oranlarını gösteren çubuk grafik. CR = kalsiyum reintrodüksiyon. Her değer, 10 fareden ortalama ± SD'sini temsil eder. s < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | İçindekiler (farklı belirtilmemişse mmol/L'deki son konsantrasyon) | Kaydetti |
| Perfüzyon çözeltisi (çözüm 1) | 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurin, 5 Glikoz, 10 2,3-butanedione monoksim(BDM) | 4 °C'de 3 gün saklanabilen. Glikoz, Taurin ve BDM deney günü eklenir. Her kalp için 200 mL perfüzyon çözeltisi hazırlayın. |
| Tyrode'un çözümü (çözüm 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glikoz | 4 °C'de 3 gün saklanabilen. CaCl2 ve Glikoz deney günü eklenir, ph metre ile oda sıcaklığında (28-30 °C) doymuş NaOH ile pH'ı 7.3-7.4'e ayarlayın. |
Tablo 1. Yetişkin fare CM yalıtımı için çözümler.
| Çözüm | Içeriği | Kaydetti |
| Sindirim çözeltisi(çözüm 3) | 25 mL çözelti 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg kollajenaz II, 50μL (%2,5 10×) tripsin | her kalp için |
| Durdurma çözümü 1(çözüm 4) | 9 mL çözelti 1, 1 mL FBS (Fetal Sığır Serumu), 4μL 100 mM/L CaCl2 | her kalp için |
| Durdurma çözümü 2(çözüm 5) | 9,5 mL çözelti 1, 0,5 mL FBS (Fetal Sığır Serumu), 4μL 100 mM/L CaCl2 | her kalp için |
| Hücre resüspensyon çözümü (çözüm 6) | 13 mL çözelti 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) sıvının yüzeyini kaplayan ince bir tabaka oluşturabilen bir dozda | her kalp için |
Tablo 2. Yetişkin fare CM yalıtımı ve depolama için çözümler.
Şekil 9. Sodyum kanallarının akım-gerilim eğrileri. İzole kardiyomiyositlerin sodyum akımlarını gerilim kelepçe modunda kaydetmek için tam hücreli yama kelepçe teknikleri kullanılmıştır. Gerilim kelepçesi protokolü girişte gösterilir. (A) ve VM'den (B) kaydedilen sodyum akımları gösterilir. −45mV potansiyellerinde akım yoğunlukları, −40mV ve −35 mV, SıRASıYLA (−32,71 ± 1,597 pA/pF, −31,49 ± 1,820 pA/pF ve −29,34 ± 1,939 pA/pF;; n = 10) VM'den (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± 1,560 pA/pF ve −21,86 ± 1,381 pA/pF, sırasıyla; n = 8; P < 0,05). (C) I-V eğrileri hücre kapasitansına normalleştirilen sodyum akım yoğunluklarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10. Atriyal damarın kökeni ve dağılımı. A. Panel B panelinde atriyal damar (ok 1) ve CA (ok 2) atriyal damara daha yakından bakılır (ok 3). (C) İki farklı büyüklükte ostia vardır; biri (ok 4) atriyal ekleri sulayan atriyal damara, diğeri (ok 5) CA'ya (stereomikroskop 10 × 5 büyütme) karşılık gelir. CA = koroner arter. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Farelerin seri numarası | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| Aort cannülasyonunun derinliği yükselen aorttadır | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| Aort cannülasyonunun derinliği aort kökündedir | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
Tablo 3. Kanül ucundan koroner arter ostium'a uzaklık. C57BL/6 farelerin kalpleri (n = 20), aortu sırasıyla yükselen aort ve aort kökünün derinliklerinde kanülat ve ligatlamak için kullanılmıştır. Aort anatomilendi ve kanül ucundan CA ostium'a olan uzaklığı ölçüldü. Mesafe milimetre cinsinden ölçülür ve pozitif veya negatif işaretler sırasıyla CA ostium'un üstündeki ve altındaki kanül ucunu temsil eder.
Discussion
Tek CM, kardiyak fonksiyon ve hastalıkların hücresel düzeydeki çalışmalarında değerli ve vazgeçilmez bir araçtır20. Bu nedenle, uygulanabilir CD'lerin kalplerden izolesi ilk ve en önemli adımdır. Hücre kalitesi, özellikle optik ve elektrofizyolojik deneylerde başarılı deneyler yapmanın önemli belirleyicilerinden biridir. Diğer hayvanların CD'leri ile karşılaştırıldığında, kemirgen CD'leri, Na+/ Ca2 + exchanger21 aracılığıyla kalsiyum akınını destekleyen daha yüksek hücre içi sodyum iyonları konsantrasyonu nedeniyle iskemi ve hipoksiye karşı daha savunmasızdır. Ayrıca, sayısı VM'lerden çok daha azdır; bu nedenle, başarılı izolasyon elde etmek son derece zordur. Langendorff yöntemi fare VM'lerini izole etmek için mükemmeldir22, ancak AM'leri izole etmedeki başarı oranı düşüktür ve çok az rapor mevcuttur. Aort cannülasyonunun uygun derinliği, tampon hazırlama için kullanılan sıcaklık, enzim aktivitesi, PH ve su kalitesi dışında ideal VM'lerin eldeılmasında da önemli bir faktördür. Langendorff yönteminin prensibi kalbin retrograd perfüzyona dayanır. Perfüzyon üzerine aort kapağı kapatılır; böylece perfüzyon koroner arterlere zorla sokarak damar dallarından enzim çözeltisi iletilir ve miyokard dokusu eşit olarak sindirilir. Bu tür bir dolaşım desenini elde etmek için, aort kanülasyon ve ligasyon için yeterli uzunluk ayırmalı, ayrıca kanül ucu aort kapaklarına nüfuz etmemeli veya CA ostiumunu engellememelidir. Bu nedenle, aort kanülasyonunun derinliğinin, atria'nın sindirim etkinliğini ve verimini benzer şekilde etkileyen atria perfüzyonu ile de ilişkili olduğunu tahmin etmek mantıklıdır. Burada sunulan protokol hipotezi doğruladı ve önerilerle birlikte hücre verimini optimize etmek için önemli adımlar aşağıda not edildi.
Adım 1.9'da, aortu daha iyi sabitlemek için, uçtaki mesafenin 1 mm olduğu yerden bir çentik (veya çevresel bir oluk) ile kör bir 20 G'lık bir kavun önerilir. Deneyimlerimize dayanarak, aortun çapından biraz daha büyük olan kanül boyutunun, kanül ucunun kanülasyon sırasında aort kapaklarını delmesini önlediği bulunmuştur, çünkü aort, içsel elastikiyetine güvenerek, kanüle sıkıca sığabilir ve kanülasyon derinliğini ayarlarken koruyucu bir faktör olarak işlev gören sürtünme üretebilir. Çentiğin konumu açısından, kalp, canül ucuna çok yakınsa yerçekimi nedeniyle canülasyon sırasında kolayca kayar. Tersine, cannülasyon derinliğini ve ligasyon pozisyonunu ayarlamak için alan çok uzaksa çok sınırlı olacaktır. Bu koşullar göz önüne alındığında, aortu yeterince uzun olduğundan ve yükselen aortta kanüle edilip lige edilebilmesini sağlamak için sol ortak karotid arter arasındaki aortu ( Şekil 2'deki yeşil çizgi olarak) transekte etmek 3.3. Yükselen aortta transeksiyon olurken, kanülasyon için ayrılmış uzunluk en azından kanül ucunu aort köküne yakın sabitleyebilir ve ligasyondan sonra aort kapaklarına nüfuz etmez. Aortu anatomisi ve kanül ucundan CA ostiumuna olan mesafenin ölçümü, aortu sol ortak karotid arter arasında transeksiyonun uygun bir aort kanülasyon derinliği elde etmek için ideal bir konum olduğunu göstermektedir.
Kanülasyon derinliğinin, atria perfüzyonu ile ilişkili olduğu bulunmuştur, bu da bir derinlik göstergesi görevi görür. Şekil 4 , derinlik yükselen aortta olduğunda atria perfüzyonun iyi olduğunu ve her iki atriyal ekin de şişirildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, derinlik aort kökündeyken (veya yaklaştığında) atria perfüzyonu yetersizdir ve her iki atriyal ek de wizened. Şişirilmiş atriyal eklerden elde edilen toplam ve uygulanabilir sayısı daha yüksekti (Şekil 8). Bu bulgular, aort kanülasyon derinliğinin atria ve atriyal eklerin perfüzyonunu ve sindirimini belirli bir şekilde etkileyebileceğini ve son olarak verimini ve kalitesini etkileyebileceğini göstermektedir. AM'nin verimi ve kalitesi, aryayı besleyen gemilerin dağılımı ile ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır. Fernández ve ark.23 çalışması, fare CA'sının kökeninde ve seyrinde çeşitli anomaliler göstermiştir. CA ostiasının oldukça değişken olduğunu ve hepsinin aort sinüsünde yer aldığını buldular. Bazı CA'lar, yüksek kalkışlı ostium olarak adlandırılan aort sinüslerinin üstünden anormal bir şekilde kaynaklanabilir. Bazı CA'lar aynı aort sinüsünden kaynaklanabilir ve atriyum kabının ostium'u hemen yakındadır. Bu çalışmadaki aortu anatomisi de Fernández'in bulunmasıyla tutarlıdır (Şekil 10). Bu, cannülasyon derinliği uygun değilse, AM'yi Langendorff yöntemiyle izole etme girişimlerinin büyük ölçüde başarısız olmasının nedeni olabilir. Bu nedenle, canül ucu ile CA ostium arasında yeterli alan yoksa, canül ucunun CA ostium'a bitişik olan atriyum damar ostiumunu engelleme şansı daha yüksek olacaktır. Buna karşılık, aort kapakları kanül ucu tarafından nüfuz edilmedikçe ventrikülün perfüzyonu ve hücre verimi neredeyse hiç etkilenmedi. Bunun nedeni muhtemelen ventriküle kan sağlayan CA'ların daha büyük ostia ve daha fazla kökene sahip olmasıdır. Bir ostium kanül tarafından tıkanmışsa, ventrikül perfüzyonu başka bir CA veya kollateral dolaşım ile telafi edilebilirken, atriyumu sağlayan kan damarı oldukça küçüktür ve yerini hiçbir şey tutamaz. Bu nedenle, aort cannülasyonundaki derinliğin etkisi önemlidir.
Sindirim ve hücre saklama sürecindeki diğer dikkat çekici faktörler ve sorun çekimleri aşağıdaki gibi sıralanmıştır. İlk olarak, aort ligasyonundan sonra atriadaki kan aceleye getirilmemişse, kas kasmasını sağlamak ve artık kan pompalamak için 4.1 adımda oksijenli Tyrode'un çözeltisini perfüzyon yapmayı düşünün. Bu, ca2+ ve hasarlı eritrositlerden salınan diğer malzemelerin olumsuz etkisini önlemeye yardımcı olabilir. İkinci olarak, bağlantıyı ayrıştırmak ve hücreler arasındaki boşluğu genişletmek için ca2+içermeyen çözeltinin perfüzyonlanması enzim sindiriminin etkinliğini artırabilir, çünkü CM'ler arasındaki intercalated diskler kalsiyuma bağımlı hücreler arası kavşaklardır. Bununla birlikte, kalsiyum paradoksu fenomeninden kaçınmak için süre 3-5 dakika ile sınırlanmalıdır24. Karışık bir enzim çözeltisi önerilir. Kollajenaz tip II hücre dışı matris ağını bozar ve kollajenaz II sindirimi eksikse tripin hücre yüzeyinde kalan granül malzemenin temizlenmesine yardımcı olur. Bu, yama kelepçe kaydında bir GΩ contası oluşturmak için kritik olan pürüzsüz bir hücre yüzeyi sağlar. Bununla birlikte, tripin konsantrasyonu aşırı sindirim ve hücre yaralanmasını önlemek için uygun aralıkta kontrol edilmelidir, çünkü membran proteinini bozabilir. Hücre verimini artırmak için tek başına kollajenaz tip II kullanmak genellikle sindirim üzerinde dokuya yol açabilir ve izole edilmiş CD'ler uzun süreli kollajenaz maruziyeti sonrası kalsiyum intoleransı olacaktır25. Miyozin ATPase'yi inhibe ederek ve köprüler arası oluşumu engelleyerek kendiliğinden kasılmayı önleyen bir madde olan 2,3 butanedione monoksim (BDM) kullanımı halen tartışmalıdır26,27,28,29. Önceki deneyime göre, bu protokol için BDM eklemek gereklidir. Enzim çözeltisi çözelti 1 ile hazırlanır, ancak çözelti 1 kalsiyum içermez ve enzimi aktive etmek için kalsiyum eklenir. Perfüzyon çözeltisinde BDM eklemenin yararı, (1) enzim çözeltisi perfüzyonu sırasında miyositlerin kasılmasını inhibe etmeyi ve oksijen tüketimini azaltmayı ve (2) miyositlerin hipoksiden önlenmesini ve izole edilmiş miyositlerin kalitesinin artırılmasını içerir. Bazı çalışmalar, BDM'nin hücresel elektriksel özellikler üzerinde potansiyel bir olumsuz etkisi olabileceğini bildirmektedir. Bununla birlikte, sodyum akımının tüm hücreli yama kelepçe kaydının sonuçları istenmeyen bir etkiye işaret etmedi. Hücre depolama adımında (adım 6), çok sayıda çalışma, hücrelerin polarize ve düşük metabolik koşullarda oldukları için daha iyi bir durum koruyabilecekleri kalsiyum içermeyen ancak yüksek potasyum konsantrasyonu çözümü olan KB tamponunu seçti. Bununla birlikte, hücre zarının glikokalipsi, belirli bir süre eksojen kalsiyum yokluğunda lipid bilayerden ayrılır ve membran geçirgenliği artarak sonraki fonksiyonel analizi etkiler30,31,32.
Tüm miyosit izolasyon teknikleri esasen şu anda enzymatic bir çözeltide öbek (küçük bir doku parçası) sindirimi veya enzymatic çözelti (Langendorff perfüzyonu) ile CA perfüzyonu olarak sınıflandırılabilir 22. Langendorff yöntemi ile karşılaştırıldığında, öbek sindirim yönteminin gerçekleştirilmesi daha kolaydır ve birçok laboratuvarda CD'leri izole etmek için rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntem normalde yetişkin dokularından düşük kalitede CD'ler üretir22. Ayrıca, bu yöntemle izole edilen hücreler karşılaştırmalı deneyler yapmak için uygun olmayabilir. Örneğin, ve VM arasındaki hücre tipine özgü ilaç etkileri test edilirken, farklı izolasyon koşullarının etkisi ihmal edilemez veya dışlanamaz. Bunun nedeni, miyokard ve ventrikülün doku yoğunluğunun atriyumdan çok daha kalın ve yoğun olmasıdır, bu da farklı sindirim süreleri ve enzim konsantrasyonları ile sonuçlanır. Ayrıca, sindirim sırasında dokunun aşırı ajitasyon ve pipetlenmesi hücrelere zarar verecek ve fonksiyonel çalışmaları önemli ölçüde etkileyecektir. Ayrıca, daha önceki birçok çalışma, AM'lerin kalsiyuma karşı daha savunmasız olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, mevcut protokol tarafından izole edilen AM'ler, muhtemelen sindirim sürecinin sonunda dokunun yırtılması kolay olduğu için gradyan kalsiyumun yeniden girişine karşı hoşgörülü olabilir. Bu nedenle, mekanik hasar daha azdır, oysa hücreler öbek yönteminin adımları tekrarlanan yırtılma ve santrifüje ihtiyaç duyduğundan daha fazla mekanik hasara uğrar. Daha yakın zamanda, Ackers ve arkadaşları, uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve nonmiyositlerin izolasyonu için basitleştirilmiş, Langendorff içermeyen bir yöntem bildirdi. VM'ler ve fibroblastlar etkili bir şekilde izole edilebilir, ancak AM'lerin miktarından bahsedilmedi. Ancak, bu protokolün birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, kalp kan damarlarının dağılımı bireysel farklılıklar ve fareler için gerginlik için varyasyonlara sahip olabilir ve önerilen kanülasyon derinliği her zaman için başarılı bir AMs izolasyonunu garanti edemez. İkincisi, bu prosedüre yeni başlayanlar için aort transeksiyonu ve retrograd aort kanülasyonu uygulamak belirli bir zaman alabilir. Son olarak, bu yöntem sağlıklı ve yaşlı fareler dışında diğer kalp hastalığı modellerinde test edildi. Bu nedenle, kalbin fibrozis boyutu nedeniyle enzim konsantrasyonlarında ve sindirim süresinde ayarlamalar gerektirecektir. Öbek yönteminde karşılaşılan farklı sindirim koşullarının dezavantajı, enzim çözeltisinin damar yatakları tarafından dokuya eşit olarak dağıtıldığı Langendorff yönteminde bir sorun olmayacaktır.
Özetle, burada açıklanan tek ve VM'nin eşzamanlı izolasyonu için protokoller, uygun aort kanülasyon derinliğinin atriyum perfüzyonunu ve verimini etkili bir şekilde iyileştirebileceğini göstermiştir. Bu yöntemle izole edilen CD'ler yüksek kalitededir, iyi kalsiyum toleransına sahiptir ve team34'te patch kelepçe kaydı ve kalsiyum elleçleme (IonOptix sistemi tarafından Ca2+ salınımı ve Ca2+ dalga ölçümü) için başarıyla uygulanmıştır. İzolasyon protokolünün, kardiyak fizyoloji ve patolojinin anlaşılmasını derinleştirmeye yardımcı olacak bir dizi hücresel ve hücre altı araştırmada hücre hazırlığı için kullanılabileceği öngörülmektedir. Daha da önemlisi, klinik olarak daha ilgili kalp hastalığı mekanizmalarının ve müdahale yöntemlerinin keşfedilmesini sağlayacaktır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7192051 No. Yazar katkıları: Bai ve Liu projeyi tasarladı ve tasarladı. Wen ve Ruan deneyler için değerli tavsiyelerde bulundular. Wu ve Linling Li deneysel çalışmayı yürüttüler ve veri toplama, analiz ve yorumlamada kilit roller oynadılar. Li, Langendorff aparat montajına katıldı. Peng, Zhang, Wang ve Yang deneyden önce reaktiflerin ve çözümlerin hazırlanmasına katıldılar. Makaleyi Wu yazdı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
- Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective. Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).
- Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances. Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
- Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte. Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).
- Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte. The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).
- Chou, C. C., et al. Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium. Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).
- Brittsan, A. G., et al. Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport. Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).
- Mohler, P. J., et al. Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).
- Ni, L., et al. Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector. Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).
- Dobrev, D., Wehrens, X. H. T.
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109 (2014).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823 (2014).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms. Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Bers, D. M. Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Hall, A. R., Hausenloy, D. J. Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes. Physiological Reports. 4 (1), 12606 (2016).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. 2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jiang, L., et al. Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium. Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).
