Summary
Este protocolo describe modificaciones del método de Langendorff, incluida la profundidad de la canulación de la aorta para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos.
Abstract
Un solo cardiomiocito es una herramienta vital en los estudios a nivel celular y subcelular de la biología cardíaca y las enfermedades como unidad fundamental de contracción y actividad eléctrica. Por lo tanto, aislar cardiomiocitos viables y de alta calidad del corazón es el paso experimental inicial y más crucial. Comparando los diversos protocolos para aislar los cardiomiocitos de ratones adultos, la perfusión retrógrada de Langendorff es el método más exitoso y reproducible reportado en la literatura, especialmente para aislar miocitos ventriculares. Sin embargo, aislar los miocitos auriculares de calidad del corazón perfundido sigue siendo un desafío, y hay pocos informes de aislamiento exitosos disponibles. Resolver este complicado problema es extremadamente importante porque, aparte de la enfermedad ventricular, la enfermedad auricular representa una gran parte de las enfermedades cardíacas. Por lo tanto, se justifican más investigaciones a nivel celular para revelar los mecanismos. En este trabajo se introduce un protocolo basado en el método de perfusión retrógrada de Langendorff y se realizan simultáneamente algunas modificaciones en la profundidad de la canulación de la aorta y los pasos que pueden afectar al proceso de digestión para aislar los miocitos auriculares y ventriculares. Además, se confirma que los cardiomiocitos aislados son susceptibles de investigación de pinzas de parche.
Introduction
La enfermedad cardíaca es una de las principales causas mundiales de mortalidad1. Para abordar esta carga en el sistema de salud, es esencial una comprensión profunda de la fisiología y la patología del corazón. Además de la preparación del corazón entero e intacto, la preparación celular es otra herramienta indispensable para el estudio funcional y de enfermedades2. Al aplicar la pinza de parche, las imágenes de calcio, la biología molecular y otras tecnologías avanzadas, los investigadores pueden obtener más información sobre las propiedades electrofisiológicas, la homeostasis del calcio, las vías de señalización, los estados metabólicos y las transcripciones de genes en un solo cardiomiocito (CM). Esto es extremadamente útil para revelar los mecanismos fisiológicos y patológicos del proceso de la enfermedad cardíaca3,4,5,6,7. Para la investigación con animales, se pueden utilizar especies que van desde animales pequeños (por ejemplo, ratones, ratas y conejillos de indias) hasta animales grandes (por ejemplo, conejos y perros). Por lo general, se prefieren los animales pequeños, especialmente los ratones, porque son susceptibles de manipulación genética y de modelos de enfermedades8,9,10.
Las técnicas de CM agudamente aisladas han experimentado un largo período de desarrollo y aún están evolucionando11. La perfusión retrógrada de Langendorff es el método de aislamiento de CM más exitoso y reproducible aplicado en ratas y ratones, especialmente para aislar miocitos ventriculares (VM)12,13,14,15. Sin embargo, los informes de miocitos auriculares (AM) aislados con éxito son escasos16,17,18. Se justifican más investigaciones en ambos niveles de todo el órgano/sistema y el celular/subcelular para revelar los mecanismos y explorar nuevos enfoques terapéuticos porque la fibrilación auricular (FA), el tipo más común de arritmia, se está volviendo cada vez más frecuente a nivel mundial, y las modalidades de tratamiento actuales tanto en las terapias farmacológicas como en la ablación cardíaca siguen siendo ineficaces en aproximadamente el 40%-50% de los pacientes con FA19 . El aislamiento exitoso de CM de ratones adultos es el primer paso para el estudio celular. Se pueden utilizar dos métodos de aislamiento primario: el trozo y los métodos de Langendorff. En el método de perfusión de Langendorff, la digestión tisular depende de la solución enzimática suministrada por las arterias coronarias y sus ramas a los lechos capilares. Una profundidad de canulación de aorta adecuada que pueda evitar penetrar en las válvulas aórticas y bloquear la ostia de la arteria coronaria es el requisito previo para lograr dicho patrón de perfusión, que también es el paso esencial para una digestión eficiente y un rendimiento ideal de VM. Por lo tanto, es razonable suponer que la profundidad de la canulación de la aorta puede afectar de manera similar la perfusión del vaso de aurículas y finalmente afectar el rendimiento de AM. Para probar esta hipótesis, se realizó la canulación de la aorta a diferentes profundidades y se compararon los rendimientos de AM correspondientes. Los datos mostraron que la profundidad de canulación de la aorta es directamente relevante para el rendimiento de AM. Aquí, se introduce un protocolo para aislar AM y VM simultáneamente.
Protocol
Los ratones C57BL / 6 machos adultos que pesan 20-30 g, 8-10 semanas de edad fueron comprados en el Centro de Animales de la Universidad Médica de Capital, Beijing, China. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de capital Medical University y se realizaron de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio propuesta por el Instituto de Recursos Animales y publicada por los Institutos Nacionales de Salud. Se utilizó Excel y Origin 8.5 para la adquisición y análisis de datos. Los datos se presentan como medias ± de la DE, para la evaluación estadística, se utilizó la prueba t de Student y se consideró estadísticamente significativa la P < 0,05.
1. Preparación de la solución y del aparato de perfusión
- Montar un aparato Langendorff de flujo constante (disponible comercialmente o de fabricación propia). La Figura 1 proporciona un esquema simple.
- Preparar las soluciones de acuerdo con los reactivos dados en la Tabla 1 y tabla 2.
- Encienda el baño de agua circulante y ajuste una temperatura de entrada adecuada (42,7 °C en nuestro laboratorio) para garantizar que el flujo de salida del sistema de circulación de perfusato de la cánula alcance los 37 °C.
- Limpie el sistema de perfusión haciendo circular agua desionizada. Si se requiere una condición estéril, pase etanol al 75% a través del sistema de perfusión durante 15 minutos, seguido de agua desionizada (al menos 10 ciclos para evitar los efectos de toxicidad del alcohol en el corazón).
- Mida el tiempo y el volumen durante un ciclo del sistema de circulación de perfusato para determinar cuántos mililitros de solución de Tyrode oxigenado se cargarán en el siguiente paso de perfusión.
- Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas en el método deseado.
- Ajuste el caudal del sistema de perfusión de perfusato a 4 ml/min.
- Prepare dos placas de Petri limpias de 35 mm: una que contenga la solución de Tyrode (placa de Petri 1), la otra que contenga la solución 1 (placa de Petri 2).
- Prepare una jeringa de 1 ml llena de solución 1 y una aguja de cánula de acero romo de 20 G con una muesca desde donde la distancia es de 1 mm hasta la punta. Prepare un nudo suelto con sutura 3-0 al eje de la cánula. Regule el campo de visión del estereomicroscopio y asegúrese de que la punta de la cánula esté debajo de la superficie líquida de la placa de Petri 2.
2. Preparación animal
- Administrar heparina (concentración, 1.000 UI/ml; 0,2 ml/ratón) por vía intraperitoneal a los ratones para evitar coágulos de sangre. Después de 10 min, anestesiar a los ratones con pentobarbital de sodio (50 mg / kg, inyección I.P.) y asegurarse de que los ratones dejen de responder a los pellizcos de la cola / dedo del pie. Realizar luxación cervical 20 min después de la administración de heparina.
- Transfiera los ratones a la plataforma quirúrgica, fije los ratones en posición supina, esterilice el pecho con etanol al 75% y séquelo con una gasa o servilleta.
3. Escisión cardíaca y canulación de la aorta
- Levante la piel del xifoide con fórceps de tejido y haga una incisión lateral menor a través de la piel con tijeras de tejido. Realice una disección roma entre la piel y la fascia y extienda la incisión de la piel en forma de V hacia las axilas en ambos lados.
- Continúe el mismo rastro de incisión a través de la caja torácica y luego, desvíe la caja torácica hacia arriba sujetando el esternón con fórceps de tejido para exponer completamente el corazón y los pulmones.
- Despegue el pericardio con un fórceps curvo. Desgarra la glándula del timo hacia ambos lados con dos pinzas curvas si cubre los grandes vasos. Tire suavemente de la base del corazón hacia la cola con fórceps curvos hasta que se pueda ver un vaso sanguíneo en forma de "Y" (la aorta y sus arterias ramificadas).
- Para reservar diferentes longitudes de la aorta para la canulación y la comparación, transecte la aorta en la arteria carótida común izquierda (línea verde en la Figura 2) y corte la arteria braquiocefálica al mismo tiempo en algunos ratones. Transecto en la aorta ascendente en otros ratones (línea negra en la Figura 2).
NOTA: Para aquellos que son nuevos en este procedimiento, este paso también se puede hacer bajo un microscopio estereoscópico. - Extirpa el corazón e inmediatamente sumérgete en la placa de Petri 1 para lavar y bombear la sangre residual.
- Transfiera el corazón a la placa de Petri 2 y recorte cualquier tejido excedente con tijeras de iris fino si es necesario. Para aquellos que son nuevos en este procedimiento, haga este paso debajo del estereomicroscopio para evitar cortar erróneamente la aorta u otras estructuras cardíacas.
- Empuje la jeringa para expulsar las burbujas de aire antes de la canulación de la aorta. Realice la canulación retrógrada de la aorta con la ayuda de dos pinzas de amarre rectas (mandíbulas lisas) debajo del estereomicroscopio. Asegúrese de que todo el proceso de canulación esté debajo de la superficie líquida.
- Evite penetrar en las válvulas aórticas y ajuste las profundidades a la aorta ascendente (el ratón que la aorta fue transectada en la arteria carótida común izquierda) y la raíz aórtica (el ratón que la aorta fue transectada en la aorta ascendente), respectivamente.
NOTA: La profundidad de la canulación de la aorta (conocida simplemente como profundidad) se define aquí como la posición donde la punta de la cánula está en la aorta o donde se liga la aorta. - Ligar la aorta con la sutura pre-nudo 3-0 a la muesca de la cánula. Presione suavemente el contenido de la jeringa para enjuagar la sangre residual.
NOTA: La sangre saldrá de las arterias coronarias y se expulsará de las venas dorsales si la profundidad está correctamente posicionada. El corazón y los apéndices auriculares se expandirán y se volverán pálidos. - Retire y conecte la cánula al aparato de Langendorff. Una vez más, tenga cuidado de evitar que las burbujas de aire entren en el corazón.
NOTA: Tenga en cuenta que el tiempo desde la toracotomía hasta la perfusión inicial no debe exceder los 5 min.
4. Perfusión cardíaca
- Primero, imprima y perfunda oxigenó la solución de Tyrode durante aproximadamente 10 s (el volumen de líquido que corre 10 s en el sistema utilizado en este protocolo es de aproximadamente 0,7 ml) si hay sangre residual en las aurículas, y luego cambie a la solución 1. Sin embargo, solo perfunda con la solución 1 si no hay sangre residual en las aurículas. Perfundir el corazón durante aproximadamente 2 min.
- Cambie a la solución 3. Aspire aproximadamente 2,5 ml de solución 3 con una pipeta de polietileno estéril de un solo uso y precalentarla en el baño de agua para su uso posterior, y el resto se utilizará para perfusión durante aproximadamente 11-12 min. Desechar la solución 3 perfundida en los primeros 2 min. Recicle el resto a los depósitos de perfusato mediante la bomba peristáltica para su reutilización hasta que se complete la digestión.
- Termine la digestión cuando el corazón se hincha y se vuelve ligeramente pálido y flácido (textura esponjosa) o existe una huella si el miocardio se pellizca suavemente con un fórceps dentado.
5. Aislamiento celular y reintroducción de calcio
- Retira los ventrículos y las aurículas con fórceps, y colócalos en diferentes placas de Petri. Añadir la solución precalentada 3 a las placas de Petri.
- Triture el tejido en una textura turbia con fórceps contundentes y pipetee suavemente el tejido para una digestión uniforme. Evite introducir burbujas de aire.
- Transfiera el tejido turbio digerido con la pipeta a la solución 4 para detener la actividad enzimática restante, y luego centrífuga durante 20 s a 192×g. Retire el sobrenadante y agregue la solución 5 en el sedimento celular y la pipeta para dispersar uniformemente las células.
- Reintroducir el calcio de manera gradual para evitar la paradoja del calcio y la sobrecarga de calcio. Añadir gradualmente un total de 50 μL 100 mM/L CaCl2 (a cada intervalo de 5 min de 5 μL, 10 μL, 15 μL y 20 μL, respectivamente) a la suspensión celular.
6. Almacenamiento celular
- Para el estudio de la pinza de parche, almacene las células en la solución de Tyrode. Para otros estudios celulares, almacene las células en la solución 6.
- Para garantizar la precisión de los resultados de los estudios funcionales agudos (por ejemplo, chispas de Ca2+ , ondas de Ca2+ , liberación de Ca2+ , fugas de Ca2+ y registros de pinzas de parche), finalice este tipo de experimentos funcionales dentro de las próximas 6 h.
Representative Results
Este documento, donde la punta de la cánula se coloca en la aorta, que se define como la profundidad de la canulación de la aorta (conocida simplemente como profundidad), también representa dónde se liga la aorta. La AM y la VM aisladas de un corazón que fue canulado y ligado en la aorta ascendente se representan como AMAA y VMAA, respectivamente. Además, AM y VM aislados de un corazón que fue canulado y ligado en la raíz aórtica se representan como AMAR y VMAR, respectivamente. La Figura 2 muestra la visión general de la aorta y las posiciones de transección. Además, la Figura 3 muestra las profundidades y los lugares de ligadura que corresponden a las posiciones de transección de la aorta. La profundidad se asoció con la perfusión de las aurículas y los apéndices auriculares. Ambos apéndices auriculares se inflan cuando la punta de la cánula está en la aorta ascendente, lo que indica suficiente perfusión de aurículas. Sin embargo, cuando está en la raíz aórtica, la perfusión de aurículas es insuficiente y ambos apéndices auriculares están enjutos (Figura 4). La morfología y viabilidad de la CM que se aíslan de los corazones canulados a diferentes profundidades después de la reintroducción del calcio (Figura 5). Las morfologías celulares de AMAA, AMAR, VMAA y VMAR están bajo el microscopio confocal antes y después de la reintroducción de calcio. Las AM tienen forma de husillo, mientras que las VM tienen forma de varilla con extremos rectangulares. Además, los AM y las VM tienen membranas intactas, contornos claros, sarcómeros estriados claros y superficie lisa (Figura 6). La viabilidad celular se evaluó mediante tinción azul tripano. Las células normales con membranas intactas pueden excluir el azul de tripano y no se teñirán, mientras que la actividad de pérdida de las células acumulará rápidamente el azul de tripano intracelularmente (Figura 7). Las máquinas virtuales y las máquinas virtuales se colocaron en diferentes diapositivas de objetos para realizar el recuento de celdas. Los rendimientos totales de AM y el porcentaje de CM viables en forma de huso (tasa de supervivencia) se determinaron transfiriendo 10 μL de la suspensión celular a un portaobjetos de objeto y se contaron bajo un microscopio de contraste de fase invertido a 4 × 10 campos de visión. El mismo método se utilizó para determinar los rendimientos totales de las máquinas virtuales (en forma de varilla) y el porcentaje de máquinas virtuales viables. Este método es preferible al uso de un hemocitómetro, porque los CM no se distribuyeron fácilmente en el área de conteo del hemocitómetro debido a su tamaño y forma. Un gráfico de barras (Figura 8) muestra las tasas de supervivencia de AMAA, AMAR, VMAA y VMAR antes y después de la reintroducción del calcio. Cada valor representa la media ± SD de 10 ratones. Antes de la reintroducción del calcio, las tasas de supervivencia de AMAA son significativamente más altas que las de AMAR (70,9% ± 2,8% y 41,0% ± 5,2%, respectivamente; p < 0,01). Después de la reintroducción del calcio, las tasas de supervivencia de AMAA son significativamente más altas que las de AMAR (69,4% ± 3,0% y 37,7% ± 4,9%, respectivamente; p < 0,01).
Las tasas de supervivencia de VMAA no difirieron de las de la VMAR (89,5% ± 2,7% vs 88,1% ± 2,6%, respectivamente; p > 0,05) antes de la reintroducción del calcio. Del mismo modo, las tasas de supervivencia del VMAA no difirieron de las del VMAR (82,2% ± 1,9% vs 82,9% ± 1,6%, respectivamente; p > 0,05) después de la reintroducción del calcio.
Un corazón canulado en profundidad como recomendaba este protocolo (en la aorta ascendente), un rendimiento viable de MÁQUINAS virtuales y AM de aproximadamente 4,1 millones y aproximadamente 180.000, respectivamente, después de la reintroducción de calcio. El registro de la pinza de parche de celda entera de la corriente de sodio (Figura 9A, B) y las densidades de corriente (Figura 9C) en el AM y VM aislados confirma que la calidad de la celda ha cumplido con los requisitos para experimentos electrofisiológicos. La anatomía de la aorta (Figura 10) muestra que el ostium del vaso auricular está cerca de la raíz aórtica y es adyacente al ostium de la arteria coronaria (AC). La Tabla 3 muestra la distancia desde la punta de la cánula hasta el ostium CA de corazones canulados y ligados en la aorta ascendente y la raíz aórtica, respectivamente.
Figura 1. Diagrama esquemático de un sistema de Langendorff modificado ensamblado. Este sistema es económico y portátil para los usuarios. Tiene dos partes de tubo de plástico, una para el agua (diámetro interior, 8 mm) y otra para el perfusato (diámetro interior, 1,5 mm), cuyo extremo distal está conectado a una llave de paso de tres vías médica de PE con una cerradura Luer. Una botella de vidrio que contiene agua y con un tapón de goma se forma como un intercambiador de calor. El perfusato es bombeado al tubo de plástico en el intercambiador de calor por la bomba peristáltica y sale de la llave de paso de tres vías conectada a la cánula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Aorta y tejidos alrededor. Una estructura de vasos sanguíneos en forma de "Y" es la aorta y sus ramas: la arteria braquiocefálica (flecha 1) y la arteria carótida común izquierda (flecha 2). Transectar la aorta entre la arteria carótida común izquierda (línea verde) y cortar simultáneamente la arteria braquiocefálica en algunos ratones; transecto en la aorta ascendente (línea negra) en otros ratones (estereomicroscopio 10 × 2 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Vista frontal del corazón canulado. La línea curva negra representa el borde incisal de la aorta que se transectó entre la arteria carótida común izquierda. La línea curva roja representa el borde incisal de la aorta transectada en la aorta ascendente. La línea recta representa dónde se aligó la aorta: negro en la aorta ascendente y rojo en la raíz aórtica (estereomicroscopio 10 × 2 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Estado de perfusión de los corazones canulados. Las aurículas están suficientemente perfundidas, y ambos apéndices auriculares se inflan en el corazón (A) canulados y ligados en la aorta ascendente. Sin embargo, ambos apéndices auriculares se enjuagan en el corazón (B) canulados y ligados en la raíz aórtica, lo que indica una mala perfusión de las aurículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Evaluación de la morfología celular y la viabilidad tras la reintroducción del calcio. Las AM (A) y las VM (B) aisladas del corazón canuladas y ligadas en la aorta ascendente se representan como AMAA y VMAA, respectivamente. Las AM (C) y las VM (D) aisladas del corazón canuladas y ligadas en la raíz aórtica se representan como AAR y VMAR, respectivamente. Los CM de alta calidad son inactivos y tienen membranas intactas, contornos claros, sarcómeros estriados claros y una superficie celular lisa. Las AM tienen forma de husillo, mientras que las MÁQUINAS virtuales tienen forma de varilla o ladrillo con extremos rectangulares. Los CM que se contraen espontáneamente o contienen ampollas en la membrana son de mala calidad, y los que se encogen en forma esférica son células muertas. Un campo de visión aleatorio (microscopio de fluorescencia, 10 × 10 de aumento; barras de escala, 100 μm). AM = miocito auricular, VM = miocito ventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Morfología celular bajo un microscopio confocal antes y después de la reintroducción del calcio. Antes de la reintroducción del calcio, AMAA (A) y AMAR (C) tienen forma de huso con contornos claros, sarcómeros estriados y superficies de membrana lisas. Después de la reintroducción de calcio, AMAA (B) y AMAR (D) también tienen forma de huso con contornos claros, sarcómeros estriados y superficies de membrana lisas. Antes de la reintroducción del calcio, VMAA (E) y VMAR (G) tienen forma de varilla o ladrillo con contornos claros, sarcómeros estriados y superficies de membrana lisas con extremos rectangulares. Después de la reintroducción de calcio, VMAA (F) y VMAR (H) también tienen forma de varilla o ladrillo con contornos claros, sarcómeros estriados y superficies de membrana lisas con extremos rectangulares (aceite de microscopio confocal, 63 × 10 de aumento; barras de escala, 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Evaluación de la viabilidad celular. Las células dañadas que pierden actividad se tiñen con azul tripano. Por el contrario, las células viables no pueden teñirse con azul de tripano (microscopio de fluorescencia, 4 × 10 de aumento; barras de escala, 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Gráfico de barras que muestra las tasas de supervivencia de AMAA, AMAR, VMAA y VMAR antes y después de la reintroducción de calcio. CR = reintroducción de calcio. Cada valor representa la media ± SD de 10 ratones. p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Contenido (concentración final en mmol/L, si no se especifica de manera diferente) | nombrado |
| Solución de perfusión (solución 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurina, 5 Glucosa, 10 2,3-butanediona monoxima(BDM) | Que se puede almacenar durante 3 días a 4 °C. La glucosa, la taurina y la BDM se agregan el día del experimento. Preparar 200 ml de solución de perfusión para cada corazón. |
| Solución de Tyrode (solución 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 mgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 glucosas | Que se puede almacenar durante 3 días a 4 °C. CaCl2 y glucosa se agregan el día del experimento, ajuste el pH a 7.3-7.4 con NaOH saturado a temperatura ambiente (28-30 ° C) con un medidor de pH. |
Tabla 1. Soluciones para el aislamiento de CM en ratones adultos.
| Solución | Contenido | nombrado |
| Solución de digestión (solución 3) | 25 ml de solución 1, 6μL 100 mM/L De CaCl2, 25 mg de colagenasa II, 50 μL (2,5 % 10×) tripsina | para cada corazón |
| Detener la solución 1(solución 4) | 9 ml de solución 1, 1 ml de FBS (suero fetal bovino), 4μL 100 mM/L de CaCl2 | para cada corazón |
| Detener la solución 2(solución 5) | 9,5 ml de solución 1, 0,5 ml de FBS (suero fetal bovino), 4μL 100 mM/L de CaCl2 | para cada corazón |
| Solución de resuspensión celular (solución 6) | 13 ml de solución 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) a una dosis que puede formar una capa delgada que cubre la superficie del líquido | para cada corazón |
Tabla 2. Soluciones para el aislamiento y almacenamiento de CM de ratones adultos.
Figura 9. Curvas corriente-voltaje de los canales de sodio. Se utilizaron técnicas de pinza de parche de células enteras para registrar las corrientes de sodio de los cardiomiocitos aislados en el modo de pinza de voltaje. El protocolo de abrazadera de voltaje se muestra en el recuadro. Se muestran las corrientes de sodio registradas de la AM (A) y vm (B). Las densidades actuales a potenciales de −45mV, −40mV y −35 mV son significativamente mayores en AM (−32.71 ± 1.597 pA/pF, −31.49 ± 1.820 pA/pF, y −29.34 ± 1.939 pA/pF, respectivamente; n = 10) que en VM (−17.66 pA/pF ± 1.976 pA/pF, −21.09 ± 1.560 pA/pF, y −21.86 ± 1.381 pA/pF, respectivamente; n = 8; P < 0,05). (C) Las curvas I-V muestran las densidades de corriente de sodio que se normalizaron a capacitancia celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. Origen y distribución del vaso auricular. El vaso auricular (flecha 1) y el CA (flecha 2) en el panel A. El panel B es una mirada más cercana al vaso auricular (flecha 3). C) Existen dos ostias de diferentes tamaños; uno (flecha 4) corresponde al vaso auricular que irrigó los apéndices auriculares, y el otro (flecha 5) corresponde al CA (estereomicroscopio 10 × 5 aumento). CA = arteria coronaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| El número de serie de los ratones | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| La profundidad de la canulación de la aorta está en la aorta ascendente | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| La profundidad de la canulación de la aorta está en la raíz aórtica | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
Tabla 3. Distancia desde la punta de la cánula hasta la arteria coronaria ostium. Los corazones de ratones C57BL/6 (n = 20) se utilizaron para cannular y ligar la aorta a profundidades de la aorta ascendente y la raíz aórtica, respectivamente. La aorta se anatomiza y se mide la distancia desde la punta de la cánula hasta el ostium CA. La distancia se mide en milímetros, y los signos positivos o negativos representan la punta de la cánula por encima y por debajo del ostium CA, respectivamente.
Discussion
La CM única es una herramienta valiosa e indispensable en los estudios a nivel celular de la función cardíaca y las enfermedades20. Por lo tanto, el aislamiento de los CM viables de los corazones es el paso inicial y más crucial. La calidad celular es uno de los determinantes significativos de la realización de experimentos exitosos, especialmente en experimentos ópticos y electrofisiológicos. En comparación con los CM de otros animales, los CM de roedores son más vulnerables a la isquemia y la hipoxia debido a una mayor concentración de iones de sodio intracelulares, lo que favorece la afluencia de calcio a través del intercambiador Na+/Ca2+21. Además, el número de AM es mucho menor que el de las máquinas virtuales; por lo tanto, el aislamiento exitoso es extremadamente difícil de lograr. El método Langendorff es excelente para aislar VMs de ratones22, pero la tasa de éxito en el aislamiento de AM es baja, y hay pocos informes disponibles. La profundidad adecuada de la canulación de la aorta también es un factor esencial para producir máquinas virtuales ideales, aparte de la temperatura, la actividad enzimática, el pH y la calidad del agua utilizadas para la preparación del tampón. El principio del método de Langendorff se basa en la perfusión retrógrada del corazón. Tras la perfusión, la válvula aórtica se cierra; por lo tanto, el perfusato se fuerza en las arterias coronarias, entregando solución enzimática a través de las ramas de los vasos, y el tejido miocárdico se digiere uniformemente. Para lograr este tipo de patrón de circulación, la aorta debe reservar suficiente longitud para la canulación y la ligadura, también la punta de la cánula no debe penetrar en las válvulas aórticas ni bloquear el ostium CA. Por lo tanto, es razonable especular que la profundidad de la canulación de la aorta también se asocia con la perfusión de aurículas, lo que afecta la eficacia de la digestión de las aurículas y los rendimientos de AM de manera similar. El protocolo presentado aquí confirmó la hipótesis, y los pasos cruciales para optimizar el rendimiento celular junto con las sugerencias se señalan a continuación.
En el paso 1.9, para asegurar mejor la aorta, se recomienda una cánula roma de 20 G con una muesca (o un surco circunferencial) desde donde la distancia es de 1 mm hasta la punta. Según nuestras experiencias, se descubrió que el tamaño de la cánula que es un poco más grande que el diámetro de la aorta evita que la punta de la cánula perfore las válvulas aórticas durante la canulación porque la aorta, confiando en su elasticidad intrínseca, puede encajar perfectamente en la cánula y producir fricción, lo que actúa como un factor protector al avanzar o retroceder ajustando la profundidad de la canulación. En términos de la posición de la muesca, el corazón se deslizará fácilmente durante la canulación debido a la gravedad si está demasiado cerca de la punta de la cánula. Por el contrario, el espacio para ajustar la profundidad de canulación y la posición de ligadura estará muy limitado si está demasiado lejos. Dadas estas circunstancias, la transectación de la aorta entre la arteria carótida común izquierda (como la línea verde en la Figura 2) para garantizar que la aorta sea lo suficientemente larga y pueda ser canulada y ligada en la aorta ascendente es mejor en el paso 3.3. Mientras que la transectación en la aorta ascendente, la longitud reservada para la canulación al menos podría asegurar la punta de la cánula cerca de la raíz aórtica y no penetrará en las válvulas aórticas después de la ligadura. La anatomía de la aorta y la medición de la distancia desde la punta de la cánula hasta el ostium CA indican que la transectación de la aorta entre la arteria carótida común izquierda es una posición ideal para lograr una profundidad de canulación de aorta adecuada.
Se encontró que la profundidad de canulación está asociada con la perfusión de las aurículas, que a su vez actúa como un indicador de profundidad. La Figura 4 muestra que la perfusión de aurículas es buena cuando la profundidad está en la aorta ascendente, y ambos apéndices auriculares están inflados. Sin embargo, la perfusión de aurículas es insuficiente cuando la profundidad está en (o acercándose) a la raíz aórtica y ambos apéndices auriculares están enjutos. El recuento total y viable de AM obtenido de los apéndices auriculares inflados fue mayor (Figura 8). Estos hallazgos indican que la profundidad de la canulación de la aorta puede afectar la perfusión y la digestión de las aurículas y los apéndices auriculares de cierta manera y finalmente afectar el rendimiento y la calidad de la AM. Se infirió que el rendimiento y la calidad de la AM estaban asociados con la distribución de los vasos que suministran las aurículas. El estudio de Fernández et al.23 ha demostrado diversas anomalías en el origen y curso de la AC del ratón. Encontraron que los Ostia de CA eran muy variables y no todos estaban ubicados en el seno aórtico. Algunas CA pueden originarse anómalamente desde arriba de los senos aórticos, llamados ostium de alto despegue. Algunas CA pueden originarse en el mismo seno aórtico, y el ostium del vaso de la aurícula está cerca. La anatomía de la aorta en el presente estudio (Figura 10) también es consistente con el hallazgo de Fernández. Esta puede ser la causa por la cual los intentos de aislar la AM por el método de Langendorff han sido en gran medida infructuosos si la profundidad de canulación no es apropiada. Por lo tanto, la punta de la cánula tendrá una mayor probabilidad de bloquear el ostium del vaso de la aurícula que está adyacente al ostium ca si no hay suficiente espacio disponible entre la punta de la cánula y el ostium CA. Por el contrario, la perfusión y el rendimiento celular del ventrículo apenas se vieron afectados mientras las válvulas aórticas no fueran penetradas por la punta de la cánula. Esto se debe probablemente a que las CA que suministran sangre al ventrículo tienen ostias más grandes y más orígenes. Si un ostium fue ocluido por la cánula, la perfusión del ventrículo puede ser compensada por otra AC o la circulación colateral, mientras que el vaso sanguíneo que suministra la aurícula es bastante pequeño y no tiene sustituto. Por lo tanto, la influencia de la profundidad en la canulación de la aorta es importante.
Otros factores notables y problemas en el proceso de digestión y almacenamiento celular se enumeran a continuación. Primero, considere perfundir la solución oxigenada de Tyrode en el paso 4.1 para hacer que el músculo se contraiga y bombee sangre residual si la sangre en las aurículas no se ha apresurado después de la ligadura de la aorta. Esto puede ayudar a evitar el efecto adverso del ca2+ y otros materiales liberados de los eritrocitos dañados. En segundo lugar, perfundir una solución libre de ca2+ antes de tiempo para disociar la conexión y expandir el espacio entre las células puede mejorar la eficacia de la digestión enzimática porque los discos intercalados entre los CM son uniones intercelulares dependientes del calcio. Sin embargo, el tiempo debe limitarse a 3-5 min para evitar el fenómeno de la paradoja del calcio24. Se recomienda una solución enzimática mixta. La colagenasa tipo II interrumpe la red de la matriz extracelular, y la tripsina ayuda a limpiar el material granular que permanece en la superficie celular si la digestión de la colagenasa II es incompleta. Esto garantiza una superficie de celda lisa, que es fundamental para formar un sello GΩ en la grabación de la abrazadera de parche. Sin embargo, la concentración de tripsina debe controlarse en el rango adecuado para evitar la digestión excesiva y la lesión celular, ya que puede degradar la proteína de membrana. El uso de colagenasa tipo II sola para mejorar el rendimiento celular a menudo puede conducir a la digestión del tejido, y los CM aislados serán intolerantes al calcio después de una exposición prolongada a la colagenasa25. El uso de monoxima de 2,3-butanediona (BDM), una sustancia que previene la contracción espontánea al inhibir la miosina ATPasa y prevenir la formación de puentes cruzados, sigue siendo controvertido26,27,28,29. Según la experiencia previa, la adición de BDM es necesaria para este protocolo. La solución enzimática se prepara con la solución 1, aunque la solución 1 no contiene calcio, y se agrega calcio para activar la enzima. El beneficio de agregar BDM en la solución de perfusión incluye (1) inhibir la contracción de los miocitos y reducir el consumo de oxígeno durante la perfusión de la solución enzimática y (2) prevenir la hipoxia de los miocitos y mejorar la calidad de los miocitos aislados. Algunos estudios informaron que la BDM puede tener una influencia adversa potencial en las propiedades eléctricas celulares. Sin embargo, los resultados del registro de la pinza de parche de células enteras de la corriente de sodio no indicaron un efecto indeseable. En la etapa de almacenamiento celular (paso 6), numerosos estudios han elegido el tampón KB, una solución libre de calcio pero de alta concentración de potasio, en la que las células pueden mantener un mejor estado porque se encuentran en condiciones polarizadas y metabólicas bajas. Sin embargo, el glicocáliz de la membrana celular se separará de la bicapa lipídica en ausencia de calcio exógeno durante un cierto período de tiempo y la permeabilidad de la membrana aumentará, afectando al análisis funcional posterior30,31,32.
Todas las técnicas de aislamiento de miocitos se pueden clasificar esencialmente actualmente en digestión por trozos (un pequeño trozo de tejido) en una solución enzimática o perfusión CA con solución enzimática (la perfusión de Langendorff)22. En comparación con el método langendorff, el método de digestión en trozos es más fácil de realizar y también se utiliza de forma rutinaria para aislar los CM en muchos laboratorios. Sin embargo, este método normalmente produce un bajo rendimiento de CM de mala calidad a partir de tejidos adultos22. Además, las células aisladas por este método pueden no ser adecuadas para realizar experimentos comparativos. Por ejemplo, al probar los efectos de los medicamentos específicos del tipo de célula entre AM y VM, el impacto de las diferentes condiciones de aislamiento no se puede descuidar ni excluir. Esto se debe a que el miocardio y la densidad tisular del ventrículo son mucho más gruesos y densos que los de la aurícula, lo que resulta en diferentes tiempos de digestión y concentraciones de enzimas. Además, la agitación excesiva y el pipeteo del tejido durante la digestión dañarán las células y tendrán un impacto significativo en los estudios funcionales. Además, muchos estudios previos han demostrado que los AM son más vulnerables al calcio. Sin embargo, los AM aislados por el protocolo actual pueden ser tolerantes a la reintroducción de calcio gradiente probablemente porque el tejido es fácil de romper al final del proceso de digestión. Por lo tanto, el daño mecánico es menor, mientras que las células sufrirían más daños mecánicos ya que los pasos del método de trozos necesitan ruptura repetida y centrífuga. Más recientemente, Ackers et al.33 reportaron un método simplificado, libre de Langendorff para el aislamiento de miocitos cardíacos viables y no miocitos. Las máquinas virtuales y los fibroblastos se pueden aislar de manera efectiva, pero no se mencionó la cantidad de las AM. Sin embargo, este protocolo tiene varias limitaciones. En primer lugar, la distribución de los vasos sanguíneos del corazón puede tener variaciones para las diferencias individuales y la tensión de los ratones, y la profundidad de canulación recomendada no puede garantizar un aislamiento exitoso de AM para cada vez. En segundo lugar, para aquellos que son nuevos en este procedimiento puede tomar una cierta cantidad de tiempo para practicar la transección de la aorta y la canulación retrógrada de la aorta. Finalmente, este método no se probó en otros modelos de enfermedades cardíacas, excepto en ratones sanos y ancianos. Por lo tanto, requerirá ajustes en las concentraciones de enzimas y el tiempo de digestión debido a la extensión de la fibrosis del corazón. La desventaja de las diferentes condiciones de digestión encontradas en el método de trozos no será un problema en el método de Langendorff en el que la solución enzimática se distribuye uniformemente al tejido por los lechos de los vasos.
En resumen, los protocolos para el aislamiento simultáneo de AM y VM individuales descritos aquí han demostrado que la profundidad de canulación de la aorta adecuada puede mejorar efectivamente la perfusión de la aurícula y el rendimiento de AM. Los CM aislados por este método son de alta calidad, poseen una buena tolerancia al calcio y se han aplicado con éxito al registro de pinzas de parche y al manejo de calcio (liberación de Ca2+ y medición de onda de Ca2+ por el sistema IonOptix) en el equipo34. Se prevé que el protocolo de aislamiento se puede utilizar para la preparación celular en una serie de investigaciones celulares y subcelulares, lo que ayudará a profundizar la comprensión de la fisiología y la patología cardíaca. Es importante destacar que permitirá el descubrimiento de mecanismos y métodos de intervención de enfermedades cardíacas clínicamente más relevantes.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (No. 7192051). Contribuciones del autor: Bai y Liu diseñaron y concibieron el proyecto. Wen y Ruan proporcionaron valiosos consejos para los experimentos. Wu y Linling Li llevaron a cabo el trabajo experimental y desempeñaron papeles clave en la adquisición, análisis e interpretación de datos. Li participó en el montaje del aparato langendorff. Peng, Zhang, Wang y Yang participaron en la preparación de los reactivos y soluciones antes del experimento. Wu escribió el artículo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
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