Summary
Denne protokol beskriver ændringer af Langendorff-metoden, herunder dybden af aorta cannulation til samtidig isolering af atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus.
Abstract
En enkelt kardiomyocyt er et vigtigt redskab i de cellulære og subcellulære niveau undersøgelser af hjertebiologi og sygdomme som en grundlæggende enhed for sammentrækning og elektrisk aktivitet. Derfor isolere levedygtige, høj kvalitet kardiomyocytter fra hjertet er det første og mest afgørende eksperimentelle skridt. Sammenligning af de forskellige protokoller for isolering af kardiomyocytter af voksne mus, langendorff retrograd perfusion er den mest succesfulde og reproducerbare metode rapporteret i litteraturen, især for isolere ventrikulære myocytter. Det er dog stadig en udfordring atolating kvalitet atrie myocytter fra perfused hjertet, og få vellykkede isolationsrapporter er tilgængelige. Løsning af dette komplicerede problem er yderst vigtigt, fordi bortset fra ventrikulær sygdom, atriesygdom tegner sig for en stor del af hjertesygdomme. Derfor er yderligere undersøgelser på celleniveau for at afsløre mekanismerne berettiget. I dette papir, en protokol baseret på Langendorff retrograd perfusion metode er indført, og nogle ændringer i dybden af aorta cannulation og de trin, der kan påvirke fordøjelsesprocessen for at isolere atrie og ventrikulære myocytter blev samtidig foretaget. Desuden er de isolerede kardiomyocytter bekræftet at være modtagelige for patch klemme undersøgelse.
Introduction
Hjertesygdomme er en af de førende globale årsager til dødelighed1. For at imødegå denne byrde på sundhedssystemet er en dybdegående forståelse af hjertets fysiologi og patologi afgørende. Udover hele dyr og intakt hjerteforberedelse er cellulær forberedelse et andet uundværligt værktøj til funktionel og sygdomsundersøgelse2. Ved at anvende plaster klemme, calcium imaging, molekylær biologi, og andre avancerede teknologier, forskere kan få mere information om de elektrofysiologiske egenskaber, calcium homøostase, signalering veje, metaboliske tilstande, og gen transskriptioner i en enkelt kardiomyocyt (CM). Dette er yderst nyttigt at afsløre de fysiologiske og patologiske mekanismer i hjertesygdomsprocessen3,4,5,6,7. Til dyreforsøg kan der anvendes arter lige fra små (f.eks. mus, rotter og marsvin) til store (f.eks. kaniner og hunde) dyr. Små dyr foretrækkes normalt, især mus, fordi de er modtagelige for genetisk og sygdomsmodelmanipulation8,9,10.
Teknikker til akut isolerede CMs har gennemgået en lang udviklingsperiode og er stadig under udvikling11. Langendorff retrograd perfusion er den mest succesfulde og reproducerbare CMs isolationsmetode, der anvendes hos rotter og mus, især til isolering af ventrikulære myocytter (VM'er)12,13,14,15. Men rapporter om vellykkede isolerede atrie myocytter (AM'er) er knappe16,17,18. Yderligere undersøgelser på begge niveauer af hele organ /system og cellulære / subcellulære at afsløre mekanismerne og udforske nye terapeutiske tilgange er berettiget, fordi atrieflimren (AF), den mest almindelige form for arytmi, i stigende grad bliver udbredt globalt, og nuværende behandlingsmetoder i både farmakologiske behandlinger og hjerteablation forbliver ineffektiv hos ca. 40%-50% af AF patienter19 . Vellykket voksen mus CMs isolation er det første skridt for cellulære undersøgelse. To primære isolationsmetoder kan anvendes: chunk og Langendorff metoder. I Langendorff perfusionsmetoden afhænger væv fordøjelsen af enzymet løsning leveret af kranspulsårerne og deres grene til kapillær senge. En ordentlig aorta cannulation dybde, der kan undgå at trænge ind i aorta ventiler og blokere kranspulsåren ostia er forudsætningen for at opnå en sådan perfusion mønster, som også er det væsentlige skridt for effektiv fordøjelse og ideelle VM udbytte. Det er derfor rimeligt at antage, at aorta cannulationens dybde på samme måde kan påvirke forkamrenes forkamrenes perfusion og endelig påvirke AM-udbyttet. For at teste denne hypotese blev aorta cannulation på forskellige dybder udført, og de tilsvarende AM-udbytter blev sammenlignet. Dataene viste, at aorta cannulationsdybden er direkte relevant for AM-udbyttet. Heri introduceres en protokol til at isolere AM'er og VM'er samtidigt.
Protocol
Voksne mandlige C57BL/6 mus vejer 20-30 g, 8-10 uger blev købt fra Animal Centre of Capital Medical University, Beijing, Kina. Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af Animal Care and Use Committee of Capital Medical University og blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr foreslået af Institute of Animal Resources og offentliggjort af National Institutes of Health. Excel og Origin 8.5 blev brugt til dataindsamling og -analyse. Data præsenteres som middel ± SD, til statistisk evaluering, Student's t test blev brugt og P < 0,05 blev anset for statistisk signifikant.
1. Forberedelse af opløsnings- og perfusionsapparater
- Saml et konstant flow Langendorff apparat (kommercielt tilgængelige eller selvfremstillede). Figur 1 giver et simpelt skema.
- Opløsningerne forberedes i henhold til de reagenser, der er angivet i tabel 1 og tabel 2.
- Tænd for det cirkulerende vandbad, og juster en passende indgangstemperatur (42,7 °C i vores laboratorium) for at sikre, at perfusatcirkulationssystemets udstrømning fra kanylen når 37 °C.
- Rengør perfusionssystemet ved at cirkulere deioniseret vand. Hvis en steril tilstand er påkrævet, køre 75% ethanol gennem perfusion system i 15 min, efterfulgt af deioniseret vand (mindst 10 cyklusser for at undgå alkohol toksicitet virkninger på hjertet).
- Mål tid og volumen for en cyklus af perfusatcirkulationssystemet for at bestemme, hvor mange milliliter iltet Tyroders opløsning der skal indlæses i følgende perfusionstrin.
- Steriliser alle kirurgiske værktøjer i den ønskede metode.
- Indstil strømningshastighed for perfusate perfusionssystemet til 4 mL/min.
- Forbered to rene 35 mm Petriskåle- den ene indeholder Tyroders opløsning (Petriskål 1), den anden indeholder opløsning 1 (Petriskål 2).
- Forbered en 1 mL sprøjte fyldt med opløsning 1 og en 20 G stump stålkanyle nål med et hak, hvorfra afstanden er 1 mm til spidsen. Forbered en løs knude med 3-0 sutur til kanyleskaftet. Regulere stereomikroskopets visningsfelt og sørg for, at kanylespidsen er under petriskålens flydende overflade 2.
2. Tilberedning af dyr
- Giv heparin (koncentration, 1.000 IE/mL; 0,2 mL/mus) intraperitonealt til musene for at undgå blodpropper. Efter 10 min. bedøver musene med natriumpentobarbital (50 mg/kg, I.P.-injektion) og sikrer, at musene holder op med at reagere på hale/tå-klemmer. Udfør cervikal dislokation 20 min efter heparin administration.
- Overfør musene på den kirurgiske platform, fastgør musene i en liggende position, steriliser brystet med 75% ethanol og tør det med gasbind eller serviet.
3. Hjerte excision og aorta cannulation
- Løft huden af xiphoid med vævs-sammentrækninger og lav et mindre sideindsnit gennem huden med vævssaks. Udfør en stump dissektion mellem hud og fascia og udvide snittet af huden i en V-form mod aksillen på begge sider.
- Fortsæt det samme snit spor gennem brystkassen, og derefter aflede brystkassen opad ved at spænde brystbenet med vævs-sammenkakter til fuldt ud at udsætte hjerte og lunger.
- Skræl perikardium ved hjælp af en buet sammentak. Riv thymuskirtlen mod begge sider med to buede sammentrulninger, hvis den dækker de store kar. Træk forsigtigt bunden af hjertet mod halen med buede sammentrækninger, indtil et "Y"-formet blodkar (aortaen og dens grenarterier) kan ses.
- For at reservere forskellige længder af aorta til cannulation og sammenligning, transect aorta på venstre fælles halspulsåren (grøn linje i figur 2) og skære brachiocephalic arterie på samme tid i nogle mus. Transect på den stigende aorta i andre mus (sort linje i figur 2).
BEMÆRK: For dem, der er nye i denne procedure, kan dette trin også udføres under et stereoskopisk mikroskop. - Punktafgifter hjertet, og straks nedsænke i Petri fad 1 til at vaske og pumpe ud restblod.
- Overfør hjertet til Petri parabol 2, og trim eventuelle overskydende væv ved hjælp af fine iris saks om nødvendigt. For dem, der er nye til denne procedure, gør dette trin under stereomikroskopet for at undgå fejlagtigt at skære aorta eller andre hjertestrukturer.
- Skub sprøjten for at udvise luftbobler før aorta cannulation. Udfør retrograd aorta cannulation ved hjælp af to lige binde tang (glatte kæber) under stereomikroskop. Sørg for, at hele cannulationsprocessen er under den flydende overflade.
- Undgå at trænge ind i aortaventilerne og juster dybderne til den stigende aorta (musen, som aortaen blev overført til ved venstre fælles halspulsåre) og aortaroden (musen, som aortaen blev overført til henholdsvis den stigende aorta).
BEMÆRK: Dybden af aorta cannulation (benævnt blot som dybde) defineres her som den position, hvor kanylespidsen er i aortaen, eller hvor aortaen er ligated. - Ligate aorta med pre-knude 3-0 sutur til kanylen hak. Tryk forsigtigt på sprøjteindholdet for at skylle det resterende blod.
BEMÆRK: Blodet vil efterlade kranspulsårerne og effuse fra rygårerne Hvis dybden er korrekt placeret. Hjertet og atrie vedhængene vil udvide sig og blive blege. - Fjern og tilslut kanylen til Langendorff-apparatet. Endnu en gang skal du sørge for at undgå, at luftbobler kommer ind i hjertet.
BEMÆRK: Vær opmærksom på, at tiden fra thoracotomy til indledende perfusion ikke må overstige 5 min.
4. Hjerteperfusion
- Først prime og gennemsyre iltet Tyrode opløsning for ca 10 s (mængden af væske kører 10 s i det system, der anvendes i denne protokol er ca 0,7 mL), hvis der er resterende blod i forkamrene, og derefter skifte til løsning 1. Men bare gennemgå med opløsning 1 Hvis der ikke er noget resterende blod i forkamrene. Gennemgå hjertet i ca. 2 min.
- Skift til løsning 3. Sug ca. 2,5 mL opløsning 3 med et engangs sterilt polyethylenpipet og forvarm det i vandbadet til senere brug, mens resten anvendes til perfusion i ca. 11-12 min. Kassér opløsning 3 perfunderet i de første 2 min. Genbrug resten til perfusate reservoirerne ved peristaltisk pumpe til genbrug, indtil fordøjelsen er afsluttet.
- Afslut fordøjelsen, når hjertet bliver hævet og bliver lidt bleg og slap (svampet tekstur) eller et aftryk eksisterer, hvis myokardiet forsigtigt klemmes ved hjælp af en tandtangete.
5. Celleisolation og calciumgentroduktion
- Fjern hjertekamrene og forkamrene med sammentværger, og læg dem i forskellige petriskåle. Tilsæt den forvarmede opløsning 3 til Petri-retterne.
- Triturere vævet i en uklar tekstur med stumpe sammenklatter og forsigtigt pipette vævet for selv fordøjelsen. Undgå at indføre luftbobler.
- Overfør det uklare fordøjede væv med pipetten til opløsning 4 for at standse den resterende enzymaktivitet, og centrifuge i 20 s ved 192×g. Fjern supernatanten og tilsæt opløsning 5 i cellesedimentet og pipetten for at sprede cellerne jævnt.
- Genindføre calcium på en trinvis måde for at undgå calcium paradoks og calcium overbelastning. Tilsættes gradvist i alt 50 μL 100 mM/L CaCl2 (ved hvert 5 min interval på henholdsvis 5 μL, 10 μL, 15 μL og 20 μL) til celleaffjedringen.
6. Cellelagring
- Til patch clamp-undersøgelsen skal cellerne opbevares i Tyroders opløsning. Til andre cellulære undersøgelser skal cellerne opbevares i opløsning 6.
- For at sikre nøjagtigheden af akutte funktionelle undersøgelser ' (f.eks Ca2 + gnister, Ca2 + bølger, Ca2 + frigivelse, Ca2 + lækage, og patch klemme optagelser) resultater, afslutte disse former for funktionelle eksperimenter inden for de næste 6 timer.
Representative Results
Dette papir, hvor kanylespidsen er placeret i aortaen, som defineres som dybden af aorta cannulation (blot kaldet dybde), repræsenterer også, hvor aortaen er ligated. AM og VM isoleret fra et hjerte, der blev cannulated og ligated på den stigende aorta er repræsenteret som AMAA og VMAA, henholdsvis. Desuden er AM og VM isoleret fra et hjerte, der blev cannulated og ligated ved aorta roden er repræsenteret som henholdsvis AMAR og VMAR. Figur 2 viser oversigten over aorta- og transsektionspositionerne. Figur 3 viser også de dybder og ligationssteder, der svarer til aortatranssektionspositionerne. Dybde var forbundet med forkamrene og atrie vedhæng 'perfusion. Begge atrie vedhæng er oppustet, når kanylespidsen er ved den stigende aorta, hvilket indikerer tilstrækkelig atria perfusion. Men når der ved aortaroden, er atria perfusion utilstrækkelig, og begge atrie vedhæng er wizened (Figur 4). CM morfologi og levedygtighed, der er isoleret fra de kanyttede hjerter på forskellige dybder efter calcium genindførelse (Figur 5). Cellemorfologier af AMAA, AMAR, VMAA og VMAR er under det konfokale mikroskop før og efter calcium genindførelse. AMs er spindelformede, mens VM'er er stangformede med rektangulære ender. Desuden har AM'er og VM'er intakte membraner, klare konturer, klare striated sarkomer og glat overflade (figur 6). Celle levedygtighed blev vurderet via trypan blå farvning. Normale celler med intakte membraner kan udelukke trypan blå og vil ikke blive farves, mens celler tab aktivitet vil intracellulært hurtigt akkumulere trypan blå (Figur 7). AMs og VM'er blev placeret i forskellige objektdias for at udføre celleoptælling. De samlede udbytter af AM og procentdelen af levedygtige spindelformede CMs (overlevelsesrate) blev bestemt ved at overføre 10 μL af celleaffjedringen til et objektdias og tælles under et omvendt fasekontrastmikroskop ved 4 × 10 synsfelter. Den samme metode blev anvendt til at bestemme det samlede udbytte af VM'er (stangformede) og procentdelen af levedygtige VM'er. Denne metode foretrækkes frem for at bruge et hæmocytometer, fordi CMs ikke let distribueres i tælleområdet af hæmocytometeret på grund af deres størrelse og form. En søjlegraf (figur 8) viser overlevelsesraten for AMAA, AMAR, VMAA og VMAR før og efter calcium genindførelse. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD fra 10 mus. Før calcium genindførelse, overlevelsesraten for AMAA er betydeligt højere end for AMAR (70,9% ± 2,8% og 41,0% ± 5,2%, henholdsvis; p < 0,01). Efter calciumretroduktion er OVERLEVELSESRATEN for AMAA betydeligt højere end for AMAR (henholdsvis 69,4 % ± 3,0 % og 37,7 % ± henholdsvis 4,9 %; p < 0,01).
VMAA overlevelsesraten adskilte sig ikke fra VMAR's (henholdsvis 89,5 % ± 2,7 % mod 88,1 % ± 2,6 %; p > 0,05) før calcium genindførelse. På samme måde adskilte VMAA-overlevelsesraten sig ikke fra VMAR's (henholdsvis 82,2 % ± 1,9 % mod 82,9 % ± 1,6 %; p > 0,05) efter calcium genindførelse.
Et hjerte kannuleret i dybden som denne protokol anbefalede (ved den stigende aorta), en levedygtig VM og AM'er udbytte på ca 4,1 millioner og ca. 180.000, henholdsvis efter calcium genindførelse. Hele celle patch clamp registrering af natriumstrømmen (figur 9A, B) og nuværende tætheder (figur 9C) i den isolerede AM og VM bekræfter, at cellekvaliteten har opfyldt kravene til elektrofysiologiske eksperimenter. Anatomien af aorta (figur 10) viser, at ostium af atriebeholderen er nær aorta roden og støder op til ostium af kranspulsåren (CA). Tabel 3 viser afstanden fra kanylespidsen til CA-ostium af hjerter, der kanykuleres og ligated ved henholdsvis den opstigende aorta og aortaroden.
Figur 1. Skemadiagram over et samlet ændret Langendorff-system. Dette system er økonomisk og bærbart for brugerne. Den har to dele af plastrør-en til vandet (indre diameter, 8 mm) og en til perfusat (indre diameter, 1,5 mm)-hvoraf den distale ende er forbundet til en PE medicinsk tre-vejs stophane med en Luer lås. En glasflaske indeholdende vand og med en gummiprop form som varmeveksler. Perfusate pumpes ind i plastikslangen i varmeveksleren af den peristaltiske pumpe og kommer ud fra den trevejs stophane, der er forbundet med kanylen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Aorta og væv rundt. En "Y"-formet blodkar struktur er aorta og dens grene: brachiocephalic arterie (pil 1) og venstre fælles halspulsåren (pil 2). Transect aorta mellem venstre fælles halspulsåren (grøn linje) og samtidig skære brachiocephalic arterie i nogle mus; ved den stigende aorta (sort linje) hos andre mus (stereomikroskop 10 × 2 forstørrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Frontalt syn på det kantede hjerte. Den sorte buede linje repræsenterer den skarpe kant af aorta, der blev transected mellem venstre fælles halspulsåren. Den røde buede linje repræsenterer aortaens skarpe kant, der transected ved den stigende aorta. Den lige linje repræsenterer, hvor aorta blev ligated: sort på den stigende aorta og rød ved aorta rod (stereomikroskop 10 × 2 forstørrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Perfusion tilstand af de kantede hjerter. Forkamrene er tilstrækkeligt perfused, og begge atrie vedhæng er oppustet i hjertet (A) cannulated og ligated på den stigende aorta. Men begge atrie vedhæng er wizened i hjertet (B) cannulated og ligated ved aorta roden, hvilket indikerer dårlig atria perfusion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Cellemorfologi og levedygtighed evaluering efter calcium genindførelse. AMs (A) og VM'er (B) isoleret fra hjertet kannuleret og ligated på ascending aorta er repræsenteret som AMAAs og VMAAs, henholdsvis. AMs (C) og VM'er (D) isoleret fra hjertet cannulated og ligated ved aorta rod er repræsenteret som AMARs og VMARs, henholdsvis. Høj kvalitet CMs er quiescent og har intakte membraner, klare konturer, klare striated sarkomer, og en glat celle overflade. AMs er spindelformede, mens VM'er er stang eller murstensformede med rektangulære ender. CMs, der spontant kontrakt eller indeholder blebs i membranen er af dårlig kvalitet, og dem, der krymper ind i en sfærisk form er døde celler. Et tilfældigt synsfelt (fluorescensmikroskop, 10 × 10 forstørrelse; skalastænger, 100 μm). AM = atrie myocyte, VM = ventrikulær myocyte. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Cellemorfologi under et konfokalt mikroskop før og efter calcium genindførelse. Før calcium genindførelse, AMAA (A) og AMAR (C) er spindel-formet med klare konturer, striated sarkomer, og glatte membran overflader. Efter calcium genindførelse, AMAA (B) og AMAR (D) er også spindel-formet med klare konturer, striated sarkomer, og glatte membran overflader. Før calcium genindførelse, VMAA (E) og VMAR (G) er stang- eller mursten-formet med klare konturer, striate sarkomer, og glatte membran overflader med rektangulære ender. Efter calciumretroduktion er VMAA (F) og VMAR (H) også stang- eller murstensformede med klare konturer, strierede sarkomer og glatte membranoverflader med rektangulære ender (konfokal mikroskopolie, 63 × 10 forstørrelse; skalastænger, 50 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Vurdering af celle levedygtighed. Beskadigede celler, der mister aktivitet, farves af trypanblå. I modsætning hertil kan levedygtige celler ikke farves af trypan blå (fluorescens mikroskop, 4 × 10 forstørrelse; skala barer, 100 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Søjlegraf, der viser overlevelsesraten for AMAA, AMAR, VMAA og VMAR før og efter calciumgentroduktion. CR = calciumgentroduktion. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD fra 10 mus. p < 0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Opløsning | Indhold (endelig koncentration i mmol/L, hvis ikke angivet forskelligt) | Bemærkede |
| Perfusionsopløsning (løsning 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurin, 5 Glukose, 10 2,3-butanedion monoxime(BDM) | Som kan opbevares i 3 dage ved 4 °C. Glukose, taurin og BDM tilsættes på dagen for eksperimentet. Forbered 200 mL perfusionsopløsning til hvert hjerte. |
| Tyroders løsning (løsning 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glukose | Som kan opbevares i 3 dage ved 4 °C. CaCl2 og Glukose tilsættes på forsøgsdagen, justerer pH til 7,3-7,4 med mættet NaOH ved stuetemperatur (28-30 °C) med en PH-måler. |
Tabel 1. Løsninger til voksen mus CM isolation.
| Opløsning | Indhold | Bemærkede |
| Fordøjelsesopløsning(opløsning 3) | 25 mL opløsning 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25 mg kollagenASE II, 50μL (2,5 % 10×) trypsin | for hvert hjerte |
| Stopløsning 1(løsning 4) | 9 mL opløsning 1, 1 mL FBS (Fosterkvægserum), 4μL 100 mM/L CaCl2 | for hvert hjerte |
| Stop løsning 2(løsning 5) | 9,5 mL opløsning 1, 0,5 mL FBS (Fosterkvægserum), 4μL 100 mM/L CaCl2 | for hvert hjerte |
| Cell resuspension solution(løsning 6) | 13 mL opløsning 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) ved en dosis, der kan danne et tyndt lag, der dækker væskens overflade | for hvert hjerte |
Tabel 2. Løsninger til voksen mus CM isolation og opbevaring.
Figur 9. Natriumkanalernes strømspændingskurver. Helcellet plaster klemme teknikker blev brugt til at registrere natrium strømme af de isolerede kardiomyocytter i spænding klemme mode. Spændingsklemmerprotokollen vises i starten. Natriumstrømme, der er registreret fra AM (A) og VM (B), vises. De nuværende tætheder ved potentialer på −45mV, −40mV og −35 mV er betydeligt højere i AM (−32,71 ± 1,597 pA/pF, −31,49 ± 1.820 pA/pF og −29,34 ± 1,939 pA/pF, henholdsvis n = 10) end i VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, -21,09 ± 1,560 pA/pF og -21,86 ± 1,381 pA/pF; n = 8; P < 0,05). (C) I-V kurverne viser natriumstrømstætheder, der blev normaliseret til celle kapacitans. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. Atriefartøjets oprindelse og fordeling. Atriebeholderen (pil 1) og CA (pil 2) i panel A. Panel B er et nærmere kig på atriebeholderen (pil 3). C) Der findes to ostia af forskellig størrelse; den ene (pil 4) svarer til det atriebeholder, der vandede atrievedhængene, og det andet (pil 5) svarer til CA (stereomikroskop 10 × 5 forstørrelse). CA = kranspulsåre. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Musenes serienummer | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| Dybden af aorta cannulation er på den stigende aorta | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| Dybden af aorta cannulation er ved aortaroden | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
Tabel 3. Afstand fra kanylespidsen til kranspulsåren ostium. Hjerterne på C57BL/6 mus (n = 20) blev brugt til at kanlere og ligate aortaen på dybder af henholdsvis den stigende aorta og aortaroden. Aortaen er anatomisk, og afstanden fra kanylespidsen til CA ostium blev målt. Afstanden måles i millimeter, og positive eller negative tegn repræsenterer kanylespidsen henholdsvis over og under CA ostium.
Discussion
Single CM er et værdifuldt og uundværligt værktøj i cellulære niveau undersøgelser af hjertefunktion og sygdomme20. Derfor er isolationen af levedygtige DM'er fra hjerterne det første og mest afgørende skridt. Cellekvalitet er en af de væsentlige determinanter for at udføre vellykkede eksperimenter, især i optiske og elektrofysiologiske eksperimenter. Sammenlignet med CMs af andre dyr, gnaver DM'er er mere sårbare over for iskæmi og hypoxi på grund af en højere koncentration af intracellulære natriumioner, som favoriserer calcium tilstrømning gennem Na +/Ca2 + veksler21. Desuden er antallet af AMs langt mindre end antallet af VM'er; det er således yderst vanskeligt at opnå en vellykket isolation. Langendorff-metoden er fremragende til isolering af mus-VM'er22, men succesraten i isoleringen af AM'er er lav, og få rapporter er tilgængelige. Den korrekte dybde af aorta cannulation er også en væsentlig faktor i at give ideelle VM'er bortset fra temperatur, enzymaktivitet, PH og vandkvalitet, der anvendes til bufferforberedelse. Princippet om Langendorff-metoden bygger på retrograd perfusion af hjertet. Ved perfusion lukkes aortaklappen; derved tvinges perfusatet ind i kranspulsårerne og leverer enzymopløsning gennem kargrenene, og myokardievævet fordøjes jævnt. For at opnå denne form for cirkulationsmønster skal aortaen reservere tilstrækkelig længde til cannulation og ligation, også kanylespidsen må ikke trænge ind i aortaventilerne eller blokere CA ostium. Det er således rimeligt at spekulere i, at dybden af aorta cannulation også er forbundet med atria perfusion, hvilket påvirker fordøjelseseffektiviteten af forkamrene og udbyttet af AM på samme måde. Protokollen præsenteret her bekræftede hypotesen, og afgørende skridt til optimering af celleudbyttet sammen med forslagene er noteret nedenfor.
I trin 1.9 anbefales en stump 20 G kanyle med et hak (eller en omkredsspor), hvorfra afstanden er 1 mm til spidsen. Baseret på vores erfaringer blev kanylens størrelse, der er lidt større end aortaens diameter, fundet for at forhindre kanylespidsen i at punktere aortaventilerne under cannulation, fordi aortaen, der bygger på dens iboende elasticitet, kan tæt passe ind i kanylen og producere friktion, der fungerer som en beskyttende faktor, når man bevæger sig frem eller tilbage justerer kannulationsdybden. Med hensyn til hakkets position vil hjertet let glide af under cannulation på grund af tyngdekraften, hvis det er for tæt på kanylespidsen. Omvendt vil pladsen til justering af cannulationsdybden og ligationspositionen være meget begrænset, hvis det er for langt. Under disse omstændigheder er det bedre at omformulere aortaen mellem den venstre fælles halspulsåre (som den grønne linje i figur 2) for at sikre, at aortaen er lang nok og kan befolkes og ligated ved den opstigende aorta, bedre i trin 3.3. Mens transecting på den stigende aorta, den reserverede længde for cannulation i det mindste kunne sikre kanylen spidsen tæt på aorta roden og vil ikke trænge ind i aorta ventiler efter ligation. Anatomien af aorta og måling af afstanden fra kanylen spids til CA ostium indikerer, at transecting aorta mellem venstre fælles halspulsåren er en ideel position til at opnå en ordentlig aorta cannulation dybde.
Cannulation dybde viste sig at være forbundet med forkamrenes perfusion, som igen fungerer som en dybdeindikator. Figur 4 viser, at atria perfusion er god, når dybden er på den stigende aorta, og begge atrie vedhæng er oppustet. Atria perfusion er imidlertid utilstrækkelig, når dybden er ved (eller nærmer sig) aortaroden, og begge atrievedhæng er wizened. Det samlede og levedygtige antal AM, der blev givet fra de oppustede atrievedhæng, var højere (figur 8). Disse resultater tyder på, at aorta cannulation dybde kan påvirke perfusion og fordøjelse af forkamrene og atrie vedhæng på en bestemt måde og endelig påvirke AM udbytte og kvalitet. Udbyttet og kvaliteten af AM blev udledt til at være forbundet med fordelingen af de fartøjer, der leverer forkamrene. Undersøgelsen af Fernández et al.23 har vist forskellige uregelmæssigheder i oprindelsen og forløbet af mus CA. De fandt, at DE'er ostia var meget varierende og ikke alle var placeret i aorta sinus. Nogle CAs kan stamme unormalt ovenfra aorta bihuler, opkaldt den høje start ostium. Nogle CAs kan stamme fra den samme aorta sinus, og ostium af atrium fartøj er lige i nærheden. Anatomien af aorta i denne undersøgelse (figur 10) er også i overensstemmelse med konstateringen af Fernández. Dette kan være årsagen til, at forsøg på at isolere AM ved Langendorff-metoden stort set har været forgæves, hvis cannulationsdybden ikke er passende. Således vil kanylespidsen have en større chance for at blokere atriumfartøjets ostium, der støder op til CA ostium, hvis der ikke er tilstrækkelig plads mellem kanylespidsen og CA ostium. I modsætning hertil blev ventrikelens perfusion og celleudbytte næppe påvirket, så længe aortaventilerne ikke blev gennemtrængt af kanylespidsen. Dette skyldes sandsynligvis, at de CAs, der leverer blod til ventrikel har større ostia og mere oprindelse. Hvis en ostium blev okkluderet af kanylen, kan ventrikelperfusion kompenseres af en anden CA eller sikkerhedsstillelsen, mens blodkarret, der leverer atriummet, er ret lille og har ingen erstatning. Således er dybdens indflydelse i aorta cannulation vigtig.
Andre bemærkelsesværdige faktorer og problemer skyderier i fordøjelsen og celle opbevaring proces er opført som følger. Først skal du overveje at perfusing iltet Tyroders opløsning i trin 4.1 for at gøre muskelkontrakten og pumpe ud resterende blod, hvis blodet i forkamrene ikke er blevet hastet ud efter aorta ligation. Dette kan hjælpe med at undgå den negative virkning af ca2+ og andre materialer, der frigives fra de beskadigede erythrocytter. For det andet kan perfusing ca2 +-fri løsning i forvejen til at adskille forbindelsen og udvide afstanden mellem celler forbedre effekten af enzym fordøjelsen, fordi interkalkede diske mellem DM'er er calcium-afhængige intercellulære vejkryds. Tiden bør dog begrænses til 3-5 min for at undgå calciumparadoksfænomenet24. En blandet enzymopløsning anbefales. Kollagenase type II forstyrrer den ekstracellulære matrix netværk, og trypsin hjælper med at rydde det granulære materiale, der forbliver på celleoverfladen, hvis kollagen ii fordøjelsen er ufuldstændig. Dette sikrer en glat celleoverflade, som er afgørende for at danne en GΩ-forsegling i plasterklemmeoptagelsen. Ikke desto mindre bør trypsinkoncentrationen kontrolleres i det rette interval for at undgå over fordøjelse og celleskade, fordi det kan nedbryde membranproteinet. Ved hjælp af kollagenase type II alene for at forbedre celleudbyttet kan ofte føre til væv over fordøjelsen, og de isolerede DM'er vil være calcium intolerant efter langvarig kollagenase eksponering25. Brugen af 2,3-butanedion monoxime (BDM), et stof, der forhindrer spontan sammentrækning ved at hæmme myosin ATPase og forhindre cross-bridge dannelse, er stadig kontroversielt26,27,28,29. Ifølge tidligere erfaringer er det nødvendigt at tilføje BDM for denne protokol. Enzymopløsning fremstilles med opløsning 1, selvom opløsning 1 ikke indeholder calcium, og calcium tilsættes for at aktivere enzymet. Fordelen ved at tilsætte BDM i perfusionsopløsningen omfatter (1) hæmmende myocytter sammentrækning og reduktion af iltforbruget under enzymopløsningsperfusion og (2) forebyggelse af myocytter fra hypoxi og forbedring af kvaliteten af de isolerede myocytter. Nogle undersøgelser rapporterede, at BDM kan have en potentiel negativ indflydelse på cellulære elektriske egenskaber. Resultaterne af helcelletlappernes fast registrering af natriumstrømmen indikerede imidlertid ikke en uønsket virkning. I celleopbevaringstrinnet (trin 6) har talrige undersøgelser valgt KB-bufferen, en calciumfri, men høj kaliumkoncentrationsopløsning, hvor celler kan opretholde en bedre tilstand, fordi de er i polariserede og lave metaboliske forhold. Imidlertid vil glykokalyksen af cellemembranen adskilles fra lipid-bilayeren i mangel af udefrakommende calcium i en vis periode, og membranens permeabilitet vil stige, hvilket påvirker den efterfølgende funktionelle analyse30,31,32.
Alle myocytter isolation teknikker kan hovedsagelig kategoriseres i øjeblikket i enten luns (et lille stykke væv) fordøjelse i en enzymatisk løsning eller CA perfusion med enzymatisk løsning (Langendorff perfusion)22. Sammenlignet med Langendorff-metoden er chunk-fordøjelsesmetoden lettere at udføre og bruges også rutinemæssigt til isolering af CMs i mange laboratorier. Denne metode giver dog normalt et lavt udbytte af DM'er af dårlig kvalitet fra voksenvæv22. Desuden er celler, der er isoleret ved denne metode, muligvis ikke egnede til at udføre sammenlignende eksperimenter. Når du f.eks. tester de celletypespecifikke lægemiddeleffekter mellem AM og VM, kan virkningen af forskellige isolationsforhold ikke overses eller udelukkes. Dette skyldes, at myokardiet og vævstætheden af ventrikel er meget tykkere og tættere end atriummet, hvilket resulterer i forskellige fordøjelsestider og enzymkoncentrationer. Desuden vil overdreven agitation og pipettering af vævet under fordøjelsen beskadige cellerne og påvirke funktionelle undersøgelser betydeligt. Desuden har mange tidligere undersøgelser vist, at AM'er er mere sårbare over for calcium. Men, AM'er isoleret af den nuværende protokol kan være tolerante over for gradient calcium genindførelse sandsynligvis fordi vævet er let at briste i slutningen af fordøjelsesprocessen. Således er mekanisk skade mindre, mens celler ville lide mere mekaniske skader, da trin i chunk-metoden skal gentagne brud og centrifugal. For nylig rapporterede Ackers et al.33 en forenklet, Langendorff-fri metode til isolering af levedygtige hjertemyocytter og nonmyocytter. VM'erne og fibroblast kan isoleres effektivt, men mængden af AM'erne blev ikke nævnt. Denne protokol har dog flere begrænsninger. For det første kan fordelingen af hjerte blodkarrene have variationer for individuelle forskelle og mus stamme, og den anbefalede cannulation dybde kan ikke garantere en vellykket AMs isolation for hver gang. For det andet kan det tage en vis tid for dem, der er nye i denne procedure, at praktisere aortatransektion og retrograd aorta cannulation. Endelig blev denne metode ikke testet i andre hjertesygdomsmodeller undtagen hos raske og ældre mus. Derfor vil det kræve justeringer i enzym koncentrationer og tidspunktet for fordøjelsen på grund af hjertets fibrose omfang. Ulempen ved forskellige fordøjelsesforhold, der opstår i chunk-metoden, vil ikke være et problem i Langendorff-metoden, hvor enzymopløsningen fordeles jævnt til vævet af karbedene.
Sammenfattende har protokollerne for samtidig isolering af enkelt AM og VM beskrevet her vist, at den korrekte aorta cannulation dybde effektivt kan forbedre atrium perfusion og AM udbytte. De CMs isoleret ved denne metode er af høj kvalitet, besidder god calcium tolerance, og er blevet anvendt med succes til patch klemme optagelse og calcium håndtering (Ca2 + frigivelse og Ca2 + bølge måling af IonOptix system) i team34. Det forventes, at isolationsprotokollen kan bruges til celleforberedelse i en række cellulære og subcellulære undersøgelser, hvilket vil bidrage til at uddybe forståelsen af hjertefysiologi og patologi. Det er vigtigt, at det vil gøre det muligt at opdage mere klinisk relevante hjertesygdomsmekanismer og interventionsmetoder.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (Nr. 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) og Beijing Natural Science Foundation (nr. 7192051). Forfatter bidrag: Bai og Liu designet og udtænkt projektet. Wen og Ruan gav værdifulde råd til eksperimenterne. Wu og Linling Li udførte det eksperimentelle arbejde og spillede nøgleroller inden for dataindsamling, analyse og fortolkning. Li deltog i Langendorff apparatet samles. Peng, Zhang, Wang og Yang deltog i forberedelsen af reagenser og løsninger før eksperimentet. Wu skrev artiklen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
- Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective. Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).
- Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances. Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
- Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte. Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).
- Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte. The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).
- Chou, C. C., et al. Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium. Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).
- Brittsan, A. G., et al. Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport. Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).
- Mohler, P. J., et al. Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).
- Ni, L., et al. Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector. Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).
- Dobrev, D., Wehrens, X. H. T.
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109 (2014).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823 (2014).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms. Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Bers, D. M. Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Hall, A. R., Hausenloy, D. J. Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes. Physiological Reports. 4 (1), 12606 (2016).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. 2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jiang, L., et al. Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium. Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).
