Summary
Descriviamo qui il metodo per l'imaging di megacariociti e proplatelet nel midollo dell'osso del cranio di topi viventi usando la microscopia a due fotoni.
Abstract
Le piastrine sono prodotte da megacariociti, cellule specializzate situate nel midollo osseo. La possibilità di immagine dei megacariociti in tempo reale e del loro ambiente nativo è stata descritta più di 10 anni fa e getta nuova luce sul processo di formazione delle piastrine. I megacariociti estendono protrusioni allungate, chiamate proplatelet, attraverso il rivestimento endoteliale dei vasi sinusoidi. Questo documento presenta un protocollo per l'immagine simultanea in tempo reale di megacariociti marcati fluorescenti nel midollo osseo del cranio e nei vasi sinusoidi. Questa tecnica si basa su un intervento chirurgico minore che mantiene intatto il cranio per limitare le reazioni infiammatorie. La testa del topo è immobilizzata con un anello incollato al cranio per impedire ai movimenti di respirare.
Utilizzando la microscopia a due fotoni, i megacariociti possono essere visualizzati per un massimo di poche ore, consentendo l'osservazione di protrusioni cellulari e proplatelet nel processo di allungamento all'interno di vasi sinusoidi. Ciò consente la quantificazione di diversi parametri relativi alla morfologia delle sporgenze (larghezza, lunghezza, presenza di aree di costrizione) e al loro comportamento di allungamento (velocità, regolarità o presenza di pause o fasi di retrazione). Questa tecnica consente anche la registrazione simultanea delle piastrine circolanti nei vasi sinusoidi per determinare la velocità piastrinica e la direzione del flusso sanguigno. Questo metodo è particolarmente utile per studiare il ruolo dei geni di interesse nella formazione piastrinica utilizzando topi geneticamente modificati ed è anche suscettibile di test farmacologici (studiare i meccanismi, valutare i farmaci nel trattamento dei disturbi della produzione piastrinica). È diventato uno strumento inestimabile, soprattutto per integrare gli studi in vitro poiché è ormai noto che la formazione di proplatelet in vivo e in vitro si basa su meccanismi diversi. È stato dimostrato, ad esempio, che i microtubuli in vitro sono necessari per l'allungamento del proplatelet di per sé. Tuttavia, in vivo, servono piuttosto come un'impalcatura, l'allungamento è principalmente promosso dalle forze del flusso sanguigno.
Introduction
Le piastrine sono prodotte da cellule specializzate in megacariociti situate nel midollo osseo. Il modo preciso in cui i megacariociti rilasciano piastrine nella circolazione è rimasto a lungo poco chiaro a causa della sfida tecnica nell'osservare eventi in tempo reale attraverso l'osso. La microscopia a due fotoni ha contribuito a superare questa sfida e ha portato a importanti progressi nella comprensione del processo di formazione delle piastrine. Le prime osservazioni in vivo di megacariociti sono state fatte da von Andrian e colleghi nel 2007, con la visualizzazione di megacariociti fluorescenti attraverso il cranio1. Ciò è stato possibile perché lo strato osseo nel cranio frontoparietale di topi giovani adulti ha uno spessore di poche decine di micron ed è sufficientemente trasparente da consentire la visualizzazione di cellule fluorescenti nel midollo osseo sottostante2.
Gli studi successivi hanno applicato questa procedura per valutare la formazione di proplatelet in varie condizioni e per decifrare i meccanismi sottostanti3,4,5,6. Questi studi hanno fornito la prova definitiva che i megacariociti estendono dinamicamente le protrusioni, chiamate proplatelet, attraverso la barriera endoteliale dei vasi sinusoidi (Figura 1). Questi propulati vengono poi rilasciati come lunghi frammenti che rappresentano diverse centinaia di piastrine in volume. Le piastrine si formeranno dopo il rimodellamento delle proplatelet nella microcircolazione degli organi a valle, in particolare nei polmoni7. Ad oggi, tuttavia, il processo preciso e i meccanismi molecolari rimangono oggetto di dibattito. Ad esempio, il ruolo proposto delle proteine citoscheletriche nell'allungamento delle proplatelet differisce tra le condizioni in vitro e in vivo 3e le differenze nella formazione dei proplatelet sono state dimostrate in condizioni infiammatorie6. A complicare ulteriormente le cose, un recente studio ha contestato il concetto guidato dai proplatelet e ha proposto che in vivo,le piastrine si formino essenzialmente attraverso un meccanismo di gemmazione della membrana a livello di megacariociti8.
Questo documento presenta un protocollo per l'osservazione di megacariociti e proplatelet nel midollo osseo dall'osso del cranio in topi viventi, utilizzando una procedura minimamente invasiva. Approcci simili sono stati precedentemente descritti per visualizzare altre cellule del midollo, in particolare cellule staminali ematopoietiche e progenitrici9. L'attenzione qui è sull'osservazione di megacariociti e piastrine per dettagliare alcuni parametri che possono essere misurati, in particolare le morfologie delle proplatelet e la velocità piastrinica. Questo protocollo presenta come inserire un catetere nella vena giugulare per iniettare traccianti fluorescenti e farmaci e osservare attraverso l'osso del cranio. L'osso calvarioriale viene esposto con un intervento chirurgico minore in modo che un anello sia incollato all'osso. Questo anello serve a immobilizzare la testa e prevenire i movimenti dovuti alla respirazione e formare una tazza piena di soluzione salina come mezzo di immersione della lente. Questa tecnica ben si presta a i) osservare in tempo reale la geometria sinusoide e i megacariociti che interagiscono con la parete del vaso; ii) seguire i megacariociti nel processo di formazione, allungamento e rilascio delle proplatelet; e iii) misurare i movimenti piastrinici per monitorare il flusso sanguigno sinusoide complesso. I dati ottenuti utilizzando questo protocollo sono stati recentemente pubblicati3.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS sull'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility agreement N°: G67-482-10, project agreement N°: 2018061211274514).
1. Preparazione dei topi e inserimento di un catetere nella vena giugulare
NOTA: Qui sono stati utilizzati topi reporter mTmG maschi o femmine, di 5-7 settimane (B6.129 (Cg)-Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP) Luo10) incrociati con topi Pf4-cre11, consentendo un'intensa etichettatura di fluorescenza verde nei megacariociti e nelle piastrine12. Prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare la camera di riscaldamento del microscopio per alcune ore.
- Trasportare il mouse nella sala immagini e procedere all'anestesia.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di ketamina (ketamina (100 μg/g) e xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
NOTA: La somministrazione ripetuta di ketamina / xilazina viene utilizzata qui e funziona bene, ma richiede l'interruzione della registrazione per la reiniezione regolare. In alternativa, se è disponibile una macchina per anestesia, l'induzione dell'anestesia può essere eseguita con ketamina/xilazina e successivamente mantenuta sotto inalazione di gas (miscela di isoflurano, aria e ossigeno). - Sostituisci l'animale nella sua gabbia fino a raggiungere l'anestesia profonda. Posizionare il mouse su una piastra riscaldata riscaldata a 37 °C per tutte le successive manipolazioni.
NOTA: Mentre l'animale raggiunge l'anestesia profonda, accendere il microscopio e tutte le apparecchiature (vedere paragrafo 4.1) e impostare i diversi parametri necessari (vedere paragrafo 4.2) per iniziare l'esperimento una volta terminato l'intervento chirurgico. Qui, la procedura dura solo 3 ore ed è terminale. Il topo viene eutanasizzato dopo l'esperimento senza svegliarsi. Quindi, la disinfezione con etanolo per la pelle e gli strumenti è sufficiente. Tuttavia, a seconda delle linee guida istituzionali, o se la procedura durerebbe più a lungo, dovrebbero essere utilizzati metodi di disinfezione più completi come tre scrub alternati con betadina / povidone e alcol.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di ketamina (ketamina (100 μg/g) e xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
- Installare un catetere nella vena giugulare.
NOTA: È importante evitare il più possibile la contaminazione microbica durante l'intervento chirurgico. Fare attenzione a disinfettare accuratamente la pelle con il 70% di etanolo (EtOH) prima di procedere con l'intervento chirurgico. Utilizzare sempre forbici e pinzette sterilizzate e risciacquarle regolarmente nel 70% di EtOH. Lavora in un luogo pulito e indossa una maschera. Un catetere "over-the needle" da 22 G, costituito da un ago all'interno di un tubo di plastica, viene utilizzato per l'iniezione endovenosa (vedere la Tabella dei materiali).- Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le gambe anteriori con del nastro chirurgico per allungare la gola (Figura 2A). Disinfettare la gola con il 70% di etanolo.
NOTA: Per comodità, la gola può essere rasata prima dell'intervento chirurgico. Se la procedura dura più a lungo, è necessario eseguire un'attenta rasatura per una corretta tecnica asettica. - Fai un'incisione di 0,7-1 cm sulla vena giugulare destra o sinistra usando forbici sterili. Allungare il tessuto connettivo adiacente per esporre la vena giugulare esterna e la parte superiore del muscolo pettorale (Figura 2A).
- Riempire il catetere con soluzione fisiologica calda e sterile. Inserire il catetere nella vena dopo essere penetrato attraverso il muscolo pettorale (Figura 2B).
NOTA: Fare attenzione ad evitare bolle d'aria all'interno del catetere. È importante inserire il catetere attraverso il muscolo per prevenire l'emorragia poiché il muscolo formerà un punto di compressione. Anche i topi con difetti di emostasi, come i topi Itgb3-/-, non sanguinano dopo l'inserimento del catetere con questo approccio. - Rimuovere delicatamente l'ago e, se necessario, spostare con attenzione il catetere più in profondità nella vena. Collegare la siringa e stabilizzare il catetere aggiungendo una goccia di colla chirurgica (Tabella dei materiali).
NOTA: È possibile inserire un catetere all'interno della vena della coda, anche se richiede un po 'di pratica perché la vena ha un calibro più piccolo. Questo è particolarmente difficile quando si usano topi con i capelli scuri, la cui vena della coda è appena visibile. Grazie al suo calibro più grande, il posizionamento del catetere all'interno della vena giugulare può consentire di iniettare volumi maggiori o trattamenti ripetuti in modo più affidabile. Si prega di notare che la siringa viene riempita la prima volta con soluzione salina calda e non dimenticare di iniettare il volume morto prima di iniettare la soluzione farmacologica. - Riportare con attenzione il mouse in posizione prona (Figura 2C). Applicare gel (Tabella dei materiali) sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le gambe anteriori con del nastro chirurgico per allungare la gola (Figura 2A). Disinfettare la gola con il 70% di etanolo.
2. Chirurgia e installazione dell'anello cranico
NOTA: Il supporto completo per l'installazione del mouse comprende 4 pezzi, un blocco e una piastra, l'anello per tenere la testa del mouse e una vite per fissare l'anello al blocco (Figura 3A). Tutti gli elementi del supporto sono stati ottenuti da i.materialise.com mediante stampa 3D. La piastra è realizzata in polimero acrilonitrile butadiene stirene (ABS), il blocco e la vite di acciaio inossidabile e l'anello di acciaio inossidabile di alta qualità (acciaio inossidabile ad alta dettaglio) (vedere la figura supplementare S1 per dimensioni e materiali supplementari per i file di stampa 3D). Il blocco è fissato in modo permanente al supporto, avvitato o incollato. Una volta che l'anello è fissato sul cranio del mouse, deve essere avvitato al supporto del blocco (Figura 3A).
- Inumidire i capelli sul cuoio capelluto con un tovagliolo di carta bagnato con etanolo al 70% per la disinfezione. Rimuovere tutti i capelli sciolti con un tovagliolo di carta bagnato.
NOTA: Per comodità, il cuoio capelluto può essere rasato prima dell'intervento chirurgico. - Incidere il cuoio capelluto formando una T sulla linea mediana fino a 1 cm e tra le orecchie per esporre il calvario usando forbici e pinzette sterili.
NOTA: L'anello sarà posizionato per sovrapporsi alle ossa frontali e parietali (Figura 3B). - Utilizzare pinzette sterili per esporre il cranio. Rimuovere con attenzione il periosteo con forbici e pinzette. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione salina fisiologica per rimuovere tutto il periosteo e qualsiasi detrito o capello, che potrebbe alterare l'imaging.
NOTA: Per limitare le reazioni infiammatorie, fare molta attenzione a non danneggiare l'osso. - Rimuovere eventuali tracce di sangue risciacquando con soluzione salina e asciugare rapidamente l'osso con un batuffolo di cotone asciutto. Applicare il gel di colla sull'anello, posizionarlo sull'osso esposto e mantenerlo per alcuni secondi in modo che l'anello sia saldamente attaccato al cranio.
NOTA: Nessuna colla deve entrare nel campo di osservazione in quanto potrebbe portare ad autofluorescenza indesiderata. - Inumidire leggermente il cranio con un batuffolo di cotone immerso nella fisiologica soluzione salina.
- Preparare la pasta dentale di silicone mescolando accuratamente i componenti blu e gialli 1:1. Applicare la pasta dentale intorno all'anello per sigillare per evitare perdite durante l'imaging. Rimuovere con attenzione qualsiasi pasta dentale o colla che potrebbe essere entrata nell'anello.
- Riempire l'anello con soluzione salina e verificare la perdita.
NOTA: La soluzione salina funge da mezzo di immersione per l'obiettivo del microscopio. Il sanguinamento può essere più critico quando si utilizzano topi con difetti correlati all'emostasi. È essenziale impedire al sangue di entrare nell'anello in quanto potrebbe sfocare ulteriori immagini. - Posizionare il mouse sul supporto e avvitare l'anello sul supporto del blocco (Figura 3C). Metti gli impacchi piegati sotto la testa dell'animale per sollevare la testa e impedire il distacco dell'anello dal cranio.
NOTA: la testa è fissata direttamente in modo da impedire i movimenti dell'immagine dovuti alla respirazione. - Posizionare il supporto e l'assemblaggio del mouse nella camera riscaldata del microscopio (Figura 3D).
NOTA: Fare attenzione a non rimuovere il catetere inserito in qualsiasi momento.
3. Follow-up dei topi anestetizzati fino alla fine dell'esperimento
NOTA: L'anestesia viene reinindotta ogni 35 minuti alternando iniezioni sottocutanee (s.c.) di ketamina (25 μg/g) in un volume di 5 μL/g di peso corporeo e una miscela di ketamina (50 μg/g) e xilazina (5 μg/g) (1,2 μL/g). Poiché non è possibile aprire la camera del microscopio riscaldata durante l'acquisizione, il monitoraggio anestetico viene eseguito prima e dopo la ri-somministrazione dell'anestetico mediante pizzicamento delle dita. Allo stesso modo, il pizzicamento della dita dei punti viene eseguito prima di iniziare ogni nuova registrazione video.
- Se necessario, interrompere l'acquisizione e reindurre l'anestesia mediante iniezione di s.c.
- Facendo attenzione a non muovere la testa del mouse, pizzicare la pelle della schiena tra il pollice e l'indice della mano sinistra. Iniettare per via sottocutanea l'anestetico nella piega della pelle posteriore usando la mano destra (o viceversa per i mancini).
- Verificare la presenza di soluzione salina nell'anello e, se necessario, riempire con soluzione salina fresca. Continua a registrare per i successivi 35 minuti e procedi in modo simile per la durata della registrazione.
- Alla fine dell'esperimento, eutanasizzare il topo per lussazione cervicale prima che si svegli.
NOTA: Il topo viene tenuto anestetizzato per una durata massima di 3 ore, in accordo con il comitato etico e per il benessere degli animali locale.
4. Imaging a due fotone
NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sul microscopio e sulle relative apparecchiature. Le immagini sono state registrate con uno scanner risonante (12 o 8 kHz). La modalità bidirezionale è stata impostata per aumentare la velocità di acquisizione man mano che i pixel vengono registrati in entrambe le direzioni; quindi, qualsiasi discrepanza nella fase deve essere corretta con la "correzione di fase" del pannello di controllo. Infine, è stata impostata una media adattata come compromesso tra velocità di acquisizione e rapporto segnale-rumore.
- Accendere il microscopio a due fotone, incluso il laser e lo scanner risonante (potenza laser in uscita di solito ~ 1,8-2,5 W a seconda del laser).
- Impostare la lunghezza d'onda laser appropriata per i fluorofori scelti. Impostare la lunghezza d'onda appropriata per il recupero delle luci emesse.
NOTA: Qui, una lunghezza d'onda di 913 nm e rilevatori ibridi (500-550 nm e 575-625 nm) sono stati utilizzati per eccitare e rilevare contemporaneamente AlexaFluor-488 e Qtracker-655, rispettivamente. - Utilizzando il catetere intragiugulare, iniettare il tracciante fluorescente per etichettare la vascolarizzazione (Qtracker-655; Tabella dei materiali). Iniettare 50 μL/topo di una soluzione a 0,2 μM, rinnovata una volta ogni ora per un massimo di 150 μL/esperimento.
NOTA: Possono essere utilizzati altri traccianti come il destrano ad alto peso molecolare1. In tal caso, considerare che la viscosità del sangue può essere alterata dal destrano e modificare alcuni parametri emoreologici. - Posizionare lo stadio del microscopio con il supporto e il mouse sotto l'obiettivo del microscopio. Controllare che l'anello sia sempre pieno di soluzione salina e immergere l'obiettivo. Utilizzare l'epifluorescenza per localizzare i vasi del midollo osseo (rosso) e la presenza di megacariociti (verdi) allineati lungo i vasi sinusoidi.
NOTA: L'osso del cranio ha uno spessore inferiore a 100 μm2. Il midollo si trova sotto l'osso ed è facilmente riconoscibile dai megacariociti verdi fluorescenti e dai densi vasi sinusoidi anastomosi rossi etichettati da Qtracker-655. - Acquisizioni lunghe (megacariociti, proplatelet)
- Cerca la regione di interesse. Applicare i parametri di acquisizione delle immagini come menzionato sopra.
- Per le acquisizioni lunghe (ad esempio, la visualizzazione della formazione o dell'allungamento del proplatelet), acquisire immagini z-stack con intervalli ottimizzati (di solito tra 0,85 e 1,34 μm) utilizzando uno scanner risonante a 8 kHz.
NOTA: uno scanner risonante a 12 kHz può aumentare la velocità di acquisizione. - Acquisisci immagini da 384 x 384 pixel per visualizzare l'intero megacariocita e la nave. Utilizzare la media di linea, come desiderato, per un'acquisizione rapida con una buona risoluzione. Determinare l'intervallo di tempo di acquisizione dello stack di immagini, in genere 10 s o 30 s per la visualizzazione del proplatelet.
NOTA: Qui, è stata utilizzata una media di linea di 8 per ottenere un rapporto segnale-rumore più elevato, che ha permesso l'acquisizione di 1 immagine / 10 s con uno scanner risonante a 8 kHz. Assicurati che la media delle linee durante l'acquisizione dal vivo sia consentita.
- Acquisizione breve e rapida (piastrine)
NOTA: per l'acquisizione più breve di eventi rapidi, come la velocità piastrinica, è essenziale massimizzare la velocità di acquisizione dei fotogrammi. La selezione del tipo di acquisizione corretto ottimizzerà la velocità di acquisizione dei fotogrammi (ad es. un tipo di acquisizione spazio-temporale "xyt").- Riduci a icona (ad esempio, 256 x 90 pixel) e regola le dimensioni dell'immagine sulla nave ruotando il campo di imaging, se necessario.
- Utilizzare la massima velocità di scansione disponibile.
- Utilizzare la scansione bidirezionale.
NOTA: per la scansione bidirezionale, assicurarsi che la fase sia ben regolata. - Riduci al minimo la media delle linee per trovare il compromesso ottimale tra definizione dell'immagine e rapidità di acquisizione.
NOTA: per le misurazioni della velocità piastrinica, un'immagine pixelizzata può essere sufficiente se aiuta ad aumentare la rapidità di acquisizione. - Riduci al minimo z-stack per aumentare la rapidità di acquisizione. L'acquisizione di solo 1 z-stack è sufficiente per quantificare la velocità piastrinica. Acquisire per 10-20 s per misurare la velocità piastrinica.
NOTA: è possibile ottenere un massimo di 133 fotogrammi/s utilizzando queste condizioni con uno scanner risonante a 12 kHz. I parametri devono essere adattati alle condizioni. In alcuni vasi, la velocità piastrinica è tuttavia troppo alta per quantificare la velocità piastrinica con queste impostazioni in modo affidabile.
- Misurazione della larghezza e della lunghezza del proplatelet
NOTA: per caricare i file LIF ottenuti sul software Leica con ImageJ, scaricare e installare prima il plug-in LOCI su ImageJ per utilizzare Bio-Formats Importer.- Larghezza del proplatelet
- Apri il filmato con ImageJ. Per eseguire la misurazione della larghezza, utilizzare solo il filmato dei proplatelet senza la nave. Per separare i diversi canali, clicca su Immagine| Colore e selezionare Dividi canali.
- Per un filmato z-stack, crea una proiezione z media per ogni punto temporale facendo clic su Immagine| Impila e seleziona Progetto Z. Per Tipo di proiezione, immettete Intensità media.
- Trattare l'immagine per rimuovere il rumore. Sottrarre lo sfondo facendo clic su Elabora| Sottrarre lo sfondo e applicare il raggio della sfera di rotolamento: 50,0 pixel. Liscia l'immagine facendo clic su Elabora e Liscia.
- Traccia una linea vicino alla base del proplatelet (vicino al megacariocita, evitando qualsiasi altro oggetto).
NOTA: Non dimenticare di impostare la scala dell'immagine per ottenere il valore nell'unità desiderata facendo clic su Analizza e Imposta scala. Per impostazione predefinita, l'unità dell'immagine è in pixel. - Tracciate il profilo di intensità, inserite una curva gaussiana e calcolate l'intera larghezza a metà massimo (FWHM). Per questo, scrivi il seguente script in una macro facendo clic su Plugin| Nuovo e selezionare Macro ed eseguirlo facendo clic su Macro| Esegui macro: y = getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussian",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; stampa (FWHM).
NOTA: assicurarsi che nella scansione della linea sia presente un solo picco, corrispondente all'intensità del proplatelet. - Eseguire le azioni descritte nel passaggio 4.7.5 su 1 fetta o ripetute nel tempo per ottenere la larghezza media del proplatelet
- Lunghezza del proplatelet
- Traccia una linea lungo la proplatelet, dalla base vicino al megacariocita verso l'alto. Utilizzate una linea segmentata per seguire la forma del proplatelet. Ripetilo per ogni punto temporale.
- Ricordati di salvare ogni riga utilizzando il ROI Manager: clicca su Analizza | Strumenti e selezionare ROI Manager. Fare clic su Aggiungi nella finestra ROI Manager per aggiungere ogni riga al manager così come è selezionato. Per salvare tutte le righe in una cartella, fare clic in ROI Manager su Deseleziona | Altro e clicca su Salva. Dal ROI Manager, estrarre il valore di lunghezza di ogni riga (Misura) dalla tabella dei risultati.
NOTA: Non dimenticare di impostare la scala dell'immagine per ottenere il valore nelle unità desiderate cliccando su Analizza e Imposta scala. Per impostazione predefinita, l'unità dell'immagine è in pixel.
- Larghezza del proplatelet
- Misurazione della velocità piastrinica
NOTA: La velocità piastrinica è calcolata dalla registrazione video di piastrine fluorescenti che scorrono all'interno del recipiente oltre 10-20 s. Viene eseguito un trattamento di prima immagine per ottenere dati di scansione della linea ciclicamente ripetuti. Il movimento porta a striature il cui angolo dipende dalla velocità, consentendo il suo calcolo. Qui, la velocità è stata calcolata con un metodo che utilizza la trasformata di Radon, che è più robusta del classico metodo di decomposizione del valore singolare (SVD)15.- Trattamento delle immagini con ImageJ
- Apri il filmato con ImageJ. Applicare un filtro Sfocatura gaussiana facendo clic su Elabora | Filtri, selezionare Sfocatura gaussianae applicare Sigma (Raggio): 2.00. Scegli una piccola regione per misurare il flusso e traccia 3 linee adiacenti seguendo la direzione del flusso.
NOTA: Non dimenticare di salvare ogni riga utilizzando il ROI Manager facendo clic su Analizza | Strumenti | ROI Manager. Clicca su Aggiungi nella finestra ROI Manager per aggiungere ogni riga e salvarle; clicca prima su Deseleziona | Altro e quindi fare clic su Salva. - Utilizzando il software di scansione della linea ImageJ, crea un kymograph per ogni linea facendo clic su Image | Pile; selezionare Reslice e applicare i seguenti parametri: Spaziatura di uscita (micron): 1.000 / Conteggio sezioni: 1 / Evitare l'interpolazione. Salvare le immagini spazio-temporali risultanti.
NOTA: L'immagine risultante mostra strisce corrispondenti al movimento lineare delle piastrine nel flusso sanguigno nel tempo. L'angolo di una striscia è una funzione della velocità.
- Apri il filmato con ImageJ. Applicare un filtro Sfocatura gaussiana facendo clic su Elabora | Filtri, selezionare Sfocatura gaussianae applicare Sigma (Raggio): 2.00. Scegli una piccola regione per misurare il flusso e traccia 3 linee adiacenti seguendo la direzione del flusso.
- Misurazione della velocità con il software Matlab o GNU Octave
NOTA: La velocità delle piastrine nel flusso sanguigno è stimata dalle immagini spazio-temporali utilizzando un metodo di analisi computazionale basato sulla trasformata di Radon descritta da Drew e collaboratori15. La descrizione di questo metodo matematico esula dallo scopo di questa recensione, e il lettore è rimandato alla pubblicazione di Drew et al. per i dettagli riguardanti ilcalcolo 15. Sia il codice Matlab che ulteriori informazioni sono disponibili sul loro sito Web https://www.drew-lab.org/code.- Apri il codice usando il software Matlab o GNU Octave.
NOTA: il codice potrebbe richiedere un adattamento in base allo studio desiderato. - Estrarre il valore dalle 3 immagini spazio-temporali, corrispondenti alle linee adiacenti disegnate nella stessa porzione di vaso. Calcolare il valore medio della velocità del flusso piastrinico per questa porzione della nave.
NOTA: non dimenticare di convertire il risultato nell'unità di misura corretta (ad esempio, μm/s).
- Apri il codice usando il software Matlab o GNU Octave.
- Trattamento delle immagini con ImageJ
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Representative Results
Utilizzando questo protocollo, il tracciante fluorescente, Qtracker-655, è stato somministrato per via endovenosa per l'immagine dei vasi sinusoidi del midollo anastomoso nel midollo osseo del cranio e la direzione del flusso come raffigurato dalle frecce(Figura 4A,a sinistra). Utilizzando mouse mTmG, le piastrine fluorescenti eGFP sono state registrate oltre 20 s in ogni ramo del vaso e la loro velocità è stata misurata utilizzando il software ImageJ e GNU Octave(Figura 4A,a destra). Si noti l'eterogeneità nella velocità e nella direzione del flusso. I vasi sinusoidi presentano flussi complessi dovuti alle anastomosi, con presenza di flusso-riflusso e persino stasi, come mostrato nella biforcazione registrata nel Video 1. La stessa biforcazione è mostrata nella Figura 4B (a sinistra), con le frecce rosse e blu che evidenziano i flussi opposti. La velocità piastrinica in questa biforcazione è stata misurata e riportata nel grafico(Figura 4B,a destra). Il tracciato rosso corrisponde alla velocità nel ramo sinistro della nave e il tracciamento blu a quello nel ramo della nave destra. Questo mostra irregolarità nel tempo in ogni ramo della nave, con fasi di accelerazione, stasi e decelerazione. È importante notare che in alcuni vasi, il flusso sanguigno era troppo rapido per un'analisi affidabile nelle attuali condizioni di acquisizione.
La registrazione dell'allungamento dei proplatelet permette la visualizzazione delle loro varie morfologie nel tempo (Figura 5). Alcuni proplatelet si allungano con morfologie irregolari (Figura 5Ai e Video 2). Altri, di solito quelli più sottili, possono estendersi su lunghe distanze che richiedono il movimento della finestra di acquisizione per seguire la loro estensione (Figura 5Aii e Video supplementare 1). Altri sono più corti e spessi e di solito si allungano lentamente (Figura 5Aiii e Video supplementare 2). Quando i megacariociti estendono i proplatelet in aree di flussi complessi, come la biforcazione mostrata nella Figura 4B,i proplatelet vengono lanciati da un ramo del vaso all'altro secondo la direzione del flusso (Figura 5B e Video 3). L'importanza delle forze emodinamiche per l'allungamento del proplatelet nella direzione del flusso è stata evidenziata quando il topo ha subito inaspettatamente un arresto cardiaco. L'arresto del flusso sanguigno ha rilassato i proplatelet estesi dal megacariocita (Figura 5C e Video 4).
Quando la qualità/risoluzione dell'acquisizione è appropriata, è possibile misurare parametri morfologici, come la lunghezza delle propilastri fino al distacco, la loro larghezza alla base del proplatelet o qualsiasi altra posizione definita, o la dimensione delle gemme (Figura 6A). È stata calcolata una lunghezza massima media del proplatelet di ~185 μm (range 41,5-518,5 μm) e una larghezza media del proplatelet di 5,2 μm (range 2,8-8 μm) (Figura 6A). Tracciare la lunghezza del proplatelet in funzione del tempo consente la visualizzazione del comportamento dei proplatelet durante le fasi di allungamento, stasi o persino retrazione (Figura 6B). La misurazione della velocità di allungamento del proplatelet è un parametro importante, che riflette direttamente l'allungamento, la stasi o il comportamento di retrazione delle propilature3.
La velocità di allungamento del proplatelet può essere misurata se il proplatelet rimane attaccato alla sua cellula madre; una volta staccato, verrà immediatamente portato via dal flusso e scomparirà dalla finestra di visualizzazione. Nei topi wild-type (WT), la velocità media di allungamento del proplatelet era di ~10 μm/min (Figura 6C), in accordo con le precedenti pubblicazioni1. Infine, è possibile iniettare farmaci attraverso il catetere inserito nella vena giugulare. Ad esempio, è stato osservato che la somministrazione endovenosa di vincristina, un farmaco che depolimerizza i microtubuli, ha portato alla retrazione delle protubelle dai topi WT ma non ha avuto alcun effetto sui proplatelet dei topi carenti di miosina IIA (Myh9-/-) (Video 5 e Video 6)3.
Figura 1: Rappresentazione schematica della formazione di proplatelet nel midollo osseo. Dopo la differenziazione dalle cellule staminali ematopoietiche, i grandi megacariociti si allineano lungo i vasi sinusoidi ed estendono le proiezioni citoplasmatiche, chiamate proplatelet, attraverso la barriera endoteliale. I proplatelet si allungano e si staccano sotto l'influenza delle forze emodinamiche per rimodellarsi ulteriormente in piastrine nella microcircolazione a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Inserimento del catetere. (A) Viene praticata un'incisione per esporre la vena giugulare e la parte superiore del muscolo pettorale. (B) Il catetere riempito con soluzione salina viene inserito nella vena giugulare passando attraverso il muscolo, creando un punto di compressione. (C) Il mouse viene accuratamente ruotato in modo che si trovi sulla superficie ventrale verso il basso con il catetere ben posizionato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Configurazione sperimentale utilizzata per l'imaging a due fotoni attraverso l'osso del cranio. (A) Il blocco di acciaio inossidabile stampato in 3D è fissato sul supporto del polimero ABS (vedere Figura supplementare S1 e Materiali supplementari per i progetti 3D). Il blocco e l'anello del cranio sono progettati in modo che l'anello possa essere avvitato al blocco. Si noti che, per facilità d'uso, la testa della vite è stata incorporata in Epon. (B) Schema che mostra il posizionamento dell'anello sull'osso cranico esposto. (C) Fotografie che illustrano il topo con l'anello incollato al cranio, la testa su un tampone di tessuto e (D) il posizionamento sotto l'obiettivo del microscopio. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; ABS = acrilonitrile butadiene stirene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misura della velocità piastrinica nei vasi sinusoidi anastomosi del midollo osseo del cranio. (A) Imaging a due fotoni sinistro di vasi sinusoidi etichettati mediante iniezione di Q-Dot. z-proiezione che mostra l'anastomosi dei vasi sinusoidi nel midollo osseo del cranio. Le frecce indicano la direzione del flusso, illustrando la complessità dei flussi nelle sinusoidi. Giusto, velocità media del flusso stimata dalla misurazione della velocità piastrinica in ciascun ramo del vaso. I numeri sull'asse x corrispondono ai numeri freccia nell'immagine a sinistra. (B) A sinistra, biforcazione sinusoidale delineata da linee tratteggiate, che mostra piastrine che scorrono in direzioni opposte (frecce rosse e blu) (corrispondenti al Video 1). Immagine a piano singolo a due fotone. A destra, un grafico che mostra la velocità del flusso in ogni porzione del vaso in funzione del tempo (linea rossa, lato sinistro; linea blu, lato destro), che mostra le fasi di stasi, accelerazione e decelerazione. Barre di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Varie morfologie di proplatelet osservate nel midollo cranico mediante microscopia a due fotoni. (A)Tre proplatelet rappresentativi in vivo: immagini z-projection da esperimenti time-lapse (mostrati nel Video 2,Video supplementare 1e Video supplementare 2)che mostrano le varie morfologie delle proplatelet (frecce) che si estendono all'interno delle sinusoidi del midollo osseo. Proplatelet e megacariociti sono in verde; i vasi sinusoidi sono in rosso. (B) Immagini time-lapse di un proplatelet nella stessa biforcazione della Figura 4B, oscillante secondo la direzione del flusso (mostrato anche nel Video 3). (C) immagini time-lapse a proiezione z che mostrano il rilassamento di 3 proplatelet dopo la cessazione del flusso sanguigno a causa di arresto cardiaco del topo (mostrato nel Video 4), precedentemente allineato nella stessa linea di flusso (indicata dalle frecce bianche, gialle e blu). Barre di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi morfologiche del proplatelet. (A) Immagine superiore, z-projection raffigurante il sito in cui è stata misurata la larghezza del proplatelet insieme alla lunghezza massima; di seguito sono riportati i grafici che rappresentano la lunghezza massima di 25 singoli proplatelet e la larghezza media dei proplatelet degli stessi proplatelet (stesso codice grigio) durante l'allungamento. i) La larghezza del proplatelet è stata misurata disegnando una linea perpendicolare in una posizione fissa vicino alla base del proplatelet, e l'intensità del profilo è stata registrata in questa posizione ogni minuto. Una curva gaussiana è stata adattata a questo profilo e il FWHM è stato considerato rappresentare la larghezza del proplatelet. La larghezza media è stata quindi calcolata facendo la media delle larghezze del proplatelet misurate in ogni punto temporale nella posizione fissa. Le barre sono ± sem della larghezza misurata ogni minuto durante l'acquisizione; ii) è stata determinata anche la lunghezza massima del proplatelet, dalla base del proplatelet alla sua punta. (B) Tracciati individuali che mostrano il comportamento di allungamento delle proplatelet WT, alcune delle quali presentano fasi di pausa e retrazione. Per evidenziare meglio le pause e le retrazioni sul processo di crescita del proplatelet, la lunghezza misurata ogni 10 s è stata rappresentata come percentuale della lunghezza massima di ciascun proplatelet. (C) Grafico a dispersione che rappresenta la velocità di allungamento del proplatelet. La velocità media netta di allungamento del proplatelet (comprese le pause e le retrazioni) è stata calcolata come la variazione della lunghezza della proplatelet a intervalli di 1 minuto, mediata sull'intera sequenza temporale. Valori individuali e media ± sem. Abbreviazioni: FWHM = Full Width a Half Maximum; sem = errore standard della media; WT = wild-type.
Video 1: Flusso inverso all'interno di vasi sinusoidi. Piastrine circolanti (verde) all'interno dei vasi sinusoidi (rosso, Qtracker) (singolo piano z confocale). Viene mostrato un vaso sinusoide anastomoso che presenta biforcazioni in cui il flusso è instabile e mostra fasi di stasi, accelerazione e decelerazione. Acquisito con un microscopio Leica SP5 dotato di uno scanner risonante a 12 kHz e un obiettivo ad acqua 25x con un'apertura numerica di 0,95 (Leica), un piano, 256 x 90 pixel, acquisizione bidirezionale, linea media di 2.133 fotogrammi/s. Fare clic qui per scaricare questo video.
Video 2: I proplatelet allungati mostrano varie morfologie. Registrazione video time-lapse rappresentativa (proiezione z) in un topo WT con megacariociti che estendono proplatelet con varie morfologie (verde) all'interno delle sinusoidi del midollo osseo (rosso, Qtracker). Acquisito con un microscopio Leica SP5 dotato di uno scanner risonante a 12 kHz e un obiettivo ad acqua 25x con apertura numerica di 0,95 (Leica), acquisizione z-stack a intervalli di 10 s, profondità z di 4 μm, risoluzione x-y 384 x 384 pixel, linea media 8. Quando necessario, i profili sono stati allineati utilizzando il plug-in di corrispondenza del modello ImageJ per ottenere una proiezione z media. A seconda della qualità dell'immagine, lo sfondo è stato sottratto, l'immagine è stata levigata e la luminosità e il contrasto sono stati regolati. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: I proplatelet vengono lanciati dai cambiamenti nella direzione del flusso. Video time-lapse che mostra un megacariocita wild-type nella biforcazione sinusoide mostrata nel Video 1, nel processo di estensione di un proplatelet che oscilla in un ramo del vaso a seconda della direzione del flusso (proiezione z). Acquisito con un microscopio Leica SP5 dotato di uno scanner risonante a 12 kHz e un obiettivo ad acqua 25x con apertura numerica di 0,95 (Leica), acquisizione z-stack a intervalli di 10 s, profondità z di 4 μm, risoluzione x-y 384 x 384 pixel, linea media 8. I profili sono stati allineati utilizzando il plug-in di corrispondenza del modello ImageJ ed è stata ottenuta una proiezione z media. Lo sfondo è stato sottratto, l'immagine è stata levigata e la luminosità e il contrasto sono stati regolati. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 4: Impatto del flusso sull'allineamento e la tensione del proplatelet. Registrazione video time-lapse di un proplatelet prima e dopo l'arresto cardiaco. Il video mostra tre proplatelet (verdi, etichettate con il derivato anticorpale anti-GPIX AF-488) nella stessa linea di flusso prima dell'arresto cardiaco, quindi scarsamente individualizzate alla risoluzione della microscopia a due fotoni. Dopo l'arresto cardiaco, le tre proplatelet si separano e si rilassano in assenza di flusso sanguigno. Video acquisito con un microscopio confocale Leica SP8 dotato di uno scanner risonante a 8 kHz, immagine con un obiettivo ad acqua 25x con un'apertura numerica di 0,95 (Leica). I profili sono stati allineati utilizzando il plug-in di corrispondenza del modello ImageJ ed è stata ottenuta una proiezione z media. Lo sfondo è stato sottratto, l'immagine è stata levigata e la luminosità e il contrasto sono stati regolati. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 5: Impatto dell'iniezione di vincristina sul comportamento del proplatelet dei topi WT. Registrazione video time-lapse di un proplatelet prima e dopo la somministrazione di vincristina (1 mg/kg) (proiezione z). Il proplatelet allungato (verde) all'interno dei vasi sinusoidi (rosso) inizia a ritrarsi dopo somministrazione endovenosa di vincristina. Il video è stato acquisito con un microscopio confocale Leica SP8 dotato di uno scanner risonante a 8 kHz, immagine con un obiettivo ad acqua 25x con un'apertura numerica di 0,95 (Leica). Il profilo è stato allineato utilizzando il plug-in di corrispondenza del modello ImageJ ed è stata ottenuta una proiezione z media. Lo sfondo è stato sottratto, l'immagine è stata levigata e la luminosità e il contrasto sono stati regolati. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 6: Impatto dell'iniezione di farmaco vincristina sul comportamento del proplatelet di topi carenti di miosina. Registrazione video time-lapse di un proplatelet prima e dopo la somministrazione di vincristina (1 mg/kg) (proiezione z). Il proplatelet allungato (verde) all'interno dei vasi sinusoidi (rosso) continua ad allungarsi nei topi Myh9-/-. Il video è stato acquisito con un microscopio confocale Leica SP8 dotato di uno scanner risonante a 8 kHz, immagine con un obiettivo ad acqua 25x con un'apertura numerica di 0,95 (Leica). Il profilo è stato allineato utilizzando il plug-in di corrispondenza del modello ImageJ ed è stata ottenuta una proiezione z media. Lo sfondo è stato sottratto, l'immagine è stata levigata e la luminosità e il contrasto sono stati regolati. Clicca qui per scaricare questo video.
Figura supplementare S1: Progettazione per la stampa 3D dell'anello del cranio e del supporto. Questo design è stato utilizzato per stampare in 3D(A)l'anello del cranio in acciaio inossidabile di alta qualità,(B)la vite,(C)il blocco in acciaio inossidabile e(D)il supporto in polimero ABS. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; ABS = ABS = acrilonitrile butadiene stirene. Fare clic qui per scaricare questa figura.
Video supplementari:
Video supplementare 1: Registrazione video time-lapse rappresentativa (proiezione z) in un topo wild-type con megacariociti che estendono la proplatelet (verde) all'interno delle sinusoidi del midollo osseo (rosso, Qtracker). Acquisito con un microscopio Leica SP5 dotato di uno scanner risonante a 12 kHz e un obiettivo ad acqua 25x con un'apertura numerica di 0,95 (Leica), acquisizione z-stack a intervalli di 10 s, profondità z di 1,34 μm, risoluzione x-y 384 x 384 pixel, linea media 8. Quando necessario, il profilo è stato allineato utilizzando il plug-in di corrispondenza del modello ImageJ per ottenere una proiezione z media. A seconda della qualità dell'immagine, lo sfondo è stato sottratto, l'immagine è stata levigata e la luminosità e il contrasto sono stati regolati. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Registrazione video time-lapse rappresentativa (proiezione z) in un topo wild-type con megacariociti che estendono la proplatelet (verde) all'interno delle sinusoidi del midollo osseo (rosso, Qtracker). Acquisito con un microscopio Leica SP5 dotato di uno scanner risonante a 12 kHz e un obiettivo ad acqua 25x con un'apertura numerica di 0,95 (Leica), acquisizione z-stack a intervalli di 10 s, profondità z di 1,34 μm, risoluzione x-y 384 x 384 pixel, linea media 8. Quando necessario, il profilo è stato allineato utilizzando il plug-in di corrispondenza del modello ImageJ per ottenere una proiezione z media. A seconda della qualità dell'immagine, lo sfondo è stato sottratto, l'immagine è stata levigata e la luminosità e il contrasto sono stati regolati. Clicca qui per scaricare questo video.
Materiali supplementari:
File di codifica 1: stampa 3D-Blocco. File oggetto 3D per la stampa del blocco. Fare clic qui per scaricare questo file di codifica.
File di codifica 2: stampa 3D-Anello del teschio. File oggetto 3D per la stampa dell'anello cranico. Fare clic qui per scaricare questo file di codifica.
File di codifica 3: stampa 3D-Supporto. File oggetto 3D per la stampa del supporto. Fare clic qui per scaricare questo file di codifica.
File di codifica 4: stampa 3D-Anello a vite. File oggetto 3D per la stampa della vite. Fare clic qui per scaricare questo file di codifica.
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Discussion
I meccanismi di formazione delle piastrine dipendono fortemente dall'ambiente del midollo osseo. Quindi, la microscopia intravitale è diventata uno strumento importante sul campo per visualizzare il processo in tempo reale. I topi con megacariociti fluorescenti possono essere ottenuti incrociando topi che esprimono la cre ricombinatasi in megacariociti con qualsiasi topo reporter floxed contenente una cassetta di espressione genica fluorescente condizionale. Qui sono stati utilizzati topi reporter mTmG (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo10) incrociati con topi Pf4-cre11, consentendo un'intensa etichettatura di fluorescenza verde in megacariociti e piastrine12. È importante notare che alcune perdite sono state riportate con topi Pf4-cre nei leucociti, inclusi monociti / macrofagi e fibroblasti12,13.
Tuttavia, i megacariociti sono facilmente riconoscibili dalle loro grandi dimensioni e dal loro nucleo. Gli sperimentatori nuovi nel campo potrebbero confrontare le osservazioni in [mTmG; Pf4-cre] con quelli ottenuti dopo l'etichettatura specifica dei megacariociti. Ciò è possibile attraverso la somministrazione endovenosa di un anticorpo Alexa-fluor-marcato diretto contro la proteina piastrinica specifica, GPIX (CD42a)3,14. Quest'ultimo approccio è anche utile per l'imaging di megacariociti fluorescenti da qualsiasi topo geneticamente modificato senza eseguire noiosi e dispendiosi in termini di tempo incroci di topi con topi reporter fluorescenti. Qui, i topi di 5-7 settimane sono stati usati come topi più giovani presenti con un osso più sottile che è più traslucido e facilita l'imaging rispetto ai topi più anziani. Tuttavia, i topi troppo giovani possono presentare difficoltà nell'installazione dell'anello cranico senza perdite.
In questo studio, l'imaging intravitale è stato eseguito utilizzando un microscopio Leica dotato di un obiettivo ad acqua 25x con un'apertura numerica di 0,95 (Table of Materials). L'obiettivo dovrebbe essere conico in modo che possa entrare nella tazza formata dall'anello cranico con una distanza di lavoro ottimale. Le immagini sono state registrate con uno scanner risonante (12 o 8 kHz). Le impostazioni generali dipenderanno dal tipo di domanda scientifica a cui rispondere e dovrebbero essere ottimizzate in base all'ingrandimento, alla risoluzione e alla velocità di acquisizione necessari. Ad esempio, con uno scanner risonante a 12 kHz, un obiettivo 25x sarebbe più adatto per misurare la velocità piastrinica, mentre uno scanner a 8 kHz e un ingrandimento inferiore potrebbero essere sufficienti per registrare l'allungamento della proplateleta.
Il passaggio più critico del protocollo è il corretto fissaggio dell'anello all'osso del cranio in modo che non si verifichino perdite e in modo che non si stacchi durante la registrazione. Per questo, è essenziale che l'osso del cranio sia asciutto appena prima di applicare l'anello. Una volta incollato l'anello, ri-umidificare rapidamente l'osso. Inoltre, a causa della forza esercitata dal peso della testa sull'anello, l'anello è sottoposto ad una tensione che può causarne il distacco parziale durante la registrazione. Ciò può causare perdite e, quindi, secchezza dell'osso, portando sia a immagini di scarsa qualità che a reazioni infiammatorie indesiderate. Questo problema può essere facilmente evitato aggiungendo un impacco piegato sotto il naso del mouse per sostenere la testa (Figura 3C). Un altro punto critico è quello di ridurre al minimo il sanguinamento e la presenza di sangue all'interno dell'anello in quanto può portare a immagini sfocate. Questo deve essere tenuto a mente quando si studiano topi che presentano emostasi difettosa e sono inclini al sanguinamento. Alcuni traccianti, come il destrano, possono presentare perdite nella cavità del midollo osseo se iniettati in forma concentrata, il che peggiora l'imaging dei vasi, anche se non la fluorescenza verde dei megacariociti. Qtracker-655 non perde molto ma viene eliminato dalla circolazione entro 30 minuti in modo che siano necessarie nuove iniezioni del tracciante per visualizzare i vasi per periodi più lunghi.
Una limitazione di questo metodo qui descritto è la necessità di interrompere l'acquisizione ogni 35 minuti per reiniettare anestetici. Questa limitazione può essere superata se è disponibile una macchina per anestesia. In tal caso, l'anestesia può essere indotta in modo simile dall'iniezione i.p. di una miscela di ketamina e xilazina, che è il modo più semplice per eseguire l'inserimento del catetere e l'intervento chirurgico minore. Una volta posizionata sotto l'obiettivo del microscopio, l'anestesia viene poi mantenuta per inalazione di gas (miscela di ossigeno, anestetici come isoflurano e aria ambiente). In questo modo, le osservazioni possono essere fatte per diverse ore senza interruzioni. Tuttavia, per ragioni etiche, le osservazioni sono state limitate a 3 ore in questo studio. Un'altra limitazione nell'uso della miscela ketamina/ xilazina potrebbe essere il suo potenziale impatto deleterio sulle funzioni piastrine16 che potrebbe richiedere schemi di anestesia alternativi.
Nel complesso, il merito principale di questo protocollo ben consolidato è il suo aspetto non invasivo con un intervento chirurgico minimo. Altri protocolli sono stati sviluppati per eseguire l'imaging intravitale time-lapse nelle ossa lunghe. Questi si basano su chirurgia invasiva che richiede la rimozione del tessuto muscolare e l'abrasione ossea17,18,sonde endoscopiche impiantate vicino alla testa del femore19,20,o l'installazione di una camera finestra nel femore21. Tutte queste procedure provocano traumi importanti e vari gradi di infiammazione. L'infiammazione non è solo dannosa per il topo, ma è stato anche segnalato per modificare il processo di formazione delle piastrine6 in modo che le condizioni infiammatorie incontrollate possano portare a discrepanze e interpretazioni errate dei dati. Ecco perché questa procedura è stata scelta per evitare reazioni infiammatorie. Tuttavia, a seconda della domanda scientifica, gli sperimentatori potrebbero preferire avere un campo di osservazione più profondo e una risoluzione più elevata (meno scattering), che è possibile utilizzando un approccio basato sull'assottigliamento del cranio a scapito di un basso grado di reazione infiammatoria.
A causa della sua natura non invasiva, il principale limite di questo metodo è la profondità massima che può essere raggiunta. A causa della densità dell'osso e delle sue proprietà di dispersione, è possibile immaginare le regioni entro una profondità di poche centinaia di micrometri, impedendo le osservazioni dell'intero midollo calvalare. Lo sviluppo della microscopia a tre fotoni, che si basa su lunghezze d'onda di eccitazione infrarossa ancora più elevate, sembra essere un approccio promettente con una risoluzione superiore dei tessuti profondi. È già stato utilizzato con successo per l'immagine in profondità nel cervello anche attraverso l'osso22,23, aprendo l'eccitante possibilità di immaginare il midollo osseo all'interno delle ossa lunghe senza dover assottigliare l'osso o impiantare una finestra chirurgica.
In sintesi, questo metodo è sempre più utilizzato per studiare il comportamento dei megacariociti nel midollo osseo e visualizzare l'estensione dei proplatati. Inoltre, consentendo la visualizzazione dell'osso compatto calvariale esterno e di parte del midollo sottostante, questo metodo è già stato utilizzato in molte applicazioni al di fuori del campo piastrinico. È stato utilizzato per lo studio della dinamica cellulare sia dell'osso che del midollo nel loro ambiente, inclusi osteoblasti e osteoclasti, traffico di leucociti ed uscita del midollo, cellule endoteliali e architettura microvascolare, dinamica del flusso sanguigno nei microvasi del midollo o homing cellulare24.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Austria) per la sua consulenza esperta sugli esperimenti di microscopia a due fotoni nel momento in cui abbiamo stabilito la tecnica in laboratorio, e Yves Lutz presso l'Imaging Center IGBMC / CBI (Illkirch, Francia) per la sua esperienza e l'aiuto con il microscopio a due fotoni. Ringraziamo anche Jean-Yves Rinkel per il suo aiuto tecnico e Ines Guinard per il disegno dello schema in Figura 1. Ringraziamo ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) per il suo supporto nell'acquisizione del microscopio a due fotoni. AB è stata sostenuta da borse di studio post-dottorato dell'Etablissement Français du Sang (APR2016) e dell'Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter - Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
References
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