Summary
Wir beschreiben hier die Methode zur Abbildung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Schädelknochens lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Abstract
Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert, spezialisierten Zellen im Knochenmark. Die Möglichkeit, Megakaryozyten in Echtzeit und ihre native Umgebung abbilden zu können, wurde vor mehr als 10 Jahren beschrieben und wirft ein neues Licht auf den Prozess der Thrombozytenbildung. Megakaryozyten verlängern längliche Vorsprünge, Pro thrombozyten genannt, durch die Endothelauskleidung von Sinusgefäßen. Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um gleichzeitig in Echtzeit fluoreszierend markierte Megakaryozyten im Schädelknochenmark und in den Sinusgefäßen abbilden zu können. Diese Technik beruht auf einer kleinen Operation, die den Schädel intakt hält, um Entzündungsreaktionen zu begrenzen. Der Mauskopf wird mit einem Ring immobilisiert, der auf den Schädel geklebt ist, um Bewegungen am Atmen zu hindern.
Mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie können Megakaryozyten bis zu einigen Stunden visualisiert werden, was die Beobachtung von Zellvorsprüngen und Blutplättchen im Prozess der Dehnung in Sinusgefäßen ermöglicht. Dies ermöglicht die Quantifizierung mehrerer Parameter, die sich auf die Morphologie der Vorsprünge (Breite, Länge, Vorhandensein von Verengungsbereichen) und deren Dehnungsverhalten (Geschwindigkeit, Regelmäßigkeit oder Vorhandensein von Pausen oder Rückzugsphasen) beziehen. Diese Technik ermöglicht auch die gleichzeitige Aufzeichnung von zirkulierenden Blutplättchen in sinusförmigen Gefäßen, um die Thrombozytengeschwindigkeit und die Blutflussrichtung zu bestimmen. Diese Methode ist besonders nützlich, um die Rolle von Genen von Interesse bei der Thrombozytenbildung mit genetisch veränderten Mäusen zu untersuchen und ist auch für pharmakologische Tests (Untersuchung der Mechanismen, Bewertung von Medikamenten bei der Behandlung von Thrombozytenproduktionsstörungen) möglich. Es ist zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, insbesondere zur Ergänzung von In-vitro-Studien, da heute bekannt ist, dass die In-vivo- und In-vitro-Pro thrombozytenbildung auf verschiedenen Mechanismen beruht. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass in vitro Mikrotubuli für die Thrombozytenverlängerung per se benötigt werden. In vivodienen sie jedoch eher als Gerüst, wobei die Dehnung hauptsächlich durch Blutflusskräfte gefördert wird.
Introduction
Blutplättchen werden von Megakaryozyten-spezialisierten Zellen im Knochenmark produziert. Wie genau Megakaryozyten Blutplättchen im Kreislauf freisetzen, blieb aufgrund der technischen Herausforderung bei der Beobachtung von Echtzeitereignissen durch den Knochen lange unklar. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie hat dazu beigetragen, diese Herausforderung zu meistern und zu großen Fortschritten beim Verständnis des Thrombozytenbildungsprozesses geführt. Die ersten in vivo Megakaryozytenbeobachtungen wurden von Andrian und Kollegen im Jahr 2007 gemacht, mit der Visualisierung von fluoreszierenden Megakaryozyten durch den Schädel1. Dies war möglich, weil die Knochenschicht im frontoparietalen Schädel junger erwachsener Mäuse eine Dicke von einigen zehn Mikrometern aufweist und ausreichend transparent ist, um die Visualisierung fluoreszierender Zellen im darunter liegenden Knochenmark zu ermöglichen2.
Nachfolgende Studien wandten dieses Verfahren an, um die Pro thrombozytenbildung unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten und die zugrunde liegenden Mechanismen3,4,5,6zu entschlüsseln . Diese Studien lieferten definitive Beweise dafür, dass Megakaryozyten Protrusionen, sogenannte Pro thrombozyten, dynamisch durch die Endothelbarriere der Sinusgefäße verlängern (Abbildung 1). Diese Proplättchen werden dann als lange Fragmente freigesetzt, die mehrere hundert Blutplättchen im Volumen darstellen. Die Blutplättchen werden nach dem Umbau der Blutplättchen in der Mikrozirkulation der nachgeschalteten Organe, insbesondere in der Lunge, gebildet7. Bis heute sind der genaue Prozess und die molekularen Mechanismen jedoch weiterhin Gegenstand von Diskussionen. Zum Beispiel unterscheidet sich die vorgeschlagene Rolle der Zytoskelettproteine bei der Verlängerung von Blutplättchen zwischen in vitro und in vivo 3, und Unterschiede in der Pro thrombozytenbildung wurden unter entzündlichen Bedingungen nachgewiesen6. Erschwerend kommt hinzu, dass eine kürzlich durchgeführte Studie das prothrombozytengetriebene Konzept in Betracht stellte und vorschlug, dass in vivoBlutplättchen im Wesentlichen durch einen membranbewegenden Mechanismus auf Megakaryozytenebene gebildet werden8.
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark aus dem Schädelknochen bei lebenden Mäusen mit einem minimalinvasiven Verfahren vor. Ähnliche Ansätze wurden bereits beschrieben, um andere Markzellen zu visualisieren, insbesondere hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen9. Der Fokus liegt hier auf der Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen, um einige Parameter zu beschreiben, die gemessen werden können, insbesondere Prothrombozytenmorphologien und Thrombozytengeschwindigkeit. Dieses Protokoll zeigt, wie man einen Katheter in die Jugularvene einführt, um fluoreszierende Tracer und Medikamente zu injizieren und durch den Schädelknochen zu beobachten. Der Calvarialknochen wird durch eine kleinere Operation freigelegt, so dass ein Ring auf den Knochen geklebt wird. Dieser Ring dient dazu, den Kopf zu immobilisieren und Bewegungen durch Atmung zu verhindern und eine mit Kochsalzlösung gefüllte Tasse als Tauchmedium der Linse zu bilden. Diese Technik eignet sich gut, um i) in Echtzeit die Sinusgeometrie und Megakaryozyten zu beobachten, die mit der Gefäßwand interagieren; ii) Megakaryozyten im Prozess der Prothrombozytenbildung, -dehnung und -freisetzung zu verfolgen; und iii) Thrombozytenbewegungen messen, um den komplexen sinusförmigen Blutfluss zu überwachen. Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen wurden, wurden kürzlich veröffentlicht3.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility Agreement N°: G67-482-10, Projektvereinbarung Nr.: 2018061211274514) durchgeführt.
1. Vorbereitung von Mäusen und Einsetzen eines Katheters in die Vena jugularis
HINWEIS: Hier wurden männliche oder weibliche, 5-7 Wochen alte mTmG-Reportermäuse verwendet (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)gekreuzt mit Pf4-cre-Mäusen11, was eine intensive grüne Fluoreszenzmarkierung in Megakaryozyten und Blutplättchen ermöglicht12. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, heizen Sie die Heizkammer des Mikroskops für einige Stunden vor.
- Transportieren Sie die Maus in den Bildgebungsraum und fahren Sie mit der Anästhesie fort.
- Betäubung der Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer Lösung von Ketamin (Ketamin (100 μg/g) und Xylazin (10 μg/g) (5 μL/g).
HINWEIS: Die wiederholte Verabreichung von Ketamin / Xylazin wird hier verwendet und funktioniert gut, erfordert jedoch die Unterbrechung der Aufnahme für eine regelmäßige Wiedereinleitung. Alternativ, wenn ein Anästhesiegerät verfügbar ist, kann die Induktion der Anästhesie mit Ketamin / Xylazin durchgeführt und anschließend unter Inhalation von Gasen (Mischung aus Isofluran, Luft und Sauerstoff) aufrechterhalten werden. - Ersetzen Sie das Tier in seinem Käfig, bis es eine tiefe Betäubung erreicht. Legen Sie die Maus für alle nachfolgenden Manipulationen auf eine beheizte Platte, die bei 37 °C erwärmt ist.
HINWEIS: Während das Tier eine tiefe Betäubung erreicht, schalten Sie das Mikroskop und alle Geräte ein (siehe Abschnitt 4.1) und richten Sie die verschiedenen Parameter ein, die erforderlich sind (siehe Abschnitt 4.2), um das Experiment nach Abschluss der Operation zu starten. Hier dauert der Vorgang nur 3 h und ist terminal. Die Maus wird nach dem Experiment eingeschläfert, ohne aufzuwachen. Daher ist die Ethanoldesinfektion für Haut und Instrumente ausreichend. Abhängig von den institutionellen Richtlinien oder wenn das Verfahren länger dauern würde, sollten jedoch vollständigere Desinfektionsmethoden wie drei abwechselnde Peelings mit Betadin / Povidon und Alkohol verwendet werden.
- Betäubung der Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer Lösung von Ketamin (Ketamin (100 μg/g) und Xylazin (10 μg/g) (5 μL/g).
- Installieren Sie einen Katheter in der Vena jugularis.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine mikrobielle Kontamination während der Operation so weit wie möglich zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Haut sorgfältig mit 70% Ethanol (EtOH) zu desinfizieren, bevor Sie mit der Operation fortfahren. Verwenden Sie immer sterilisierte Scheren und Pinzetten und spülen Sie sie regelmäßig in 70% EtOH aus. Arbeiten Sie an einem sauberen Ort und tragen Sie eine Gesichtsmaske. Ein 22 G "Over-the-Needle"-Katheter, bestehend aus einer Nadel in einem Kunststoffschlauch, wird für die intravenöse Injektion verwendet (siehe Materialtabelle).- Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die vorderen Beine mit chirurgischem Klebeband, um den Hals zu dehnen (Abbildung 2A). Desinfizieren Sie den Hals mit 70% Ethanol.
HINWEIS: Der Einfachheit halber kann der Hals vor der Operation rasiert werden. Wenn das Verfahren länger dauert, muss eine sorgfältige Rasur für die richtige aseptische Technik durchgeführt werden. - Machen Sie einen 0,7-1 cm großen Schnitt über die rechte oder linke Jugularvene mit einer sterilen Schere. Dehnen Sie das angrenzende Bindegewebe, um die äußere Vena jugularis und die Oberseite des Brustmuskels freizulegen (Abbildung 2A).
- Füllen Sie den Katheter mit warmer, steriler physiologischer Kochsalzlösung. Führen Sie den Katheter nach dem Eindringen durch den Brustmuskel in die Vene ein (Abbildung 2B).
HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen im Katheter zu vermeiden. Es ist wichtig, den Katheter durch den Muskel einzuführen, um Blutungen zu verhindern, da der Muskel einen Kompressionspunkt bildet. Selbst Mäuse mit Hämostasedefekten, wie Itgb3-/- Mäuse, bluten bei Kathetereinführung mit diesem Ansatz nicht. - Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und bewegen Sie den Katheter bei Bedarf vorsichtig tiefer in die Vene. Verbinden Sie die Spritze und stabilisieren Sie den Katheter, indem Sie einen Tropfen chirurgischen Klebstoffs hinzufügen (Materialtabelle).
HINWEIS: Es ist möglich, einen Katheter in die Schwanzvene einzuführen, obwohl dies etwas Übung erfordert, da die Vene ein kleineres Kaliber hat. Dies ist besonders schwierig bei der Verwendung von Mäusen mit dunklem Haar, deren Schwanzvene kaum sichtbar ist. Aufgrund seines größeren Kalibers kann die Positionierung des Katheters in der Vena jugularis es ermöglichen, größere Volumina oder wiederholte Behandlungen zuverlässiger zu injizieren. Bitte beachten Sie, dass die Spritze zum ersten Mal mit warmer Kochsalzlösung gefüllt wird, und vergessen Sie nicht, das tote Volumen vor dem Injizieren der Arzneimittellösung zu injizieren. - Stellen Sie die Maus vorsichtig in eine Bauchlage zurück (Abbildung 2C). Tragen Sie Gel (Table of Materials) auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
- Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die vorderen Beine mit chirurgischem Klebeband, um den Hals zu dehnen (Abbildung 2A). Desinfizieren Sie den Hals mit 70% Ethanol.
2. Operation und Installation des Schädelrings
HINWEIS: Die volle Unterstützung für die Mausinstallation besteht aus 4 Teilen, einem Block und einer Platte, dem Ring zum Halten des Mauskopfes und einer Schraube zur Befestigung des Rings am Block (Abbildung 3A). Alle Elemente der Unterstützung wurden aus i.materialise.com durch 3D-Druck erhalten. Die Platte besteht aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS)-Polymer, dem Block und der Schraube aus Edelstahl und dem Ring aus hochwertigem Edelstahl (hochdetaillierter Edelstahl) (siehe Ergänzende Abbildung S1 für Abmessungen und ergänzende Materialien für die 3D-Druckdateien). Der Block wird dauerhaft am Träger befestigt, entweder verschraubt oder geklebt. Sobald der Ring am Mausschädel befestigt ist, sollte er an den Blockhalter geschraubt werden (Abbildung 3A).
- Befeuchten Sie das Haar auf der Kopfhaut mit einem Papiertuch, das zur Desinfektion mit 70% Ethanol nass ist. Entfernen Sie alle losen Haare mit einem nassen Papiertuch.
HINWEIS: Aus Gründen der Bequemlichkeit kann die Kopfhaut vor der Operation rasiert werden. - Schneiden Sie die Kopfhaut ein, indem Sie ein T an der Mittellinie bis zu 1 cm und zwischen den Ohren bilden, um das Kalvarium mit sterilen feinen Scheren und Pinzetten freizulegen.
HINWEIS: Der Ring wird so positioniert, dass er die Frontal- und Parietalknochen überlappt (Abbildung 3B). - Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie das Periost vorsichtig mit Schere und Pinzette. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, der mit physiologischer Kochsalzlösung getränkt ist, um das gesamte Periost und alle Ablagerungen oder Haare zu entfernen, die die Bildgebung verändern könnten.
HINWEIS: Um Entzündungsreaktionen zu begrenzen, achten Sie sehr darauf, den Knochen nicht zu beschädigen. - Entfernen Sie alle Blutspuren, indem Sie mit Kochsalzlösung spülen, und trocknen Sie den Knochen schnell mit einem trockenen Wattestäbchen. Tragen Sie das Klebegel auf den Ring auf, positionieren Sie es auf dem freiliegenden Knochen und halten Sie es für einige Sekunden, so dass der Ring fest am Schädel befestigt ist.
HINWEIS: Es darf kein Klebstoff in das Beobachtungsfeld gelangen, da dies zu unerwünschter Autofluoreszenz führen kann. - Befeuchten Sie den Schädel leicht mit einem Wattestäbchen, das in physiologische Kochsalzlösung getaucht ist.
- Bereiten Sie die Silikon-Dentalpaste vor, indem Sie vorsichtig 1:1 blaue und gelbe Komponenten mischen. Tragen Sie Zahnpaste rund um den Ring zum Versiegeln auf, um ein Auslaufen während der Bildgebung zu verhindern. Entfernen Sie vorsichtig alle Zahnpasten oder Klebstoffe, die möglicherweise in den Ring gelangt sind.
- Füllen Sie den Ring mit Kochsalzlösung und überprüfen Sie auf Leckagen.
HINWEIS: Die Kochsalzlösung dient als Tauchmedium für das Mikroskopobjektiv. Blutungen können kritischer sein, wenn Mäuse mit hämostasebedingten Defekten verwendet werden. Es ist wichtig, zu verhindern, dass Blut in den Ring gelangt, da dies die weitere Bildgebung verwischen kann. - Setzen Sie die Maus auf den Träger, und schrauben Sie den Ring an den Blockhalter (Abbildung 3C). Legen Sie gefaltete Kompressen unter den Kopf des Tieres, um den Kopf anzuheben und ein Ablösen des Rings vom Schädel zu verhindern.
HINWEIS: Der Kopf ist direkt fixiert, so dass er Bildbewegungen durch Atmung verhindert. - Positionieren Sie die Stütze und die Mausanordnung in der beheizten Mikroskopkammer (Abbildung 3D).
HINWEIS: Achten Sie darauf, den eingeführten Katheter zu keinem Zeitpunkt zu verdrängen.
3. Nachbeobachtung der betäubten Mäuse bis zum Ende des Experiments
HINWEIS: Die Anästhesie wird alle 35 Minuten durch abwechselnde subkutane (s.c.) Injektionen von Ketamin (25 μg/g) in einem Volumen von 5 μL/g Körpergewicht und einer Mischung aus Ketamin (50 μg/g) und Xylazin (5 μg/g) (1,2 μL/g) erneut induziert. Da es nicht möglich ist, die beheizte Mikroskopkammer während der Erfassung zu öffnen, wird vor und nach der erneuten Verabreichung des Anästhetikums durch Zehenklemmen eine anästhetische Überwachung durchgeführt. In ähnlicher Weise wird vor Beginn jeder neuen Videoaufnahme ein Zehenknen durchgeführt.
- Stoppen Sie bei Bedarf die Akquise und induzieren Sie die Anästhesie durch s.c. Injektion.
- Achten Sie darauf, den Mauskopf nicht zu bewegen, und kneifen Sie die Haut des Rückens zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Subkutan das Anästhetikum mit der rechten Hand in die Falte der Rückenhaut injizieren (oder umgekehrt bei Linkshändern).
- Überprüfen Sie das Vorhandensein von Kochsalzlösung im Ring und füllen Sie sie gegebenenfalls mit frischer Kochsalzlösung. Fahren Sie für die nächsten 35 Minuten mit der Aufnahme fort und fahren Sie für die Aufnahmedauer ähnlich fort.
- Am Ende des Experiments euthanasieren Sie die Maus durch zervikale Luxation, bevor sie aufwacht.
HINWEIS: Die Maus wird in Absprache mit dem örtlichen Ethik- und Tierschutzkomitee für eine maximale Dauer von 3 h betäubt.
4. Zwei-Photonen-Bildgebung
HINWEIS: Details zum Mikroskop und der zugehörigen Ausrüstung finden Sie in der Materialtabelle. Die Bilder wurden mit einem Resonanzscanner (12 oder 8 kHz) aufgenommen. Der bidirektionale Modus wurde eingerichtet, um die Geschwindigkeitserfassung zu erhöhen, da Pixel in beide Richtungen aufgezeichnet werden. Daher muss jede Diskrepanz in der Phase mit dem Bedienfeld "Phasenkorrektur" korrigiert werden. Schließlich wurde eine angepasste Mittelwertbildung als Kompromiss zwischen Erfassungsgeschwindigkeit und Signal-Rausch-Verhältnis eingerichtet.
- Schalten Sie das Zwei-Photonen-Mikroskop einschließlich Laser und Resonanzscanner ein (Ausgangslaserleistung normalerweise ~ 1,8-2,5 W je nach Laser).
- Stellen Sie die geeignete Laserwellenlänge für die ausgewählten Fluorophore ein. Stellen Sie die geeignete Wellenlänge für die Rückgewinnung von emittierten Lichtern ein.
HINWEIS: Hier wurden eine Wellenlänge von 913 nm und Hybriddetektoren (500-550 nm und 575-625 nm) verwendet, um AlexaFluor-488 bzw. Qtracker-655 gleichzeitig anzuregen und zu detektieren. - Injizieren Sie mit dem intrajugulären Katheter den fluoreszierenden Tracer, um das Gefäßsystem zu kennzeichnen (Qtracker-655; Tabelle der Materialien). Injektion von 50 μL/Maus einer Lösung bei 0,2 μM, die einmal pro Stunde für maximal 150 μL/Experiment erneuert wird.
HINWEIS: Andere Tracer können verwendet werden, wie z.B. dextran1mit hohem Molekulargewicht. Berücksichtigen Sie in diesem Fall, dass die Blutviskosität durch Dextran verändert werden kann und einige hämorheologische Parameter ändern kann. - Platzieren Sie den Mikroskopstand mit der Unterstützung und maus unter das Objektiv des Mikroskops. Überprüfen Sie, ob der Ring immer mit Kochsalzlösung gefüllt ist und tauchen Sie das Objektiv ein. Verwenden Sie Epifluoreszenz, um die Knochenmarkgefäße (rot) und das Vorhandensein von Megakaryozyten (grün) entlang sinusförmiger Gefäße zu lokalisieren.
HINWEIS: Der Schädelknochen hat eine Dicke von weniger als 100 μm2. Das Mark befindet sich unter dem Knochen und ist leicht an den fluoreszierenden grünen Megakaryozyten und den dichten roten anastomosierten Sinusgefäßen zu erkennen, die mit Qtracker-655 markiert sind. - Lange Akquisitionen (Megakaryozyten, Blutplättchen)
- Suchen Sie nach der Region von Interesse. Wenden Sie die Bilderfassungsparameter wie oben erwähnt an.
- Für lange Aufnahmen (z. B. Visualisierung der Pro thrombozytenbildung oder -dehnung) erfassen Sie Z-Stack-Bilder mit optimierten Intervallen (normalerweise zwischen 0,85 und 1,34 μm) mit einem 8 kHz-Resonanzscanner.
HINWEIS: Ein 12 kHz Resonanzscanner kann die Erfassungsgeschwindigkeit erhöhen. - Erfassen Sie 384 x 384 Pixel bilder, um den gesamten Megakaryozyten und das gesamte Gefäß zu visualisieren. Verwenden Sie die Linienmittelung wie gewünscht für eine schnelle Erfassung mit guter Auflösung. Bestimmen Sie das Zeitintervall der Bildstapelerfassung, normalerweise 10 s oder 30 s für die Proplatelet-Visualisierung.
HINWEIS: Hier wurde ein Zeilenmittelwert von 8 verwendet, um ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, was die Aufnahme von 1 Bild / 10 s mit einem 8 kHz Resonanzscanner ermöglichte. Stellen Sie sicher, dass die Linienmittelung während der Live-Erfassung zulässig ist.
- Kurze und schnelle Erfassung (Blutplättchen)
HINWEIS: Für eine kürzere Erfassung schneller Ereignisse, wie z. B. der Thrombozytengeschwindigkeit, ist es wichtig, die Bilderfassungsrate zu maximieren. Durch die Auswahl des richtigen Erfassungstyps wird die Bilderfassungsrate optimiert (d. h. ein Raum-Zeit-Erfassungstyp "xyt").- Minimieren Sie (z. B. 256 x 90 Pixel) und passen Sie die Bildgröße bei Bedarf an das Gefäß an, indem Sie das Bildfeld drehen.
- Verwenden Sie die höchste verfügbare Scangeschwindigkeit.
- Verwenden Sie bidirektionales Scannen.
HINWEIS: Stellen Sie beim bidirektionalen Scannen sicher, dass die Phase gut eingestellt ist. - Minimieren Sie die Linienmittelung, um den optimalen Kompromiss zwischen Bilddefinition und Aufnahmeschnelligkeit zu finden.
HINWEIS: Für Thrombozytengeschwindigkeitsmessungen kann ein pixeliges Bild ausreichen, wenn es dazu beiträgt, die Geschwindigkeit der Erfassung zu erhöhen. - Minimieren Sie den Z-Stack, um die Erfassungsschnelligkeit zu erhöhen. Die Erfassung von nur 1 z-Stack reicht aus, um die Thrombozytengeschwindigkeit zu quantifizieren. Erfassen Sie für 10-20 s, um die Thrombozytengeschwindigkeit zu messen.
HINWEIS: Unter diesen Bedingungen können mit einem 12 kHz Resonanzscanner maximal 133 Bilder/s erzielt werden. Die Parameter müssen an die Gegebenheiten angepasst werden. In einigen Gefäßen ist die Thrombozytengeschwindigkeit dennoch zu hoch, um die Thrombozytengeschwindigkeit mit diesen Einstellungen zuverlässig zu quantifizieren.
- Prothrombozytenbreite und Längenmessung
HINWEIS: Um LIF-Dateien zu laden, die auf Leica Software mit ImageJ erhalten wurden, laden Sie zuerst das LOCI-Plug-in herunter und installieren Sie es auf ImageJ, um den Bio-Formats Importer zu verwenden.- Prothrombozytenbreite
- Öffnen Sie den Film mit ImageJ. Um eine Breitenmessung durchzuführen, verwenden Sie nur den Film der Proplättchen ohne das Gefäß. Um die verschiedenen Kanäle zu trennen, klicken Sie auf Bild| Farbe und wählen Sie Kanäle teilen.
- Erstellen Sie für einen Z-Stack-Film eine durchschnittliche Z-Projektion für jeden Zeitpunkt, indem Sie auf Bild klicken| Stapeln und Z-Projekt auswählen. Geben Sie für Projektionstyp die durchschnittliche Intensität ein.
- Behandeln Sie das Bild, um das Rauschen zu entfernen. Subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie auf Prozess klicken| Subtrahieren Sie den Hintergrund und wenden Sie den Rollkugelradius an: 50,0 Pixel. Glätten Sie das Bild, indem Sie auf Verarbeiten und Glättenklicken.
- Verfolgen Sie eine Linie in der Nähe der Basis des Prothrombozyten (in der Nähe des Megakaryozyten, wobei Sie jedes andere Objekt vermeiden).
HINWEIS: Vergessen Sie nicht, die Skalierung des Bildes einzustellen, um den Wert in der gewünschten Einheit zu erhalten, indem Sie auf Analysieren und Maßstab festlegenklicken. Standardmäßig wird die Einheit des Bildes in Pixeln dargestellt. - Zeichnen Sie das Intensitätsprofil, passen Sie eine Gaußsche Kurve an und berechnen Sie die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM). Schreiben Sie dazu das folgende Skript in ein Makro, indem Sie auf Plugins klicken| Neu und wählen Sie Makro und führen Sie es aus, indem Sie auf Makro klicken| Makro ausführen: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gauß",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) * Sigma; drucken(FWHM).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es nur einen einzigen Peak im Zeilenscan gibt, der der Pro thrombozytenintensität entspricht. - Führen Sie die in Schritt 4.7.5 beschriebenen Aktionen auf 1 Slice aus oder wiederholen Sie sie im Laufe der Zeit, um die mittlere Breite des Prothrombozyten zu erhalten.
- Prothrombozytenlänge
- Verfolgen Sie eine Linie entlang des Prothrombozyten, von der Basis in der Nähe des Megakaryozyten bis zur Spitze. Verwenden Sie eine segmentierte Linie, um der Prothrombozytenform zu folgen. Wiederholen Sie es für jeden Zeitpunkt.
- Denken Sie daran, jede Zeile mit dem ROI Manager zu speichern: Klicken Sie auf Analyse | Tools und wählen Sie ROI Manager. Klicken Sie im ROI Manager-Fenster auf Hinzufügen, um jede Zeile wie ausgewählt zum Manager hinzuzufügen. Um alle Zeilen in einem Ordner zu speichern, klicken Sie im ROI Manager auf Auswahl aufheben | Mehr und klicken Sie auf Speichern. Extrahieren Sie aus dem ROI-Manager den Längenwert jeder Zeile (Measure) aus der Ergebnistabelle.
HINWEIS: Vergessen Sie nicht, die Skalierung des Bildes einzustellen, um den Wert in den gewünschten Einheiten zu erhalten, indem Sie auf Analysieren und Skalieren festlegenklicken. Standardmäßig wird die Einheit des Bildes in Pixeln dargestellt.
- Prothrombozytenbreite
- Thrombozytengeschwindigkeitsmessung
HINWEIS: Die Thrombozytengeschwindigkeit wird aus der Videoaufzeichnung von fluoreszierenden Blutplättchen berechnet, die über 10-20 s im Inneren des Gefäßes fließen. Eine Erstbildbehandlung wird durchgeführt, um zyklisch wiederholte Zeilenscandaten zu erhalten. Bewegung führt zu Streifen, deren Winkel von der Geschwindigkeit abhängt, was ihre Berechnung ermöglicht. Hier wurde die Geschwindigkeit mit einer Methode berechnet, die die Radontransformation verwendet, die robuster ist als die klassische Singular Value Decomposition (SVD) Methode15.- Bildbehandlung mit ImageJ
- Öffnen Sie den Film mit ImageJ. Wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichnerfilter an, indem Sie auf Prozess | klicken Filtern, wählen Sie Gaußsche Weichzeichnerund wenden Sigma (Radius): 2.00an. Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, um den Durchfluss zu messen, und verfolgen Sie 3 benachbarte Linien, die der Strömungsrichtung folgen.
HINWEIS: Vergessen Sie nicht, jede Zeile mit dem ROI Manager zu speichern, indem Sie auf Analyze | Werkzeuge | ROI-Manager. Klicken Sie im ROI Manager-Fenster auf Hinzufügen, um jede Zeile hinzuzufügen und zu speichern. Klicken Sie zuerst auf | deaktivieren Mehr und klicken Sie dann auf Speichern. - Erstellen Sie mit der ImageJ-Zeilenscan-Software einen Kymographen für jede Zeile, indem Sie auf Image | Stapel; Wählen Sie Reslice und wenden Sie die folgenden Parameter an: Ausgangsabstand (Mikrometer): 1.000 / Slice-Anzahl: 1 / Interpolation vermeiden. Speichern Sie die resultierenden Raum-Zeit-Bilder.
HINWEIS: Das resultierende Bild zeigt Streifen, die der linearen Bewegung der Blutplättchen im Blutfluss im Laufe der Zeit entsprechen. Der Winkel eines Streifens ist eine Funktion der Geschwindigkeit.
- Öffnen Sie den Film mit ImageJ. Wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichnerfilter an, indem Sie auf Prozess | klicken Filtern, wählen Sie Gaußsche Weichzeichnerund wenden Sigma (Radius): 2.00an. Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, um den Durchfluss zu messen, und verfolgen Sie 3 benachbarte Linien, die der Strömungsrichtung folgen.
- Geschwindigkeitsmessung mit Matlab oder GNU Octave Software
HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Blutplättchen im Blutfluss wird aus den Raum-Zeit-Bildern mit einer computergestützten Analysemethode geschätzt, die auf der von Drew und Mitarbeitern beschriebenen Radontransformation basiert15. Die Beschreibung dieser mathematischen Methode geht über den Rahmen dieser Übersicht hinaus, und der Leser wird auf die Veröffentlichung von Drew et al. für Details zur Berechnungverwiesen 15. Sowohl der Matlab-Code als auch weitere Informationen sind auf ihrer Website https://www.drew-lab.org/code verfügbar.- Öffnen Sie den Code mit Matlab oder GNU Octave Software.
HINWEIS: Der Code muss möglicherweise an die gewünschte Studie anpasst werden. - Extrahieren Sie den Wert aus den 3 Raum-Zeit-Bildern, die den benachbarten Linien entsprechen, die im selben Gefäßabschnitt gezeichnet sind. Berechnen Sie den mittleren Thrombozytenströmungsgeschwindigkeitswert für diesen Teil des Behälters.
HINWEIS: Vergessen Sie nicht, das Ergebnis in die richtige Maßeinheit (z. B. μm/s) umzurechnen.
- Öffnen Sie den Code mit Matlab oder GNU Octave Software.
- Bildbehandlung mit ImageJ
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Protokolls wurde der fluoreszierende Tracer Qtracker-655 intravenös verabreicht, um anastomosierte Knochensinusgefäße im Schädelknochenmark und die Fließrichtung, wie durch die Pfeile dargestellt, abzubilden (Abbildung 4A, links). Mit mTmG-Mäusen wurden eGFP-fluoreszierende Blutplättchen über 20 s in jedem Gefäßzweig aufgezeichnet und ihre Geschwindigkeit mit ImageJ und GNU Octave-Software gemessen(Abbildung 4A,rechts). Beachten Sie die Heterogenität in Strömungsgeschwindigkeit und -richtung. Sinusförmige Gefäße präsentieren komplexe Strömungen aufgrund der Anastomosen, mit dem Vorhandensein von Flow-Reflow und sogar Stasis, wie in der in Video 1aufgezeichneten Verzweigung gezeigt. Die gleiche Verzweigung ist in Abbildung 4B (links) dargestellt, wobei die roten und blauen Pfeile die gegenüberliegenden Flüsse hervorheben. Die Thrombozytengeschwindigkeit in dieser Verzweigung wurde gemessen und in der Grafik angegeben (Abbildung 4B, rechts). Die rote Spur entspricht der Geschwindigkeit im linken Gefäßzweig und die blaue Spur der im rechten Gefäßzweig. Dies zeigt Unregelmäßigkeiten im Laufe der Zeit in jedem Gefäßzweig mit Phasen der Beschleunigung, Desung und Verzögerung. Es ist wichtig zu beachten, dass in einigen Gefäßen der Blutfluss unter den gegenwärtigen Aufnahmebedingungen zu schnell für eine zuverlässige Analyse war.
Die Prothrombozytendehnungsaufzeichnung ermöglicht die Visualisierung ihrer verschiedenen Morphologien im Laufe der Zeit (Abbildung 5). Einige Blutplättchen verlängern sich mit unregelmäßigen Morphologien (Abbildung 5Ai und Video 2). Andere, in der Regel dünnere, können sich über große Entfernungen erstrecken, so dass die Bewegung des Erfassungsfensters erforderlich ist, um ihrer Erweiterung zu folgen (Abbildung 5Aii und Ergänzendes Video 1). Andere sind kürzer und dicker und verlängern sich normalerweise langsam (Abbildung 5Aiii und Ergänzendes Video 2). Wenn Megakaryozyten Proplättchen in Bereichen komplexer Strömungen ausdehnen, wie z. B. die in Abbildung 4Bgezeigte Verzweigung, werden Pro thrombozyten entsprechend der Fließrichtung von einem Gefäßzweig zum anderen geschleudert (Abbildung 5B und Video 3). Die Bedeutung hämodynamischer Kräfte für die Prothrombozytendehnung in Strömungsrichtung wurde deutlich, als die Maus unerwartet einen Herzstillstand erlitt. Das Stoppen des Blutflusses entspannte die durch den Megakaryozyten verlängerten Blutplättchen (Abbildung 5C und Video 4).
Wenn die Qualität/Auflösung der Erfassung angemessen ist, können morphologische Parameter gemessen werden, z. B. die Länge der Proplättchen bis zur Ablösung, ihre Breite an der Basis des Proplättchens oder an einer anderen definierten Stelle oder die Größe der Knospen (Abbildung 6A). Es wurde eine mittlere maximale Pro thrombozytenlänge von ~185 μm (Bereich 41,5-518,5 μm) und eine mittlere Prothrombbreite von 5,2 μm (Bereich 2,8-8 μm) berechnet(Abbildung 6A). Die Darstellung der Prothrombozytenlänge als Funktion der Zeit ermöglicht die Visualisierung des Verhaltens von Proplättchen während Phasen der Dehnung, Stase oder sogar des Rückzugs (Abbildung 6B). Die Messung der Prothrombozytendehnungsgeschwindigkeit ist ein wichtiger Parameter, der das Dehnungs-, Stasis- oder Rückzugsverhalten von Proplättchen direkt widerspiegelt3.
Die Prothrombozytendehnungsgeschwindigkeit kann gemessen werden, wenn das Pro thrombozytenaggregation an seiner Mutterzelle haftet; Einmal gelöst, wird es sofort vom Fluss weggetragen und verschwindet aus dem Visualisierungsfenster. Bei Wildtyp-Mäusen (WT) betrug die mittlere Prothrombozytendehnungsgeschwindigkeit ~10 μm/min(Abbildung 6C),in Übereinstimmung mit früheren Veröffentlichungen1. Schließlich ist es möglich, Medikamente durch den Katheter in die Vena jugularis eingeführt zu injizieren. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass die intravenöse Verabreichung von Vincristin, einem Medikament, das Mikrotubuli depolymerisiert, zum Rückzug von Blutplättchen von WT-Mäusen führte, aber keine Wirkung auf Proplättchen von Myosin IIA-defizienten Mäusen(Myh9-/-) hatte (Video 5 und Video 6)3.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Thrombozytenbildung im Knochenmark. Nach der Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen richten sich große Megakaryozyten entlang sinusförmiger Gefäße aus und verlängern zytoplasmatische Projektionen, sogenannte Pro thrombozyten, durch die Endothelbarriere. Pro thrombozyten verlängern und lösen sich unter dem Einfluss hämodynamischer Kräfte, um in der nachgeschalteten Mikrozirkulation weiter zu Blutplättchen umzumodellieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Einsetzen des Katheters. (A) Ein Schnitt wird vorgenommen, um die Vena jugularis und die Oberseite des Brustmuskels freizulegen. (B) Der mit Kochsalzlösung gefüllte Katheter wird durch den Muskel in die Vena jugularis eingeführt, wodurch ein Kompressionspunkt entsteht. (C) Die Maus wird vorsichtig so gedreht, dass sie mit dem Katheter gut positioniert ventrale Oberfläche nach unten liegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Versuchsaufbau für die Zwei-Photonen-Bildgebung durch den Schädelknochen. (A) Der 3D-gedruckte Edelstahlblock ist auf dem ABS-Polymerträger befestigt (siehe Ergänzende Abbildung S1 und ergänzende Materialien für die 3D-Designs). Der Block und der Schädelring sind so konstruiert, dass der Ring an den Block geschraubt werden kann. Beachten Sie, dass der Schraubenkopf aus Gründen der Benutzerfreundlichkeit in Epon eingebettet wurde. (B) Schematisch, der die Positionierung des Rings auf dem freiliegenden Schädelknochen zeigt. (C) Fotografien, die die Maus mit dem auf den Schädel geklebten Ring, den Kopf auf einem Gewebepad und (D) die Positionierung unter dem Mikroskopobjektiv veranschaulichen. Abkürzungen: 3D = dreidimensional; ABS = Acrylnitril-Butadien-Styrol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Messung der Thrombozytengeschwindigkeit in anastomosierten Sinusgefäßen des Schädelknochenmarks. (A) Linke, Zwei-Photonen-Bildgebung von Sinusgefäßen, die durch Q-Dot-Injektion markiert sind. z-Projektion, die die Anastomose der sinusförmigen Gefäße im Schädelknochenmark zeigt. Pfeile zeigen die Fließrichtung an und veranschaulichen die Komplexität der Strömungen in Sinusoiden. Rechts, mittlere Strömungsgeschwindigkeit, die durch die Messung der Thrombozytengeschwindigkeit in jedem Gefäßzweig geschätzt wird. Die Zahlen auf der x-Achse entsprechen den Pfeilzahlen im Bild links. (B) Links, sinusförmige Verzweigung, die durch gepunktete Linien abgegrenzt ist und Blutplättchen zeigt, die in entgegengesetzte Richtungen fließen (rote und blaue Pfeile) (entsprechend Video 1). Zwei-Photonen-Einzelebenenbild. Rechts, ein Diagramm, das die Strömungsgeschwindigkeit in jedem Teil des Gefäßes als Funktion der Zeit (rote Linie, linke Seite; blaue Linie, rechte Seite) zeigt und Phasen der Stasis, Beschleunigung und Verlangsamung zeigt. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Verschiedene Prothrombozytenmorphologien, die im Schädelmark durch Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet wurden. (A) Drei repräsentative In-vivo-Proplättchen: z-Projektionsbilder aus Zeitrafferexperimenten (gezeigt in Video 2, Supplemental Video 1und Supplemental Video 2), die die verschiedenen Morphologien von Proplättchen (Pfeilen) zeigen, die sich innerhalb der Knochenmarksinusoide erstrecken. Blutplättchen und Megakaryozyten sind grün; Sinusgefäße sind rot. (B) Zeitrafferbilder eines Prothrombozyten in der gleichen Verzweigung wie in Abbildung 4B, oszillierend entsprechend der Strömungsrichtung (auch in Video 3 gezeigt). (C) z-ProjektionSzeitrafferbilder, die die Entspannung von 3 Blutplättchen nach Beendigung des Blutflusses aufgrund eines Herzstillstands der Maus zeigen (gezeigt in Video 4),zuvor in derselben Flusslinie ausgerichtet (gekennzeichnet durch die weißen, gelben und blauen Pfeile). Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Morphologische Prothrombozytenanalysen. (A) Oberes Z-Projektionsbild, das die Stelle darstellt, an der die Prothrombozytenbreite zusammen mit der maximalen Länge gemessen wurde; Im Folgenden finden Sie Diagramme, die die maximale Länge von 25 einzelnen Proplättchen und die mittlere Proplättchenbreite derselben Proplättchen (gleicher grauer Code) während der gesamten Dehnung darstellen. i) Die Prothrombozytenbreite wurde gemessen, indem eine senkrechte Linie an einer festen Position in der Nähe der Basis des Proplatelets gezeichnet wurde, und die Profilintensität wurde an dieser Position jede Minute aufgezeichnet. Diesem Profil wurde eine Gaußsche Kurve angebracht, und die FWHM sollte die Breite des Proplatelets darstellen. Die mittlere Breite wurde dann berechnet, indem die Breiten des Prothrombozyten, die zu jedem Zeitpunkt an der festen Position gemessen wurden, gemittelt wurden. Balken sind mittlere ± sem der Breite, die jede Minute während der Erfassung gemessen wird; ii) Die maximale Prothrombozytenlänge wurde ebenfalls bestimmt, von der Basis des Prothrombozyten bis zu seiner Spitze. (B) Individuelle Tracings, die das Dehnungsverhalten von WT-Proplättchen zeigen, von denen einige Pausen- und Rückzugsphasen aufweisen. Um die Pausen und Rückzüge beim Prothrombozytenwachstum besser hervorzuheben, wurde die alle 10 s gemessene Länge als Prozentsatz der maximalen Länge jedes Prothrombozyten dargestellt. (C) Streudiagramm, das die Prothrombozytendehnungsgeschwindigkeit darstellt. Die mittlere Netto-Prothrombozytendehnungsgeschwindigkeit (einschließlich Pausen und Rückzüge) wurde als Änderung der Prothrombozytenlänge in 1-minuten-Intervallen berechnet, gemittelt über die gesamte Zeitsequenz. Individuelle Werte und Mittelwerte ± sem. Abkürzungen: FWHM = Full Width at Half Maximum; sem = Standardfehler des Mittelwerts; WT = Wildtyp.
Video 1: Rückfluss in sinusförmigen Gefäßen. Zirkulierende Blutplättchen (grün) innerhalb der sinusförmigen Gefäße (rot, Qtracker) (einzelne konfokale z-Ebene). Ein anastomosiertes Sinusgefäß zeigt Verzweigungen, bei denen die Strömung instabil ist und Phasen der Stase, Beschleunigung und Verlangsamung anzeigt. Aufgenommen mit einem Leica SP5 Mikroskop mit einem 12 kHz Resonanzscanner und einem 25-fach Wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica), einer Ebene, 256 x 90 Pixeln, bidirektionaler Erfassung, Linie mit durchschnittlich 2. 133 Bild/s. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Längliche Blutplättchen weisen verschiedene Morphologien auf. Repräsentative Zeitraffer-Videoaufzeichnung (z-Projektion) in einer WT-Maus mit Megakaryozyten, die Sich ausdehnende Proplättchen mit verschiedenen Morphologien (grün) innerhalb von Knochenmarksinusoiden (rot, Qtracker). Aufgenommen mit einem Leica SP5-Mikroskop mit einem 12-kHz-Resonanzscanner und einem 25-fachen Wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica), Z-Stack-Erfassung in 10-s-Intervallen, z-Tiefe von 4 μm, x-y-Auflösung 384 x 384 Pixel, Linienmittelwert 8. Bei Bedarf wurden die Profile mit dem ImageJ-Template-Matching-Plug-In ausgerichtet, um eine durchschnittliche Z-Projektion zu erhalten. Je nach Bildqualität wurde der Hintergrund subtrahiert, das Bild geglättet und Helligkeit und Kontrast angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Proplättchen werden durch Änderungen der Fließrichtung umgesiedert. Zeitraffervideo, das einen Wildtyp-Megakaryozyten in der in Video 1gezeigten Sinusoid-Verzweigung zeigt, bei der Ausdehnung eines Prothrombozyten, das je nach Strömungsrichtung in einem Gefäßzweig oszilliert (z-Projektion). Aufgenommen mit einem Leica SP5-Mikroskop mit einem 12-kHz-Resonanzscanner und einem 25-fachen Wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica), Z-Stack-Erfassung in 10-s-Intervallen, z-Tiefe von 4 μm, x-y-Auflösung 384 x 384 Pixel, Linienmittelwert 8. Die Profile wurden mit dem ImageJ-Template-Matching-Plug-In ausgerichtet und eine durchschnittliche Z-Projektion wurde erhalten. Der Hintergrund wurde subtrahiert, das Bild geglättet und Helligkeit und Kontrast angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 4: Einfluss der Strömung auf die Ausrichtung und Spannung der Prothrombozyten. Zeitraffer-Videoaufzeichnung eines Thrombozytenaggregations vor und nach einem Herzstillstand. Das Video zeigt drei Blutplättchen (grün, markiert mit AF-488 Anti-GPIX-Antikörperderivat) in derselben Flusslinie vor dem Herzstillstand, also bei der Auflösung der Zwei-Photonen-Mikroskopie schlecht individualisiert. Nach einem Herzstillstand trennen sich die drei Blutplättchen und entspannen sich in Abwesenheit von Blutfluss. Videoaufnahme mit einem konfokalen Leica SP8 Mikroskop mit 8 kHz Resonanzscanner, Bild mit einem 25-fachen Wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica). Die Profile wurden mit dem ImageJ-Template-Matching-Plug-In ausgerichtet und eine durchschnittliche Z-Projektion wurde erhalten. Der Hintergrund wurde subtrahiert, das Bild geglättet und Helligkeit und Kontrast angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 5: Einfluss der Vincristin-Medikamenteninjektion auf das Prothrombozytenverhalten von WT-Mäusen. Zeitraffer-Videoaufzeichnung eines Prothrombozyten vor und nach der Verabreichung von Vincristin (1 mg/kg) (z-Projektion). Das längliche Thrombozytenaggregation (grün) innerhalb der Sinusgefäße (rot) beginnt sich nach intravenöser Verabreichung von Vincristin zurückzuziehen. Das Video wurde mit einem konfokalen Leica SP8-Mikroskop aufgenommen, das mit einem 8-kHz-Resonanzscanner ausgestattet ist, das Bild mit einem 25-fachen Wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica). Das Profil wurde mit dem ImageJ-Template-Matching-Plug-In ausgerichtet und eine durchschnittliche Z-Projektion wurde erhalten. Der Hintergrund wurde subtrahiert, das Bild geglättet und Helligkeit und Kontrast angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 6: Einfluss der Vincristin-Medikamenteninjektion auf das Thrombozytenaggregationsverhalten von Myosin-defizienten Mäusen. Zeitraffer-Videoaufzeichnung eines Prothrombozyten vor und nach der Verabreichung von Vincristin (1 mg/kg) (z-Projektion). Das längliche Thrombozytenaggregation (grün) innerhalb der Sinusgefäße (rot) verlängert sich bei den Myh9-/-Mäusen weiter. Das Video wurde mit einem konfokalen Leica SP8-Mikroskop aufgenommen, das mit einem 8-kHz-Resonanzscanner ausgestattet ist, das Bild mit einem 25-fachen Wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica). Das Profil wurde mit dem ImageJ-Template-Matching-Plug-In ausgerichtet und eine durchschnittliche Z-Projektion wurde erhalten. Der Hintergrund wurde subtrahiert, das Bild geglättet und Helligkeit und Kontrast angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S1: Design für den 3D-Druck des Schädelrings und der Stütze. Dieses Design wurde verwendet, um(A)den Schädelring aus hochwertigem Edelstahl,(B)die Schraube,(C)den Block aus Edelstahl und(D)den Träger aus ABS-Polymer in 3D zu drucken. Abkürzungen: 3D = dreidimensional; ABS = ABS = Acrylnitril-Butadien-Styrol. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Videos:
Ergänzendes Video 1: Repräsentative Zeitraffer-Videoaufzeichnung (Z-Projektion) bei einer Wildtyp-Maus mit Megakaryozyten, die sich innerhalb der Knochenmarksinusoide (grün) ausdehnen (rot, Qtracker). Aufgenommen mit einem Leica SP5 Mikroskop mit einem 12 kHz Resonanzscanner und einem 25-fach wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica), Z-Stack-Erfassung in 10-s-Intervallen, z-Tiefe von 1,34 μm, x-y-Auflösung 384 x 384 Pixel, Linienmittelwert 8. Bei Bedarf wurde das Profil mit dem ImageJ-Vorlagen-Matching-Plug-In ausgerichtet, um eine durchschnittliche Z-Projektion zu erhalten. Je nach Bildqualität wurde der Hintergrund subtrahiert, das Bild geglättet und Helligkeit und Kontrast angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: Repräsentative Zeitraffer-Videoaufzeichnung (Z-Projektion) bei einer Wildtyp-Maus mit Megakaryozyten, die sich innerhalb der Knochenmarksinusoide (grün) ausdehnen (rot, Qtracker). Aufgenommen mit einem Leica SP5 Mikroskop mit einem 12 kHz Resonanzscanner und einem 25-fach wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 (Leica), Z-Stack-Erfassung in 10-s-Intervallen, z-Tiefe von 1,34 μm, x-y-Auflösung 384 x 384 Pixel, Linienmittelwert 8. Bei Bedarf wurde das Profil mit dem ImageJ-Vorlagen-Matching-Plug-In ausgerichtet, um eine durchschnittliche Z-Projektion zu erhalten. Je nach Bildqualität wurde der Hintergrund subtrahiert, das Bild geglättet und Helligkeit und Kontrast angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzende Materialien:
Codierdatei 1: 3D-Druck-Block. 3D-Objektdatei für den Druck des Blocks. Bitte klicken Sie hier, um diese Coding File herunterzuladen.
Coding File 2: 3D-Druck-Schädelring. 3D-Objektdatei für den Druck des Schädelrings. Bitte klicken Sie hier, um diese Coding File herunterzuladen.
Coding File 3: 3D-Druck-Unterstützung. 3D-Objektdatei für den Druck des Trägers. Bitte klicken Sie hier, um diese Coding File herunterzuladen.
Codierdatei 4: 3D-Druck-Schraubenring. 3D-Objektdatei für den Druck der Schraube. Bitte klicken Sie hier, um diese Coding File herunterzuladen.
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Discussion
Die Mechanismen der Thrombozytenbildung hängen stark von der Knochenmarkumgebung ab. Daher ist die intravitalen Mikroskopie zu einem wichtigen Werkzeug im Feld geworden, um den Prozess in Echtzeit zu visualisieren. Mäuse mit fluoreszierenden Megakaryozyten können durch Kreuzung von Mäusen, die die Cre-Rekombinase in Megakaryozyten exprimieren, mit allen gefloxten Reportermäusen erhalten werden, die eine bedingte fluoreszierende Genexpressionskassette enthalten. Hier wurden mTmG-Reportermäuse (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)mit Pf4-cre-Mäusen11gekreuzt, was eine intensive grüne Fluoreszenzmarkierung in Megakaryozyten und Blutplättchen ermöglicht12. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Leckagen bei Pf4-cre-Mäusen in Leukozyten, einschließlich Monozyten / Makrophagen und Fibroblasten12,13,berichtet wurden.
Megakaryozyten sind jedoch leicht an ihrer Größe und ihrem Kern zu erkennen. Experimentatoren, die neu auf dem Gebiet sind, konnten Beobachtungen in [mTmG; Pf4-cre] Mäuse mit solchen, die nach megakaryozytenspezifischer Markierung erhalten wurden. Dies ist möglich durch intravenöse Verabreichung eines Alexa-Fluor-markierten Antikörpers, der gegen das plättchenspezifische Protein GPIX (CD42a)3,14gerichtet ist. Dieser letztere Ansatz ist auch vorteilhaft für die Abbildung fluoreszierender Megakaryozyten von jeder gentechnisch veränderten Maus, ohne langwierige und zeitaufwändige Mauskreuzungen mit fluoreszierenden Reportermäusen durchzuführen. Hier wurden 5-7 Wochen alte Mäuse als jüngere Mäuse mit einem dünneren Knochen verwendet, der durchscheinender ist und die Bildgebung im Vergleich zu älteren Mäusen erleichtert. Zu junge Mäuse können jedoch Schwierigkeiten bei der Installation des Schädelrings ohne Leckage haben.
In dieser Studie wurde die intravitalen Bildgebung mit einem Leica-Mikroskop durchgeführt, das mit einem 25-fachen Wasserobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 ausgestattet war (Materialtabelle). Das Objektiv sollte konisch sein, damit es mit einem optimalen Arbeitsabstand in den vom Schädelring gebildeten Becher gelangen kann. Die Bilder wurden mit einem Resonanzscanner (12 oder 8 kHz) aufgenommen. Die Gesamteinstellungen hängen von der Art der zu beantwortenden wissenschaftlichen Frage ab und sollten je nach gewünschter Vergrößerung, Auflösung und Aufnahmegeschwindigkeit optimiert werden. Zum Beispiel wäre mit einem 12 kHz Resonanzscanner ein 25-faches Objektiv besser geeignet, um die Thrombozytengeschwindigkeit zu messen, während ein 8 kHz-Scanner und eine geringere Vergrößerung ausreichen könnten, um die Prothrombozytendehnung aufzuzeichnen.
Der kritischste Schritt des Protokolls ist die korrekte Befestigung des Rings am Schädelknochen, damit keine Leckage auftritt und er sich während der Aufnahme nicht löst. Dazu ist es wichtig, dass der Schädelknochen kurz vor dem Auftragen des Rings trocken ist. Sobald der Ring geklebt ist, befeuchten Sie den Knochen schnell wieder. Darüber hinaus wird der Ring aufgrund der Kraft, die durch das Gewicht des Kopfes auf den Ring ausgeübt wird, einer Spannung ausgesetzt, die dazu führen kann, dass er sich während der Aufnahme teilweise löst. Dies kann zu Leckagen und damit zu Trockenheit des Knochens führen, was sowohl zu qualitativ schlechten Bildern als auch zu unerwünschten Entzündungsreaktionen führt. Dieses Problem kann leicht vermieden werden, indem eine gefaltete Kompresse unter der Nase der Maus hinzugefügt wird, um den Kopf zu stützen (Abbildung 3C). Ein weiterer kritischer Punkt ist die Minimierung von Blutungen und das Vorhandensein von Blut im Ring, da dies zu verschwommenen Bildern führen kann. Dies muss bei der Untersuchung von Mäusen berücksichtigt werden, die eine defekte Hämostase aufweisen und zu Blutungen neigen. Einige Tracer, wie Dextran, können Leckagen in der Knochenmarkhöhle aufweisen, wenn sie in konzentrierter Form injiziert werden, was die Gefäßbildgebung verschlechtert, wenn auch nicht die grüne Fluoreszenz von Megakaryozyten. Qtracker-655 leckt nicht viel, sondern wird innerhalb von 30 minuten aus dem Kreislauf entfernt, so dass neue Injektionen des Tracers erforderlich sind, um Gefäße über längere Zeiträume zu visualisieren.
Eine Einschränkung dieser hier beschriebenen Methode ist die Notwendigkeit, die Akquise alle 35 Minuten zu stoppen, um Anästhetika erneut zu injizieren. Diese Einschränkung kann überwunden werden, wenn ein Anästhesiegerät verfügbar ist. In diesem Fall kann die Anästhesie in ähnlicher Weise durch i.p. Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin induziert werden, was der einfachste Weg ist, das Einsetzen des Katheters und die kleinere Operation durchzuführen. Einmal unter dem Mikroskopobjektiv positioniert, wird die Anästhesie dann durch Inhalation von Gasen (Gemisch aus Sauerstoff, Anästhetika wie Isofluran und Umgebungsluft) aufrechterhalten. Auf diese Weise können Beobachtungen über mehrere Stunden ohne Unterbrechung gemacht werden. Aus ethischen Gründen waren die Beobachtungen in dieser Studie jedoch auf 3 h beschränkt. Eine weitere Einschränkung bei der Verwendung von Ketamin / Xylazin-Mischung könnte ihre mögliche schädliche Wirkung auf die Thrombozytenfunktionen16 sein, die alternative Anästhesieschemata erfordern könnte.
Insgesamt ist das Hauptverdienst dieses gut etablierten Protokolls sein nichtinvasiver Aspekt mit nur minimaler Operation. Andere Protokolle wurden entwickelt, um zeitraffer-intravitalen Bildgebung in langen Knochen durchzuführen. Diese beruhen entweder auf invasiver Chirurgie, die Muskelgewebeentfernung und Knochenabrieb17,18, implantierte endoskopische Sonden in der Nähe des Femurkopfes19,20oder die Installation einer Fensterkammer im Femur21erfordert. Alle diese Verfahren führen zu schweren Traumata und unterschiedlichen Entzündungsgraden. Entzündungen sind nicht nur schädlich für die Maus, sondern es wurde auch berichtet, dass sie den Prozess der Thrombozytenbildung6 so verändern, dass unkontrollierte Entzündungszustände zu Diskrepanzen und Fehlinterpretationen der Daten führen können. Deshalb wurde dieses Verfahren gewählt, um Entzündungsreaktionen zu vermeiden. Abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung bevorzugen Experimentatoren jedoch ein tieferes Beobachtungsfeld und eine höhere Auflösung (weniger Streuung), was durch die Verwendung eines schädelverdünnenden Ansatzes auf Kosten einer geringen Entzündungsreaktion möglich ist.
Aufgrund ihrer nichtinvasiven Natur ist die Haupteinschränkung dieser Methode die maximale Tiefe, die erreicht werden kann. Aufgrund der Dichte des Knochens und seiner Streueigenschaften ist es möglich, Regionen in einer Tiefe von nur wenigen hundert Mikrometern abbilden, wodurch Beobachtungen des gesamten Kalvarialmarks verhindert werden. Die Entwicklung der Drei-Photonen-Mikroskopie, die auf noch höhere Infrarot-Anregungswellenlängen angewiesen ist, scheint ein vielversprechender Ansatz mit überlegener Tiefengewebsauflösung zu sein. Es wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um tief in das Gehirn hinein auch durch den Knochen22,23zu bilden, was die aufregende Möglichkeit eröffnet, Knochenmark in langen Knochen abbilden zu müssen, ohne den Knochen verdünnen oder ein operationsfenster implantieren zu müssen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode zunehmend eingesetzt wird, um das Verhalten von Megakaryozyten im Knochenmark zu untersuchen und die Ausdehnung von Blutplättchen zu visualisieren. Darüber hinaus wurde diese Methode durch die Visualisierung des äußeren kalvarialen kompakten Knochens sowie eines Teils des darunter liegenden Knochenmarks bereits in vielen Anwendungen außerhalb des Thrombozytenfeldes eingesetzt. Es wurde für die Untersuchung der Dynamik von Knochen- und Knochenmarkzellen in ihrer Umgebung verwendet, einschließlich Osteoblasten und Osteoklasten, Leukozytentransport und Markausgang, Endothelzellen und Mikrovaskulaturarchitektur, Blutflussdynamik in Markmikrowsgefäßen oder Zellhohweg24.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren danken Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Österreich) für seine fachkundige Beratung zu Zwei-Photonen-Mikroskopie-Experimenten zu der Zeit, als wir die Technik im Labor etablierten, und Yves Lutz vom Imaging Center IGBMC /CBI (Illkirch, Frankreich) für seine Expertise und Hilfe beim Zwei-Photonen-Mikroskop. Wir danken auch Jean-Yves Rinkel für seine technische Hilfe und Ines Guinard für die Zeichnung des Schemas in Abbildung 1. Wir danken ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) für die Unterstützung bei der Anschaffung des Zwei-Photonen-Mikroskops. AB wurde durch Postdoktorandenstipendien des Etablissement Français du Sang (APR2016) und der Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter - Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
References
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