In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Resumen

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Resumen

Las plaquetas son producidas por megacariocitos, células especializadas ubicadas en la médula ósea. La posibilidad de obtener imágenes de megacariocitos en tiempo real y su entorno nativo se describió hace más de 10 años y arroja nueva luz sobre el proceso de formación de plaquetas. Los megacariocitos extienden protuberancias alargadas, llamadas proplatletas, a través del revestimiento endotelial de los vasos sinusoides. Este artículo presenta un protocolo para obtener imágenes simultáneas en tiempo real de megacariocitos etiquetados fluorescentemente en la médula ósea del cráneo y los vasos sinusoides. Esta técnica se basa en una cirugía menor que mantiene el cráneo intacto para limitar las reacciones inflamatorias. La cabeza del ratón se inmoviliza con un anillo pegado al cráneo para evitar que los movimientos respiren.

Utilizando microscopía de dos fotones, los megacariocitos se pueden visualizar hasta por unas pocas horas, lo que permite la observación de protuberancias celulares y proplatlets en el proceso de elongación dentro de los vasos sinusoides. Esto permite cuantificar varios parámetros relacionados con la morfología de las protuberancias (anchura, longitud, presencia de zonas de constricción) y su comportamiento de elongación (velocidad, regularidad, o presencia de pausas o fases de retracción). Esta técnica también permite el registro simultáneo de plaquetas circulantes en los vasos sinusoides para determinar la velocidad plaquetaria y la dirección del flujo sanguíneo. Este método es particularmente útil para estudiar el papel de los genes de interés en la formación de plaquetas utilizando ratones modificados genéticamente y también es susceptible de pruebas farmacológicas (estudiar los mecanismos, evaluar medicamentos en el tratamiento de trastornos de producción de plaquetas). Se ha convertido en una herramienta invaluable, especialmente para complementar los estudios in vitro, ya que ahora se sabe que la formación de proplatlet in vivo e in vitro se basa en diferentes mecanismos. Se ha demostrado, por ejemplo, que los microtúbulos in vitro son necesarios para el alargamiento proplalet per se. Sin embargo, in vivo,más bien sirven como un andamio, el alargamiento es promovido principalmente por las fuerzas del flujo sanguíneo.

Introducción

Las plaquetas son producidas por células especializadas en megacariocitos ubicadas en la médula ósea. La forma precisa en que los megacariocitos liberan plaquetas en la circulación ha permanecido poco clara durante mucho tiempo debido al desafío técnico en la observación de eventos en tiempo real a través del hueso. La microscopía de dos fotones ha ayudado a superar este desafío y ha llevado a grandes avances en la comprensión del proceso de formación de plaquetas. Las primeras observaciones in vivo de megacariocitos fueron realizadas por von Andrian y sus colegas en 2007, con la visualización de megacariocitos fluorescentes a través del cráneo

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre ética de los experimentos con animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, acuerdo sobre instalaciones para animales N°: G67-482-10, acuerdo de proyecto N°: 2018061211274514).

1. Preparación de ratones e inserción de un catéter en la vena yugular

NOTA: Aquí, machos o hembras, ratones reporteros mTmG de 5-7 semanas de edad fueron utilizados (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)}cruzados c....

Resultados

Usando este protocolo, el trazador fluorescente, Qtracker-655, se administró por vía intravenosa para obtener imágenes de los vasos sinusoides de la médula ósea anastomosados en la médula ósea del cráneo y la dirección del flujo como se muestra en las flechas(Figura 4A,izquierda). Usando ratones mTmG, las plaquetas fluorescentes eGFP se registraron a lo largo de 20 s en cada rama del vaso, y su velocidad se midió utilizando el software ImageJ y GNU Octave(Figura 4A,

Discusión

Los mecanismos de formación de plaquetas son altamente dependientes del entorno de la médula ósea. Por lo tanto, la microscopía intravital se ha convertido en una herramienta importante en el campo para visualizar el proceso en tiempo real. Los ratones con megacariocitos fluorescentes se pueden obtener cruzando ratones que expresan la cre recombinasa en megacariocitos con cualquier ratón reportero floxed que contenga un casete de expresión génica fluorescente condicional. Aquí, se utilizaron ratones reporteros mTmG (B6.1.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
GNU Octave software	Proyecto		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0,5 mL	Braun	1050052	solución inyectable de pegamento quirúrgico
Detectores híbridos HyD Leica Microsystems 4tunes
		Se requiere una versión mínima Imalgene
Microscopio Leica SP8 MP DIVE equipado con un objetivo de agua de 25x, apertura numérica de 0,95	Excitación simultánea de Leica Microsystems		de AlexaFluor-488 y Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Pasta dental de silicona azul y amarillo
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 etiqueta vascular	Invitrogen	Q21021MP	solución inyectable
Escáner resonante, 8 o 12 kHz
Rompun Xilacina 2% fl/25 mL	Gel
Superglue			para pegar el anillo al hueso
Catéter Surflo IV - Azul 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Láser pulsante Saph (Coherente) (femtosegundo)	Coherente

GNU Proyecto ImageJ GNU de Leica Microsystems /Ketamine 1000 fl/10 mL Boehring 03661103003199 protección ocular Bayer 04007221032311