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Biology

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Published: July 28, 2021 doi: 10.3791/62515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

Summary

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Abstract

Las plaquetas son producidas por megacariocitos, células especializadas ubicadas en la médula ósea. La posibilidad de obtener imágenes de megacariocitos en tiempo real y su entorno nativo se describió hace más de 10 años y arroja nueva luz sobre el proceso de formación de plaquetas. Los megacariocitos extienden protuberancias alargadas, llamadas proplatletas, a través del revestimiento endotelial de los vasos sinusoides. Este artículo presenta un protocolo para obtener imágenes simultáneas en tiempo real de megacariocitos etiquetados fluorescentemente en la médula ósea del cráneo y los vasos sinusoides. Esta técnica se basa en una cirugía menor que mantiene el cráneo intacto para limitar las reacciones inflamatorias. La cabeza del ratón se inmoviliza con un anillo pegado al cráneo para evitar que los movimientos respiren.

Utilizando microscopía de dos fotones, los megacariocitos se pueden visualizar hasta por unas pocas horas, lo que permite la observación de protuberancias celulares y proplatlets en el proceso de elongación dentro de los vasos sinusoides. Esto permite cuantificar varios parámetros relacionados con la morfología de las protuberancias (anchura, longitud, presencia de zonas de constricción) y su comportamiento de elongación (velocidad, regularidad, o presencia de pausas o fases de retracción). Esta técnica también permite el registro simultáneo de plaquetas circulantes en los vasos sinusoides para determinar la velocidad plaquetaria y la dirección del flujo sanguíneo. Este método es particularmente útil para estudiar el papel de los genes de interés en la formación de plaquetas utilizando ratones modificados genéticamente y también es susceptible de pruebas farmacológicas (estudiar los mecanismos, evaluar medicamentos en el tratamiento de trastornos de producción de plaquetas). Se ha convertido en una herramienta invaluable, especialmente para complementar los estudios in vitro, ya que ahora se sabe que la formación de proplatlet in vivo e in vitro se basa en diferentes mecanismos. Se ha demostrado, por ejemplo, que los microtúbulos in vitro son necesarios para el alargamiento proplalet per se. Sin embargo, in vivo,más bien sirven como un andamio, el alargamiento es promovido principalmente por las fuerzas del flujo sanguíneo.

Introduction

Las plaquetas son producidas por células especializadas en megacariocitos ubicadas en la médula ósea. La forma precisa en que los megacariocitos liberan plaquetas en la circulación ha permanecido poco clara durante mucho tiempo debido al desafío técnico en la observación de eventos en tiempo real a través del hueso. La microscopía de dos fotones ha ayudado a superar este desafío y ha llevado a grandes avances en la comprensión del proceso de formación de plaquetas. Las primeras observaciones in vivo de megacariocitos fueron realizadas por von Andrian y sus colegas en 2007, con la visualización de megacariocitos fluorescentes a través del cráneo1. Esto fue posible porque la capa ósea en el cráneo frontoparietal de ratones adultos jóvenes tiene un grosor de unas pocas decenas de micras y es lo suficientemente transparente como para permitir la visualización de células fluorescentes en la médula ósea subyacente2.

Los estudios posteriores aplicaron este procedimiento para evaluar la formación de proplatlets en diversas condiciones y para descifrar los mecanismos subyacentes3,4,5,6. Estos estudios proporcionaron evidencia definitiva de que los megacariocitos extienden dinámicamente las protuberancias, llamadas proplatlets, a través de la barrera endotelial de los vasos sinusoides(Figura 1). Estos proplatlets se liberan como fragmentos largos que representan varios cientos de plaquetas en volumen. Las plaquetas se formarán después de la remodelación de los proplatlets en la microcirculación de los órganos aguas abajo, especialmente en los pulmones7. Hasta la fecha, sin embargo, el proceso preciso y los mecanismos moleculares siguen siendo objeto de debate. Por ejemplo, el papel propuesto de las proteínas citoesqueléticas en el alargamiento de los proplatlets difiere entre las condiciones in vitro e in vivo 3, y las diferencias en la formación de proplatlet se han demostrado en condiciones inflamatorias6. Para complicar aún más las cosas, un estudio reciente cuestionó el concepto impulsado por proplatelets y propuso que in vivo,las plaquetas se forman esencialmente a través de un mecanismo de gemación de membrana en el nivel de megacariocitos8.

Este trabajo presenta un protocolo para la observación de megacariocitos y proplatlets en la médula ósea a partir del hueso del cráneo en ratones vivos, utilizando un procedimiento mínimamente invasivo. Se han descrito enfoques similares para visualizar otras células de la médula, en particular las células madre y progenitoras hematopoyéticas9. El enfoque aquí está en la observación de megacariocitos y plaquetas para detallar algunos parámetros que se pueden medir, en particular las morfologías propallet y la velocidad plaquetaria. Este protocolo presenta cómo insertar un catéter en la vena yugular para inyectar trazadores fluorescentes y medicamentos y observar a través del hueso del cráneo. El hueso calvarial se expone mediante cirugía menor para que se pegue un anillo al hueso. Este anillo sirve para inmovilizar la cabeza y evitar movimientos debidos a la respiración y formar una copa llena de solución salina como medio de inmersión de la lente. Esta técnica es muy adecuada para i) observar en tiempo real la geometría sinusoide y los megacariocitos interactuando con la pared del vaso; ii) seguir a los megacariocitos en el proceso de formación, elongación y liberación de proplatlet; y iii) medir los movimientos plaquetarios para monitorear el flujo sanguíneo sinusoide complejo. Los datos obtenidos mediante este protocolo han sido publicados recientemente3.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre ética de los experimentos con animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, acuerdo sobre instalaciones para animales N°: G67-482-10, acuerdo de proyecto N°: 2018061211274514).

1. Preparación de ratones e inserción de un catéter en la vena yugular

NOTA: Aquí, machos o hembras, ratones reporteros mTmG de 5-7 semanas de edad fueron utilizados (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)cruzados con ratones Pf4-cre11,permitiendo el etiquetado de fluorescencia verde intenso en megacariocitos y plaquetas12. Antes de comenzar el experimento, precaliente la cámara de calentamiento del microscopio durante unas horas.

  1. Transporte el ratón a la sala de imágenes y proceda a la anestesia.
    1. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución de ketamina (ketamina (100 μg/g) y xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
      NOTA: La administración repetida de ketamina/xilazina se utiliza aquí y funciona bien, pero requiere la interrupción del registro para la reinyección regular. Alternativamente, si se dispone de una máquina de anestesia, la inducción de la anestesia puede realizarse con ketamina/xilazina y posteriormente mantenerse bajo inhalación de gases (mezcla de isoflurano, aire y oxígeno).
    2. Reemplace al animal en su jaula hasta que alcance la anestesia profunda. Coloque el ratón sobre una placa calentada calentada a 37 °C para todas las manipulaciones posteriores.
      NOTA: Mientras el animal alcanza la anestesia profunda, encienda el microscopio y todo el equipo (ver sección 4.1) y configure los diferentes parámetros necesarios (ver sección 4.2) para iniciar el experimento una vez realizada la cirugía. Aquí, el procedimiento dura solo 3 h y es terminal. El ratón es sacrificado después del experimento sin despertarse. Por lo tanto, la desinfección con etanol para la piel y los instrumentos es suficiente. Sin embargo, dependiendo de las pautas institucionales, o si el procedimiento duraría más tiempo, se deben utilizar métodos de desinfección más completos, como tres exfoliantes alternos con betadina / povidona y alcohol.
  2. Instale un catéter en la vena yugular.
    NOTA: Es importante evitar la contaminación microbiana durante la cirugía en la medida de lo posible. Tenga cuidado de desinfectar cuidadosamente la piel con etanol al 70% (EtOH) antes de proceder con la cirugía. Siempre use tijeras y pinzas esterilizadas, y enjuáguelas regularmente en 70% EtOH. Trabaje en un lugar limpio y use una máscara facial. Se utiliza un catéter de 22 G "sobre la aguja", que consiste en una aguja dentro de un tubo de plástico, para la inyección intravenosa (consulte la Tabla de materiales).
    1. Coloque el ratón sobre su espalda y fije las patas anteriores con cinta quirúrgica para estirar la garganta (Figura 2A). Desinfectar la garganta con etanol al 70%.
      NOTA: Para mayor comodidad, la garganta se puede afeitar antes de la cirugía. Si el procedimiento dura más tiempo, se debe realizar un afeitado cuidadoso para una técnica aséptica adecuada.
    2. Haga una incisión de 0.7-1 cm sobre la vena yugular derecha o izquierda usando tijeras estériles. Estirar el tejido conectivo adyacente para exponer la vena yugular externa y la parte superior del músculo pectoral (Figura 2A).
    3. Llene el catéter con solución salina fisiológica tibia y estéril. Inserte el catéter en la vena después de penetrar a través del músculo pectoral (Figura 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de evitar burbujas de aire dentro del catéter. Es importante insertar el catéter a través del músculo para prevenir la hemorragia, ya que el músculo formará un punto de compresión. Incluso los ratones con defectos de hemostasia, como los ratones Itgb3-/-, no sangran al insertar el catéter con este enfoque.
    4. Retire suavemente la aguja y, si es necesario, mueva con cuidado el catéter más profundamente en la vena. Conecte la jeringa y estabilice el catéter agregando una gota de pegamento quirúrgico (Tabla de Materiales).
      NOTA: Es posible insertar un catéter dentro de la vena de la cola, aunque requiere algo de práctica porque la vena tiene un calibre más pequeño. Esto es especialmente difícil cuando se usan ratones con cabello oscuro, cuya vena de la cola apenas es visible. Debido a su mayor calibre, colocar el catéter dentro de la vena yugular puede permitir que se inyecten volúmenes más grandes o tratamientos repetidos de manera más confiable. Tenga en cuenta que la jeringa se llena por primera vez con solución salina tibia, y no olvide inyectar el volumen muerto antes de inyectar la solución de medicamento.
    5. Devuelva con cuidado el ratón a una posición prona (Figura 2C). Aplicar gel (Tabla de Materiales) en los ojos para prevenir la sequedad.

2. Cirugía e instalación del anillo craneal

NOTA: El soporte completo para la instalación del ratón comprende 4 piezas, un bloque y una placa, el anillo para sostener la cabeza del ratón y un tornillo para fijar el anillo al bloque(Figura 3A). Todos los elementos del soporte se han obtenido de i.materialise.com mediante impresión 3D. La placa está hecha de polímero de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), el bloque y el tornillo de acero inoxidable, y el anillo de acero inoxidable de alta calidad (acero inoxidable de alto detalle) (Consulte la Figura suplementaria S1 para dimensiones y materiales suplementarios para los archivos de impresión 3D). El bloque se fija permanentemente al soporte, ya sea atornillado o pegado. Una vez que el anillo se fija en el cráneo del ratón, debe atornillarse al soporte del bloque (Figura 3A).

  1. Humedezca el cabello en el cuero cabelludo con una toalla de papel mojada con etanol al 70% para la desinfección. Retire todo el cabello suelto con una toalla de papel mojada.
    NOTA: Para mayor comodidad, el cuero cabelludo puede afeitarse antes de la cirugía.
  2. Incise el cuero cabelludo formando una T en la línea media hasta 1 cm y entre las orejas para exponer el calvario utilizando tijeras y pinzas finas estériles.
    NOTA: El anillo se colocará para superponerse a los huesos frontal y parietal (Figura 3B).
  3. Use pinzas estériles para exponer el cráneo. Retire con cuidado el periostio con tijeras y pinzas. Use un hisopo de algodón estéril empapado con solución salina fisiológica para eliminar todo el periostio y cualquier residuo o cabello, lo que podría alterar las imágenes.
    NOTA: Para limitar las reacciones inflamatorias, tenga mucho cuidado de no dañar el hueso.
  4. Elimine cualquier rastro de sangre enjuagando con solución salina y seque rápidamente el hueso con un hisopo de algodón seco. Aplique el gel de pegamento al anillo, colóquelo sobre el hueso expuesto y manténgalo durante unos segundos para que el anillo esté firmemente unido al cráneo.
    NOTA: Ningún pegamento debe entrar en el campo de observación, ya que puede conducir a una autofluorescencia indeseable.
  5. Humedezca ligeramente el cráneo con un hisopo de algodón sumergido en solución salina fisiológica.
  6. Prepare la pasta dental de silicio mezclando cuidadosamente los componentes azules y amarillos 1: 1. Aplique pasta dental alrededor del anillo para sellar y evitar fugas durante las imágenes. Retire con cuidado cualquier pasta dental o pegamento que pueda haber entrado en el anillo.
  7. Llene el anillo con solución salina y verifique si hay fugas.
    NOTA: La solución salina sirve como medio de inmersión para el objetivo del microscopio. El sangrado puede ser más crítico cuando se usan ratones con defectos relacionados con la hemostasia. Es esencial evitar que la sangre entre en el anillo, ya que puede difuminar más imágenes.
  8. Coloque el ratón sobre el soporte y atornille el anillo en el soporte del bloque (Figura 3C). Coloque compresas dobladas debajo de la cabeza del animal para levantar la cabeza y evitar el desprendimiento del anillo del cráneo.
    NOTA: La cabeza está fijada directamente para evitar los movimientos de imagen debido a la respiración.
  9. Coloque el soporte y el conjunto del ratón en la cámara del microscopio calentada(Figura 3D).
    NOTA: Tenga cuidado de no desalojar el catéter insertado en ningún momento.

3. Seguimiento de los ratones anestesiados hasta el final del experimento

NOTA: La anestesia se reinduce cada 35 min alternando inyecciones subcutáneas (s.c.) de ketamina (25 μg/g) en un volumen de 5 μL/g de peso corporal y una mezcla de ketamina (50 μg/g) y xilazina (5 μg/g) (1,2 μL/g). Como no es posible abrir la cámara del microscopio calentada durante la adquisición, se realiza un monitoreo anestésico antes y después de la administración del anestésico mediante pellizco del dedo del pie. Del mismo modo, el pellizco del dedo del dedo del dedo del día se realiza antes de comenzar cada nueva grabación de video.

  1. Si es necesario, detenga la adquisición y vuelva a inducir la anestesia mediante inyección de s.c.
    1. Teniendo cuidado de no mover la cabeza del ratón, pellizque la piel de la espalda entre el pulgar y el dedo índice de la mano izquierda. Inyecte por vía subcutánea el anestésico en el pliegue de la piel de la espalda con la mano derecha (o viceversa para las personas zurdas).
  2. Verifique la presencia de solución salina en el anillo y, si es necesario, llénelo con solución salina fresca. Continúe grabando durante los próximos 35 minutos y proceda de manera similar durante la duración de la grabación.
  3. Al final del experimento, eutanasia al ratón por dislocación cervical antes de que se despierte.
    NOTA: El ratón se mantiene anestesiado durante un tiempo máximo de 3 h, de acuerdo con el comité ético y de bienestar animal local.

4. Imágenes de dos fotones

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el microscopio y el equipo relacionado. Las imágenes se grabaron con un escáner resonante (12 u 8 kHz). El modo bidireccional se configuró para aumentar la adquisición de velocidad a medida que los píxeles se registran en ambas direcciones; por lo tanto, cualquier desajuste en la fase debe corregirse con la "corrección de fase" del panel de control. Finalmente, se estableció un promedio adaptado como un compromiso entre la velocidad de adquisición y la relación señal-ruido.

  1. Encienda el microscopio de dos fotones, incluido el láser y el escáner resonante (la potencia del láser de salida generalmente ~ 1.8-2.5 W dependiendo del láser).
  2. Establezca la longitud de onda láser adecuada para los fluoróforos elegidos. Establezca la longitud de onda adecuada para la recuperación de las luces emitidas.
    NOTA: Aquí, se utilizó una longitud de onda de 913 nm y detectores híbridos (500-550 nm y 575-625 nm) para excitar y detectar simultáneamente AlexaFluor-488 y Qtracker-655, respectivamente.
  3. Usando el catéter intrayugular, inyecte el marcador fluorescente para etiquetar la vasculatura (Qtracker-655; Tabla de Materiales). Inyectar 50 μL/ratón de una solución a 0,2 μM, renovada una vez cada hora para un máximo de 150 μL/experimento.
    NOTA: Se pueden utilizar otros trazadores como el dextrano1de alto peso molecular. En ese caso, considere que la viscosidad de la sangre puede ser alterada por el dextrano y modifique algunos parámetros hemorreológicos.
  4. Coloque la etapa del microscopio con el soporte y el mouse debajo del objetivo del microscopio. Revisa que el anillo esté siempre lleno de solución salina y sumerge el objetivo. Use la epifluorescencia para localizar los vasos de la médula ósea (rojo) y la presencia de megacariocitos (verde) alineados a lo largo de los vasos sinusoides.
    NOTA: El hueso del cráneo tiene un grosor inferior a 100 μm2. La médula se encuentra debajo del hueso y es fácilmente reconocible por los megacariocitos verdes fluorescentes y los densos vasos sinusoides anastomosados rojos etiquetados por Qtracker-655.
  5. Adquisiciones largas (megacariocitos, proplatlets)
    1. Busque la región de interés. Aplique los parámetros de adquisición de imágenes como se mencionó anteriormente.
    2. Para adquisiciones largas (por ejemplo, visualización de la formación o elongación de proplatelets), adquiera imágenes de pila z con intervalos optimizados (generalmente entre 0,85 y 1,34 μm) utilizando un escáner resonante de 8 kHz.
      NOTA: Un escáner resonante de 12 kHz puede aumentar la velocidad de adquisición.
    3. Adquiere imágenes de 384 x 384 píxeles para visualizar todo el megacariocito y la vasija. Utilice el promedio de línea, según lo desee, para una adquisición rápida con buena resolución. Determine el intervalo de tiempo de adquisición de la pila de imágenes, generalmente 10 s o 30 s para la visualización de proplatelets.
      NOTA: Aquí, se utilizó un promedio de línea de 8 para obtener una mayor relación señal-ruido, lo que permitió la adquisición de 1 imagen/10 s con un escáner resonante de 8 kHz. Asegúrese de que se permita el promedio de línea durante la adquisición en vivo.
  6. Adquisición corta y rápida (plaquetas)
    NOTA: Para una adquisición más corta de eventos rápidos, como la velocidad plaquetaria, es esencial maximizar la velocidad de adquisición de fotogramas. La selección del tipo de adquisición adecuado optimizará la velocidad de adquisición de fotogramas (es decir, un tipo de adquisición espacio-temporal "xyt").
    1. Minimice (por ejemplo, 256 x 90 píxeles) y ajuste el tamaño de la imagen al recipiente girando el campo de imágenes, si es necesario.
    2. Utilice la velocidad de escaneo más alta disponible.
    3. Utilice el escaneo bidireccional.
      NOTA: Para el escaneo bidireccional, asegúrese de que la fase esté bien ajustada.
    4. Minimice el promedio de línea para encontrar el compromiso óptimo entre la definición de la imagen y la rapidez de adquisición.
      NOTA: Para las mediciones de la velocidad de las plaquetas, una imagen pixelada puede ser suficiente si ayuda a aumentar la rapidez de adquisición.
    5. Minimice la pila z para aumentar la rapidez de adquisición. Adquirir solo 1 pila z es suficiente para cuantificar la velocidad plaquetaria. Adquirir durante 10-20 s para medir la velocidad plaquetaria.
      NOTA: Se puede obtener un máximo de 133 fotogramas/s utilizando estas condiciones con un escáner resonante de 12 kHz. Los parámetros deben adaptarse a las condiciones. En algunos vasos, la velocidad plaquetaria es, sin embargo, demasiado alta para cuantificar la velocidad plaquetaria con estos ajustes de manera confiable.
  7. Medición de ancho y largo de proplatelet
    NOTA: Para cargar los archivos LIF obtenidos en el software Leica con ImageJ, primero descargue e instale el complemento LOCI en ImageJ para utilizar el Importador de bioformatos.
    1. Ancho del proplatelet
      1. Abra la película con ImageJ. Para realizar la medición de anchura, use solo la película de los proplatelets sin el recipiente. Para separar los diferentes canales, haga clic en Imagen| Colorea y selecciona Dividir canales.
      2. Para una película de pila z, haga una proyección z promedio para cada punto de tiempo haciendo clic en Imagen| Pilas y seleccione Proyecto Z. En Tipo de proyección, introduzca Intensidad media.
      3. Trate la imagen para eliminar el ruido. Reste el fondo haciendo clic en Proceso| Reste el fondo y aplique el radio de la bola rodante: 50.0 píxeles. Suaviza la imagen haciendo clic en Procesar y Suavizar.
      4. Traza una línea cerca de la base del proplatelet (cerca del megacariocito, evitando cualquier otro objeto).
        NOTA: No olvide establecer la escala de la imagen para obtener el valor en la unidad deseada haciendo clic en Analizar y Establecer escala. De forma predeterminada, la unidad de la imagen está en píxeles.
      5. Traza el perfil de intensidad, ajusta una curva gaussiana y calcula el ancho completo a medio máximo (FWHM). Para eso, escriba el siguiente script en una macro haciendo clic en Plugins| Nuevo y seleccione Macro y ejecutarlo haciendo clic en Macro| Ejecutar macro: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussiano",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; imprimir (FWHM).
        NOTA: Asegúrese de que solo haya un pico en el escaneo de línea, correspondiente a la intensidad del proplatelet.
      6. Realice las acciones descritas en el paso 4.7.5 en 1 segmento o repita a lo largo del tiempo para obtener el ancho medio del proplatelet
    2. Longitud del proplatelet
      1. Traza una línea a lo largo del proplatelet, desde la base cerca del megacariocito hasta la parte superior. Utilice una línea segmentada para seguir la forma proplatelet. Repítelo para cada punto de tiempo.
      2. Recuerda guardar cada línea usando el ROI Manager: haz clic en Analizar | Herramientas y seleccione ROI Manager. Haga clic en Agregar en la ventana ROI Manager para agregar cada línea al administrador tal como está seleccionado. Para guardar todas las líneas de una carpeta, haga clic en el Administrador de ROI al anular la selección | Más y haga clic en Guardar. Desde el Gestor de ROI, extraiga el valor de longitud de cada línea (Medida) de la tabla de resultados.
        NOTA: No olvide establecer la escala de la imagen para obtener el valor en las unidades deseadas haciendo clic en Analizar y Establecer escala. De forma predeterminada, la unidad de la imagen está en píxeles.
  8. Medición de la velocidad plaquetaria
    NOTA: La velocidad plaquetaria se calcula a partir de la grabación de video de plaquetas fluorescentes que fluyen dentro del vaso durante 10-20 s. Se realiza un tratamiento de primera imagen para obtener datos de escaneo de línea repetidos cíclicamente. El movimiento conduce a rayas cuyo ángulo depende de la velocidad, lo que permite su cálculo. Aquí, la velocidad se calculó con un método que utiliza la transformada de radón, que es más robusta que el método clásico de descomposición del valor singular (SVD)15.
    1. Tratamiento de imágenes con ImageJ
      1. Abra la película con ImageJ. Aplicar un filtro de desenfoque gaussiano haciendo clic en Procesar | Filtros, seleccione Desenfoque gaussianoy aplique Sigma (Radio): 2.00. Elija una región pequeña para medir el flujo y trace 3 líneas adyacentes siguiendo la dirección del flujo.
        NOTA: No olvide guardar cada línea utilizando el Administrador de ROI haciendo clic en Analizar | Herramientas | Gestor de ROI. Haga clic en Agregar en la ventana de ROI Manager para agregar cada línea y guardarlas; haga clic primero en Anular selección | Más y luego haga clic en Guardar.
      2. Usando el software de escaneo de línea ImageJ, cree un kymograph para cada línea haciendo clic en Image | Pilas; seleccione Reslice y aplique los siguientes parámetros: Espaciado de salida (micras): 1.000 / Recuento de segmentos: 1 / Evitar interpolación. Guarde las imágenes espacio-tiempo resultantes.
        NOTA: La imagen resultante muestra rayas correspondientes al movimiento lineal de las plaquetas en el flujo sanguíneo a lo largo del tiempo. El ángulo de una raya es una función de la velocidad.
    2. Medición de velocidad con el software Matlab o GNU Octave
      NOTA: La velocidad de las plaquetas en el flujo sanguíneo se estima a partir de las imágenes espacio-temporales utilizando un método de análisis computacional basado en la transformada de radón descrita por Drew y colaboradores15. La descripción de este método matemático está más allá del alcance de esta revisión, y el lector es referido a la publicación de Drew et al. para obtener detalles sobre el cálculo15. Tanto el código de Matlab como más información están disponibles en su sitio web https://www.drew-lab.org/code.
      1. Abra el código usando el software Matlab o GNU Octave.
        NOTA: El código puede requerir adaptación de acuerdo con el estudio deseado.
      2. Extraiga el valor de las 3 imágenes espacio-temporales, correspondientes a las líneas adyacentes dibujadas en la misma porción del buque. Calcule el valor medio de la velocidad del flujo plaquetario para esta porción del vaso.
        NOTA: No olvide convertir el resultado en la unidad de medida correcta (por ejemplo, μm/s).

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Representative Results

Usando este protocolo, el trazador fluorescente, Qtracker-655, se administró por vía intravenosa para obtener imágenes de los vasos sinusoides de la médula ósea anastomosados en la médula ósea del cráneo y la dirección del flujo como se muestra en las flechas(Figura 4A,izquierda). Usando ratones mTmG, las plaquetas fluorescentes eGFP se registraron a lo largo de 20 s en cada rama del vaso, y su velocidad se midió utilizando el software ImageJ y GNU Octave(Figura 4A,derecha). Nótese la heterogeneidad en la velocidad y dirección del flujo. Los vasos sinusoides presentan flujos complejos debido a las anastomosis, con presencia de flujo-reflujo e incluso estasis, como se muestra en la bifurcación registrada en el Video 1. La misma bifurcación se muestra en la Figura 4B (izquierda), con las flechas rojas y azules resaltando los flujos opuestos. La velocidad plaquetaria en esta bifurcación ha sido medida e informada en el gráfico(Figura 4B,derecha). El trazado rojo corresponde a la velocidad en la rama izquierda del vaso y el trazado azul a la de la rama derecha del buque. Esto muestra irregularidad a lo largo del tiempo en cada rama del vaso, con fases de aceleración, estasis y desaceleración. Es importante tener en cuenta que en algunos vasos, el flujo sanguíneo fue demasiado rápido para un análisis confiable en las condiciones actuales de adquisición.

El registro de alargamiento de proplatelets permite la visualización de sus diversas morfologías a lo largo del tiempo (Figura 5). Algunos proplalets se alargan con morfologías irregulares(Figura 5Ai y Video 2). Otros, generalmente más delgados, pueden extenderse a largas distancias que requieren el movimiento de la ventana de adquisición para seguir su extensión(Figura 5Aii y Video Suplementario 1). Otros son más cortos y gruesos y generalmente se alargan lentamente(Figura 5Aiii y Video Suplementario 2). Cuando los megacariocitos extienden proplalets en áreas de flujos complejos, como la bifurcación que se muestra en la Figura 4B,los proplatlets se lanzan de una rama de vaso a la otra de acuerdo con la dirección del flujo(Figura 5B y Video 3). La importancia de las fuerzas hemodinámicas para el alargamiento proplatelet en la dirección del flujo se evidenció cuando el ratón sufrió inesperadamente un paro cardíaco. Detener el flujo sanguíneo relajó los proplatlets extendidos por el megacariocito(Figura 5C y Video 4).

Cuando la calidad/resolución de adquisición es adecuada, se pueden medir parámetros morfológicos, como la longitud de los proplatlets hasta el desprendimiento, su anchura en la base del proplalet o cualquier otro lugar definido, o el tamaño de las yemas (Figura 6A). Se calculó una longitud máxima media de proplatelet de ~185 μm (rango 41.5-518.5 μm) y una anchura media de proplatelet de 5.2 μm (rango 2.8-8 μm) (Figura 6A). Trazar la longitud del proplatelet en función del tiempo permite la visualización del comportamiento de los proplatelets durante las fases de elongación, estasis o incluso retracción(Figura 6B). La medición de la velocidad de elongación de los proplatlets es un parámetro importante, que refleja directamente el comportamiento de elongación, estasis o retracción de los proplatlets3.

La velocidad de elongación del proplato se puede medir si el proplatelet permanece unido a su célula madre; una vez desprendido, será inmediatamente arrastrado por el flujo y desaparecerá de la ventana de visualización. En ratones de tipo salvaje (WT), la velocidad media de elongación proplatelet fue de ~10 μm/min(Figura 6C),de acuerdo con publicaciones anteriores1. Finalmente, es posible inyectar medicamentos a través del catéter insertado en la vena yugular. Por ejemplo, se ha observado que la administración intravenosa de vincristina, un fármaco que despolimeriza los microtúbulos, condujo a la retracción de los proplatelets de los ratones WT, pero no tuvo ningún efecto sobre los proplatlets de ratones deficientes en miosina IIA(Myh9-/-) (Video 5 y Video 6)3.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática de la formación de proplatelet en la médula ósea. Después de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas, los megacariocitos grandes se alinean a lo largo de los vasos sinusoides y extienden las proyecciones citoplasmáticas, llamadas proplatlets, a través de la barrera endotelial. Los proplatlets se alargan y se desprenden bajo la influencia de las fuerzas hemodinámicas para remodelarse aún más en plaquetas en la microcirculación aguas abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Inserción del catéter. (A) Se realiza una incisión para exponer la vena yugular y la parte superior del músculo pectoral. (B) El catéter lleno de solución salina se inserta en la vena yugular pasando a través del músculo, creando un punto de compresión. (C) El ratón se gira cuidadosamente para que se encuentre en la superficie ventral hacia abajo con el catéter bien posicionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Configuración experimental utilizada para imágenes de dos fotones a través del hueso del cráneo. (A) El bloque de acero inoxidable impreso en 3D se fija en el soporte de polímero ABS (consulte la Figura suplementaria S1 y Materiales suplementarios para los diseños 3D). El bloque y el anillo del cráneo están diseñados para que el anillo se pueda atornillar al bloque. Tenga en cuenta que, para facilitar su uso, la cabeza del tornillo se ha incrustado en Epon. (B) Esquema que muestra la posición del anillo en el hueso del cráneo expuesto. (C) Fotografías que ilustran el ratón con el anillo pegado al cráneo, la cabeza en una almohadilla de tejido, y (D) el posicionamiento bajo el objetivo del microscopio. Abreviaturas: 3D = tridimensional; ABS = acrilonitrilo butadieno estireno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Medida de la velocidad plaquetaria en los vasos sinusoides anastomosados de la médula ósea del cráneo. (A) Izquierda, imágenes de dos fotones de los vasos sinusoides etiquetados por inyección Q-Dot. z-proyección que muestra la anastomosis de los vasos sinusoides en la médula ósea del cráneo. Las flechas indican la dirección del flujo, ilustrando la complejidad de los flujos en los sinusoides. Derecha, velocidad media del flujo estimada por la medición de la velocidad plaquetaria en cada rama del vaso. Los números en el eje x corresponden a los números de flecha en la imagen de la izquierda. (B) Izquierda, bifurcación sinusoide delineada por líneas punteadas, que muestran plaquetas que fluyen en direcciones opuestas (flechas rojas y azules) (correspondiente al Video 1). Imagen de un solo plano de dos fotones. A la derecha, un gráfico que muestra la velocidad del flujo en cada porción del vaso en función del tiempo (línea roja, lado izquierdo; línea azul, lado derecho), que muestra las fases de estasis, aceleración y desaceleración. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Diversas morfologías proplatlet observadas en la médula del cráneo mediante microscopía de dos fotones. (A) Tres proplatados representativos in vivo: imágenes de proyección z de experimentos de lapso de tiempo (que se muestran en el Video 2,Video Suplementario 1y Video Suplementario 2)que muestran las diversas morfologías de los proplatlets (flechas) que se extienden dentro de los sinusoides de la médula ósea. Los proplatlets y los megacariocitos están en verde; los vasos sinusoides están en rojo. (B)Imágenes de lapso de tiempo de un proplatelet en la misma bifurcación que en la Figura 4B,oscilando según la dirección del flujo (también se muestra en el Video 3). (C) imágenes de lapso de tiempo de proyección z que muestran la relajación de 3 proplatelets después del cese del flujo sanguíneo debido a un paro cardíaco del ratón (mostrado en el Video 4),previamente alineados en la misma línea de flujo (indicado por las flechas blancas, amarillas y azules). Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Análisis morfológicos de proplatelets. (A) Imagen superior de proyección z que representa el sitio donde se midió el ancho de proplatelet junto con la longitud máxima; a continuación se muestran gráficos que representan la longitud máxima de 25 proplatelets individuales y el ancho medio de proplatelets de los mismos proplatelets (mismo código gris) a lo largo de la elongación. i) El ancho del proplatelet se midió dibujando una línea perpendicular en una posición fija cerca de la base del proplatelet, y la intensidad del perfil se registró en esta posición cada minuto. Se ajustó una curva gaussiana a este perfil, y se consideró que el FWHM representaba el ancho del proplatelet. El ancho medio se calculó promediando los anchos del proplatelet medidos en cada punto de tiempo en la posición fija. Las barras son medias ± sem del ancho medido cada minuto durante la adquisición; ii) también se determinó la longitud máxima del proplatelet, desde la base del proplatelet hasta su punta. (B) Trazados individuales que muestran el comportamiento de alargamiento de los proplatelets WT, algunos de ellos presentando fases de pausa y retracción. Para resaltar mejor las pausas y retracciones en el proceso de crecimiento del proplatelet, la longitud medida cada 10 s se representó como un porcentaje de la longitud máxima de cada proplatelet. (C) Diagrama de dispersión que representa la velocidad de elongación del proplatelet. La velocidad media neta de elongación del proplatelet (incluidas las pausas y retracciones) se calculó como el cambio en la longitud del proplatelet a intervalos de 1 min, promediado durante toda la secuencia de tiempo. Valores individuales y media ± sem. Abreviaturas: FWHM = Ancho completo a la mitad máximo; sem = error estándar de la media; WT = tipo salvaje.

Video 1: Flujo inverso dentro de los vasos sinusoides. Plaquetas circulantes (verde) dentro de los vasos sinusoides (rojo, Qtracker) (plano z confocal único). Se muestra un vaso sinusoide anastomosado que presenta bifurcaciones donde el flujo es inestable y muestra fases de estasis, aceleración y desaceleración. Adquirido con un microscopio Leica SP5 equipado con un escáner resonante de 12 kHz y un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0.95 (Leica), un plano, 256 x 90 píxeles, adquisición bidireccional, línea con un promedio de 2, 133 cuadros / s. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Los proplatelets alargados muestran varias morfologías. Grabación de vídeo de lapso de tiempo representativo (proyección z) en un ratón WT con megacariocitos que extienden proplatlets con diversas morfologías (verde) dentro de los sinusoides de la médula ósea (rojo, Qtracker). Adquirido con un microscopio Leica SP5 equipado con un escáner resonante de 12 kHz y un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0.95 (Leica), adquisición z-stack a intervalos de 10 s, profundidad z de 4 μm, resolución x-y 384 x 384 píxeles, línea promedio 8. Siempre que fue necesario, los perfiles se alinearon utilizando el complemento de coincidencia de plantillas ImageJ para obtener una proyección z promedio. Dependiendo de la calidad de la imagen, se restó el fondo, se suavizó la imagen y se ajustaron el brillo y el contraste. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: Los proplatelets son desnzados por cambios en la dirección del flujo. Video de lapso de tiempo que muestra un megacariocito de tipo salvaje en la bifurcación sinusoide que se muestra en el Video 1,en el proceso de extender un proplatelet que oscila en una rama del vaso dependiendo de la dirección del flujo (proyección z). Adquirido con un microscopio Leica SP5 equipado con un escáner resonante de 12 kHz y un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0.95 (Leica), adquisición z-stack a intervalos de 10 s, profundidad z de 4 μm, resolución x-y 384 x 384 píxeles, línea promedio 8. Los perfiles se alinearon utilizando el complemento de coincidencia de plantillas ImageJ y se obtuvo una proyección z promedio. Se restó el fondo, se suavizó la imagen y se ajustaron el brillo y el contraste. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 4: Impacto del flujo en la alineación y tensión de los proplatlets. Grabación de video de lapso de tiempo de un proplatelet antes y después de un paro cardíaco. El video muestra tres proplatlets (verdes, etiquetados con el derivado de anticuerpos anti-GPIX AF-488) en la misma línea de flujo antes del paro cardíaco, por lo tanto, mal individualizados a la resolución de la microscopía de dos fotones. Después de un paro cardíaco, los tres proplatlets se separan y se relajan en ausencia de flujo sanguíneo. Video adquirido con un microscopio confocal Leica SP8 equipado con un escáner resonante de 8 kHz, imagen con un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0.95 (Leica). Los perfiles se alinearon utilizando el complemento de coincidencia de plantillas ImageJ y se obtuvo una proyección z promedio. Se restó el fondo, se suavizó la imagen y se ajustaron el brillo y el contraste. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 5: Impacto de la inyección de drogas de vincristina en el comportamiento proplatelet de ratones WT. Grabación de vídeo time-lapse de un proplatelet antes y después de la administración de vincristina (1 mg/kg) (proyección z). El proplatelet alargado (verde) dentro de los vasos sinusoides (rojo) comienza a retraerse después de la administración intravenosa de vincristina. El video fue adquirido con un microscopio confocal Leica SP8 equipado con un escáner resonante de 8 kHz, imagen con un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0.95 (Leica). El perfil se alineó utilizando el complemento de coincidencia de plantilla ImageJ y se obtuvo una proyección z promedio. Se restó el fondo, se suavizó la imagen y se ajustaron el brillo y el contraste. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 6: Impacto de la inyección de medicamentos con vincristina en el comportamiento proplatelet de ratones con deficiencia de miosina. Grabación de vídeo time-lapse de un proplatelet antes y después de la administración de vincristina (1 mg/kg) (proyección z). El proplatelet alargado (verde) dentro de los vasos sinusoides (rojo) continúa alonándose en los ratones Myh9-/-. El video fue adquirido con un microscopio confocal Leica SP8 equipado con un escáner resonante de 8 kHz, imagen con un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0.95 (Leica). El perfil se alineó utilizando el complemento de coincidencia de plantilla ImageJ y se obtuvo una proyección z promedio. Se restó el fondo, se suavizó la imagen y se ajustaron el brillo y el contraste. Haga clic aquí para descargar este video.

Figura suplementaria S1: Diseño para la impresión 3D del anillo y soporte del cráneo. Este diseño se utilizó para imprimir en 3D (A) el anillo del cráneo en acero inoxidable de alta calidad, (B) el tornillo, (C) el bloque en acero inoxidable, y (D) el soporte en polímero ABS. Abreviaturas: 3D = tridimensional; ABS = ABS = acrilonitrilo butadieno estireno. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Videos complementarios:

Video suplementario 1: Grabación de video de lapso de tiempo representativo (proyección z) en un ratón de tipo salvaje con megacariocitos que extienden proplatelet (verde) dentro de los sinusoides de la médula ósea (rojo, Qtracker). Adquirido con un microscopio Leica SP5 equipado con un escáner resonante de 12 kHz y un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0,95 (Leica), adquisición de pila z a intervalos de 10 s, profundidad z de 1,34 μm, resolución x-y 384 x 384 píxeles, línea promedio 8. Siempre que fue necesario, el perfil se alineó utilizando el complemento de coincidencia de plantillas ImageJ para obtener una proyección z promedio. Dependiendo de la calidad de la imagen, se restó el fondo, se suavizó la imagen y se ajustaron el brillo y el contraste. Haga clic aquí para descargar este video.

Video suplementario 2: Grabación de video de lapso de tiempo representativo (proyección z) en un ratón de tipo salvaje con megacariocitos que extienden proplatelet (verde) dentro de los sinusoides de la médula ósea (rojo, Qtracker). Adquirido con un microscopio Leica SP5 equipado con un escáner resonante de 12 kHz y un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0,95 (Leica), adquisición de pila z a intervalos de 10 s, profundidad z de 1,34 μm, resolución x-y 384 x 384 píxeles, línea promedio 8. Siempre que fue necesario, el perfil se alineó utilizando el complemento de coincidencia de plantillas ImageJ para obtener una proyección z promedio. Dependiendo de la calidad de la imagen, se restó el fondo, se suavizó la imagen y se ajustaron el brillo y el contraste. Haga clic aquí para descargar este video.

Materiales complementarios:

Archivo de codificación 1: Bloque de impresión 3D. Archivo de objeto 3D para la impresión del bloque. Haga clic aquí para descargar este archivo de codificación.

Archivo de codificación 2: Impresión 3D-Anillo de calavera. Archivo de objeto 3D para la impresión del anillo del cráneo. Haga clic aquí para descargar este archivo de codificación.

Archivo de codificación 3: Soporte de impresión 3D. Archivo de objeto 3D para la impresión del soporte. Haga clic aquí para descargar este archivo de codificación.

Archivo de codificación 4: Impresión 3D-Anillo de tornillo. Archivo de objeto 3D para la impresión del tornillo. Haga clic aquí para descargar este archivo de codificación.

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Discussion

Los mecanismos de formación de plaquetas son altamente dependientes del entorno de la médula ósea. Por lo tanto, la microscopía intravital se ha convertido en una herramienta importante en el campo para visualizar el proceso en tiempo real. Los ratones con megacariocitos fluorescentes se pueden obtener cruzando ratones que expresan la cre recombinasa en megacariocitos con cualquier ratón reportero floxed que contenga un casete de expresión génica fluorescente condicional. Aquí, se utilizaron ratones reporteros mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)cruzados con ratones Pf4-cre11,permitiendo el etiquetado de fluorescencia verde intenso en megacariocitos y plaquetas12. Es importante tener en cuenta que se ha reportado alguna fuga con ratones Pf4-cre en leucocitos, incluyendo monocitos/macrófagos y fibroblastos12,13.

Sin embargo, los megacariocitos se reconocen fácilmente por su gran tamaño y núcleo. Los experimentadores nuevos en el campo podrían comparar observaciones en [mTmG; Pf4-cre] ratones con los obtenidos después del etiquetado específico de megacariocitos. Esto es posible mediante la administración intravenosa de un anticuerpo marcado con Alexa-fluor dirigido contra la proteína específica de plaquetas, GPIX (CD42a)3,14. Este último enfoque también es beneficioso para obtener imágenes de megacariocitos fluorescentes de cualquier ratón genéticamente modificado sin realizar cruces de ratones tediosos y lentos con ratones reporteros fluorescentes. Aquí, se utilizaron ratones de 5 a 7 semanas de edad, ya que los ratones más jóvenes presentan un hueso más delgado que es más translúcido y facilita las imágenes en comparación con los ratones más viejos. Sin embargo, los ratones que son demasiado jóvenes pueden presentar dificultades en la instalación del anillo craneal sin fugas.

En este estudio, la imagen intravital se realizó utilizando un microscopio Leica equipado con un objetivo de agua 25x con una apertura numérica de 0,95 (Tabla de Materiales). El objetivo debe ser cónico para que pueda entrar en la copa formada por el anillo craneal con una distancia de trabajo óptima. Las imágenes se grabaron con un escáner resonante (12 u 8 kHz). La configuración general dependerá del tipo de pregunta científica que se responderá y debe optimizarse en función de la ampliación, la resolución y la velocidad de adquisición necesarias. Por ejemplo, con un escáner resonante de 12 kHz, un objetivo 25x sería más adecuado para medir la velocidad de las plaquetas, mientras que un escáner de 8 kHz y un aumento más bajo podrían ser suficientes para registrar el alargamiento proplatelet.

El paso más crítico del protocolo es la fijación correcta del anillo al hueso del cráneo para que no se produzcan fugas y para que no se desprenda durante la grabación. Para eso, es esencial que el hueso del cráneo esté seco justo antes de aplicar el anillo. Una vez que el anillo está pegado, vuelva a humidificar rápidamente el hueso. Además, debido a la fuerza ejercida por el peso de la cabeza sobre el anillo, el anillo está sometido a una tensión que puede hacer que se desprenda parcialmente durante la grabación. Esto puede causar fugas y, por lo tanto, sequedad del hueso, lo que lleva a imágenes de mala calidad y reacciones inflamatorias indeseables. Este problema se puede evitar fácilmente agregando una compresa doblada debajo de la nariz del mouse para apoyar la cabeza (Figura 3C). Otro punto crítico es minimizar el sangrado y la presencia de sangre dentro del anillo, ya que puede conducir a imágenes borrosas. Esto debe tenerse en cuenta al estudiar ratones que presentan hemostasia defectuosa y son propensos a sangrar. Algunos marcadores, como el dextrano, pueden presentar fugas en la cavidad de la médula ósea si se inyectan en forma concentrada, lo que empeora las imágenes de los vasos, aunque no la fluorescencia verde de los megacariocitos. Qtracker-655 no tiene muchas fugas, pero se elimina de la circulación en 30 minutos, por lo que se requieren nuevas inyecciones del trazador para visualizar los vasos durante períodos más largos.

Una limitación de este método descrito aquí es la necesidad de detener la adquisición cada 35 minutos para volver a inyectar anestésicos. Esta limitación se puede superar si hay una máquina de anestesia disponible. En ese caso, la anestesia puede ser inducida de manera similar por inyección i.p. de una mezcla de ketamina y xilazina, que es la forma más fácil de realizar la inserción del catéter y la cirugía menor. Una vez colocada por debajo del objetivo del microscopio, la anestesia se mantiene mediante la inhalación de gases (mezcla de oxígeno, anestésicos como isoflurano y aire ambiente). De esta manera, las observaciones se pueden realizar durante varias horas sin interrupción. Sin embargo, por razones éticas, las observaciones se limitaron a 3 h en este estudio. Otra limitación en el uso de la mezcla de ketamina /xilazina podría ser su potencial impacto perjudicial en las funciones plaquetarias16 que podría requerir esquemas de anestesia alternativos.

En general, el principal mérito de este protocolo bien establecido es su aspecto no invasivo con solo una cirugía mínima. Se han desarrollado otros protocolos para realizar imágenes intravitales de lapso de tiempo en huesos largos. Estos se basan en la cirugía invasiva que requiere la extirpación del tejido muscular y la abrasión ósea17,18, sondas endoscópicas implantadas cerca de la cabeza del fémur19,20, o la instalación de una cámara de ventana en el fémur21. Todos estos procedimientos resultan en un trauma mayor y diversos grados de inflamación. La inflamación no solo es perjudicial para el ratón, sino que también se ha informado que modifica el proceso de formación de plaquetas6, de modo que las condiciones inflamatorias no controladas pueden conducir a discrepancias y una mala interpretación de los datos. Es por eso que se eligió este procedimiento para evitar reacciones inflamatorias. Sin embargo, dependiendo de la pregunta científica, los experimentadores pueden preferir tener un campo de observación más profundo y una resolución más alta (menos dispersión), lo que es posible mediante el uso de un enfoque basado en el adelgazamiento del cráneo a expensas de un bajo grado de reacción inflamatoria.

Debido a su naturaleza no invasiva, la principal limitación de este método es la profundidad máxima que se puede alcanzar. Debido a la densidad del hueso y sus propiedades de dispersión, es posible obtener imágenes de regiones dentro de una profundidad de solo unos pocos cientos de micrómetros, evitando observaciones de toda la médula calvarial. El desarrollo de la microscopía de tres fotones, que se basa en longitudes de onda de excitación infrarroja aún más altas, parece ser un enfoque prometedor con una resolución superior de tejido profundo. Ya se ha utilizado con éxito para obtener imágenes profundas en el cerebro incluso a través del hueso22,23, abriendo la emocionante posibilidad de obtener imágenes de la médula ósea dentro de huesos largos sin tener que adelgazar el hueso o implantar una ventana quirúrgica.

En resumen, este método se utiliza cada vez más para estudiar el comportamiento de los megacariocitos en la médula ósea y visualizar la extensión de los proplatlets. Además, al permitir la visualización del hueso compacto calvarial externo, así como parte de la médula subyacente, este método ya se ha utilizado en muchas aplicaciones fuera del campo plaquetario. Se ha utilizado para el estudio de la dinámica celular tanto ósea como medular en su entorno, incluyendo osteoblastos y osteoclastos, tráfico de leucocitos y salida de médula, células endoteliales y arquitectura de microvasculatura, dinámica del flujo sanguíneo en microvasos medulares, o homing celular24.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Florian Gaertner (Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria, Klosterneuburg, Austria) por su asesoramiento experto sobre experimentos de microscopía de dos fotones en el momento en que establecimos la técnica en el laboratorio, e Yves Lutz en el Centro de Imágenes IGBMC / CBI (Illkirch, Francia) por su experiencia y ayuda con el microscopio de dos fotones. También agradecemos a Jean-Yves Rinkel por su ayuda técnica e Ines Guinard por el dibujo del esquema en la Figura 1. Agradecemos a ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) su apoyo en la adquisición del microscopio de dos fotones. AB fue apoyado por becas postdoctorales de Etablissement Français du Sang (APR2016) y de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GNU Octave software GNU Project https://www.gnu.org/software/octave/
 Histoacryl 5 x 0, 5 mL Braun 1050052 injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes Leica Microsystems
ImageJ GNU project Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL Boehring 03661103003199 eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 Leica Microsystems simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab MathWorks https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g Laboratoires T.V.M. 03700454505621 Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed Rotec 13001002
Qtracker 655 vascular label Invitrogen Q21021MP injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL Bayer 04007221032311
Superglue gel to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G Terumo SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) Coherent

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References

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  23. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  24. Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).

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Biología Número 173 Microscopía de dos fotones Observación intravital Médula ósea del cráneo Megacariocitos Proplatelets
<em>In Vivo</em> Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón
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Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F.,… More

Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F., Gachet, C., Léon, C. In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow. J. Vis. Exp. (173), e62515, doi:10.3791/62515 (2021).

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