Summary
알루미늄 호일은 고환의 융합을 방해하기 위해 Spodoptera litura 의 고환 사이에 미세 외과 적으로 삽입되었습니다. 절차에는 동결, 고정, 소독, 절개, 장벽 배치, 봉합, 수술 후 수유 및 검사가 포함됩니다. 이러한 접근법은 조직 형성을 방해하는 방법을 제공한다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)과 같은 유전 적 방법을 사용하고 정기적으로 간격이 짧은 구두체 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 엔도뉴클레아제 Cas9와 같은 유전 적 방법을 사용하는 대신, 물리적 장벽이 Spodoptera litura 의 고환 사이에 미세 외과 적으로 삽입되어이 미세 수술이 성장과 번식에 미치는 영향을 연구했습니다. 고환 사이에 알루미늄 호일을 삽입 한 후, 변태 중 곤충 털갈이가 정상적으로 진행되었습니다. 곤충의 성장과 발달은 현저하게 변화되지 않았다. 그러나 고환 융합이 미세 수술에 의해 중단되면 정자 다발의 수가 변경되었습니다. 이러한 발견은 고환 융합을 차단하는 것이 남성 생식 능력에 영향을 줄 수 있음을 의미합니다. 이 방법은 특정 신호 전달 경로의 기능을 연구하기 위해 기관 간의 통신을 중단하는 데 더 적용될 수 있습니다. 기존의 수술에 비해, 미세수술은 동결마취만을 필요로 하며, 이는 이산화탄소 마취보다 바람직하다. 미세 수술은 또한 수술 부위 영역을 최소화하고 상처 치유를 용이하게합니다. 그러나 특정 기능을 가진 재료를 선택하려면 추가 조사가 필요합니다. 수술 중 절개를 할 때 조직 손상을 피하는 것이 중요합니다.
Introduction
융합은 조직 또는 장기 발달에서 흔히 발생하는 현상입니다. 그 예로는 Drosophila1에서의 등쪽 폐쇄 및 흉부 폐쇄 및 구개골 형태형성, 신경관 형태형성, 및 마우스 및 닭에서의 심장 형태형성2이 포함된다. CRISPR 및 RNAi는 융합 과정에서 유전자의 역할을 조사하기 위해 적용되었습니다2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera : Noctuidae)는 중국을 포함한 아시아의 열대 및 아열대 지역에 널리 분포하는 해로운 다식성 해충입니다4,5,6. S. litura의 광범위한 분포는 부분적으로 생식선 발달과 관련된 강력한 생식 능력에 기인합니다. 남성 불임은이 해충을 방제하는 한 가지 접근법입니다. 고환 구조의 개략적인 그림에서 볼 수 있듯이, 고환은 외부 외피 (복막 외피) 및 내부 기저 라미나를 포함한 고환 외피에 의해 둘러싸여 있습니다. 기저 라미나는 내부적으로 확장되어 여포 상피를 형성하고 고환의 내부 영역을 여포라는 네 개의 챔버로 분리합니다 (그림 1).
여포에서 정자는 유사분열과 meiosis 후에 정자로 발전하고, 정자 주머니의 정자는 같은 방향으로 정렬되어 정자 다발을 형성합니다7. 정자 생성 동안, 일차 정자 세포는 유피렌 정자 또는 아피렌 정자로 분화됩니다. 유충 단계의 정자 세포는 길쭉한 핵의 머리에 연결된 긴 꼬리를 가진 유피렌 정자로 발전합니다. 이들은 알을 비옥하게 할 수 있습니다. 반대로, 번데기 중반 단계의 정자 세포는 버려진 핵을 가진 아피렌 정자로 발전합니다. 이 정자는 유피렌 정자의 생존, 운동 및 수정을 돕습니다9,10. 번데기의 6 일째 날은 고환이 풍부한 유피렌과 아피렌 정자 번들을 가지고있는 기간입니다.
그림 1 : Lepidoptera 곤충의 고환 구조의 개략도11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고환 융합은 Lepidoptera 순서의 대부분의 곤충에서11,12, 특히 농업 해충 인 종에서 발생합니다. 고환 융합은 애벌레 단계에서 양측으로 자라는 한 쌍의 고환을 말하며, 서로 접근하고 고수하여 결국 단일 생식선으로 통합됩니다 11. Spodoptera litura에서는 애벌레에서 번데기 단계로 변태하는 동안 발생합니다. 5번째 인스타(L5D1)의 1일째부터 6번째 인스타(L6D4)의 4일째까지, 한 쌍의 고환은 점차 크기가 커지고, 색은 아이보리 화이트에서 연한 노란색으로 변합니다. 그것은 준비 단계 (L6D5 내지 L6D6)에 도달함에 따라 희미한 적색이된다. 두 개의 양측 대칭 고환이 준비 단계에서 서로 접근하고, 하나로 융합되고, 시계 반대 방향 (doral view)을 비틀어 번데기와 성인 단계에서 단일 고환을 생성합니다11. 이 현상은 상당한 경제적 중요성을 가지고 있으며 5000 년 동안 길들여진 누에에서는 발생하지 않습니다.13. 따라서 고환의 융합이 생식 능력을 향상시킨다고 가정합니다.
Spodoptera litura 고환 융합의 중요성을 결정하기 위해서는 과정을 막는 효과를 조사하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서 알루미늄 호일은 고환 사이에 미세 외과 적으로 삽입되어 분리되도록 유지했으며 곤충과 고환의 발달에 따른 변화가 연구되었습니다.
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Protocol
1. 곤충 사육 및 유지 보수
- Spodoptera litura 유충을 6th instar (L6D4)의 4 일째에 도달 할 때까지 인공 식단으로 환경 시뮬레이션 챔버에서 배양하십시오. 벌레가 여덟 번째 복부의 역 삼각형 모양의 구조를 기반으로 6 번째 instar (L6D0)의 첫날에 들어갈 때 수컷 유충을 선택하십시오14.
참고 : 유충 사육 및 유지 보수 기술은 이전에 출판되었습니다4,14.
2. 수술 전 준비
- 알루미늄 호일을 둥근 모서리가 있는 직사각형 조각으로 다듬습니다(1mm x 2mm, 그림 2).
- 수술 플랫폼 및 관련 항목 (테이블 표면, 현미경, 아이스 박스, 곤충 상자, 왁스 트레이, 핀 및 실)을 표면에 75 % 알코올을 뿌리고 닦아서 멸균하십시오.
- 수술 도구 (알루미늄 호일 포함)를 고압 증기 멸균기로 30 분 동안 멸균하고 120 °C의 가열 및 건조 오븐에 놓습니다.
- 작업자가 깨끗한 실험실 옷, 외과 용 마스크 및 멸균 장갑을 착용했는지 확인하십시오.
3. 고환 사이의 장벽의 미세 외과 적 배치
참고 : 일반적인 작업 흐름은 다음과 같습니다 : 냉동 → 고정 → 소독 → 절개 → 장벽 배치 → 봉합→ 수술 후 먹이 및 검사
- 수컷 유충 (L6D4)을 얼음 위에 10-30 분 동안 두어 수술 중에 마취 상태로 유지하십시오.
- 등쪽이 위로 위로 향하도록 왁스 트레이에 유충을 놓은 다음 유충의 머리와 꼬리를 핀과 실로 고정하여 9 번째 신체 세그먼트의 등쪽 표면 인 수술 영역을 보여줍니다 (그림 3A).
- 표피(9번째 신체 부위)에 면봉으로 3% 요오드 팅크를 도포하여 수술 부위를 소독한 다음, 70% 알코올을 사용하여 요오드를 제거하였다(도 3B).
참고 : 수술 현미경의 거칠고 미세한 조정을 통해 유충에 집중하십시오 (그림 3C). 마취를 유지하기 위해 얼음으로 채워진 더 큰 문화 접시에 왁스 트레이를 놓습니다. - 9 번째 신체 세그먼트의 등쪽 표피에 2mm 길이의 절개를하십시오. 다음으로, 멸균 면봉을 사용하여 누출 된 용혈림프와 지방체를 제거하고 수술 부위를 명확하게 볼 수 있습니다.
참고 : 절차 중에 심장을 피하는 것이 중요합니다. 이것은 애벌레 내부 압력으로 인해 고환이 튀어 나오지 않도록 9 번째 신체 세그먼트의 중간 선 옆이나 9 번째와 10 번째 신체 세그먼트 사이의 관절에서 절개를 약간 옆에두면 수행 할 수 있습니다. 메스를 사용하는 동안 먼저 블레이드로 수직 슬릿을 만든 다음(그림 4A), 표피를 고르게 그리고 연속적으로 절단하기 전에 표피 쪽으로 45° 돌립니다(그림 4B). - 수술용 핀셋을 사용하여 고환 사이에 알루미늄 호일 조각을 삽입합니다(그림 5).
- 수술이 끝나면 감염을 피하기 위해 절개를 닫고 애벌레가 수술에서 회복 할 수 있도록하십시오.
- 달리는 봉합사로 표피를 닫습니다(그림 6).
- 바늘 홀더와 수술용 핀셋을 사용하여 수술용 사각형 매듭을 묶으려면 두 개의 반대되는 거울 이미지 단순 매듭이 필요합니다(그림 6D,E).
- 가위를 사용하여 루프 꼬리에서 과도한 봉합사를 자르고 2mm 실을 남겨 둡니다.
- 봉합 후, 유충을 사육 상자에 부드럽게 놓고 깨끗한 환경 시뮬레이션 챔버에 보관하십시오. 애벌레를 계속 관찰하십시오.
참고 : 상처는 용혈림프가 새는 것을 멈추고 유충은 수술 후 점차적으로 회복됩니다. 웜은 계속해서 변태를 완료합니다.
그림 2: 알루미늄 호일(1mm x 2mm)을 사용하여 준비된 물리적 장벽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 절개 전. (A) 애벌레 고정. (B) 수술 부위의 표피의 소독. (C) 현미경으로 수술 수행. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 절개. (A) 유충을 칼날로 수직으로 썰다. (B) 절단하기 전에 블레이드를 표피 쪽으로 45° 돌립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 고환 사이에 물리적 장벽(알루미늄 호일)을 삽입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 봉합 . (A) 바늘을 삽입합니다. (B) 바늘을 뽑는다. (C) 바늘을 뽑아 고정시킨다. (D) 첫 번째 간단한 매듭을 묶는다. (E) 반대편 거울 이미지 단순 매듭을 묶는다. (F) 과도한 봉합사 실을 자른다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
Spodoptera litura 성장 및 발달에 대한 미세 수술의 효과
미세 수술은 등쪽 유충 표피에 2mm 길이의 상처를 남겼고 결국 용혈림프가 새는 것을 멈추고 치유되었습니다. 유충은 준비 및 번데기 단계를 거쳐 폐쇄 된 것으로, 미세 수술이 성장과 발달에 큰 영향을 미치지 않았 음을 나타냅니다. 유충이 번데기로 털갈이했을 때, 봉합사 실은 표피와 함께 버려졌습니다. 수술을 받았고 수술을받지 않은 번데기의 모습에는 명백한 차이가 없었습니다. 폐색 후, 성인 암컷은 이전에 수술 한 성인 수컷과 성공적으로 교미하여 수정 된 난자와 부화 된 애벌레를 낳았습니다 (그림 7).
그림 7 : 미세 수술 후 Spodoptera litura 개발. (A) L6D4에서 수컷 유충. (B) 수술 직후 L6D4 유충. (C) 번데기 전 (L6D6). (d) P0, 적색 화살표는 수술의 위치를 나타내고; 노란색 화살표는 봉합사 실이있는 버려진 표피를 보여줍니다. (E) 짝짓기 성인. (F) 수술을받은 수컷과 짝짓기를하는 여성 성인의 알과 부화 된 유충. 배율 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유충은 번데기 단계를 거쳐 고환 사이에 알루미늄 호일을 미세 외과 적으로 배치 한 후 닫혔습니다. 이 작업 이후의 자세한 결과는 이전에 게시되었습니다11. 장벽이 고환이 일부 애벌레에서 융합되는 것을 막았지만, 대부분의 유충은 애벌레에서 번데기 변형에 이르는 동안 고환 융합을 겪었습니다.
이 연구에서 개인은 실험 (Exp), Sham-operation (Ctl-sham) 및 No operation (Ctl)의 세 가지 치료법으로 그룹화되었습니다. Exp 그룹의 개인은 물리적 장벽을 삽입하기 위해 미세 수술을 받았으며 고환은 번데기와 성인 단계에서 분리 된 상태로 유지되었습니다. Ctl-sham 그룹의 개인은 동일한 미세 수술을 받았다. 그러나 그들의 고환은 알려지지 않은 이유로 차단되고 융합되지 않았습니다. Ctl 그룹에는 수술없이 자연적으로 자란 유충이 포함되어있었습니다. 그들의 두 고환은 준비 단계에서 정상적으로 융합되었습니다.
미세 수술 그룹에는 두 개의 하위 그룹이 포함되었습니다 : 두 고환 (그룹 A) 사이에 장벽을 놓기 위해 미세 수술을받은 유충과 1 개의 고환을 제거하기 위해 미세 수술을받은 유충 (그룹 B : 그룹 B-1에서 왼쪽 고환이 제거됨, 그룹 B-2에서 오른쪽 고환이 제거됨). 표 1 은 수술 유충의 수, 애벌레 사망률, 번데기의 수, 번데기의 비율, 성인의 수, 성인 출현의 비율, 성공적인 교미의 비율 및 다른 그룹의 성공적인 수술 비율을 보여줍니다. 그룹 A는 고환 사이에 장벽을 삽입하기 위해 미세 수술을받은 유충을 포함합니다. 이 절차의 성공은 해부 후에 만 결정될 수 있었는데, 이는 Exp 및 Ctl-sham 그룹으로 더 나뉘어 졌을 때입니다.
도 8에 나타난 바와 같이, 유충 사망률은 수술군에서 약간 높았던 반면, 번데기, 성인 출현 및 성공적인 교미의 비율은 대조군보다 수술군에서 약간 낮았다. 그러나 차이점 중 어느 것도 크게 다르지 않았으며, 이는 미세 수술이 Spodoptera litura 유충의 성장과 발달에 현저하게 영향을 미치지 않았 음을 나타냅니다.
| 그룹 | 유충의 수 | 유충 사망률/% | 번데기의 수 | 번식 비율 / % | 성인 수 | 성인 출현률/% | 성공적인 짝짓기의 백분율/% | 성공적인 작업 비율/% | |||||
| 미세외과 그룹 A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| 미세 외과 그룹 A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| 미세외과 그룹 A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| 미세 외과 그룹 A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| 미세 외과 그룹 A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| 미세 외과 그룹 A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| 미세 외과 그룹 A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| 미세 외과 그룹 A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| 미세 외과 그룹 B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| 미세 외과 그룹 B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| 미세 외과 그룹의 평균 (평균± SD) | 159 | 17±10.1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20.8 | 25.8±18.5 | |||||
| 대조군 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| 대조군 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| 대조군 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| 대조군 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| 대조군 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| 대조군 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| 대조군의 평균 (평균± SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9.5 | N | |||||
표 1 : Spodoptera litura 발달에 대한 미세 수술의 효과. 미세 수술 그룹 B-1과 B-2는 일방적 인 고환을 제거하기 위해 미세 수술을 받았다 (미세 외과 그룹 B-1에서 왼쪽으로, 미세 수술 그룹 B-2에서 오른쪽). 참고 : 미세 수술 그룹 A-1 ~ A-8은 고환 사이에 장벽을 삽입하기 위해 미세 수술을 받았다. 미세 수술 그룹 B-1 및 B-2는 일방적 인 고환을 제거하기 위해 미세 수술을 받았다 (미세 수술 그룹 B-1에서 왼쪽, 미세 수술 그룹 B-2에서 오른쪽); 비율과 백분율은 SD± 평균으로 주어진다. 별표는 그룹의 개인이 번데기 단계에서 해부되었다는 것을 나타내며 성인 수, 성인 출현 비율 또는 성공적인 짝짓기 비율에 대한 통계가 없었습니다. N은 데이터가 없음을 나타냅니다.
그림 8 : Spodoptera litura 성장 및 발달에 대한 미세 수술의 영향 (n ≥ 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Spodoptera litura의 정자 다발의 수에 대한 미세 수술의 영향
미세 수술은 고환 융합을 중단하거나 Spodoptera litura 에서 일방적 인 고환을 제거하기 위해 물리적 장벽을 삽입하기 위해 수행되었습니다. Eupyrene 및 apyrene 정자 다발은 번데기 단계의 여섯째 날에 유피렌 정자 다발의 백분율을 계산하기 위해 계수되었다. 개체들은 상기 기술된 바와 같이 치료에 의해 그룹화되었다. 정자 다발의 수 (유피렌 정자 다발, 아피렌 정자 다발, 및 총계)는 Ctl-sham 및 Ctl 그룹보다 Exp 그룹에서 유의하게 낮았다. Exp 그룹에서 두 개의 분리 된 고환으로부터의 유피렌 정자 다발의 평균 수는 2082 ± 599이었다. 융합 된 고환이있는 Ctl-sham 및 Ctl 그룹에서 유피렌 정자 다발의 수는 4652에서 6200 사이였습니다.
Exp 그룹의 apyrene 정자 번들의 수는 1602 ± 703 인 반면, Ctl-Sham 및 Ctl 그룹에서는 3299에서 4632까지의 범위였습니다. Exp 그룹의 정자 번들의 총계는 3684 ± 985이었다. 그것은 Ctl-Sham 및 Ctl 그룹에서 9284에서 10832까지 다양했습니다. 따라서, 유피렌 정자 다발의 백분율은 50%에서 60%까지 다양하였으며, 세 그룹 모두에서 유의한 차이는 없었다. 도 9 는 융합이 방지되었을 때, 유피렌 및 아피렌 정자 다발의 양이 감소한 반면, 유피렌 정자 다발의 백분율은 변하지 않았다는 것을 보여준다.
그림 9: 서로 다른 그룹의 정자 다발의 수와 유피렌 정 자 다발의 백분율. (A) Exp 그룹의 정자 다발의 수는 Ctl-sham 및 Ctl 그룹보다 현저히 낮았다. (B) 유피렌 정자 다발의 백분율은 세 그룹 사이에서 유의하게 다르지 않았다. 별표는 Ctl. P < 0.05, 평균 ± SD (n ≥5)와 비교할 때 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유충의 일방적 인 고환을 제거한 후, 번데기 단계의 여섯째 날에 유피렌 정자 다발의 비율을 계산하기 위해 유피렌 및 아피렌 정자 다발의 수를 계산했다. 유피렌 및 아피렌 정자 다발의 수는 각각 1286 내지 1638 및 720 내지 850 범위였으며, 이는 총 수가 2006 내지 2488 년까지였으며, 이는 63 % 내지 65%의 유피렌 정자 번들 백분율에 해당함을 의미한다. 도 10 은 일방적 고환 제거 후 정자 다발의 수가 유의하게 감소(60%에서 70%로 감소)한다는 것을 보여주며, 유피렌 정자 다발의 백분율에 큰 영향을 미치지 않는다.
그림 10: 일방적인 고환을 제거한 후 정자 다발의 수와 유피렌 정자 다발의 백분율. (A) 일방적 고환 제거를 받은 번데기의 정자 다발의 수는 세 그룹간에 유의하게 달랐다(미세수술 그룹 B-1 및 미세수술 그룹 B-2에서 각각 제거된 좌우 고환) (B ) 일방적 고환 제거를 받은 번데기의 유피렌 정자 다발의 비율은 Ctl과 비교하여 유의하게 다르지 않았다. 별표는 Ctl. P < 0.05, 평균 ± SD (n ≥8)와 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. 대조군 = 수술 없음, 고환은 준비 단계 동안 자연적으로 융합; Ctl-Sham 그룹 = 수술 실패 및 미세 수술 후 융합 된 고환; Exp. Group = 두 고환 사이에 물리적 장벽을 삽입하기 위해 수행 된 미세 수술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Spodoptera litura에서 미세 외과 적으로 고환 융합을 방해 한 후, 정자 다발의 수가 감소하여이 융합이 생식 능력에 도움이된다는 가설을지지했습니다. 외과 적 조작은 20 세기 초부터 곤충의 생리 학적 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 두개골 신경이 곤충 변형에 의해 조절되는지 여부를 결정하기 위해 일부 연구자들은 다른 곤충 (Hemiptera의 Rhodnius prolixus, Lepidoptera의 Lymantria dispar 포함)에 대한 결찰 및 감금과 같은 절차를 수행했습니다 15,16. 감금 과정은 메스로 머리를 제거하고, 항생제로 소독하고, 수술 후 상처의 파라핀 왁스 밀봉을 포함합니다17. 봄비엑스 모리의 흉부 땀샘의 추출 및 이식 후, 상처를 파라핀 왁스18로 밀봉하였다. 그러나 이러한 전통적인 치료법의 필연적 인 결과는 감염과 높은 사망률이며, 이로 인해 곤충의 발달 후반 단계에서 생리적 상태를 분석하기가 어렵습니다.
따라서, 이 프로토콜은 상처를 최소화하기 위해 현미경 하에서 수행되는 최소 침습적 수술을 보장하도록 설계되었다. 또한, 이산화탄소 마취에 비해, 동결 마취는 더 실현 가능하고 편리하다. 장애물로 사용되는 알루미늄 호일은 고환 사이의 공간과 동등한 면적 인 1mm x 2mm의 크기로 절단되었습니다. 미세 수술 후, 봉합사 실은 탈피 중에 초기 표피와 함께 떨어지므로 변형과 발달이 정상적으로 진행될 수 있습니다. 번식 결과는 성공적인 미세 수술이 곤충 발달에 큰 영향을 미치지 않았 음을 시사합니다. 고환이 융합되지 않았을 때, 전체, 유피렌 및 아피렌 정자 다발의 수는 Ctl 그룹의 정자 다발보다 현저히 낮았다. 이 결과는 남성 생식 능력이 고환 융합에 의해 영향을 받는다는 것을 나타냅니다. 정자 세포의 질 및 활력의 평가는 포유동물에서 정자 곡예 상태19, 정자 운동성20, 미토콘드리아 활성21, 원형질막 완전성22 및 기타 마커23,24를 포함하는 다양한 동물에서 상이한 지수 및 방법을 갖는다. 곤충의 독특한 정자 세포 발달로 인해 미래의 연구는 번식 능력의 변화 (짝짓기, 배양25)를 조사해야합니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 특별한주의가 필요합니다. 절개를 할 때 다른 조직에 대한 손상을 피하는 것이 중요합니다. 둘째, 장벽 재료의 선택은 무독성 및 멸균 특성과 날카로운 경계의 부족을 기반으로해야합니다. 마지막으로, 절개를 실행 봉합사와 수술 사각형 매듭으로 닫은 다음 수술 부위에 밀봉하여 수술 후 감염을 효과적으로 예방했습니다. 이식, 추출 및 약물 적용과 같은 곤충의 내부 구조에 대한 작업은 여전히 수행 할 수 있으며 수술 부위에서 밀봉 할 수 있습니다.
높은 성공률에는 능숙한 기술이 필요하며이 기술에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 작업이 하나씩 수행되기 때문에 개별 변형이 불가피하기 때문에 효율적이지 않습니다. 예비 연구에 따르면 의료용 정맥 수혈 튜브, 고무 다이어프램, 흡수성 비드 및 치과 재료를 사용하여 고환을 분리 할 때 결과가 예상만큼 성공적이지 못했습니다. 또한이 기술은 장애물이 표류하는 경우 성공하지 못합니다. 수술 성공률이 감소하는 가능한 이유는 곤충이 움직일 때 장벽이 빠져 나가고, 수축하고, 털갈이하고, 준비 단계에서 장기를 재구성하는 것을 포함합니다. 대안적으로, 알루미늄 호일은 윤활성 장에 너무 가깝게 삽입될 수 있고, 장벽이 떨어져 떠다니게 할 수 있다. 따라서, 적합한 재료가 더욱 최적화되어야 한다.
미세수술의 한계에도 불구하고, 트랜스제닉 모델 시스템을 확립하기 전에 생물학적 현상에 대한 예비 결과를 얻는 방법을 제공한다. 스위니와 워터슨은 탄탈륨 호일 블록26을 삽입하여 병아리 배아의 제거 발달을 분석한 반면, 와일드와 로건은 알루미늄 호일을 불투과성 장벽으로 사용하여 앞다리와 뒷다리의 유도 및 후속 개시에서 레티노산 신호전달의 역할을 연구했다27. 무척추 동물 Spodoptera litura에서이 미세 수술은 정상적인 웜의 성장과 발달을 성공적으로 가능하게하여 생리 학적 현상을 연구 할 수있는 방법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Nos.:31772519, 31720103916; )과 사우스 웨스트 대학 실크웜 게놈 생물학의 국가 핵심 연구소 (No.: sklsgb2013003)의 공개 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
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