Summary
Алюминиевая фольга была микрохирургически вставлена между яичками Spodoptera litura , чтобы препятствовать слиянию яичек. Процедура включает в себя замораживание, фиксацию, дезинфекцию, разрез, установку барьера, наложение швов, послеоперационное кормление, осмотр. Такой подход предусматривает метод вмешательства в образование тканей.
Abstract
Вместо использования генетических методов, таких как РНК-интерференция (РНКи) и кластеризованные регулярно интерраспространенные короткие палиндромные повторы (CRISPR)/CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9, между яичками Spodoptera litura был микрохирургически вставлен физический барьер для изучения влияния этой микрохирургии на ее рост и размножение. После введения алюминиевой фольги между яичками линька насекомых во время метаморфоз протекала нормально. Рост и развитие насекомых не претерпели значительных изменений; однако количество пучков сперматозоидов изменялось, если слияние яичек было остановлено микрохирургией. Эти результаты подразумевают, что блокирование слияния яичек может влиять на способность мужчин к размножению. Метод может быть дополнительно применен для прерывания связи между органами для изучения функции конкретных сигнальных путей. По сравнению с обычной хирургией, микрохирургия требует только замораживания анестезии, которая предпочтительнее обезболивания углекислым газом. Микрохирургия также минимизирует область места операции и способствует заживлению ран. Однако подбор материалов с конкретными функциями требует дальнейшего изучения. Предотвращение повреждения тканей имеет решающее значение при создании разрезов во время операции.
Introduction
Слияние является распространенным явлением в развитии тканей или органов. Примеры включают закрытие спины и закрытие грудной клетки у Drosophila1 и морфогенез неба, морфогенез нервной трубки и морфогенез сердца у мышей и кур2. CRISPR и RNAi были применены для исследования роли генов в процессе слияния2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) — вредный полифаговой вредитель, широко распространённый в тропических и субтропических районах Азии, включая Китай4,5,6. Широкое распространение S. litura отчасти объясняется его мощной репродуктивной способностью, которая имеет отношение к развитию половых желез. Мужское бесплодие является одним из подходов к борьбе с этим вредителем. Как показано на схематичном рисунке строения яичек, яички заключены оболочкой яичка, включая наружную оболочку (перитонеальную оболочку) и внутреннюю базальную пластинку. Базальная пластинка простирается внутрь, образуя фолликулярный эпителий и разделяет внутреннюю область яичка на четыре камеры, называемые фолликулами (рисунок 1).
В фолликулах сперматогония развивается в сперматозоиды после митоза и мейоза, а затем сперматозоиды в сперматозоидных мешочках выравниваются в том же направлении, образуя пучки сперматозоидов7. Во время сперматогенеза первичные сперматоциты дифференцируются в эвпиреновые сперматозоиды или апиреновые сперматозоиды. Сперматоциты в личиночной фазе развиваются в эвпиреновые сперматозоиды с длинным хвостом, соединенным с головкой вытянутого ядра; они могут оплодотворить яйцеклетки. И наоборот, сперматоциты в середине куколочной фазы развиваются в апиреновые сперматозоиды с выброшенным ядром; эти сперматозоиды способствуют выживанию, движению и оплодотворению сперматозоидов эвпирена9,10. 6-й день куколки – это период, в течение которого яички имеют обильные пучки сперматозоидов эвпирена и апирена.
Рисунок 1: Принципиальная схема яичковой структуры чешуекрылых насекомых11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Слияние яичек происходит у большинства насекомых отряда чешуекрылых11,12, особенно у тех видов, которые являются сельскохозяйственными вредителями. Слияние яичек относится к паре яичек, растущих двусторонне в личиночной фазе, приближающихся и прилипающих друг к другу, в конечном итоге интегрирующихся в единую гонаду11. У Spodoptera litura это происходит во время метаморфозы из личиночной в куколочную стадию. С 1-го дня 5-й звезды (L5D1) по 4-й день 6-й звезды (L6D4) пара яичек постепенно увеличивается в размерах, и цвет становится светло-желтым из слоновой кости-белого. Он становится слабым красным, когда достигает препупальной фазы (от L6D5 до L6D6). Два двусторонних симметричных яичка приближаются друг к другу во время стадии препупальности, сливаются в одну и скручиваются против часовой стрелки (доральный вид), чтобы получить одно яичко в фазе куколки и взрослой особи11. Это явление не встречается у шелкопрядов, которые имеют немалое экономическое значение и были одомашнены в течение 5000 лет13. Таким образом, предполагается, что сращение яичек улучшает репродуктивную способность.
Чтобы определить значимость слияния яичек Spodoptera litura , важно исследовать эффекты блокирования процесса. В этом протоколе алюминиевая фольга была микрохирургически вставлена между яичками, чтобы держать их разделенными, и были изучены последующие изменения в развитии насекомых и их яичек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выращивание и уход за насекомыми
- Культивируйте личинок Spodoptera litura в камерах моделирования окружающей среды с искусственной диетой, пока они не достигнут 4-го дня 6-й звезды (L6D4). Выбирайте личинок самцов, когда черви входят в первый день 6-й звезды (L6D0) на основе обратной треугольной структуры на восьмом брюшке14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы выращивания и содержания личинок были опубликованы ранее4,14.
2. Предоперационная подготовка
- Обрежьте алюминиевую фольгу прямоугольными частями с закругленными углами (1 мм х 2 мм, рисунок 2).
- Стерилизуйте хирургическую платформу и связанные с ней предметы (поверхность стола, микроскоп, ледяной ящик, ящик для насекомых, восковой лоток, булавки и нити), распыляя 75% спирта на их поверхность и протирая их.
- Стерилизуйте хирургические инструменты (в том числе алюминиевую фольгу) паровым стерилизатором высокого давления в течение 30 минут и поместите их в нагревательную и сушильную печь при 120 °C.
- Убедитесь, что операторы носят чистую лабораторную одежду, хирургические маски и стерильные перчатки.
3. Микрохирургическое размещение барьера между яичками
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий рабочий процесс выглядит следующим образом: замораживание → фиксация → дезинфекция → разрез → установка барьера → наложение швов→ послеоперационное кормление и инспекция
- Поместите личинок самцов (L6D4) на лед на 10-30 минут, чтобы они были обезболены во время операции.
- Поместите личинку на восковой лоток спинной стороной вверх, а затем зафиксируйте голову и хвост личинки булавками и нитями, показывая хирургическую область, которая является дорсальной поверхностью на 9-м сегменте тела (рисунок 3А).
- Продезинфицируйте хирургическую область, нанеся 3% настойку йода ватным тампоном на эпидермис (9-й сегмент тела), а затем 70% спирт для удаления йода (рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосредоточьтесь на личинке с помощью грубой и тонкой регулировки хирургического микроскопа (рисунок 3C). Поместите восковой лоток на большую культурную посуду, наполненную льдом, чтобы сохранить анестезию. - Сделайте разрез длиной 2 мм на спинном эпидермисе 9-го сегмента тела. Затем используйте стерильный ватный тампон, чтобы удалить любые протекающие гемолимфы и жировые тела и получить четкое представление о хирургической области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать сердца во время процедуры. Это можно сделать, сделав разрез немного рядом со средней линией в 9-м сегменте тела или в суставе между 9-м и 10-м сегментами тела, чтобы предотвратить выскакивание яичек из-за внутреннего давления личинок. Используя скальпель, сначала сделайте вертикальную щель лезвием (рисунок 4A), а затем поверните его на 45° к эпидермису, прежде чем равномерно и непрерывно разрезать эпидермис (рисунок 4B). - Используйте хирургический пинцет, чтобы вставить кусок алюминиевой фольги между яичками (рисунок 5).
- В конце операции закройте разрез, чтобы избежать инфекции, и позвольте личинкам восстановиться после операции.
- Закройте эпидермис бегущим швом (рисунок 6).
- Используйте держатель иглы и хирургический пинцет, чтобы связать хирургический квадратный узел, требующий двух противоположных зеркальных простых узлов (рисунок 6D, E).
- Используйте ножницы, чтобы отрезать лишний шов от хвостов петли, оставив позади нить 2 мм.
- После наложения швов аккуратно укладывайте личинки в ящик для выращивания и храните их в чистой камере моделирования окружающей среды. Продолжайте наблюдать за личинками.
ПРИМЕЧАНИЕ: В рану перестает протекать гемолимфа, и личинки постепенно восстанавливаются после операции. Черви продолжают завершать свои метаморфозы.
Рисунок 2: Физический барьер, подготовленный с использованием алюминиевой фольги (1 мм x 2 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Перед разрезом. (A) Фиксация личинки. (B) Дезинфекция эпидермиса хирургической области. (С) Выполнение операции под микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Разрез. (А) Разрезайте личинок вертикально лезвием. (B) Поверните лезвие на 45° в сторону эпидермиса перед разрезанием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Установка физического барьера (алюминиевой фольги) между яичками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Наложение швов. (А) Вставьте иглу. (B) Извлеките иглу. (C) Отнимите и зажмите иглу. (D) Завяжите первый простой узел. (E) Завяжите противоположный зеркальный простой узел. (F) Отрежьте лишнюю шовную нить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Влияние микрохирургии на рост и развитие Spodoptera litura
Микрохирургия оставила рану длиной 2 мм на дорсальном личиночном эпидермисе, которая в конечном итоге перестала протекать гемолимфой и зажила. Личинки прошли препупальную и куколочную стадии и эклозировались, что указывает на то, что микрохирургия не оказала серьезного влияния на рост и развитие. Когда личинки линяли в куколок, шовные нити отбрасывались вместе с эпидермисом. Явных различий во внешнем виде куколок, которые делали и не подвергались хирургическому вмешательству, не было. После эклозии взрослые самки успешно спаривались со взрослыми самцами, на которых ранее оперировали, в результате чего оплодотворялись яйца и вылуплялись личинки (рисунок 7).
Рисунок 7: Развитие Spodoptera litura после микрохирургии. (A) Личинка самца в L6D4. (B) Личинка L6D4 сразу после операции. (C) Пре-куколка (L6D6). (D) P0, красная стрелка указывает на место операции; желтая стрелка показывает выброшенный эпидермис шовной нитью. (E) Спаривание взрослых. (F) Яйца и вылупившиеся личинки от взрослой самки, спарившейся с самцом, перенесшим операцию. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Личинки прошли стадию куколки и эклозировались после микрохирургического размещения алюминиевой фольги между яичками. Подробные результаты после этой операции были опубликованы ранее11. Хотя барьер остановил слияние яичек в некоторых личинках, большинство личинок подверглись слиянию яичек во время метаморфоза личинок в куколки.
В этом исследовании люди были сгруппированы по трем методам лечения: экспериментальное (Exp), фиктивное (Ctl-sham) и отсутствие операции (Ctl). Особи группы Exp подверглись микрохирургии, чтобы вставить физический барьер, и их яички оставались разделенными во время куколочной и взрослой стадий. Лица группы Ctl-sham подверглись такой же микрохирургии; однако их яички не были заблокированы и слиты по неизвестным причинам. Группа Ctl содержала личинок, которые росли естественным образом без хирургического вмешательства; два их семенника нормально срослись на стадии препупала.
Группа микрохирургии содержала две подгруппы: личинки, которые подверглись микрохирургии для размещения барьера между двумя яичками (группа А), и те, которые подверглись микрохирургии для удаления одного яичка (группа В: левое яичко удалено в группе В-1; правое яичко удалено в группе В-2). В таблице 1 показано количество действующих личинок, показатели смертности личинок, количество куколок, процент окукливания, количество взрослых особей, процент появления взрослых особей, процент успешного спаривания и процент успешных операций в различных группах. В группу А входят личинки, которые подверглись микрохирургии для вставки барьера между яичками. Успех этой процедуры можно было определить только после вскрытия, когда они были далее разделены на группы Exp и Ctl-sham.
Как показано на рисунке 8, уровень смертности личинок был немного выше в хирургической группе, тогда как процент окукливания, появления взрослых и успешного спаривания был немного ниже в хирургической группе, чем в контрольной группе. Однако ни одно из различий существенно не отличалось, указывая на то, что микрохирургия не оказала заметного влияния на рост и развитие личинок Spodoptera litura .
| Группа | Количество личинок | Смертность личинок/% | Количество куколок | Процент окукливания/% | Количество взрослых | Процент всходов взрослых особей/% | Процент успешного спаривания/% | Процент успешных операций/% | |||||
| Микрохирургия группы А-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| Микрохирургия группы А-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| Микрохирургия группы А-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| Микрохирургия группы А-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| Микрохирургия группы А-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| Микрохирургия группы А-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| Микрохирургия группы А-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| Микрохирургия группы А-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| Микрохирургия группы B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| Микрохирургия группы B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Среднее значение группы микрохирургии (среднее± SD) | 159 | 17±10,1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20,8 8 чел. | 25.8±18.5 | |||||
| Контрольная группа 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| Контрольная группа 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| Контрольная группа 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| Контрольная группа 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| Контрольная группа 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| Контрольная группа 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| Среднее значение контрольной группы (среднее± SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9,5 чел. | N | |||||
Таблица 1: Влияние микрохирургии на развитие Spodoptera litura. Микрохирургические группы B-1 и B-2 подверглись микрохирургии для удаления одностороннего яичка (слева в группе микрохирургии B-1 и справа в группе микрохирургии B-2). Примечание: Микрохирургические группы от А-1 до А-8 подверглись микрохирургии для вставки барьера между яичками; Микрохирургические группы B-1 и B-2 подверглись микрохирургии для удаления одностороннего яичка (слева в группе микрохирургии B-1 и справа в группе микрохирургии B-2); показатели и проценты приведены как средние ± SD. Звездочки указывают на то, что особи в группе были рассечены на стадии куколки, и не было статистических данных о количестве взрослых особей, проценте появления взрослых особей или проценте успешного спаривания; N указывает на отсутствие данных.
Рисунок 8: Влияние микрохирургии на рост и развитие Spodoptera litura (n ≥ 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Влияние микрохирургии на количество пучков сперматозоидов Spodoptera litura
Микрохирургия проводилась для введения физического барьера, чтобы остановить слияние яичек или удалить одностороннее яичко у Spodoptera litura. Пучки сперматозоидов эупирена и апирена были подсчитаны для расчета процента пучков сперматозоидов эвпирена на шестой день стадии куколки. Лица были сгруппированы по лечению, как описано выше. Количество пучков сперматозоидов (пучки сперматозоидов эупирена, пучки сперматозоидов апирена и всего) было значительно ниже в группе Exp, чем в группах Ctl-sham и Ctl. Среднее количество пучков эвпиреновых сперматозоидов из двух разделенных яичек в группе Exp составило 2082 ± 599. В группах Ctl-sham и Ctl со сросшимися яичками количество пучков эвпиреновых сперматозоидов колебалось от 4652 до 6200.
Количество пучков сперматозоидов апирола в группе Exp составляло 1602 ± 703, в то время как в группах Ctl-Sham и Ctl оно варьировалось от 3299 до 4632. Общее количество пучков сперматозоидов в группе Exp составило 3684 ± 985; он варьировался от 9284 до 10832 в группах Ctl-Sham и Ctl. Таким образом, процент пучков эвпиреновых сперматозоидов варьировался от 50% до 60%, без существенных различий между всеми тремя группами. Рисунок 9 показывает, что при предотвращении слияния количество пучков сперматозоидов эвпирена и апирена уменьшалось, тогда как процент пучков сперматозоидов эвпирена не менялся.
Рисунок 9: Количество пучков сперматозоидов и процентное содержание пучков сперматозоидов эвпирена в разных группах. (A) Количество пучков сперматозоидов в группе Exp было значительно ниже, чем в группах Ctl-sham и Ctl. (B) Процентное содержание пучков сперматозоидов эвпирена существенно не различалось между тремя группами. Звездочка указывает на существенную разницу по сравнению с Ctl. P < 0,05, среднее ± SD (n ≥5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
После удаления одностороннего яичка личинок было подсчитано количество пучков эвпиреновых и апиреновых сперматозоидов для расчета процента пучков эвпиреновых сперматозоидов на шестой день стадии куколки. Количество пучков сперматозоидов эупирена и апирена варьировалось от 1286 до 1638 и от 720 до 850 соответственно, что означает, что общее количество варьировалось от 2006 до 2488, что соответствует проценту пучка сперматозоидов эвпирена от 63% до 65%. На рисунке 10 показано, что количество пучков сперматозоидов значительно уменьшилось после одностороннего удаления яичка (уменьшилось на 60% до 70%), без особого влияния на процент пучков сперматозоидов эвпирена.
Рисунок 10: Количество пучков сперматозоидов и процентное содержание пучков сперматозоидов эвпирена после удаления одностороннего яичка. (A) Количество пучков сперматозоидов у куколок, подвергшихся одностороннему удалению яичка, значительно различалось между тремя группами (левое и правое яички удалены в группе микрохирургии B-1 и группе микрохирургии B-2 соответственно) (B Процент пучков сперматозоидов эвпирена у куколок, подвергшихся одностороннему удалению яичка, существенно не отличался от Ctl. Звездочка указывает на существенную разницу по сравнению с Ctl. P < 0,05, среднее ± SD (n ≥8). Контрольная группа = без хирургического вмешательства, яички естественным образом срослись во время предоперационной стадии; Группа Ctl-Sham = операция не увенчалась успехом и яички срослись после микрохирургии; Exp. Group = микрохирургия, выполняемая для вставки физического барьера между двумя яичками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После микрохирургического препятствования слиянию яичек в Spodoptera litura количество пучков сперматозоидов уменьшилось, что подтвердило гипотезу о том, что это слияние полезно для репродуктивной способности. Хирургические манипуляции используются для изучения физиологического развития насекомых с начала 20 века. Чтобы определить, регулируется ли черепной нерв метаморфозами насекомых, некоторые исследователи выполнили такие процедуры, как лигирование и обезглавливание на различных насекомых (включая Rhodnius prolixus Hemiptera, Lymantria dispar чешуекрылых)15,16. Процесс обезглавливания включает удаление головы скальпелем, дезинфекцию антибиотиками и герметизацию раны парафиновым воском после операции17. После экстракции и трансплантации проторакальных желез Bombyx mori рану запечатали парафиновым воском18. Однако неизбежными последствиями этих обычных методов лечения являются инфекция и высокая смертность, что затрудняет анализ физиологического состояния на поздних стадиях развития насекомого.
Поэтому этот протокол был разработан для обеспечения минимально инвазивной операции, проведенной под микроскопом, чтобы минимизировать рану. Более того, по сравнению с обезболиванием углекислым газом, замораживание анестезии более осуществимо и удобно. Алюминиевая фольга, используемая в качестве обструктора, была разрезана на размер 1 мм х 2 мм, площадь, эквивалентную пространству между яичками. После микрохирургии шовные нити отпадают вместе с ранним эпидермисом во время линьки, что позволяет метаморфозу и развитию протекать нормально. Результаты размножения свидетельствуют о том, что успешная микрохирургия существенно не повлияла на развитие насекомых. Когда яички не сливались, количество общих, эупиреновых и апиреновых пучков сперматозоидов было значительно ниже, чем в группе Ctl. Эти результаты свидетельствуют о том, что на мужскую репродуктивную способность влияет слияние яичек. Оценку качества и жизнеспособности сперматозоидов имеют разные показатели и методы у различных животных, включая акросомальный статус сперматозоидов у млекопитающих19, подвижность сперматозоидов20, митохондриальную активность21, целостность плазматической мембраны22 и другие маркеры23,24. Из-за уникального развития сперматозоидов насекомыми в будущих исследованиях необходимо изучить изменения в репродуктивной способности (спаривание, инкубация25).
Критические шаги в этом протоколе требуют особого внимания для обеспечения надежных результатов. Предотвращение травмирования других тканей важно при проведении разрезов. Во-вторых, выбор барьерного материала должен основываться на его нетоксичных и стерильных свойствах и отсутствии резких границ. Наконец, разрез был закрыт бегущим швом и хирургическим квадратным узлом, с последующим уплотнением в хирургической области для эффективного предотвращения послеоперационной инфекции. Операции на внутренней структуре насекомого, такие как трансплантация, извлечение и применение лекарств, все еще могут быть выполнены с последующим уплотнением в хирургической области.
Высокие показатели успеха требуют профессиональных навыков, и эта техника имеет некоторые недостатки. Во-первых, это неэффективно, так как операции выполняются одна за другой, из-за чего индивидуальная изменчивость неизбежна. Предварительные исследования показали, что при использовании медицинских венозных трансфузионных трубок, резиновых диафрагм, абсорбирующих шариков и стоматологических материалов для разделения яичек результаты были не такими успешными, как ожидалось. Более того, техника не является успешной, когда обструктор дрейфует. Возможные причины снижения показателя хирургического успеха включают соскальзывание барьера, когда насекомые двигаются, сжимаются, линяют и реорганизуют органы во время препупальной фазы. В качестве альтернативы, алюминиевая фольга может быть вставлена слишком близко к смазывающей кишке, в результате чего барьер уплывает. Поэтому подходящий материал должен быть дополнительно оптимизирован.
Несмотря на ограничения микрохирургии, она предоставляет метод получения предварительных результатов о биологических явлениях до создания трансгенной модельной системы. Суини и Уотерсон проанализировали развитие рида у эмбрионов цыплят путем введения блоков танталовой фольги26, в то время как Уайльд и Логан использовали алюминиевую фольгу в качестве непроницаемого барьера для изучения роли передачи сигналов ретиноевой кислоты в индукции и последующем инициировании передних и задних конечностей27. У беспозвоночных Spodoptera litura эта микрохирургия успешно обеспечивает нормальный рост и развитие червей, обеспечивая способ изучения физиологических явлений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (Nos.:31772519, 31720103916; ) и открытым грантом от Государственной ключевой лаборатории биологии генома шелкопряда Юго-Западного университета (No: sklsgb2013003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
