Summary
هنا، نقوم بوصف سير عمل مترابط لتكسير الصمام الرئوي المورين والضغط عليه وتركيبه وتصويره لتحديد التركيب الإجمالي وهياكل المصفوفة خارج الخلية المحلية.
Abstract
الأسباب الكامنة وراء أمراض صمام القلب ذات الصلة (HVD) بعيد المنال. نماذج مورين توفر أداة ممتازة لدراسة HVD، ومع ذلك، فإن الخبرة الجراحية والآلات اللازمة لتحديد بدقة هيكل وتنظيم عبر جداول طول متعددة قد توقف تقدمها. يقدم هذا العمل وصفا مفصلا لتشريح المورين ، وتلطيخ الكتلة ، ومعالجة العينات ، وإجراءات التصوير المترابط لتصوير صمام القلب على نطاقات طول مختلفة. تم استخدام الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي للسيطرة على التغايرية الزمنية عن طريق إصلاح كيميائيا تشكيل صمام القلب. تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) لتأكيد هندسة صمام القلب وتوفير مرجع لمعالجة العينة المصب اللازمة للفحص المجهري الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي (SBF-SEM). تم التقاط صور عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية (ECM) وإعادة بنائها لتوفير تمثيل محلي ثلاثي الأبعاد لمؤسستها. ثم تم ربط طرق التصوير μCT و SBF-SEM للتغلب على الاختلاف المكاني عبر الصمام الرئوي. وعلى الرغم من أن العمل المقدم يقتصر على الصمام الرئوي، فإن هذه المنهجية يمكن اعتمادها لوصف التنظيم الهرمي في النظم البيولوجية، وهي محورية بالنسبة لتوصيف الهيكلي عبر مقاييس متعددة الطول.
Introduction
يعمل الصمام الرئوي (PV) على ضمان تدفق الدم أحادي الاتجاه بين البطين الأيمن والشريان الرئوي. ترتبط تشوهات الصمام الرئوي بعدة أشكال من أمراض القلب الخلقية. العلاج الحالي لأمراض صمام القلب الخلقية (HVD) هو إصلاح الصمام أو استبدال الصمام ، والذي يمكن أن يستلزم عمليات جراحية متعددة الغازية طوال عمر المريض1. وقد تم قبول على نطاق واسع أن وظيفة صمام القلب مشتقة من هيكلها، وغالبا ما يشار إليها باسم وظيفة هيكل مترابطة. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الخصائص الهندسية والميكاميكية الحيوية للقلب تملي وظيفته. الخواص الميكانيكية، بدورها، يتم تحديدها من خلال تكوين وتنظيم ECM. من خلال تطوير طريقة لتحديد الخصائص الميكانيكية الحيوية لصمامات القلب مورين، يمكن استخدام نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا لاستجواب دور ECM على وظيفة صمام القلب والخللالوظيفي 2،3،4،5.
لطالما اعتبر نموذج المورين معيارا للدراسات الجزيئية لأن النماذج المعدلة وراثيا متاحة بسهولة أكبر في الفئران مقارنة بالأنواع الأخرى. نماذج مورين المعدلة وراثيا توفر منصة متعددة للبحث في الأمراض المرتبطة بصمام القلب6. ومع ذلك، كانت الخبرة الجراحية ومتطلبات الأجهزة لتوصيف كل من الهندسة وتنظيم ECM عقبة رئيسية في تقدم أبحاث HVD. توفر البيانات الهستولوجية في الأدب صورة في محتوى مصفوفة صمام القلب المورين خارج الخلية ، ولكن فقط في شكل صور 2D ، وغير قادرين على وصف هندسته المعمارية ثلاثية الأبعاد7و8. بالإضافة إلى ذلك، يكون صمام القلب غير متجانس مكانيا وزمانيا، مما يجعل من الصعب استخلاص استنتاجات عبر التجارب المتعلقة بتنظيم ECM إذا لم يتم إصلاح أخذ العينات والتطابق. لا توفر طرق التوصيف ثلاثي الأبعاد التقليدية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو تخطيط صدى القلب ثلاثي الأبعاد، الدقة اللازمة لحل مكونات ECM9و10.
هذا العمل تفاصيل سير العمل المترابطة تماما حيث تم تناول التغايرية الزمنية بسبب دورة القلب عن طريق تحديد تشكيل الكهروضوئية مورين مع الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي. تم التحكم في التغايرية المكانية بدقة عن طريق أخذ عينات المناطق ذات الاهتمام وتسجيل مجموعات البيانات من طرائق التصوير المختلفة ، وتحديدا μCT وكتلة المسلسل مسح المجهر الإلكتروني ، عبر مقاييس طول مختلفة. وقد اقترح هذا الأسلوب من الكشفية مع μCT لتوجيه أخذ العينات المصب سابقا، ولكن لأن الصمام الرئوي يحمل الاختلاف الزمني، كان هناك حاجة إلى مستوى إضافي من السيطرة على المستوى الجراحي11.
في دراسات الجسم الحي التي تصف الميكانيكا الحيوية صمام القلب مورين متناثرة، وبدلا من ذلك، تعتمد على النماذج الحاسوبية عند وصف سلوك تشوه. ومن الأهمية بمكان أن تكون البيانات المحلية خارج الخلية على مقياس طول نانومتر ذات صلة بهندسة وموقع صمام القلب. وهذا بدوره يوفر توزيعات قابلة للقياس الكمي ورسم خرائط مكانية لبروتينات ECM المساهمة ميكانيكيا ، والتي يمكن استخدامها لتعزيز نماذج صمام القلب الميكانيكية الحيوية الموجودة12و13و14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كان استخدام الحيوانات في هذه الدراسة وفقا للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية لرعاية الحيوانات في مستشفى الأطفال على مستوى البلاد بموجب البروتوكول AR13-00030.
1. استئصال الصمام الرئوي
- أوتوكلاف الأدوات اللازمة لتشريح الماوس. وهذا يشمل مقص غرامة، ملقط صغير، المشابك الأوعية الدموية الصغيرة، المشبك تطبيق ملقط، أصحاب microneedle، مقص الربيع، والمسحبات.
- تأقلم جميع الفئران لمدة أسبوعين على الأقل قبل العملية. إزالة C57BL/6 الفئران، ما يقرب من 1 سنة من العمر، من أقفاصها ووزنها، ثم القتل الرحيم مع كوكتيل الكيتامين / xylazine (3:1 الكيتامين: xylazine، 0.01 مل لكل غرام) جرعة زائدة.
- ضع الماوس في وضع إعادة حثالة الظهر على صينية وأمن أطرافه بشريط لاصق. بمجرد تأمينها، قم بإجراء استئصال الصدر.
- كشف القلب عن طريق إزالة أي الأنسجة الدهنية الزائدة واللفافة.
- إزالة الأذين الأيمن و perfuse من خلال البطين الأيسر مع محلول ملحي درجة حرارة الغرفة (0.9٪ NaCl). يجب أن يستغرق التشوه حوالي 20 مل فوق 30 s. وهذا يؤدي إلى exsanguination الماوس.
- إزالة القلب بأكمله عن طريق قطع الوريد الأجوف متفوقة، الوريد الأجوف أدنى، الشريان الرئوي، والشريان الأورطي. يجب توخي الحذر بشكل خاص للشريان الرئوي. قطع ما يقرب من 2 مم فوق تقاطع البطين الشرياني، وهذا سيكون بمثابة قناة للضغط.
- إزالة البطينين الأيسر والأييم لتعريض الغرف للضغط الجوي. تأكد من أن هيكل الجذع الرئوي يجب أن لا يتأثر بإزالة البطينين.
2. تثبيت ضغط الصمام الرئوي
- أنابيب الضغط Anastomose مع الشريان الرئوي، وترك ما يقرب من 1 مم المسافة بين تقاطع الصينية أنبوبي ونهاية الأنابيب لاستيعاب لحركات كبيرة من المنشورات والجذع الرئوي.
- رفع الخزان إلى ضغط فسيولوجي مماثل وملئه بالمحلول الملحي. اختبر نظام التدفق للتأكد من عدم وجود انسداد أو فقاعات هوائية.
- إرفاق stopcock إلى الصمام الرئوي anastomosed وضمان تدفق كاف من خلال الأنابيب (أي، لا فقاعات الهواء) عن طريق تبديل المسالك تدفق. بمجرد أن يكون التدفق كافيا ، قم بتبديل التدفق إلى الصمام الرئوي المصاب بالانستماء وتأكد من الضغط على الجذع الرئوي. يتم التعرف على هذا عن طريق تفكك الجذع الرئوي.
- بمجرد تأكيد ضغط الجذع الرئوي ، قم بدمج محلول التثبيت الأساسي تدريجيا (1.25٪ غلوتارالدهيد ، 1.0٪ بارافورمالديهايد في 0.15 M cacodylate) حتى يتم تطهير المحلول المالح. ويتم ذلك عن طريق إزالة جزء، ما يقرب من 25٪ من قدرة الخزان، من المحلول الملحي واستبداله بالمثبت الأساسي.
تنبيه: المثبتات المستخدمة (بارافورمالديهايد وجلوتارالدهيد) هي معدات حماية شخصية شديدة السمية ومناسبة (PPE) يجب ارتداؤها لضمان السلامة. - ضع شاش مثبتا على عينة الأنسجة لمنع التجفيف.
- Perfuse المثبت لمدة 3 ساعة، وإعادة ملء الخزان حسب الحاجة للحفاظ على ضغط مستمر. في جميع أنحاء التثبيت، فإنه ليس من غير المألوف للصمام الرئوي لتقليص بسبب التثبيت الكيميائي. إذا كان هذا هو الحال، وتجديد باستمرار الخزان مع المثبتة الأولية للحفاظ على الضغط الفسيولوجي.
- قم بتخزين صمام القلب في المحلول المثبت عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تم تخزين العينات لمدة تصل إلى أسبوع واحد دون أي فرق ملحوظ.
3. En كتلة عينة تلطيخ وتضمين15،16
تنبيه: الكواشف تلطيخ المستخدمة في هذا القسم (البوتاسيوم ferrocyanide، التيتروكسيد أوسميوم، ثيوكاربوهيدرازيد، اسبارتات الرصاص، وخلات أورانيل) هي سامة للغاية، وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. ينصح باستخدام غطاء الدخان وPPE المناسبة.
- تلطيخ
- اغسل عينة صمام القلب الثابت لمدة 5 دقائق مع العازلة الباردة cacodylate 0.15 M. كرر الغسيل مرتين أخريين.
- غمر صمام القلب بالكامل في محلول من 1.5٪ فيروكيانيد البوتاسيوم، 0.15 M cacodylate، 2 mM كلوريد الكالسيوم، و 2٪ من التيتروكسيد الأوسميوم، على الجليد لمدة 1 ساعة.
- في حين أن العينة هي احتضان، وإعداد محلول ثيوكاربوهيدرازايد (TCH) عن طريق حل 0.1 غرام من TCH في 10 مل من ddH2O. وضع الحل في فرن 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. يهيج بلطف دوريا لضمان حل TCH تماما. تصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر مباشرة قبل الاستخدام.
- غسل العينات مع درجة حرارة الغرفة ddH2O عن طريق وضعها في أنبوب من DDH2O لمدة 5 دقائق وتهيج قليلا عن طريق هز الحاوية. كرر هذه العملية ثلاث مرات.
- ضعه في محلول TCH المصفى لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء خطوة الغسيل ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) مع درجة حرارة الغرفة ddH2O كما هو موضح في الخطوة 3.1.4.
- وبمجرد الانتهاء من ذلك، ضع العينة في 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل مرة أخرى لما مجموعه ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها مع درجة حرارة الغرفة ddH2O.
- احتضان العينة في خلات أورانيل 1٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- خلال هذا الوقت، وجعل حل 0.066 غرام من نترات الرصاص في 10 مل من محلول حمض الأسبارتيك الأسهم. ضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع 1 N KOH. ضع المحلول في فرن 60 درجة مئوية لإذابة نترات الرصاص.
- بعد الحضانة الليلية، قم بإجراء خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3.1.4. كرر ثلاث مرات. ثم، احتضان أنسجة صمام القلب في حل الأسبارتات الرصاص من الخطوة 3.1.8 في فرن 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تجفاف
- غسل الأنسجة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع ddH2O. كرر ثلاث مرات.
- تقديم حلول جديدة من 20٪، 50٪، 70٪، 90٪، و 100٪ الإيثانول في ddH2O. الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
- لتجفف نسيج صمام القلب. إجراء العلاجات اللاحقة من 20٪، 50٪، 70٪، و 90٪ الإيثانول على الجليد لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم إجراء علاجين لاحقين من الإيثانول 100٪ على الجليد لمدة 5 دقائق.
- نقل الأنسجة إلى الأسيتون الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة. ثم ضع في الأسيتون الطازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- تضمين
- جعل خليط الراتنج (انظر جدول المواد)وفقا لمواصفات الشركة المصنعة: 11.4 غرام من المكون A، 10 غرام من المكون B، 0.3 غرام من المكون C، و 0.05-0.1 غرام من المكون D. في البداية مزيج المكونات A و B عن طريق تسخين كل من المكونات إلى 60 درجة مئوية قبل إضافة المكونات C و D. سوف يتحول الخليط إلى لون العنبر عند إضافة المكونات C و D. وسوف تكون موحدة عندما مختلطة بشكل صحيح.
- جعل الخلائط مع نسب حجم 25:75، 50:50، و 75:25 الراتنج: الأسيتون. تخلط جيدا.
- وضع الأنسجة في العلاجات اللاحقة من 25:75، 50:50، و 75:25 الراتنج: خليط الأسيتون لمدة 2 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
- وضع الأنسجة في الراتنج 100٪ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- في اليوم التالي، ضع الأنسجة في راتنج 100٪ الطازج لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل أنسجة صمام القلب إلى كبسولة التضمين، واستبدال مع الراتنج الطازجة 100٪، ووضعها في فرن 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لعلاج.
- إجراء التصوير المترابط كما هو موضح أدناه.
4. التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة
- جبل كتلة عينة الراتنج على حامل عينة μCT مع لاصقة (الغراء أو الشريط على الوجهين يعمل بشكل جيد).
- ضع الحامل في غرفة μCT وأصلحه على المسرح عن طريق الشد على الكلية بحيث لا يكون هناك أي حركة من حاملها. سوف يقلل تحرك العينة أثناء الفحص من جودة الصورة.
- افتح واجهة المستخدم μCT بالنقر المزدوج فوق الرمز. إضافة مشروع عن طريق تحديد علامة + بجوار المشاريع وتعبئة الحقول الضرورية.
- بمجرد إنشاء هذا، ابحث عن المشروع الذي تم إنشاؤه، وحدده بالنقر فوقه. سيؤدي ذلك إلى فتح عمود ثان لعمليات الاستحواذ. حدد + بجوار عمليات الاستحواذ واملأ الحقول الضرورية.
- أغلق أبواب الغرفة وتسلح النظام عن طريق الضغط على زر التسليح على اللوحة الأمامية أو μCT. الاحماء بالأشعة السينية من واجهة المستخدم عن طريق تحديد الزر الذي يشير إلى الاحماء.
ملاحظة: سيقوم النظام تلقائيا بإيقاف تشغيل الأشعة السينية بعد إجراء عملية إحماء ناجحة. قم بتشغيل الأشعة السينية عن طريق تحديد الزر. - ضبط دوران المرحلة بحيث لا ينحرف مركز دوران العينة عن مركز الشاشة (أي أن العينة تقع ضمن مجال الرؤية للمسح الضوئي بأكمله). بالنسبة للنظام المستخدم في هذه التجربة، يتضمن ذلك تعديل مرحلة منطقة الاهتمام (ROI) تحت علامة التبويب المنسدلة كما هو مفصل أدناه.
- قم بتعيين تعديل مرحلة عائد الاستثمار عن طريق تعيين زاوية الدوران إلى 0° ووضع علامة على حافة العينة. ثم يتم تدوير العينة إلى 180 درجة ويتم وضع علامة على حافة العينة مرة أخرى.
- ضبط وضع محور x المرحلة العائد على الاستثمار بحيث حافة العينة بين هذه النقيضين. كرر هذه العملية لزوايا دوران 90 درجة و 270 درجة للموضع y.
- في حالة تسبب دوران العينة في انتقال الحواف من مجال الرؤية، قم بتقليل تكبير احتياجات μCT حتى تظهر حواف العينة في زوايا المجموعة أعلاه ويمكن إجراء تعديل مرحلة عائد الاستثمار الخشن.
- بمجرد تعديلها في التكبير السفلي ، قم بتحريك العينة أو الكاشف لزيادة التكبير ويمكن تعديل أوضاع عائد الاستثمار بشكل جيد.
ملاحظة: قد تحتاج هذه العملية إلى تكرار لضمان المحاذاة. ينتج عن المحاذاة المناسبة عينة تظهر حركة أفقية قليلة أو معدومة من خلال جميع زوايا دوران العينة.
- ضبط μCT إلى معلمات المسح المطلوب باستخدام برنامج الشركة المصنعة. وتشمل هذه المعلمات إمكانات الأنبوب، وتيار الأنبوب، ومسافة الكاشف، ومسافة العينة، ووقت التعرض، والمسار، وعدد الإسقاطات (انظر الجدول S1 لمعرفة معلمات اكتساب μCT المستخدمة في هذه الدراسة).
ملاحظة: يجب الاحتفاظ بمعلمات المعايرة، مثل مسح الحقل ومسح الحقل المظلم، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ما لم يذكر خلاف ذلك. على سبيل المثال، إذا كان نموذج كبير جدا ولا يمكن للنظام نقل العينة من طريقة عرض الحقل، ثم العينة تحتاج إلى إزالتها لإجراء مسح مسح معايرة الحقل. - بمجرد تعيين المعلمات، يمكن رؤية تقريب مدة الفحص عن طريق الضغط على زر تقدير الوقت. حدد الزر ابدأ لبدء الفحص.
- بعد الانتهاء من الفحص، تأكد من إيقاف تشغيل الأشعة السينية، فك الكلية، وإزالة العينة بعناية من غرفة μCT.
5. معالجة العينة وارتباط الصورة
- إعادة بناء إسقاطات μCT باستخدام خوارزمية إسقاط الخلفية المصفاة مع البرنامج المقدم من قبل الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- حدد علامة التبويب ريكون في أعلى الشاشة. حدد علامة التبويب المشروع والاستحواذ.
- حدد اقتران قالب recon بإسقاط تمت تصفيته مرة أخرى. اضغط على زر بدء إعادة التكون.
- تحديد الصمام الرئوي وتقسيمه باستخدام برنامج معالجة الصور. وهذا يتطلب معرفة مسبقة لتشريح الصمام الرئوي17. في الضغوط الشريانية المرتفعة ، تحاصر المنشورات وتحجب تجويف الصمام الرئوي.
- تحديد اتجاه التقطيع فيما يتعلق باتجاه المسح الضوئي والعينة. إعادة توجيه العينة بحيث يتم محاذاة اتجاه تشريح مع المحور المطلوب.
- تحديد المناطق ذات الاهتمام للتصوير عالي الدقة. في هذه التجربة، تم اختيار بطن (وسط) المنشور وتقاطع الشرياني فالفولار.
- إزالة الراتنج الزائد وعينة إما عن طريق شفرة الحلاقة أو الرملي لقطع كبيرة من المواد، أو عن طريق microtome لقطع أدق.
- مرة واحدة في موقع الاهتمام، قارن العينة المادية مع شرائح μCT الظاهري لتأكيد الموقع. وقد تم ذلك من خلال مقارنة الميزات التشريحية في المقطع العرضي.
6. تسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني18
- تقليل المقطع العرضي للعينة لاستيعاب SBF-SEM، حوالي 2.0 × 1.5 × 1.8 مم.
- قم بتركيب العينة المشذبة على كعب الألمنيوم SBF-SEM باستخدام الايبوكسي.
- معطف كتلة عينة مع الذهب 35 نانومتر. تدور العينة على المنصة لتطبيق طبقة حتى من الطلاء.
- تنفيس غرفة SBF-SEM وضبط ارتفاع شفرة السكين إلى ارتفاع المجهر eucentric.
- إدراج نموذج ومستوى كعب الروتين عينة.
- الصورة في ظل ظروف فراغ منخفضة لمنع الشحن ومع كاشف الروافض الخلفية (انظر الجدول S2 لمعلمات الاستحواذ SBF-SEM).
- صورة وغرزة مناطق متعددة من الاهتمام في التكبيرات المختلفة باستخدام البرمجيات الآلية (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر تناضح الشريان الرئوي إلى أنابيب الضغط في الشكل 1A. بعد تطبيق الضغط الهيدروستاتيكي ، ينتفض الجذع الرئوي شعاعيا(الشكل 1B)مما يشير إلى أن منشورات الصمام الرئوي في تكوين مغلق. تم تأكيد تشكيل الصمام الرئوي عن طريق μCT. في هذه الحالة، كانت المنشورات coapt (مغلقة) وكان annulus دائرية(الشكل 2A). الشكل 2B, C يظهر درجات متفاوتة من الضغط صمام رئوي غير كافية عن طريق إما التثبيت ( الشكل2B) أو انهيار الشرايين (الشكل 2C).
تم إرشاد اقتطاع كتلة العينة بواسطة تقديم وحدة تخزين μCT. في هذه الحالة، تم اختيار الطائرة الموازية لتقاطع الصينية أنبوبي كاتجاه تشريح. باستخدام المعالم التشريحية، كان حجم μCT الذي يجعل المقاطع العرضية الافتراضية مرتبطا بالصور البصرية(الشكل 3)لتأكيد اتجاه تشريح الموقع.
وبمجرد أن كانت كتلة العينة في الموقع والتوجه المطلوبين، تم التقاط صور SBF-SEM عالية الدقة في منطقة محلية داخل منشور. تم إجراء ارتباط الصورة بين حجم μCT تقديم شريحة الظاهري (الشكل 4A)، منخفضة الدقة صور SBF-SEM (الشكل 4B)، وصور SBF-SEM عالية الدقة (الشكل 4C). وبسبب تركيب العينة اليدوية، كانت هناك حاجة إلى شرائح مطلوبة من كتلة العينة لإنشاء سطح مستو قبل الحصول على الصور في SBF-SEM؛ وبالتالي ، فإن مواقع مختلفة بين الشكل 3 والشكل 4.
ويمكن رؤية ارتباط الصورة الكاملة بين مجموعات البيانات μCT وSBF-SEM في الفيديو 1. يمكن تمييز عينة الصمام الرئوي في تقديم حجم μCT بسهولة من راتنج التضمين المحيط بسبب تلطيخ ذرات المعادن الثقيلة. يتم قياس الأطوال والزوايا في الصورة لتوجيه تشريح. في هذا المثال، تم استخدام الطائرة الموازية للتقاطع الصيني الأنبوبي. شريحة افتراضية من خلال يحاكي إزالة المواد حتى يتم التوصل إلى عمق الاهتمام. تم التقاط صور عالية الدقة التقطها SBF-SEM في هذا المقطع العرضي وتم تسجيلها في مجموعة بيانات μCT.
بمجرد الحصول عليها ، يمكن استيراد الصور عالية الدقة التي التقطها SBF-SEM إلى معالج صور وتجميعها في تمثيل ثلاثي الأبعاد(الشكل 5)حيث يمكن تحديد المكونات خارج الخلية.
الشكل 1: صور تمثيلية للجذع الرئوي المصاب بانسطوم. الجذع الرئوي المقتطع (A) قبل و (B) بعد الضغط الهيدروستاتيكي. يشير الخط المنقط إلى تقاطع البطين الشرياني حيث توجد أنولوس الجذع الرئوي. لاحظ انصات الجذع الرئوي عند الضغط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حجم μCT التمثيلي جعل الصمام الرئوي. (أ) الصمام الرئوي في وضع مغلق مع منشورات امتدت بشكل كاف و coapt (دائرة). (B, C) الضغط غير الكافي للصمام الرئوي. لاحظ أن المنشورات ليست coapt بشكل صحيح (ب) وأن annulus ليست دائرية (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ارتباط صورة كتلة عينة الصمام الرئوي. (أ) μCT حجم تقديم شريحة الظاهري و (ب) كتلة العينة المادية بعد التشذيب التي اتخذتها المجهر البصري. تدور أقسام من منشورات الصمام الرئوي باللون الأحمر وتستخدم كمعالم لربط طريقتي التصوير المختلفتين. شريط المقياس يتوافق مع 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة ارتباط صورة الصمام الرئوي المقطعالعرضي. (أ) المقطع العرضي الظاهري الناتج عن تقديم حجم μCT. يشير المربع الأحمر إلى المنطقة التي تم تصويرها باستخدام SBF-SEM في (B). (B) صور نظرة عامة منخفضة الدقة للارتباط مع المقطع العرضي μCT. يمثل المربع الأزرق موقع التصوير عالي الدقة SBF-SEM (C). تتوافق أشرطة المقياس مع (B) 100 ميكرومتر و (C) 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:المنطقة المجزأة من الصمام الرئوي التي اتخذتها SBF-SEM. تم تكديس الصور المقطعية العرضية وتجميعها لتشكيل تمثيل ثلاثي الأبعاد لمنطقة الصمام الرئوي المحلية. تم تعيين التسميات إلى الخلايا البطانية (الأخضر) والخلايا الخلالية الصمامية (الأزرق) والألياف خارج الخلية (صفراء). الأبعاد التقريبية للمنطقة المصورة هي 30 ميكرومتر × 20 ميكرومتر × 100 ميكرومتر.
| أنبوب المحتملة | 70 كيلو فولت |
| أنبوب التيار | 75 ميكرون |
| وضع التركيز البؤري | M |
| مسار | مدور |
| التوقعات / الثورة | 2880 |
| طريقة | 3040 × 3040 بكسل |
| المتوسط | 1 |
| وقت التعرض | 1.0 s |
| عينة إلى بندقية المسافة | 15 ملم |
| مسافة كاشف إلى بندقية | 725 ملم |
| حجم فوكسل | 2.9 ميكرومتر |
| مجال الرؤية | 8.4 × 8.4 × 6.3 مم |
الجدول S1: معلمات التصوير لμCT.
| طاقة الهبوط | 2 - 2.5 كيلو فولت |
| شعاع الحالي | 100 - 400 pA |
| مسافة العمل | 6.5 - 7 مم |
| كاشف | VS-DBS |
| وقت الإقامة | 1 - 2 ميكروس |
الجدول S2: معلمات التصوير ل SBF-SEM.
الفيديو 1: تصحيح صورة مجموعات بيانات μCT و SBF-SEM. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إزالة البطينين يخدم غرضين. أولا، تعريض جانب البطين للضغط الجوي، وبالتالي يحتاج فقط إلى تطبيق ضغط عبر الصمام من الجانب الشرياني للصمام الرئوي لإغلاق، وثانيا، توفير قاعدة مستقرة لمنع التواء الجذع الرئوي. أثناء الضغط ، ينتقص الجذع الرئوي بشكل شعاعي وأقل شأنا ، مما يجعله عرضة للالتواء ، مما يسبب انهيار الجذع الرئوي. يوفر التحميل المسبق للصمام الرئوي بمحلول ملحي فحصا إضافيا للجودة لضمان أن الضغط كاف وإذا كان هناك أي تسرب في النظام. عمل التثبيت الأساسي سريع ، في غضون ثوان قليلة ، وبدون التحميل المسبق الهيدروستاتيكي مع المحلول الملحي ، يتم إصلاح الصمام الرئوي في تشكيل عشوائي. دون التحميل المسبق، كان معدل نجاح الصمام الرئوي المغلق حوالي 10٪ -20٪. مع خطوة التحميل المسبق ، كان معدل النجاح أعلى من 90٪.
تم ضبط ظروف التصوير μCT و SBF-SEM لهذا التطبيق. يمكن أن يكون سمك الصمام الرئوي، عند امتداده بالكامل، أقل من 10 ميكرومتر. وكقاعدة عامة، مطلوب عتبة 3 voxels لتكون قادرة على حل ميزة؛ لذلك تم مسح الاداءات حجم μCT مع حجم voxel من 2.9 ميكرومتر مع حقل رؤية من 8.4 × 8.4 × 6.3 ملم. يمكن تحقيق أحجام voxel أصغر في μCT ولكن هذا يتطلب إما تقليم العينة و / أو أوقات مسح أطول. ومن شأن عينة أصغر أن تسمح بدقة أعلى عن طريق تقريبها من مصدر الأشعة السينية. ويمكن أيضا تحقيق voxels أصغر عن طريق وضع كاشف الأشعة السينية مزيد من العودة من العينة. ومع ذلك، فإن هذا يقلل من التدفق الكلي على الكاشف ويضر بنسبة الإشارة إلى الضوضاء. كمرجع، كانت فحوصات μCT لدينا حوالي 5-6 ساعة في المدة. توجد حالات تصوير محددة مستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي S1 والجدول التكميلي S2).
هناك قيود على هذا الأسلوب. يتطلب الجزء الجراحي من هذا الإجراء خبرة في التعامل مع الحيوانات لعدم تعريض بنية الصمام الرئوي للخطر أثناء التعامل معها. بالإضافة إلى ذلك، التصوير هو الوقت المكثف ويتطلب أدوات التصوير متعددة. وكإشارة، كان التصوير عالي الدقة SBF-SEM حوالي أسبوع واحد من التصوير المستمر لعمق حوالي 100 ميكرومتر. هذه مهمة صعبة للجهاز أن تبقى مستقرة ومتسقة لجلسات التصوير الطويلة. ومن النهج الأكثر عملية وضع استراتيجية لأخذ العينات لتصوير عدم تجانس الصمام الرئوي بدقة دون استثمار الوقت. ولم يتحدد ذلك بعد. حتى الآن، تم تنفيذ سير العمل المترابط بالكامل على فأر واحد، ولكنه أظهر جدوى وإمكانات سير العمل المترابط في التحقيق في الصمام الرئوي عبر مقاييس الطول.
وقد تنطوي التكرارات المستقبلية لهذا النهج المترابط على تجارب μCT الموقعية، بحيث يمكن أن تتعرض نفس العينة لضغط مختلف عبر الصمام لإزالة الاختلاف من عينة إلى عينة. وهذا محدود حاليا من خلال استقرار العينة والأجهزة لفترات المسح الموسعة ، وجهاز الضغط المدمج في أنظمة التصوير ، والتباين بسبب معاملات التوهين المماثلة للماء والأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الضغوط عبر الصمامية كانت تعكس الظروف الفسيولوجية ، إلا أنها لا تمثل التدفق النابض الذي هو سمة من سمات انكماش القلب. ومع ذلك، فقد تبين أن معدل السلالة له تأثير ضئيل على تشكيل المنشور. في التكرارات المستقبلية ، قد يثبت أنه أكثر ملاءمة لهندسة جهاز قادر على إدارة التدفق النابض9. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الكثير من العمل الاستجواب اليدوي للعينة، حيث لا يوجد حاليا سير عمل تلقائي. تم تحديد موقع الصمام الرئوي ومعالجة العينات نحو منطقة الاهتمام وارتباط الصورة والتسجيل يدويا ، ولكن من المفيد في المستقبل تبسيط المعالجة والتخفيف من الذاتية.
العمل المقدم هو سير عمل مترابط لإصلاح تشكيل الصمام الرئوي وتسجيل التصوير في μCT و SBF-SEM. المعلومات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة سوف تستخدم في نهاية المطاف لتحديد الميكانيكا الحيوية الكامنة للصمام الرئوي في نماذج مورين، والتي لم يتم توضيحها بعد. يمكن وصف الميكانيكا الحيوية فالفولار تماما من خلال هندستها ومصفوفتها خارج الخلية ، ولكن هذه هي على مقياسين طول مختلفين. للقيام بذلك، هناك حاجة إلى التحكم الدقيق في عدم تجانس الصمام ورسم خرائط دقيقة للصور عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية فيما يتعلق بموقعها داخل الصمام الرئوي. ويجري بالفعل تنفيذ هذا سير العمل المترابط في تجارب أخرى لرسم مقارنات بين الفئران غير المثالية من النوع البري وتولد العظام المعدلة وراثيا لمقارنة اختلافات المصفوفة خارج الخلية الرجفان ويمكن استقراءها بسهولة إلى عيوب خلقية أخرى مثل تشكيل الصمام ثنائي الشرف19،20. هذه المعلومات إلى جانب البروتيوميات المحتملة سوف توفر صورة كاملة عن كيفية اختلاف الميكانيكا الحيوية بين النموذجين الحيوانيين مورين.
على الرغم من هذا العمل تصوير الصمام الرئوي فقط، هذا سير العمل قابل للتعديل بسهولة إلى النظم البيولوجية الأخرى غير المتجانسة والهرمية. لقد استخدمنا تقنيات التصوير ثلاثي الأبعاد لالتقاط التنظيم المعماري ل ECM ، ولكن يمكن إلحاق تقنيات الدقة الأعلى ، مثل المجهر الإلكتروني للإرسال أو المسح الضوئي الإلكتروني لنقل العدوى ، اعتمادا على المعلومات المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل، جزئيا، من قبل R01HL139796 وR01HL128847 المنح إلى CKB و RO1DE028297 وCBET1608058 لDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , CRC Press. (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
