Summary
Här beskriver vi ett korrelativt arbetsflöde för excision, trycksättning, fixering och avbildning av murinpulmonell ventilen för att bestämma bruttokonformationen och lokala extracellulära matrisstrukturer.
Abstract
De underliggande orsakerna till hjärtklaff relaterade-sjukdom (HVD) är svårfångade. Murine djurmodeller är ett utmärkt verktyg för att studera HVD, men den kirurgiska och instrumentella expertis som krävs för att exakt kvantifiera strukturen och organisationen över flera längdskalor har hämmat dess framsteg. Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av murin dissekering, en block färgning, prov bearbetning och korrelativa bildframställning förfaranden för att avbilda hjärtklaffen i olika längdskalor. Hydrostatiskt transvalvulärt tryck användes för att kontrollera temporal heterogenitet genom att kemiskt fixa hjärtklaffen konformation. Mikrotomografi (μCT) användes för att bekräfta hjärtklaffens geometri och ge en referens för den nedströms provbehandling som behövs för seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM). Högupplösta seriella SEM-bilder av den extracellulära matrisen (ECM) togs och rekonstruerades för att ge en lokal 3D-representation av sin organisation. μCT och SBF-SEM bildframställning metoder var sedan korrelerade för att övervinna rumsliga variationen över pulmonell ventilen. Även om det arbete som presenteras uteslutande är på lungventilen, kan denna metodik antas för att beskriva den hierarkiska organisationen i biologiska system och är avgörande för den strukturella karakteriseringen över flera längdskalor.
Introduction
Lungventilen (PV) tjänar till att säkerställa enkelriktat blodflöde mellan rätt ventrikel och lungartären. Lungventil missbildningar är associerade med flera former av medfödd hjärtsjukdom. Den nuvarande behandlingen för medfödd hjärtklaffsjukdom (HVD) är valvulär reparation eller ventilbyte, vilket kan kräva flera invasiva operationer under patientens livstid1. Det har allmänt accepterats att hjärtklaffens funktion härrör från dess struktur, ofta kallad strukturfunktionen korrelerar. Mer specifikt dikterar hjärtats geometriska och biomekaniska egenskaper dess funktion. De mekaniska egenskaperna bestäms i sin tur av ECM: s sammansättning och organisation. Genom att utveckla en metod för att bestämma de biomekaniska egenskaperna hos murinhjärtaventiler kan transgena djurmodeller användas för att förhöra ECM: s roll på hjärtklaffens funktion och dysfunktion2,3,4,5.
Murindjursmodellen har länge betraktats som standard för molekylära studier eftersom transgena modeller är mer lättillgängliga hos möss jämfört med andra arter. Murin transgena modeller ger en mångsidig plattform för forskning av hjärtklaffrelaterade sjukdomar6. Men de kirurgiska kraven på expertis och instrumentering för att karakterisera både geometrin och ECM-organisationen har varit ett stort hinder för att gå vidare med HVD-forskningen. Hstologiska data i litteraturen ger en bild i murin hjärtklaff extracellulär matrisinnehåll, men endast i form av 2D-bilder, och kan inte beskriva dess 3D-arkitektur7,8. Dessutom är hjärtklaffen både rumsligt och tidsmässigt heterogen, vilket gör det svårt att dra slutsatser över experiment om ECM-organisation om provtagningen och konformationen inte är fixad. Konventionella 3D-karakteriseringsmetoder, såsom MRI eller 3D-ekokardiografi, ger inte den upplösning som krävs för att lösa ECM-komponenterna9,10.
Detta arbete beskriver ett helt korrelativt arbetsflöde där tidsmässiga heterogenitet på grund av hjärt cykeln åtgärdades genom att fastställa konformationen av murin PV med hydrostatiska transvalvular tryck. Den rumsliga heterogeniteten kontrollerades exakt av provtagningsregioner av intresse och registrering av datauppsättningar från olika bildframställningsmetoder, särskilt μCT och seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi, över olika längdskalor. Denna metod för scouting med μCT för styrning nedströms provtagning har föreslagits tidigare, men eftersom lungventilen uppvisar tidsvariation, behövdes en ytterligare kontrollnivå på kirurgisk nivå11.
In vivo-studier som beskriver murin hjärtklaff biomekanik är glesa och förlitar sig istället på beräkningsmodeller när man beskriver deformationsbeteendet. Det är av avgörande betydelse att lokala extracellulära data på nanometerlängdsskalan är relaterade till hjärtklaffens geometri och placering. Detta ger i sin tur kvantifierbara, rumsligt kartlagda fördelningar av mekaniskt bidragande ECM-proteiner, som kan användas för att förstärka befintliga biomekaniska hjärtklaffmodeller12,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av djur i denna studie var i enlighet med Rikstäckande barnsjukhus institutionella djurvårds- och användningskommitté enligt protokoll AR13-00030.
1. Lungventil excision
- Spara automatiskt de nödvändiga verktygen som behövs för musav dissekeringen. Detta inkluderar fin sax, mikrotång, mikrovaskulära klämmor, klämpliceringstångar, mikroneedlehållare, fjädersax och upprullningsdon.
- Acklimatisera alla möss i minst 2 veckor före operationen. Ta bort C57BL/6 möss, ungefär 1 år, från sina burar och väg, avliva sedan med en ketamin/xylazincocktail (3:1 ketamin:xylazin, 0,01 ml per g) överdos.
- Placera musen i en dorsal avskumposition på en bricka och säkra benen med tejp. När du är säkrad, utför thoracotomin.
- Exponera hjärtat genom att ta bort överflödig fettvävnad och fascia.
- Ta bort höger atrium och granska genom vänster ventrikel med saltlösning i rumstemperatur (0,9% NaCl). Perfusionen ska ta cirka 20 ml över 30 s. Detta resulterar i exsanguination av musen.
- Ta bort hela hjärtat genom att skära av den överlägsna vena cava, sämre vena cava, lungartären och aortan. Särskild försiktighet bör tas för lungartären. Skär ca 2 mm ovanför ventriculo-arteriell korsning, eftersom detta kommer att fungera som röret för trycksatthet.
- Ta bort vänster och höger ventrikel för att utsätta kamrarna för atmosfärstryck. Se till att lungstammens struktur inte påverkas av avlägsnandet av ventriklarna.
2. Tryckfixering av lungventil
- Anastomos tryckslangar med lungartären, lämnar cirka 1 mm avstånd mellan den sino-rörformiga korsningen och änden av slangen för att rymma för stora rörelser i broschyrerna och lungstammen.
- Lyft behållaren till ett analogt fysiologiskt tryck och fyll den med saltlösningen. Testa genomflödessystemet för att säkerställa att det inte finns några blockeringar eller luftbubblor.
- Fäst en kran på den anastomoserade lungventilen och se till att slangarna (dvs. inga luftbubblor) flödar genom att byta utflödeskanal. När flödet är tillräckligt, byt utflödet till anastomosed lungventilen och säkerställa trycksatt av lungstammen. Detta identifieras av pulmonell stam distention.
- När trycksattentatet av lungstammen har bekräftats, införliva gradvis primära fixativ lösning (1,25% glutaraldehyd, 1,0% paraformaldehyd i 0,15 M kakodylat) tills saltlösningen rensas. Detta görs genom att ta bort en del, cirka 25% av reservoarkapaciteten, av saltlösningen och ersätta den med det primära fixativet.
VARNING: De fixeringar som används (paraformaldehyd och glutaraldehyd) är mycket giftiga och lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) bör bäras för att säkerställa säkerheten. - Placera en fixativt blötblöt gasväv över vävnadsprovet för att förhindra torkning.
- Granska fixeringen i 3 timmar och fyll på behållaren efter behov för att bibehålla ett konstant tryck. Under hela fixeringen är det inte ovanligt att lungventilen krymper på grund av den kemiska fixeringen. Om så är fallet, fyll ständigt på behållaren med primär fixativ för att upprätthålla fysiologiskt tryck.
- Förvara hjärtklaffen i fixeringslösningen vid 4 °C tills den används. Proverna lagrades i upp till 1 vecka utan någon märkbar skillnad.
3. En block provfärgning och inbäddning15,16
VARNING: De färgreagenser som används i detta avsnitt (kaliumferocyanid, osmiumtetroxid, tiookarbohydrazid, bly aspartat och uranylacetat) är mycket giftiga och bör hanteras med extrem försiktighet. Användning av en rökhuv och korrekt personlig skyddsutrustning rekommenderas.
- Färgning
- Tvätta det fasta hjärtklaffprovet i 5 min med kall 0,15 M kakodylatbuffert. Upprepa tvätten två gånger till.
- Helt nedsänkt hjärtklaffen i en lösning av 1,5% kalium ferrocyanid, 0,15 M kakodylat, 2 mM kalciumklorid och 2% osmium tetroxid, på is i 1 h.
- Medan provet inkuberar, förbered tioocarbohydrazidlösning (TCH) genom att lösa upp 0,1 g TCH i 10 ml ddH2O. Placera lösningen i en 60 °C ugn i 1 timme. Rör försiktigt om regelbundet för att säkerställa att TCH löses upp helt. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm sprutfilter omedelbart före användning.
- Tvätta proverna med rumstemperatur ddH2O genom att placera dem i ett rör ddH2O i 5 min och omrör det något genom att skaka behållaren. Upprepa den här processen tre gånger.
- Placera den i filtrerad TCH-lösning i 20 minuter vid rumstemperatur. Utför tvättsteget tre gånger (5 min vardera) med rumstemperatur ddH2O enligt beskrivningen i steg 3.1.4.
- När du är klar, placera provet i 2% osmium tetroxid i 30 min vid rumstemperatur. Tvätta sedan den igen i totalt tre gånger i 5 min vardera med rumstemperatur ddH2O.
- Inkubera provet i 1% uranylacetat över natten vid 4 °C.
- Under denna tid, gör en lösning på 0,066 g blynitrat i 10 ml aspartikelsyrabuljonglösning. Justera pH-5,5 med 1 N KOH. Placera lösningen i en ugn på 60 °C för att lösa upp blynitrat.
- Efter inkubationen över natten ska du utföra tvättsteget enligt beskrivningen i steg 3.1.4. Upprepa tre gånger. Inkubera sedan hjärtklaffvävnaden i bly aspartatlösning från steg 3.1.8 i en 60 °C ugn i 30 min.
- Uttorkning
- Tvätta vävnaderna i 5 min vid rumstemperatur med ddH2O. Upprepa tre gånger.
- Gör nya lösningar på 20%, 50%, 70%, 90%, och 100% etanol i ddH2O. Håll på is tills den används.
- För att dehydrera hjärtklaffvävnaden. Utför efterföljande behandlingar på 20%, 50%, 70% och 90% etanol på is i 5 minuter vardera. Utför sedan två efterföljande behandlingar av 100% etanol på is i 5 min.
- Flytta vävnaden till iskall aceton i 10 minuter. Placera sedan i färsk aceton vid rumstemperatur i 10 min.
- Inbäddning
- Gör hartsblandningen (se materialförteckningen)enligt tillverkarens specifikationer: 11,4 g komponent A, 10 g komponent B, 0,3 g komponent C och 0,05-0,1 g komponent D. Blanda inledningsvis komponenterna A och B genom att värma upp var och en av komponenterna till 60 °C innan komponenterna C och D tillsätts. Blandningen blir till en bärnstensfärgad färg när komponenterna C och D tillsätts. Det kommer att vara enhetligt när det blandas ordentligt.
- Gör blandningar med volymförhållanden på 25:75, 50:50 och 75:25 harts:aceton. Blanda noggrant.
- Placera vävnader i efterföljande behandlingar av 25:75, 50:50 och 75:25 harts: acetonblandning för 2 timmar vardera vid rumstemperatur.
- Placera vävnader i 100% harts över natten vid rumstemperatur.
- Följande dag, placera vävnader i färskt 100% harts i 2 h vid rumstemperatur.
- Överför hjärtklaffvävnaderna till en inbäddningskapsel, ersätt med färskt 100% harts och placera i en 60 °C ugn i 48 timmar för att härda.
- Utför korrelativ avbildning enligt nedan.
4. Mikrotomografitomografitomografi
- Montera hartsprovblocket på en μCT-provhållare med lim (lim eller dubbelhäftande tejp fungerar bra).
- Placera hållaren i μCT-kammaren och fäst den på scenen genom att skruva fast hylsan så att hållaren inte rör sig. Provrörelser under skanningen minskar bildkvaliteten.
- Öppna μCT-användargränssnittet genom att dubbelklicka på ikonen. Lägg till ett projekt genom att välja + tecknet bredvid Projekt och fylla i nödvändiga fält.
- När detta har skapats hittar du det skapade projektet och markerar det genom att klicka på det. Detta öppnar en andra kolumn Förvärv. Välj + bredvid Förvärv och fyll i nödvändiga fält.
- Stäng kammardörrarna och beväpna systemet genom att trycka på armeringsknappen på frontpanelen eller μCT. Uppvärmningsröntgenstrålar från användargränssnittet genom att välja knappen som anger Uppvärmning.
OBS: Systemet stänger automatiskt av röntgenstrålarna efter en lyckad uppvärmningsprocedur. Slå på röntgenbilder genom att välja knappen. - Justera scenrotationen så att provets rotationscentrum inte avviker från bildskärmens mitt (dvs. provet ligger inom synfältet för hela skanningen). För det system som används för detta experiment innebär detta att man justerar stadiet för intresseområde (ROI) under listrutan enligt nedan.
- Ställ in ROI-stegjusteringen genom att ställa in rotationsvinkeln på 0° och markera provets kant. Provet roteras sedan till 180° och provets kant markeras igen.
- Justera ROI-scenens x-axelposition så att provets kant ligger mellan dessa två ytterligheter. Upprepa denna process för rotationsvinklar på 90° och 270° för y-positionen.
- Om provets rotation får kanterna att röra sig ut ur synfältet, minska förstoringen av μCT-behoven tills provets kanter är synliga i ovanstående inställda vinklar och en grov ROI-stegjustering kan göras.
- När provet eller detektorn har justerats vid den nedre förstoringen, flytta provet eller detektorn för att öka förstoringen och ROI-positionerna kan finjusteras.
OBS: Denna process kan behöva upprepas för att säkerställa anpassning. Korrekt justering resulterar i ett prov som visar liten eller ingen horisontell rörelse genom alla provrotationsvinklar.
- Justera μCT till önskade skanningsparametrar med hjälp av tillverkarens programvara. Dessa parametrar inkluderar rörpotential, rörström, detektoravstånd, provavstånd, exponeringstid, bana och antalet projektioner (se tabell S1 för de μCT-förvärvsparametrar som används i denna studie).
OBS: Kalibreringsparametrar, såsom tydliga fält- och mörka fältskanningar, bör hållas enligt tillverkarens specifikationer om inget annat anges. Om ett exempel till exempel är för stort och systemet inte kan flytta exemplet från fältvyn måste exemplet tas bort för att utföra tydliga fältkalibreringsskanningar. - När parametrarna har ställts in kan en approximation av skanningens varaktighet ses genom att trycka på knappen Tidsuppskattning. Välj startknappen för att påbörja genomsökningen.
- Efter skanningen, se till att röntgenstrålarna är avstängda, skruva av hylsan och ta försiktigt bort provet från μCT-kammaren.
5. Exempelbehandling och bildkorrelation
- Rekonstruera μCT-projektioner med hjälp av en filtrerad bakåtprojektionsalgoritm med den programvara som tillhandahålls av tillverkaren (se Materialförteckning ).
- Välj fliken Rekognoscering högst upp på skärmen. Välj fliken Projekt och anskaffning.
- Välj rekognosceringsmallen associerad med filtrerad bakåtprojektion. Tryck på knappen Starta rekognoscering.
- Identifiera och segmentera lungventilen med hjälp av bildbehandlingsprogram. Detta kräver förkunskaper om lungventilens anatomi17. Vid förhöjt kranskärlstryck coapt broschyrerna och blockerar lungventilens lumen.
- Identifiera skivningsorienteringen med avseende på skanningsriktningen och provet. Rikta om provet så att skivriktningen är i linje med önskad axel.
- Identifiera regioner av intresse för högupplöst bildbehandling. I detta experiment valdes magen (mitten) av broschyren och arterio-valvular korsningen.
- Ta bort överflödigt harts och prov genom antingen rakblad eller slipning för stora bitar av material, eller genom mikrotom för finare bitar.
- En gång på en plats av intresse, jämför det fysiska provet med virtuella μCT-skivor för att bekräfta platsen. Detta gjordes genom att jämföra anatomiska funktioner vid tvärsnittet.
6. Seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi18
- Minska provexem:ns tvärsnitt så att SBF-SEM rymmer cirka 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
- Montera det trimmade provet på SBF-SEM aluminiumstub med epoxi.
- Täck provblocket med 35 nm guld. Snurra provet på plattformen för att applicera ett jämnt lager av beläggning.
- Ventilera SBF-SEM-kammaren och justera knivbladets höjd till mikroskopets eucentriska höjd.
- Sätt i provet och jämna ut provstubben.
- Bild under låga vakuumförhållanden för att förhindra laddning och med backscatterdetektor (se tabell S2 för SBF-SEM-förvärvsparametrar).
- Avbilda och sy flera regioner av intresse vid olika förstoringar med hjälp av automatiserad programvara (se Materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungartärens anastomos till tryckslangen visas i figur 1A. Efter applicering av hydrostatiskt tryck strålar lungstammen radiellt (figur 1B) vilket indikerar att lungventilbroschyrerna är i en sluten konfiguration. Pulmonell ventil konformation bekräftades av μCT. I detta fall var bipacksedlarna coapt (slutna) och annulusen var cirkulär (figur 2A). Figur 2B, C visar varierande grad av otillräcklig lungventil trycksättning genom antingen fixering ( Figur2B) eller kranskärlens kollaps (Figur 2C).
Provblocksbeskärningen styrdes av μCT-volymåtergivningen. I detta fall valdes planet parallellt med den sino-tubulära korsningen som skivningsriktningen. Med hjälp av anatomiska landmärken korrelerades μCT-volymen som återger virtuella tvärsnitt med optiska bilder (figur 3) för att bekräfta skivriktningen och platsen.
När provblocket var på önskad plats och orientering togs högupplösta SBF-SEM-bilder i en lokal region i en broschyr. Bildkorrelationen gjordes mellan det virtuella segmentet μCT volume rendering (Figur 4A), lågupplösta SBF-SEM-bilder (figur 4B) och högupplösta SBF-SEM-bilder (Figur 4C). På grund av den manuella provmonteringen behövdes nödvändiga skivor av provblocket för att skapa en plan yta innan de fick bilder i SBF-SEM; De olika platserna mellan figur 3 och figur 4.
En fullständig bildkorrelation mellan μCT- och SBF-SEM-datauppsättningar kan ses i video 1. Lungventilprovet i μCT-volymrendering kan lätt urskiljas från det omgivande inbäddningshartset på grund av färgning av tungmetallatomer. Längder och vinklar mäts i bilden för att styra skivningen. I det här exemplet användes planet parallellt med den sino-tubulära korsningen. En virtuell skiva genom emulerar avlägsnandet av materialet tills djupet av intresse uppnås. Högupplösta bilder tagna av SBF-SEM togs vid detta tvärsnitt och registrerades i μCT-datauppsättningen.
När högupplösta bilder har förvärvats kan de importeras till en bildprocessor och sammanställas till en 3D-representation (figur 5) där extracellulära komponenter kan identifieras.
Figur 1: Representativa bilder av anastomoserad lungstam. Den strukna lungstammen( A) före och (B) efter hydrostatisk trycksattisering. Den prickade linjen anger ventriculo-arteriell korsning där annulus av pulmonell stammen bor. Observera lungstammens distention vid trycksattisering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Representativ μCT-volymrenderingspulmonell ventil. (A) Lungventilen är i stängt läge med broschyrerna tillräckligt sträckta och coapt (cirkel). B,C) Otillräcklig trycksattisering av lungventilen. Observera att bipacksedlarna inte är ordentligt coapt (B) och att annulusen inte är cirkulär (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Bildkorrelation av provblock för lungventil. a)μCT-volymrendering virtuell skiva och(B)fysiskt provblock efter trimning tagen med optisk mikroskopi. Delar av lungventilbroschyrer är inringade i rött och användes som landmärken för att korrelera de två olika bildbehandlingsmetoderna. Skalstrecket motsvarar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bildkorrelation av avbildat tvärsnitt av lungventilen. (A) Virtuellt tvärsnitt som genereras av μCT-volymåtergivning. Röd ruta anger den region som avbildades med SBF-SEM i (B). (B) Lågupplösta översiktsbilder för att korrelera med μCT-tvärsnitt. Blå låda representerar platsen för (C) högupplöst SBF-SEM-avbildning. Skalstänger motsvarar (B) 100 μm och (C) 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Segmenterad region i lungventilen som SBF-SEM har tagit. Tvärsnittsbilder staplades och sammanställdes för att bilda en 3D-representation av en lokal pulmonell ventil region. Etiketter tilldelades endotelceller (gröna), valvulära interstitiella celler (blå) och extracellulära fibrer (gula). De ungefärliga dimensionerna i den bildade regionen är 30 μm x 20 μm x 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Rörpotential | 70 kV |
| Rörström | 75 μA |
| Fokusläge | M |
| Bana | Cirkulär |
| Projektioner/revolution | 2880 |
| Läge | 3040 x 3040 px |
| Genomsnitt | 1 |
| Exponeringstid | 1,0 s |
| Avstånd mellan prov och pistol | 15 mm |
| Avstånd mellan detektorer och vapen | 725 mm |
| Voxel storlek | 2,9 μm |
| Synfält | 8,4 × 8,4 × 6,3 mm |
Tabell S1: Bildparametrar för μCT.
| Landningsenergi | 2 - 2,5 kV |
| Strålström | 100 - 400 pA |
| Arbetsavstånd | 6,5 - 7 mm |
| Detektor | VS-DBS |
| Uppehållstid | 1 - 2 μs |
Tabell S2: Bildparametrar för SBF-SEM.
Video 1: Bildkorrigering av datamängderna μCT och SBF-SEM. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avlägsnande av ventriklarna tjänar två syften. Först exponera ventrikelsidan för atmosfärstrycket och behöver därmed bara applicera ett transvalvulärt tryck från lungventilens kranskärlssida för att stänga och för det andra, vilket ger en stabil bas för att förhindra vridning av lungstammen. Under trycksattisering distends lungstammen radiellt och sämre, vilket gör den benägen att vrida, vilket orsakar kollapsen av lungstammen. Förladdning av lungventilen med en saltlösning ger en extra kvalitetskontroll för att säkerställa att trycksattenteringen är tillräcklig och om det finns några läckor i systemet. Verkan av det primära fixativet är snabb, i storleksordningen några sekunder, och utan hydrostatisk förladdning med saltlösningen är lungventilen fixerad i en slumpmässig konformation. Utan förladdning var framgångsgraden för en sluten lungventil cirka 10%-20%. Med förladdningssteget var framgångsgraden över 90%.
μCT och SBF-SEM imaging villkor var inställda för denna applikation. Lungventilen kan, när den är helt sträckt, vara mindre än 10 μm tjock. Som en tumregel krävs en tröskel på 3 voxels för att kunna lösa en funktion. Så μCT volym renderingar skannades med en voxel storlek på 2,9 μm med ett synfält på 8,4 x 8,4 x 6,3 mm. Mindre voxelstorlekar kan uppnås i μCT men detta kräver antingen provklippning och/eller längre skanningstider. Ett mindre prov skulle möjliggöra högre upplösning genom att placera det närmare röntgenkällan. Mindre voxels kan också uppnås genom att placera röntgendetektorn längre tillbaka från provet; Detta minskar dock det totala flödet på detektorn och äventyrar signal-till-brus-förhållandet. Som referens var våra μCT-skanningar cirka 5-6 h långa. Särskilda bildframställningsförhållanden som används i denna studie finns i kompletterande tabell S1 och tilläggstabell S2).
Det finns begränsningar för den här metoden. Den kirurgiska delen av detta förfarande kräver expertis inom djurhantering för att inte äventyra lungventilstrukturen vid hantering. Dessutom är avbildningen tidsintensiv och kräver flera bildinstrument. Som referens var den högupplösta SBF-SEM-avbildningen cirka 1 veckas kontinuerlig avbildning för ett djup av cirka 100 μm. Detta är en krävande uppgift för instrumentet att förbli stabilt och konsekvent för långa bildsessioner. Ett mer praktiskt tillvägagångssätt skulle vara att utforma en provtagningsstrategi för att exakt beskriva lungventilens heterogenitet utan tidsinvesteringen. Detta är ännu inte bestämt. Hittills har hela det korrelativa arbetsflödet gjorts på en mus men har visat genomförbarheten och potentialen hos det korrelativa arbetsflödet för att undersöka lungventilen över längdskalor.
Framtida iterationer av detta korrelativa tillvägagångssätt kan omfatta situ μCT-experiment, så att samma prov kan utsättas för olika transvalvulära tryck för att avlägsna variation mellan prover. Detta begränsas för närvarande av prov- och instrumentstabilitet för förlängda skanningstider, en trycksättningsapparat som är integrerad i bildsystem och kontrast på grund av liknande dämpningskoefficienter för vatten och vävnad. Dessutom, även om de transvalvular trycket återspeglade fysiologiska villkor, det är inte representativt för pulsatile flödet som är karakteristiska för hjärt sammandragning. Det har dock visat sig att belastningshastigheten har liten effekt på broschyrens överensstämmelse. I framtida iterationer kan det visa sig mer relevant att konstruera en enhet som kan administrera pulsatilflöde9. Dessutom kräver mycket av arbetet manuella förhör av exemplet, eftersom det för närvarande inte finns något automatiserat arbetsflöde. Att lokalisera lungventilen, provbehandling mot intresseområdet, bildkorrelation och registrering gjordes manuellt, men skulle visa sig användbart i framtiden för att effektivisera bearbetningen och mildra subjektiviteten.
Det arbete som presenteras är ett korrelativt arbetsflöde för att fastställa överensstämmelsen mellan lungventilen och registrera avbildning i μCT och SBF-SEM. Den information som erhålls med denna metod kommer i slutändan att användas för att bestämma den underliggande biomekaniken hos lungventilen i murindjurmodeller, som ännu inte har klarlagts. Valvulär biomekanik kan beskrivas helt av dess geometri och extracellulära matris, men dessa är på två olika längdskalor. För att göra detta krävs exakt kontroll av ventilens heterogenitet och noggrann kartläggning av högupplösta bilder av den extracellulära matrisen med avseende på dess placering i lungventilen. Detta korrelativa arbetsflöde implementeras redan i andra experiment för att dra jämförelser mellan vilda och transgena osteogenesis imperfecta möss för att jämföra fibrillära extracellulära matrisskillnader och kan lätt extrapoleras till andra medfödda defekter som bicuspidventilbildning 19,20. Denna information i kombination med möjliga proteomiker kommer att ge en fullständig bild av hur biomekaniken kommer att skilja sig mellan de två murindjursmodellerna.
Trots detta arbete som bara skildrar lungventilen är detta arbetsflöde lätt att ändra till andra heterogena, hierarkiska biologiska system. Vi använde 3D-bildteknik för att fånga ECM: s arkitektoniska organisation, men tekniker med högre upplösning, såsom transmissionselektronmikroskopi eller scanningöverföringselektronmikroskopi, kan läggas till beroende på önskad information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av R01HL139796 och R01HL128847 bidrag till CKB och RO1DE028297 och CBET1608058 för DWM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , CRC Press. (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
