Summary
نقدم طريقة للتحقيق في تنظيم الخلايا الشوندروسيتية المكانية في الورم الليفي أنولوس للقرص الفقري باستخدام طريقة تقسيم بصري.
Abstract
انحطاط القرص الفقري (IVD) هو السبب الرئيسي لآلام أسفل الظهر ويستلزم درجة عالية من الضعف للأفراد المتضررين. لفك انحطاط القرص وتكون قادرة على تطوير نهج التجديد فهم شامل للبيولوجيا الخلوية لل IVD أمر ضروري. أحد جوانب هذه البيولوجيا التي لا تزال دون إجابة هو مسألة كيفية ترتيب الخلايا مكانيا في حالة فسيولوجية وأثناء الانحطاط. الخصائص البيولوجية لل IVD وتوافرها تجعل من الصعب تحليل هذا النسيج. تبحث هذه الدراسة في تنظيم الخلايا الشوندريوسية المكانية في الورم الليفي الكولوس من التطور الجنيني المبكر إلى انحطاط المرحلة النهائية. يتم تطبيق طريقة الأقسام البصرية (Apotome) لإجراء تحليلات تلطيخ عالية الدقة باستخدام الأنسجة الجنينية البقرية كنموذج حيواني وأنسجة القرص البشري التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة العمود الفقري. من كثافة chondrocyte عالية جدا في القرص البقري الجنيني في وقت مبكر، وعدد من الخلايا يقلل خلال الحمل والنمو، والنضج. في الأقراص البشرية ، رافقت زيادة الكثافة الخلوية تطور انحطاط الأنسجة. كما سبق أن ثبت في الغضروف المفصلي، تشكيل الكتلة يمثل سمة مميزة من انحطاط القرص المتقدمة.
Introduction
القرص الفقري (IVD) هو بنية تعتمد على الغضاريف التي كيميائيا بيولوجيا وفيما يتعلق العمارة الخلوية، للوهلة الأولى، يشبه في نواح كثيرة الغضاريف المفصلية1. في الواقع، يتميز كل من انحطاط IVD وهشاشة العظام (OA) من الغضاريف المفصلية بضيق المساحة المشتركة بسبب ارتداء الغضاريف، والكيس تحت الوخزات وتشكيل هشاشة العظام، والتصلب تحت الوخز2،3. على الرغم من هذه التشابهات الظاهرية تختلف العمارة والدور الوظيفي لكلا النسيجين. في حين تتكون مصفوفة الغضروف المفصلي بشكل رئيسي من شبكة الكولاجين من النوع الثاني المكونة للممرات ، يتكون IVD من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة: يأخذ اللبوس النواة الغني بالكولاجين من النوع الثاني في المركز الأحمال المحورية وينقلها إلى حلقة شاملة من ألياف الكولاجين الدائرية المعبأة بكثافة I والتي تسمى ليفية أنولوس. وظيفتها هي امتصاص الضغوط المحورية المترجمة التي تتلقاها النواة الغنية بالبروتيوغليكان والمياه مع قوة الألياف الطولية الشدية. في أعلى وأسفل كل نواة و anulus لوحة نهاية كارتيلاجينوس الهيالين يشكل تقاطع الفقرات المجاورة4 (الشكل 1).
في الغضاريف المفصلية، يمكن العثور على أربعة أنماط مميزة chondrocyte المكانية: أزواج، سلاسل، سلاسل مزدوجة، مجموعات صغيرة كبيرة على التوالي5،6،7 ( الشكل2). وترتبط التغيرات في هذا النمط مع بداية الزراعة العضوية والتقدم8،9. chondrocyte المكانية المنظمة هي أيضا مؤشرا على خاصية وظيفية مباشرة من الغضاريف، وهي صلابة لها، مما يؤكد على الصلة الوظيفية لهذا النهج الدرجات القائمة على الصورة10،11. ويمكن بالإضافة إلى ذلك تحديد هذه الأنماط مع التكنولوجيا المتاحة سريريا بالفعل12. نظرا لأوجه التشابه بين IVD والغضاريف المفصلية ، يمكن افتراض أن أنماط chondrocyte المميزة موجودة أيضا في IVD. تشكيل الكتلة هي ظاهرة لوحظت أيضا في IVD المنحطة13،14.
عند محاولة تحليل تنظيم الخلوية المكانية في IVD، فمن الضروري للتغلب على العديد من الصعوبات التقنية التي ليست موجودة عند التحقيق غضروف المفصلي:
أولا، معالجة الأنسجة نفسها هي أكثر تحديا بكثير مما كانت عليه مع الغضروف الهيالين متجانسة التي تتكون إلى حد كبير من نوع الكولاجين الثاني. مكون الألياف الرئيسي في IVD هو الكولاجين من النوع الأول ، مما يجعل من الصعب توليد أقسام نسيجية رقيقة. بينما في الغضروف المفصلي الهيالين حتى أقسام سميكة يمكن تحليلها بسهولة بسبب طبيعة "الزجاج مثل" من الأنسجة، والكولاجين نوع الأول شبكة IVD لا يمكن اختراقها بصريا للغاية. لهذا السبب ، فإن الضوضاء الخلفية القوية هي مشكلة شائعة في علم الأنسجة في IVD. طريقة سريعة ورخيصة لاختراق هذا النسيج الكثيف بصريا هو استخدام جهاز تقسيم بصري على سبيل المثال ، عن طريق Apotome. في مثل هذا Apotome ، يتم إدخال شبكة في مسار الإضاءة لمجهر مضان تقليدي. أمام الشبكة يتم وضع لوحة زجاجية موازية للطائرة. هذا يميل ذهابا وإيابا وبالتالي إسقاط الشبكة في الصورة في ثلاثة مواقف مختلفة. لكل موقع z، يتم إنشاء ثلاث صور أولية مع الشبكة المتوقعة وفرضها. عن طريق برامج خاصة ، يمكن حساب الضوء خارج التركيز. والمبدأ الأساسي هو أنه إذا كانت الشبكة مرئية، فإن تلك المعلومات هي في بؤرة التركيز، إن لم يكن تعتبر بعيدة عن التركيز. مع هذه التقنية ، يمكن الحصول على صور مركزة بشكل جيد وعالية الدقة في فترة زمنية معقولة.
ثانيا، من الصعب اتى النسيج من المتبرعين البشريين. عند القيام باستبدال الركبة بالكامل، يمكن الحصول على كامل سطح المفصل لإجراء مزيد من التحليل أثناء الجراحة. على الرغم من هشاشة العظام من المفصل ثنائي المفاصل هو أيضا مرض في المفصل كله, ومع ذلك هناك اختلافات قوية في التنسيق نوعية الغضروف مع عادة بعض المناطق من المفصل لا تزال سليمة, على سبيل المثال بسبب انخفاض التحميل في تلك المنطقة. يختلف هذا الوضع في IVD ، حيث يتم إجراء الجراحة عادة فقط عندما يتم تدمير القرص عالميا. عند الحصول على الأنسجة من المتبرعين البشريين من غرفة العمليات ، يكون النسيج مجزأ للغاية أيضا ، ومن الضروري تخصيص الأنسجة بشكل صحيح لأحد أنواع الغضاريف الثلاثة لل IVD قبل إجراء المزيد من التحليلات. ولذلك، فإن السماح بإجراء تحليلات أكثر تفصيلا لأقسام الأنسجة الأكبر حجما والنظر في التطور الجنيني لل IVD هو أمر ضروري.
عند اختيار مثل هذا الكائن النموذجي من المهم أن يكون هناك نظام قابل للمقارنة مع القرص البشري فيما يتعلق بتشريحه وأبعاده ، وتحميله الميكانيكي ، وعدد الخلايا الحالية وكذلك تكوين الأنسجة. لغرض التقنية المعروضة هنا نقترح استخدام الأنسجة القطنية البقرية: خاصية حاسمة من القرص البشري مما أدى إلى إمكاناته التجديدية المنخفضة هو فقدان الخلايا نوتوشوردال أثناء النضج في النواة. ومع ذلك، في العديد من الكائنات الحية نموذج notochordal الخلايا يمكن الكشف عن حياتهم كلها لفترة طويلة. معظم الحيوانات القليلة التي تفقد خلاياها نوتوشوردال مثل الأغنام والماعز أو الأسماك chondrodystrophig لديها IVD التي هي أصغر بكثير من الأقراص البشرية. فقط أقراص البقر القطنية موجودة بقطر قرص برجي مماثل أقطار IVDsالبشرية 15.
أحد العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى انحطاط القرص المبكر هو التحميل الميكانيكي المفرط. الضغوط داخل الفصالة من بقرة واقفة في العمود الفقري القطني حوالي 0.8 MPa مع العمود الفقري محاذاة أفقيا. من المستغرب أن هذه الضغوط مماثلة للضغوط القطنية داخل الشعب المبلغ عنها للعمود الفقري البشري المنتصب (0.5 MPa)15،16. أيضا كمية المياه والبروتيوغليكان في أقراص البقر مماثلة لتلك التي من IVD من البشر الشباب17. لذلك ، على الرغم من أن نمط الحركة الفعلي لشرائح الحركة قد يختلف في الحيوانات الرباعية عن الإنسان ثنائي الساقين ، فيما يتعلق بخصائص التحميل والقرص الكلي ، فإن البقرة أقرب بكثير إلى البيولوجيا البشرية من النماذج الحيوانية الراسخة الأخرى لل IVD مثل الأغنام وال.
في هذا البروتوكول نقدم تقنية كيفية تحليل التغيرات في IVD من وجهة نظر تنظيم chondrocyte المكانية من التطور الجنيني المبكر لإنهاء انحطاط المرحلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لتحليل النمو الجنيني والنضج ، تم استخدام أقراص الأبقار. لتقييم انحطاط ال IVD، تم تحليل العينات البشرية.
تم الحصول على أنسجة IVD البشرية من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية لانحطاط القرص القطني ، أو التدلي القرصي ، أو صدمة العمود الفقري في قسم جراحة العظام ، والمستشفى الجامعي في توبنغن ومركز الصدمات BG Tübingen. تم الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية الكاملة قبل بدء الدراسة (المشروع رقم 244/2013BO2). وقد تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى قبل المشاركة. وقد نفذت هذه الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.
تم الحصول على الأنسجة البقرية من مكتب ولاية بافاريا للصحة وسلامة الأغذية / Oberschleißheim ومن مصنع تقديم في Warthausen (ألمانيا). وتم الحصول على موافقة السلطات المحلية والبيطرية على الانسجة من الحيوانات النافقة .
1. عينة الحصاد
- أنسجة IVD البشرية: ضع عينات IVD التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة على الفور في متوسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM) مع 2٪ (v/v) من البنسلين-العقدية و 1.2٪ من (v/v) أمفوتريسين B. مخزن في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. معالجة الأنسجة في غضون 48 ساعة. بدلا من ذلك، تخزين الأنسجة في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
- الأنسجة الوريدية البقرية: تأكد من حصاد الأنسجة من الحيوانات في غضون 24 ساعة بعد الوفاة.
استئصال أقراص البقر مع الفقرات المحيطة بها من الحيوانات الميتة en-bloc. نقل الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: إذا كان المقصود فقط تحليلات الفلورسينس وليس هناك المزيد من أساليب القياس الكمي الكيميائية الحيوية مثل ELISA أو PCR المخطط لها، إجراء تثبيت الأنسجة كما هو موضح أدناه. وهذا يسمح للحفاظ على الأنسجة لفترة أطول في التخزين قبل أن يحتاج إلى معالجة. لمنع تدهور مصفوفة الأنسجة، قم بإجراء التثبيت في غضون 48 ساعة بعد الحصاد ما لم يتم تجميد الأنسجة مباشرة.
2. إعداد العينة
- إذابة الأنسجة المجمدة في درجة حرارة الغرفة. معالجة الأنسجة في أقرب وقت لا يمكن أن يشعر بلورات الجليد أي أكثر على ضغط لطيف الرقمية من الأنسجة.
ملاحظة: إجراء إعداد الأنسجة في DMEM في طبق بيتري. - تحديد أصل أنسجة IVD البشرية (الأورام الليفية anulus ، المنطقة المتوسطة ، نواة اللب ، أو اللوحة النهائية cartilaginous) استنادا إلى خصائص العيان مثل كثافة الكولاجين والتوجه.
- خذ الجزء المتحرك المكون من قرص IVD البقري مع فقرتين متجاورتين له وتشريح القرص ككل من العظم تحت الوخز باستخدام شفرة جراحية (شفرة رقم 15).
- استخدام اثنين من ملقط التشريحية لقلب القرص للوصول إلى مناطق أكثر توسيطا. إجراء تشريح. تأكد من استئصال اللب النواة الماضي كما هو أرق بكثير من anulus، عرضة للتمزق، وأنه لا يأتي قبالة بطريقة محددة بسهولة.
- تحديد مناطق مختلفة من الغضروف.
- قطع منطقة الاهتمام من القرص كله باستخدام شفرة الجراحية (شفرة رقم 20 أو 22). بدلا من ذلك، استخدم شفرة التبريد.
ملاحظة: كما أقراص البقري تأتي en-bloc كجزء من العمود الفقري، يمكن إعداد الأقراص في توتو. وهذا يجعل التحديد الصحيح لأنواع مختلفة من الغضاريف أسهل بكثير. عند تشريح القرص هكذا الموضحة أعلاه، يبقى اللوح النهائي الكارتيلاجيني على الفقرات. إذا كان يجب التحقيق في هذه المنطقة، فمن الأفضل أن تؤخذ من العظام الكامنة مع إزميل العمل في اتجاه عرضي عازمة قليلا.
- في حالة أن الأجنة هي من طول التاج الردف من أصغر من 20 سم، وضمان لمعالجة الأجنة في توتو للحفاظ على بنية الأنسجة من IVD. لا تقم بأي تشريح للفقرات في هذه الحالات.
- بمجرد إعادة استئصال القرص في توتو، حدد المناطق المختلفة للغضاريف.
- إجراء الشارات في حمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA) (20٪ (ث / v)؛ درجة الحموضة = 7.4) في درجة حرارة الغرفة. اختيار حجم اعتمادا على حجم العينة - يجب أن تكون مغطاة بشكل جيد الأنسجة بأكملها مع EDTA.
- تغيير محلول الشارات يوميا والتي يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 5 أيام اعتمادا على حجم الأنسجة.
- تحقق من نجاح الشارات بإبرة قياس 20 تخترق الفقرات دون مقاومة ملحوظة.
ملاحظة: التغيير اليومي لحل الشارات مهم لمنع EDTA الموثق chelate من التشبع للحفاظ على تأثيرية رد الفعل. كما أنه يمنع الاستعمار البكتيري.
3. تصنيف عمر العينة، والسلامة، والانحطاط
- تصنيف الأنسجة القرص البشري في واحدة من خمس فئات التالية مع مساعدة من المعلومات السريرية وكذلك الأشعة السينية والتصوير بالرنين المغناطيسي18 (الشكل 3).
ملاحظة: الفئة الأولى: لتكون بمثابة عينة شبه صحية استخدام anulus دون أي علامة إشعاعية من انحطاط IVD المستمدة من صدمة العمود الفقري الحادة.
الفئة الثانية: لتوضيح حالة الالتهاب الحاد مع بداية الانحطاط استخدام الأنسجة من المنطقة المتوسطة من المرضى الذين يعانون من أعراض سريرية مع مدة أقل من 4 أسابيع.
الفئة الثالثة: لوصف حالة كان فيها رد الفعل الالتهابي قد حان الوقت بالفعل للتأثير على الأنسجة والخلايا تأخذ الأنسجة من المرضى الذين تم إجراء عملية لتدلي نووي ولكن مع مدة أعراض تتجاوز 4 أسابيع.
الفئة الرابعة: لانحطاط القرص المعتدل حدد anulus التي تم الحصول عليها من الجراحة مع الانصهار بين الأجسام لمرض القرص التنكسية مع درجة Pfirrmann من 3 أو 4 في التصوير بالرنين المغناطيسي19.
الفئة الخامسة: بالنسبة لعملية انحطاط المرحلة النهائية التي تم الحصول عليها من الجراحة مع الانصهار بين الأجسام لمرض القرص التنكسي مع درجة Pfirrmann من 5. - تصنيف النسيج البقري على أساس مرحلة النمو / عمر الحيوان إلى واحدة من ثماني فئات ، كما هو معروض في الجدول 1.
- حساب عمر الحمل على طول التاج الردف من الأجنة على أساس الصيغة التي اقترحها كيلر:
عمر الحمل بالشهور =
ملاحظة: الحيوانات في الأسابيع ال 4 الأولى من الحمل الحالي مع طول التاج الردف من 0.8-2.2 سم20.
- حساب عمر الحمل على طول التاج الردف من الأجنة على أساس الصيغة التي اقترحها كيلر:
4. تثبيت الأنسجة
- تثبيت العينات في 10x حجم العينة من 4٪ (ث / v) محلول الفورمالديهايد في المالحة العازلة الفوسفات (PBS) خلال الليل في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يخترق محلول الفورمالديهايد الأنسجة بمعدل حوالي 1 مم/ساعة من كل اتجاه. لعينات صغيرة جدا أو كبيرة جدا تعديل من التعرض وقت استطاع كنت ضرورية. - تخزين الأنسجة في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
5. تقسيم الهسولوجيا
- تضمين العينات في المتوسط تضمين قابلة للذوبان في الماء على مقبض الباب cryotome.
- ضع الأنسجة على المقبض بحيث يتم إنشاء إما طائرة محورية أو طائرة تقطع نوع الكولاجين I lamellae عمودي (على سبيل المثال، طائرة تقسيم القوس المتوسط).
ملاحظة: يجب تغطية النسيج بالكامل من خلال وسيط التضمين.
- ضع الأنسجة على المقبض بحيث يتم إنشاء إما طائرة محورية أو طائرة تقطع نوع الكولاجين I lamellae عمودي (على سبيل المثال، طائرة تقسيم القوس المتوسط).
- قسم الأنسجة المضمنة بسماكة 70 ميكرومتر في العينات البشرية و 40 ميكرومتر في عينات الأبقار باستخدام كريوتومي قياسي.
ملاحظة: يرجع الفرق في سمك المقطع إلى الفرق في سلامة الأنسجة بين القرص البقري السليم والأنسجة البشرية المنحطة للغاية. - جمع المقاطع على شريحة زجاجية.
- تطويق أقسام الأنسجة مع قلم مسعور.
- شطف المقاطع 3 مرات مع المالحة العازلة الفوسفات (PBS) لإزالة المتوسطة تضمين قابلة للذوبان في الماء.
6. تلطيخ الفلورسينس
- إضافة 60 ميكرولتر من 1٪ (v/v) من DAPI (Exmax 358 نانومتر، إيماإكس 461 نانومتر) وكذلك 1٪ (v/v) من أكتين تتبع تلطيخ (Exmax 540 نانومتر، إيماإكس 565 نانومتر) في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بروتوكول تلطيخ وصفها هنا هو تصور النواة باستخدام DAPI تلطيخ النووية (الأزرق) والسيتوبلازم باستخدام Actin تتبع وصمة عار (أحمر). يحتوي IVD على فلورة تلقائية قوية بسبب ألياف الكولاجين في القناة الخضراء. كمية السوائل المضافة إلى المقاطع في هذا البروتوكول مخصصة لأقسام بحجم حوالي 5 مم × 5 مم. وبالنسبة للأقسام الأكبر حجما، يجب زيادة هذا المبلغ وفقا لذلك. قم بأداء جميع الأعمال في الغرف دون التعرض المباشر لأشعة الشمس ومع أضواء خافتة لمنع تبييض الصبغة. - إزالة السائل تلطيخ مع ماصة وغسل ثلاث مرات مع 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل مرة.
- إضافة وسيط تركيب مناسبة وتغطية المقاطع مع زلة غطاء.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء عالقة عند إضافة زلة الغطاء. ويتم ذلك على أفضل وجه عن طريق بدء الاتصال من زلة مع الشريحة على حافة واحدة ومن ثم السماح زلة ينزل ببطء.
7. التصوير المجهري والمعالجة
- ضع شريحة مع مقطع ملطخ على حامل العينة للمجهر.
ملاحظة: نظرا لشبكة الكولاجين الكثيفة من النوع الأول من IVD ، يجعل الضوء المتناثر الأنسجة صعبة التصور باستخدام المجهر الفلوري التقليدي. إحدى الطرق لمعالجة هذه المشكلة هي إجراء المقاطع البصرية باستخدام الإضاءة المنظمة. وهذا يسمح أيضا لتقديم إسقاط ثلاثي الأبعاد للعينة بأكملها في كلا القناتين (الأزرق والأحمر). ويتم ذلك على أفضل وجه باستخدام إعداد الإضاءة منظم ووضع الفسيفساء مع عدسة هدف التكبير 10x للحصول على لمحة عامة عن العينة، فضلا عن إعادة بناء 3D من أنماط الفردية. - بدء تشغيل جهاز الإضاءة منظم.
- قم بإجراء تصوير واحد في مجال الرؤية باستخدام مجهر مضان مناسب ومرشحات مضانة وإضاءة كافية.
ملاحظة: ضبط وقت التعرض لكافة المرشحات المستخدمة لتوحيد اقتناء التصوير. للحصول على تمثيل دقيق للعينة في صورة ذات دقة أعلى المقاطع ذات التكبير الأعلى (على سبيل المثال، هدف 20x). - بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع باستخدام برنامج تحسين الصورة متوافقة مع المجهر الفلوري.
- قم بإجراء تصوير واحد في مجال الرؤية باستخدام مجهر مضان مناسب ومرشحات مضانة وإضاءة كافية.
- لتصور المقطع ككل استخدم تقنية تصوير الفسيفساء
- افتح إعدادات الامتلاك (اضغط على 6D-Acquisition)من لوحة شريط الأدوات.
- ضبط إعدادات الفسيفساء (في سجل MosaiX)وتحديد عدد الأعمدة والصفوف من الصور حقل العرض التي سيتم دمجها لاحقا إلى صورة نظرة عامة واحدة.
- اضغط على الإعداد واضبط تصحيح التركيز على البلاطات الفردية.
ملاحظة: يكاد يكون من المستحيل على قسم الأنسجة الكبيرة أن يكون سطح الأنسجة بأكمله في مستوى تركيز واحد. يمكن أخذ بلاط الصور على مستويات بؤرية مختلفة من خلال "اكتساب MosaiX". - لبدء اكتساب إطارات الصور المتجانبة، اضغط على بدء.
- غرزة البلاط المصورة باستخدام وظيفة خياطة (زرخياطة) مع تداخل 20٪ أدرجت في البرنامج.
- بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع باستخدام برنامج تحسين الصورة متوافقة مع المجهر الفلوري.
- لتحليل المنظمة chondrocyte المكانية ، واستخدام وظيفة 3D المدرجة في البرنامج.
- ضبط إعدادات z-المكدس. تعريف معلمات المسح الضوئي: حدد موضعي البدء والتوقف في المحور z والمسافة الشريحة عن طريق تنشيط زر البدء/الإيقاف.
ملاحظة: البرنامج تلقائيا بحساب عدد الشرائح. - لبدء الحصول على الصور z-stacks، اضغط على ابدأ.
- بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع باستخدام برنامج تحسين الصورة متوافقة مع المجهر الفلوري.
- ضبط إعدادات z-المكدس. تعريف معلمات المسح الضوئي: حدد موضعي البدء والتوقف في المحور z والمسافة الشريحة عن طريق تنشيط زر البدء/الإيقاف.
- تصدير الصور مع تنسيق ملف متوافق مع برنامج معالجة الصور.
ملاحظة: تصدير عمليات إعادة إنشاء ثلاثية الأبعاد كصور فردية أو/وكنموذج ثلاثي الأبعاد تفاعلي أو بتنسيق فيديو.
8. تحديد نمط الخلوية وتقييم الكثافة
- افتح صور الفسيفساء المصدرة لقسم الأنسجة بأكمله في برنامج معالجة صور مناسب.
- تحديد المناطق الخاضعة لتقييم كثافة الخلية من خلال تحديد المناطق ذات الأهمية من 500 ميكرومتر × 500 ميكرومتر في الصور.
ملاحظة: يتم استبعاد كافة المربعات التي لا تحتوي على جودة صورة كافية من التحليل. - تحديد أنماط الخلوية الفردية.
ملاحظة: يتم تعريف الخلايا المفردة كخلايا فردية - مغلفة بالكامل داخل المصفوفة المجاورة. وتعرف الأزواج بأنها خلية متجاورة على مقربة (<25 ميكرومتر) حيث يتم ترابط الخلايا من خلال مصفوفاتها (انظر الشكل 2). تشكيلات السلسلة هي على الأقل ثلاثة chondrocytes الانحياز في خط (من منتصف النواة <25 ميكرومتر). وتشمل هذه الخلايا مصفوفة سليمة ويمكن رؤية الترابط مصفوفة بين كل خلية. تمثل المجموعات خلايا متعددة تقع في القرب المباشر من بعضها البعض (<25 ميكرومتر) ويتم تغليفها في ثغرات كبيرة خالية من المصفوفة. - استخدم مكون إضافي لحساب الخلية للتحليل الكمي للأنماط الخلوية.
ملاحظة: يمثل تلطيخ السيتوبلازم طريقة تحقق لتحديد الأنماط المكانية المختلفة. - حساب كثافة الخلية عن طريق تقسيم الخلايا التي تم عدها حسب حجم المنطقة المختارة من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام صور الفسيفساء ، يمكن التعرف بوضوح على بنية IVD مع شبكة ألياف الكولاجين الكثيفة في anulus والنواة الأكثر ليونة(الشكل 4). ويمكن ملاحظة انخفاض مستمر في الكثافة الخلوية أثناء النمو الجنيني (الشكل 5). بينما في المراحل المبكرة من تطوير IVD يمكن العثور على كثافة خلية من 11435 خلية / مم² في الليفية الأبقار anulus و 17426 خلية / ملم² في لب النواة البقرية ، وهذه الأرقام تنخفض بسرعة إلى 1011 خلية / مم² (ليفي أنولوس البقري) و 488 خلية / مم² (نواة البقر اللب) حتى الولادة. في الماشية الكبار 71 خلايا / مم² (anulus ليفية) resp. 106 خلايا / مم² (نواة اللب) وينظر (الشكل 6 A -B). باستخدام التصوير ثنائي القناة مع Apotome يسمح لتصور العمارة 3D من الأنماط المكانية (الشكل 7).
الشكل 1. التشريح العياني للقرص الفقري. رسم تخطيطي للقرص الفقري يظهر اللب النواة (أحمر) ، مباشرة من حوله المنطقة المتوسطة (الوردي) ، ثم في طبقات دائرية حوله ليفية أنولوس. لاحظ اتجاه الزاوية الرقائقية لألياف الكولاجين من النوع الأول في الورم الليفي anulus. وبالتالي يمكن ترجمة الحمل المحوري إلى النواة إلى قوى الشد المحورية لألياف الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. رسم تخطيطي لأنماط تنظيمية مكانية مختلفة من الخلايا الشوندروية. اعتمادا على الخلايا الشوندروسيتية الأنسجة وجدت كخلايا واحدة، أزواج أو سلاسل في غضروف صحي. مع بداية انحطاط هذه الأنماط تغيير لتشكيل سلاسل مزدوجة، ومجموعات صغيرة ثم مجموعات كبيرة في انحطاط المرحلة النهائية. وقد تم تعديل هذا الرقم من دانالاش، م. وآخرون21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ظروف مختلفة من القرص الفقري (IVD). (A-D ') القوس T2 مرجح التصوير بالرنين المغناطيسي للعمود الفقري القطني البشري (A-D)، مع الجزء الحركة المكبرة L4/L5 (A '-D '). الجانب البطني للمريض يواجه اليسار، والجانب الظهري يواجه الحق مع القناة الشوكية مع إشارة بيضاء للسائل النخاعي. (A,A') IVD سليمة مع anulus عرضها مع إشارة hypointense (أسود) بسبب ارتفاع الكولاجين نوع I المحتوى والنواة عرض أكثر إشراقا بكثير (hyperintense) بسبب ارتفاع محتوى البروتيوغليكانات ملزمة للمياه (Pfirrmann الصف19 الأول). (B, B ') بداية انحطاط IVD مع فقدان إشارة المياه من اللب النواة وحيث يتم فقدان التمييز بين أنولو والنواة (Pfirrmann الصف19 الرابع). (C, C ') التدلي النووي الحاد مع إشارة المياه لا تزال بارزة في منطقة النواة الإرشادية ل IVD سليمة خلاف ذلك والأنسجة القرص جاحظ ظهريا في القناة الشوكية. (D, D ') انحطاط القرص المتقدمة مع IVD دمرت إلى حد كبير مع فقدان كامل للإشارة المياه داخل القرص، تشكيل الفقارية والعادية والتصلب تحت السحري للفقرات المقابلة للصف Pfirrmann19 من V. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تصوير مضان الفسيفساء للقرص الفقري (IVD). يمكن التعرف بوضوح على بنية IVD مع شبكة ألياف الكولاجين الكثيفة في الأورام الليفية النولو والنواة الأكثر ليونة. DAPI النووية تلطيخ (أبيض) في المحوري (A1) و القوس (A2) الطائرة يظهر توزيع الخلايا والترتيب داخل IVD. يتم عرض المناطق التمثيلية المكبرة من هذه الصور الفسيفساء في B1-B4 و C1-C4 مما يوضح تنظيم chondrocyte المكانية - في هذه الحالة خلايا واحدة (مربع أخضر) ، أزواج (مربع أزرق) وسلاسل (مربع أصفر). A:شريط مقياس 1000 ميكرومتر، B1-B4: شريط مقياس 200 ميكرومتر، C1-C4: شريط مقياس: 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من بونير، F.Cوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. مراحل مختلفة من النمو والنضج من الأبقار أنولوس ليفية والإنسان تدهور الأورام الليفية anulus. DAPI تلطيخ النووية. تظهر صور الفسيفساء قرص جنيني مبكر بالكامل في قسم محوري(A1)وصور تمثيلية للنحل البقري أثناء النمو الجنيني والنضج والانحطاط الأولي(A2-A8). (B1-B3) تم الحصول على Anulus من IVDs الإنسان أثناء العملية الجراحية. يمكن ملاحظة انخفاض مستمر في الكثافة الخلوية أثناء تطور القرص الجنيني. ويبدو أن نمطا خلويا أعلى تنظيما مكانيا موجود خصوصا عند الولادة. في القرص البشري البالغ أثناء الانحطاط ، تزداد الكثافة الخلوية مرة أخرى ويمكن ملاحظة زيادة تكوين الكتلة. شريط المقياس 100 ميكرومتر. Wog: أسابيع من الحمل. وقد تم تعديل هذا الرقم من بونير، F.Cوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. انخفاض في الكثافة الخلوية في جميع أنحاء التنمية ونضوج القرص الفقري البقري. يوضح متوسط (الانحراف المعياري) عدد الخلايا لكل مم² من خلال مخططات شريطية للورم الليفي الأنولوس البقري(A)ولب نواة البقر(B). ويمكن ملاحظة انخفاض واضح في الكثافة الخلوية خاصة خلال الفترة الجنينية التي تستمر إلى حد أقل على الأقل حتى النضج الكامل للقرص (ن = 72). Wog: أسابيع من الحمل. وقد تم تعديل هذا الرقم من بونير، F.Cوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. Apotome التصوير من القرص الفقري (IVD). صورة ثنائية القناة تظهر السيتوبلازم (أحمر، تلطيخ أكتين) والنواة (الأزرق، تلطيخ DAPI النووي). (أ)في IVD سليمة، بالإضافة إلى النمط المكاني السائد من chondrocytes واحد، وتوجد أيضا أزواج. (ب)في مجموعات الخلايا anulus المنحطة يمكن العثور عليها. شريط مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1. Apotome التصوير لزوج في القرص الفقري (IVD) كنموذج 3D. صور ثنائية القناة تظهر السيتوبلازم (الأحمر، تلطيخ أكتين) والنواة (الأزرق، تلطيخ DAPI النووية) من زوج. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2. Apotome التصوير من مجموعة في القرص الفقري (IVD) كنموذج 3D. صور ثنائية القناة تظهر السيتوبلازم (الأحمر، تلطيخ أكتين) والنواة (الأزرق، تلطيخ DAPI النووية) من مجموعة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الجدول 1: النمو الجنيني البقري، والنضج، والنمو بعد الولادة مع معالمه المختلفة. Wog - أسابيع من الحمل. فترة الحمل ca. 283 أيام, الطبيعي العمر المتوقع 20-25 سنوات20,23,24. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام المجهر الفلوري المعزز بتصوير الفسيفساء والقسم البصري ، قمنا بتقييم الترتيب المكاني للخلايا الشوندرية في أنولوس IVD القطني طوال التطوير والنضج والانحطاط. في حين يمكن حصاد الأنسجة التنكسية من المرضى الذين يتلقون جراحة العمود الفقري لانحطاط القرص ، وتحليل الفترة الجنينية ومرحلة النضج يتطلب استخدام كائن حي نموذجي (البقرة). ولوحظت كثافات خلوية عالية في الندول خلال النمو الجنيني المبكر. وفي سياق التطور الإضافي، يمكن ملاحظة انخفاض واضح في الكثافة الخلوية بعد الولادة ونضوجها. في الأنسجة البشرية مع انحطاط القرص المتقدمة، يمكننا بعد ذلك قياس زيادة في الكثافة الخلوية في الأورام الليفية أنولوس.
الزيادة السريعة في حجم الأنسجة جنبا إلى جنب مع تقسيم بنشاط ونشطة بيولوجيا الخلايا نوتوشوردال هي أسباب محتملة للتغيرات في الكثافة الخلوية لوحظ في الجنين25. ومع ذلك، لا تزال الآليات التي تزداد بها الكثافة الخلوية مرة أخرى مع الانحطاط غير واضحة. العمليات التنكسية من anulus تؤدي إلى سلسلة من التغيرات المرضية بما في ذلك زيادة الأنسجة الداخلية والالتهاب، upregulation من الإنزيمات مصفوفة المهينة وإنتاج عامل النمو، وأيضا التغيرات في الخلوية26،27،28.
عند النظر في وجود الخلية كدالة للتنظيم المكاني الخلوي على أساس أنماط معروفة من الغضروف المفصلي7،9 لم نجد أي تنظيم مكاني يمكن التعرف عليه في الأقراص الجنينية المبكرة حيث يبدو أن الخلايا معبأة بكثافة والتي اعتبرناها موجودة كخلايا واحدة22. هذه النتيجة تتفق مع نتائج الغضروف المفصلي الجنيني7. في أنولوس ناضجة صحية، تمثل الخلايا المفردة النمط المكاني السائد22. أزواج وتشكيلات سلسلة، ومع ذلك، يمكن أيضا أن يلاحظ22. كلما تدهور النسيج في الأقراص البشرية ، زادت نسبة الخلايا التي يمكن العثور عليها في المجموعات22. النموذج الفيزيولوجي الذي اقترحه رولاوف في الغضروف المفصلي7،9،29 يظهر تشابها مثيرا للاهتمام مع النتائج التي توصلنا إليها. الدراسات السابقة على انحطاط IVD قد حددت بالفعل تشكيل الكتلة كسمة مميزة لانحطاط القرص14،30،31،32،33. وبما أن هذه المجموعات يمكن العثور عليها في الغالب في الأنسجة شديدة التدهور ، فقد يشير تكوين الكتلة إلى محاولة فاشلة للأنسجة لإصلاح الضرر التنكسي34. تأسيس علاقة قوية بين نمط chondrocyte السائدة محليا ومرونة الأنسجة، ويمكن إثبات أهمية وظيفية عالية من هذه الأنماط في غضروف المفصلي10،11. يمكن التكهن بأن مثل هذه الأهمية الوظيفية تنطبق أيضا على تنظيم chondrocyte المكانية في IVD.
التحليلات النسيجية الفلورية هي وسيلة سهلة الأتانا و جذابة لتحليل التغيرات المورفولوجية للأنسجة. عند محاولة تحليل IVD من الناحية النسيجية ، هناك صعوبات تقنية متميزة تحتاج إلى التغلب عليها: أولا ، فإن التوافر المحدود للأنسجة البشرية يجعل من المهم اختيار كائن حي نموذجي حيواني مناسب يمكن من خلاله دراسة جوانب المرض هذه حيث لا يمكن الحصول على عينات بشرية. بالنسبة للسؤال البحثي الذي تم تناوله في هذه الدراسة ، اخترنا نموذجا حيوانا بقري.
ثانيا، معالجة الكولاجين من النوع الأول الغنية IVD هو أكثر تحديا بكثير من معظم الأنسجة البشرية الأخرى. شبكة الكولاجين الكثيفة من نوع I-fiber تبعثر بقوة الضوء الفلوري مما يخلق إشارة ضوضاء خلفية عالية. يتم معالجة هذه المشكلة بشكل أفضل باستخدام تقنية تسمح بطرح أو إزالة إشارة الخلفية هذه. وهناك طريقة معروفة للقيام بذلك هو المجهر confocal. في حين أن جودة صورة صور LASER-images المكتسبة من confocal عادة ما تكون ممتازة ، فإن مساوئ هذه التقنية هي أنها تستغرق وقتا طويلا نسبيا وعلى هذا النحو فهي لا تسمح بتحليل مناطق الأنسجة الأكبر عن طريق تصوير الفسيفساء. ثانيا المجاهر confocal مكلفة نسبيا وغير متوفرة في كل مكان. وهناك طريقة أسرع بكثير وأرخص لتصفية الضوضاء الخلفية هو لأداء المقطع البصري على سبيل المثال ، عن طريق Apotome.
لتكون قادرة على تفسير النتائج بشكل صحيح، فمن الضروري أيضا تخصيص الأنسجة بشكل صحيح التي سيتم تحليلها إلى أصلها في IVD. في حين أن هذه المهمة بسيطة نسبيا عند وجود قرص بقرية كامل للاختيار من بين، يمكن أن يكون تحديا كبيرا عند تلقي الأنسجة البشرية من مسرح العملية. السمة المميزة للأورام الليفية anulus هو نوع الكولاجين الكثيفة جدا I شبكة في اتجاه الألياف زاوية ply. النواة ، في المقابل ، هي بنية هلامية غير متبلورة حيث لا توجد بنية كولاجين أعلى مرئية بالعين المجردة. تقع المنطقة المتوسطة بين هذين الطرفين وتمتلك أيضا بنية واضحة من ألياف الكولاجين ، ولكنها أكثر ليونة وأقل كثافة من الورم الليفي anulus. تتكون اللوحة النهائية الكارتيلاجينية من غضروف الهيالين ، ولا تقدم مع بنية الكولاجين التي يمكن التعرف عليها بالعين المجردة ولكنها "تشبه الزجاج" كما يوحي مصطلح "hyaline". على عكس اللب النواة هو، ومع ذلك، أيضا قاسية جدا، لا يمكن أن تشوه، ويقع على العظام تحت الوخز الذي يمكن في كثير من الأحيان لا يزال يمكن التعرف عليها من خلال فحص الأنسجة.
بمجرد تحديد أصل الأنسجة بشكل صحيح ، لا يزال النسيج بحاجة إلى توجيه صحيح للقسم للحصول على صور موحدة تسمح أيضا بقراءة نوعية وكمية مناسبة. في التوجه إلى تقنيات التصوير الأخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي نقترح طائرتين التحليل القياسية: واحد قسم متوسط القوس وواحد في الطائرة المحورية. هذه الطائرتين سوف توفر أيضا انطباعا جيدا من الهندسة المعمارية للكولاجين نوع I-الألياف شبكة anulus. عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها من تلطيخ F-actin يجب أن يوضع في الاعتبار أن تجميد عينات الأنسجة قد يسبب تعديلات في الهيكل الخلوي35 والتي يجب ألا تؤثر على تنظيم الخلايا الشوندروسيتية المكانية.
لفهم كامل البيولوجيا الخلوية للIVD هي واحدة من التحديات التي لا تزال مفتوحة في فهمنا للانحطاط القرص وتجديد36. الأسئلة التي تبدو تافهة في بعض الأحيان، مثل الترتيب الفسيولوجي للخلايا في الأنسجة السليمة أو مسألة إعادة تنظيم الخلية أثناء الانحطاط، لا تزال، حتى الآن، دون إجابة. قد تسمح لنا المعرفة التي تم الحصول عليها باستخدام علامة الانحطاط القائمة على الصور هذه لتقييم جودة الأنسجة ، والتحقيق في قابلية عكس تكوين الكتلة وبالتالي ربما تحديد نافذة علاجية لا يزال من الممكن فيها استهداف العمليات المنحطة بنجاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر المؤلفين المشاركين من المنشورات الأصلية على مساعدتهم ودعمهم. نشكر شارلوت إيما بامبرجر لمساعدتها في الحصول على صور apotome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
