Summary
Vi presenterer en metode for å undersøke romlig kondrocyttorganisasjon i anulus fibrosus av mellomvirvelskiven ved hjelp av en optisk seksjoneringsmetode.
Abstract
Intervertebral plate (IVD) degenerasjon er en ledende årsak til ryggsmerter, og det medfører en høy grad av svekkelse for de berørte individene. Å dekode plate degenerasjon og å kunne utvikle regenerative tilnærminger en grundig forståelse av cellulær biologi av IVD er viktig. Et aspekt av denne biologien som fortsatt er ubesvart, er spørsmålet om hvordan celler er romlig ordnet i en fysiologisk tilstand og under degenerasjon. De biologiske egenskapene til IVD og dens tilgjengelighet gjør dette vevet vanskelig å analysere. Den nåværende studien undersøker romlig kondrocyttorganisasjon i anulus fibrosus fra tidlig embryonal utvikling til degenerasjon i sluttfasen. En optisk seksjoneringsmetode (Apotome) brukes til å utføre høyoppløselige fargingsanalyser ved hjelp av storfe embryonalt vev som dyremodell og humant skivevev hentet fra pasienter som gjennomgår ryggradskirurgi. Fra en svært høy kondrocytttetthet i den tidlige embryonale storfeskiven, reduseres antall celler under svangerskap, vekst og modning. I menneskelige plater fulgte en økning i cellulær tetthet utviklingen av vevsdegenerering. Som det allerede var demonstrert i leddbrusk, representerer klyngedannelse et karakteristisk trekk ved avansert platedegenerering.
Introduction
Mellomvirvelskiven (IVD) er en bruskbasert struktur som biokjemisk og med hensyn til cellulær arkitektur ved første øyekast ligner på mange måter leddbrusk1. Faktisk er både IVD-degenerasjon og slitasjegikt (OA) av leddbrusk preget av felles plass innsnevring på grunn av brusk slitasje, subkondral cyste og osteofyttdannelse, og subkondral sklerose2,3. Til tross for disse tilsynelatende likhetene er arkitektur og funksjonell rolle i begge vevene forskjellige. Mens matrisen av leddbrusk hovedsakelig er dannet av et arkadedannende kollagen type II-nettverk, består IVD av tre forskjellige typer vev: kollagentypen II-rik kjerne pulposus i midten tar opp aksiale belastninger og overfører dem til en omfattende ring av tettpakkede sirkulære kollagen type I-fibre som kalles anulus fibrosus. Deres funksjon er å absorbere de oversatte aksiale trykkene mottatt av den proteoglykan- og vannrike kjernen med deres strekkfaste langsgående fiberstyrke. Øverst og nederst i hver kjerne og anulus danner en hyalin brusk endeplate krysset til de tilstøtende ryggvirvlene4 (figur 1).
I leddbrusk finnes fire distinkte romlige kondrocyttmønstre: par, strenger, doble strenger, små, henholdsvis store klynger5,6,7 ( Figur2). Endringer i dette mønsteret er knyttet til OA-utbruddet og progresjonen8,9. Romlig kondrocyttorganisasjon er også veiledende for en direkte funksjonell egenskap av brusk, nemlig stivheten, som understreker den funksjonelle relevansen av denne bildebaserte graderingsmetoden10,11. Disse mønstrene kan i tillegg identifiseres med allerede eksisterende klinisk tilgjengelig teknologi12. På grunn av likhetene mellom IVD og leddbrusk, kan det hypoteses at karakteristiske kondrocyttmønstre også er til stede i IVD. Klyngedannelse er et fenomen som også observeres i degenerert IVD13,14.
Når du prøver å analysere romlig cellulær organisasjon i IVD, er det nødvendig å overvinne flere tekniske vanskeligheter som ikke er til stede når du undersøker leddbrusk:
For det første er behandling av vevet selv mye mer utfordrende enn med den homogene hyaline brusk som i stor grad består av kollagen type II. IVDs hovedfiberkomponent er kollagen type I, noe som gjør det mye vanskeligere å generere tynne histologiske seksjoner. Mens i hyalinartikulær brusk selv tykke seksjoner lett kan analyseres på grunn av vevets "glasslignende" natur, er kollagen type I-nettverket til IVD optisk svært ugjennomtrengelig. Av denne grunn er en sterk bakgrunnsstøy et vanlig problem i histologien til IVD. En rask og billig måte å trenge inn i dette optisk tette vevet er bruken av en optisk seksjoneringsenhet, for eksempel ved hjelp av en Apotome. I et slikt Apotome settes et rutenett inn i belysningsveien til et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Foran rutenettet plasseres en plan-parallell glassplate. Dette vipper frem og tilbake og projiserer dermed rutenettet i bildet i tre forskjellige posisjoner. For hver z-posisjon opprettes tre RAW-bilder med det projiserte rutenettet og legges over. Ved hjelp av spesiell programvare kan lyset utenfor fokus beregnes ut. Det underliggende prinsippet er at hvis rutenettet er synlig, er denne informasjonen i fokus, hvis ikke anses den å være ute av fokus. Med denne teknikken kan godt fokuserte og høyoppløselige bilder skaffes på rimelig tid.
For det andre er vevet vanskelig å komme forbi fra menneskelige givere. Ved total kneutskifting kan hele overflaten av leddet oppnås for videre analyse under operasjonen. Selv om slitasjegikt i et diartropialt ledd også er en sykdom i hele leddet, er det likevel sterke fokusforskjeller i kvaliteten på brusk med vanligvis noen områder av leddet som fortsatt er intakte, for eksempel på grunn av redusert belastning i det området. Denne situasjonen er forskjellig i IVD, hvor kirurgi vanligvis bare utføres når platen er globalt ødelagt. Ved henting av vev fra menneskelige donorer fra operasjonsrommet er vevet også svært fragmentert, og det er nødvendig å tildele vevet riktig til en av de tre brusktypene til IVD før du gjør ytterligere analyser. For å tillate mer detaljerte analyser av også større vevsseksjoner og se på den embryonale utviklingen av IVD, er valget av en dyremodellorganisme derfor nødvendig.
Når du velger en slik modellorganisme, er det viktig å ha et system som er sammenlignbart med den menneskelige platen med hensyn til anatomi og dimensjoner, dens mekaniske belastning, dagens cellepopulasjon samt vevssammensetningen. For den presenterte teknikken her foreslår vi bruk av bovint lumbalskivevev: En kritisk egenskap ved den menneskelige platen som resulterer i sitt lave regenerative potensial er tap av notochordale celler under modning i kjernen. Men i mange modellorganismer kan notochordale celler oppdages hele livet. De fleste av de få dyrene som mister sine notokordale celler som sauer, geiter eller kondrodystrophig hunder har en IVD som er mye mindre enn menneskelige plater. Bare lumbale bovinskiver er tilstede med en sammenlignbar sagittal platediameter med de av menneskelige IVDer15.
En nøkkelfaktor som fører til tidlig platedegenerering er overdreven mekanisk lasting. Det intradiskale trykket til en stående ku i lumbal ryggraden er rundt 0,8 MPa med ryggraden justert horisontalt. Overraskende disse trykkene er sammenlignbare med lumbale intradiskale trykk rapportert for oppreist menneskelig ryggrad (0,5 MPa)15,16. Også mengden vann og proteoglykaner i storfeskiver er sammenlignbar med IVD fra unge mennesker17. Derfor, selv om bevegelsessegmentenes faktiske bevegelsesmønster kan variere i firedoble dyr fra bipedalmennesket, med hensyn til total lasting og skiveegenskaper, er kua mye nærmere menneskelig biologi enn andre etablerte dyremodeller for IVD som sauer og hunder.
I denne protokollen presenterer vi en teknikk for å analysere endringer i IVD fra romlig kondrocyttorganisasjon fra tidlig embryonal utvikling til sluttfase degenerasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For analyse av embryonal utvikling og modning ble det brukt storfeskiver. For å evaluere degenerasjon av IVD ble menneskelige prøver analysert.
Humant IVD-vev ble hentet fra pasienter som ble operert for lumbal skivedegenerasjon, skiveprolaps eller ryggtraumer ved Institutt for ortopedisk kirurgi, Universitetssykehuset i Tübingen og BG Trauma Centre Tübingen. Full etisk komitégodkjenning ble innhentet før studiestart (prosjektnummer 244/2013BO2). Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle pasienter før deltakelse. Metodene ble utført i henhold til godkjente retningslinjer.
Bovint vev ble hentet fra det bayerske statskontoret for helse- og mattrygghet/Oberschleißheim og fra et gjengivelsesanlegg i Warthausen (Tyskland). Lokale og veterinære myndigheters godkjenning ble mottatt for vev fra døde dyr.
1. Prøve høsting
- Humant IVD-vev: Plasser intraoperativt oppnådde IVD-prøver umiddelbart i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 2 % (v/v) penicillin-streptomycin og 1,2 % av (v/v) amfotericin B. Oppbevares ved 4 °C til videre behandling. Behandle vevet innen 48 timer. Alternativt kan du lagre vevet ved -20 °C i flere uker.
- Bovint IVD-vev: Sørg for å høste vevet fra dyrene innen 24 timer etter døden.
Resect bovine plater med de omkringliggende ryggvirvlene fra de døde dyrene en-bloc. Transporter det frosne vevet på tørris og oppbevar ved -20 °C inntil videre behandling.
MERK: Hvis bare fluorescensanalyser er tiltenkt og det ikke planlegges ytterligere biokjemiske kvantifiseringsmetoder som ELISA eller PCR, utfør vevsfikseringen som forklart nedenfor. Dette gjør det mulig å holde vevet lenger i lagring før det må behandles. For å forhindre forverring av vevsmatrisen, utfør fiksering innen 48 timer etter høsting med mindre vevet er frosset direkte.
2. Prøvepreparering
- Tine det frosne vevet ved romtemperatur. Behandle vevet så snart ingen iskrystaller kan føles mer ved digital skånsom kompresjon av vevet.
MERK: Utfør tilberedning av vevet i DMEM i en Petri-tallerken. - Identifiser opprinnelsen til det menneskelige IVD-vevet (anulus fibrosus, mellomsone, kjernemasse eller brusk endeplate) basert på makroskopiske egenskaper som kollagentetthet og orientering.
- Ta bevegelsessegmentet som består av den bovine IVD-platen med sine to tilstøtende ryggvirvler og disseker platen som helhet fra subkondralbenet ved hjelp av et kirurgisk blad (blad nummer 15).
- Bruk to anatomiske tang for å snu platen for å nå områder som er mer sentrert. Utfør disseksjonen. Sørg for å resect kjernen pulposus vare som det er mye tynnere enn anulus, utsatt for tåre, og det kommer ikke av på en definert måte lett.
- Identifiser de forskjellige områdene av brusk.
- Klipp ut interesseområdet fra hele platen ved hjelp av et kirurgisk blad (blad nummer 20 eller 22). Alternativt kan du bruke et kryotopblad.
MERK: Når bovinskiver kommer en-bloc som en del av ryggraden, kan platene tilberedes i toto. Dette gjør riktig identifikasjon av de forskjellige typer brusk mye enklere. Når du dissekerer platen på den måten som er beskrevet ovenfor, forblir den bruskaktige endeplaten på ryggvirvlene. Hvis dette området skal undersøkes, er det best tatt av det underliggende beinet med en meisel som arbeider i en litt bøyd tangentiell retning.
- I tilfelle at embryoer er av en krone-rump lengde på mindre enn 20 cm, sørg for å behandle embryoene i toto for å bevare vevsarkitekturen til IVD. Ikke utfør disseksjon av ryggvirvlene i disse tilfellene.
- Når platen er resected in-toto, identifisere de forskjellige områdene av brusk.
- Utfør avkalkningen i etylendiamintetraacetisk syre (EDTA) (20% (m/v); pH = 7,4) ved romtemperatur. Velg volumet avhengig av prøvestørrelsen - hele vevet må være godt dekket med EDTA.
- Endre avkalkingsløsningen daglig som kan gå i opptil 5 dager, avhengig av vevets størrelse.
- Kontroller at avkalkingen er vellykket med en 20 gauge nål som trenger inn i ryggvirvlene uten bemerkelsesverdig motstand.
MERK: Den daglige endringen av avkalkingsløsningen er viktig for å forhindre at chelateringsbinderen EDTA metning for å opprettholde reaksjonseffektiviteten. Det forhindrer også bakteriell kolonisering.
3. Gradering av prøvealder, integritet og degenerasjon
- Klabsifiser det menneskelige skivevevet i en av de fem følgende kategoriene ved hjelp av klinisk informasjon samt røntgen- og magnetisk resonansavbildning18 (figur 3).
MERK: Kategori I: For å tjene som nesten sunn prøve, bruk anulus uten radiologisk tegn på IVD-degenerasjon avledet fra akutte ryggtraumer.
Kategori II: For å illustrere en situasjon med akutt betennelse med begynnende degenerasjon, bruk vev fra mellomsonen fra pasienter med kliniske symptomer med en varighet på mindre enn 4 uker.
Kategori III: For å beskrive en situasjon der den inflammatoriske reaksjonen allerede hadde hatt tid til å påvirke vevet og cellene, ta vev fra pasienter som ble operert for en kjernefysisk prolaps, men med en symptomvarighet over 4 uker.
Kategori IV: For moderat skive degenerasjon velg anulus hentet fra kirurgi med interbody fusjon for degenerativ skive sykdom med en Pfirrmann score på 3 eller 4 i magnetisk resonans avbildning19.
Kategori V: For sluttfasen degenerasjonsprosess anulus hentet fra kirurgi med interbody fusjon for degenerativ skive sykdom med en Pfirrmann score på 5. - Klassifisere storfevevet basert på dyrets utviklingsstadium/alder i en av de åtte kategoriene, som vist i tabell 1.
- Beregn svangerskapsalderen på kron-rump lengden på embryoene basert på formelen foreslått av Keller:
Svangerskapsalder i måneder =
MERK: Dyr i de første 4 ukene av svangerskapet er til stede med en krone-rump lengde på 0,8-2,2 cm20.
- Beregn svangerskapsalderen på kron-rump lengden på embryoene basert på formelen foreslått av Keller:
4. Vev fiksering
- Fest prøvene i 10x volumet av prøven på 4% (w / v) formaldehydoppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS) over natten ved 4 °C.
MERK: Formaldehydoppløsningen trenger inn i vev med en hastighet på ca. 1 mm/time fra hver retning. For svært små eller svært store prøver kan det være nødvendig med en justering av eksponeringstiden. - Oppbevar vevet i PBS ved 4 °C inntil videre behandling.
5. Histologiske seksjonering
- Legg inn prøvene i vannløselig innebyggingsmedium på kryotopknappen.
- Plasser vevet på knotten slik at enten et aksialplan genereres eller et plan som kutter kollagentypen I lameller vinkelrett (f.eks. et median sagittal seksjonsplan).
MERK: Vevet må være helt dekket av innebyggingsmediet.
- Plasser vevet på knotten slik at enten et aksialplan genereres eller et plan som kutter kollagentypen I lameller vinkelrett (f.eks. et median sagittal seksjonsplan).
- Seksjoner det innebygde vevet med en tykkelse på 70 μm i menneskelige prøver og 40 μm i storfeprøver ved hjelp av et standard kryotop.
MERK: Forskjellen i seksjonstykkelse skyldes forskjellen i vevsintegritet mellom den intakte storfeskiven og det svært degenererte menneskelige vevet. - Samle seksjonene på en glasssklie.
- Omkrans vevsdelene med en hydrofob penn.
- Skyll seksjonene 3 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne det vannløselige innebyggingsmediet.
6. Fluorescensfarging
- Tilsett 60 μL 1% (v/v) AV DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) samt 1% (v/v) av Actin Tracking farging (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) i PBS og inkubere i 5 min ved romtemperatur.
MERK: Fargingsprotokollen som er beskrevet her, er å visualisere kjernen ved hjelp av DAPI kjernefysisk farging (blå) og cytoplasma ved hjelp av Actin Tracking Stain (rød). IVD har en sterk autofluorescence på grunn av kollagenfibrene i den grønne kanalen. Mengden væske som legges til seksjonene i denne protokollen er beregnet på deler av en størrelse på ca. 5 mm x 5 mm. For større seksjoner må dette beløpet økes tilsvarende. Utfør alle verkene i rom uten direkte sollyseksponering og med dimmede lys for å forhindre bleking av fargestoffet. - Fjern fargingsvæsken med en pipette og vask tre ganger med 60 μL PBS hver gang.
- Tilsett et passende monteringsmedium og dekk seksjonene med en dekselslipp.
MERK: Pass på at det ikke er noen luftbobler fanget opp når du legger til dekselslippet. Dette gjøres best ved å starte kontakten på gliden med gliden på en kant og deretter la gliden komme sakte ned.
7. Mikroskopisk avbildning og prosessering
- Plasser et lysbilde med en farget del på prøveholderen på mikroskopet.
MERK: På grunn av det tette kollagen type I-nettverket til IVD, gjør det spredte lyset vevet vanskelig å visualisere ved hjelp av konvensjonell fluorescensmikroskopi. En måte å løse dette problemet på er å utføre optisk seksjonering ved hjelp av strukturert belysning. Dette gjør det også mulig å gjengi en tredimensjonal projeksjon av hele prøven i begge kanaler (blå og rød). Dette gjøres best ved hjelp av den strukturerte belysningsinnstillingen og Mosaic-modusen med et 10x forstørrelsesmål objektiv for å få en oversikt over prøven samt 3D-rekonstruksjoner av individuelle mønstre. - Start den strukturerte belysningsenheten.
- Utfør enkelt synsfeltavbildning med et egnet fluorescensmikroskop, fluorescensfiltre og tilstrekkelig belysning.
MERK: Juster eksponeringstiden for alle filtrene som brukes for å standardisere bildeinnsamlingen. For å få en nøyaktig representasjon av prøven med et bilde med høyere oppløsning, seksjonene med høyere forstørrelse (f.eks. 20x objektiv). - Etterbehandling av bildene ved å optimalisere intensiteten og lysstyrken ved hjelp av en bildeoptimaliseringsprogramvare som er kompatibel med fluorescensmikroskopet.
- Utfør enkelt synsfeltavbildning med et egnet fluorescensmikroskop, fluorescensfiltre og tilstrekkelig belysning.
- For å visualisere delen som helhet, bruk mosaikkavbildningsteknikken
- Åpne anskaffelsesinnstillingene (trykk på 6D- Anskaffelse) fra verktøylinjepanelet.
- Juster mosaikkinnstillingene (i MosaiX Register) og definer antall kolonner og rader med synsfeltbilder som senere skal slås sammen til ett oversiktsbilde.
- Trykk oppsett og juster fokuskorrigeringen av enkeltfliser.
MERK: Det er nesten umulig for en stor vevsseksjon å ha hele vevsoverflaten i et enkelt fokusplan. Bildefliser på forskjellige fokusnivåer kan tas av 'MosaiX Acquisition'. - Hvis du vil starte anskaffelsen av bildeflisene, trykker du start.
- Sy sammen de avbildede flisene ved hjelp av sømfunksjonen(Søm-knappen) med 20 % overlapping innlemmet i programvaren.
- Etterbehandling av bildene ved å optimalisere intensiteten og lysstyrken ved hjelp av en bildeoptimaliseringsprogramvare som er kompatibel med fluorescensmikroskopet.
- For å analysere den romlige kondrocyttorganisasjonen, bruk 3D-funksjonen som er innlemmet i programvaren.
- Juster z-stack-innstillingene. Definer skanneparameterne: Definer start- og stoppposisjonene i z-aksen og stykkeavstanden ved å aktivere Start/stopp-knappen.
MERK: Programvaren beregner automatisk antall stykker. - Hvis du vil starte anskaffelsen av z-stakkene for bildet, trykker du start.
- Etterbehandling av bildene ved å optimalisere intensiteten og lysstyrken ved hjelp av en bildeoptimaliseringsprogramvare som er kompatibel med fluorescensmikroskopet.
- Juster z-stack-innstillingene. Definer skanneparameterne: Definer start- og stoppposisjonene i z-aksen og stykkeavstanden ved å aktivere Start/stopp-knappen.
- Eksporter bildene med et filformat som er kompatibelt med bildebehandlingsprogramvaren.
MERK: Eksporter 3D-rekonstruksjonene som individuelle bilder eller/og som en interaktiv 3D-modell eller i et videoformat.
8. Cellulær mønsteridentifikasjon og tetthetsvurdering
- Åpne de eksporterte mosaikkbildene av hele vevsdelen i et passende bildebehandlingsprogram.
- Definer områdene som er utsatt for vurdering av celletetthet ved å definere interesseområder på 500 μm x 500 μm i bildene.
MERK: Alle fliser som ikke har tilstrekkelig bildekvalitet, er ekskludert fra analysen. - Identifiser individuelle cellulære mønstre.
MERK: Enkeltceller er definert som individuelle celler - fullstendig innkapslet i den tilstøtende matrisen. Par defineres som to tilstøtende celler i nærheten (<25 μm) der cellene er sammenkoblet gjennom matrisene (se figur 2). Strengformasjoner er minst tre kondrocytter justert i linje (fra midten av kjernen <25 μm). Disse cellene er omfattet av en intakt matrise og matriseforbindelser kan ses mellom hver celle. Klynger representerer flere celler som ligger i direkte nærhet til hverandre (<25 μm) og er innkapslet i en stor lacuna uten matrise. - Bruk en plugin-modul for celleantall for den kvantitative analysen av de cellulære mønstrene.
MERK: Cytoplasmafargingen representerer en verifiseringsmetode for å identifisere de forskjellige romlige mønstrene. - Beregn celletettheten ved å dele de opptelte cellene på størrelse med det valgte interesseområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av mosaikkbilder kan arkitekturen til IVD med sitt tette kollagenfibernettverk i anulus og den mykere kjernen tydelig gjenkjennes (Figur 4). En kontinuerlig reduksjon i cellulær tetthet kan observeres under embryonal utvikling (Figur 5). Mens i de tidlige stadiene av IVD utvikling en celle tetthet på 11,435 celler / mm² i bovin anulus fibrosus og 17,426 celler / mm² i bovine kjernen pulposus kan bli funnet, Disse tallene reduseres raskt til 1011 celler/mm² (bovin anulus fibrosus) og 488 celler/mm² (bovin nucleus pulposus) til fødselen. Hos voksen storfe ses 71 celler/mm² (anulus fibrosus) 106 celler/mm² (kjernemasseosus) (Figur 6 A-B). Ved hjelp av tokanals bildebehandling med Apotome kan du visualisere 3D-arkitekturen til de romlige mønstrene (figur 7).
Figur 1. Makroskopisk anatomi av mellomvirvelskiven. Skjematisk tegning av mellomvirvelskiven som viser kjernen massosus (rød), direkte rundt den mellomliggende sonen (rosa), og deretter i sirkulære lag rundt den anulus fibrosus. Legg merke til den ply-vinkel retning av kollagen type I fibre i anulus fibrosus. Den aksiale belastningen til kjernen kan dermed oversettes til aksiale strekkkrefter av kollagenfibrene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Skjematisk illustrasjon av ulike romlige organisatoriske mønstre av kondrocytter. Avhengig av vev kondrocytter finnes som enkeltceller, par eller strenger i sunn brusk. Med begynnelsen av degenerasjon endres disse mønstrene til å danne doble strenger, små klynger og deretter store klynger i sluttfasedegenerasjon. Denne figuren er endret fra Danalache, M. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Ulike forhold på mellomvirvelskiven (IVD). (A-D') Sagittal T2-vektet magnetisk resonansavbildning av den menneskelige lumbale ryggraden (A-D), med det forstørrede bevegelsessegmentet L4/L5 (A'-D'). Den ventrale siden av pasienten vender mot venstre, dorsalsiden vender mot høyre med ryggraden med sitt hvite signal for cerebrospinalvæsken. (A,A') Intakt IVD med anulus vises med et hypointense (svart) signal på grunn av den høye kollagen type I innhold og kjernen viste mye lysere (hyperintense) på grunn av det høye innholdet av vannbindende proteoglykaner (Pfirrmann grad19 I). (B,B') Begynnende IVD degenerasjon med tap av vannsignalet fra kjernen pulposus og hvor skillet mellom anulus og kjerne går tapt (Pfirrmann grad19 IV). (C,C') Akutt kjernefysisk prolaps med fortsatt et fremtredende vannsignal i kjerneindikativet for en ellers intakt IVD og skivevevet som stikker dorsalt inn i ryggraden. (D,D') Avansert skive degenerasjon med en i stor grad ødelagt IVD med et fullstendig tap av vannsignalet i platen, ventral og dorsal spondylophyte formasjon og subkondral sklerose av ryggvirvlene tilsvarende en Pfirrmann grad19 av V. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Mosaikk fluorescens avbildning av mellomvirvelskiven (IVD). Arkitekturen til IVD med sitt tette kollagenfibernettverk i anulus fibrosus og den mykere kjernen kan tydelig gjenkjennes. DAPI-kjernefysisk farging (hvit) i aksialplanet (A1) og sagittalplanet (A2) viser cellefordelingen og -arrangementet i IVD. Forstørrede representative områder fra disse mosaikkbildene vises i B1-B4 og C1-C4 som illustrerer den romlige kondrocyttorganisasjonen - i dette tilfellet enkeltceller (grønn boks), par (blå boks) og strenger (gul boks). A: skala bar 1000 μm, B1-B4: skala bar 200 μm, C1-C4: skala bar: 50 μm. Denne figuren er endret fra Bonnaire, F.C. et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Ulike utviklings- og modningsstadier av bovin anulus fibrosus og menneskelig degenerering anulus fibrosus. DAPI kjernefysisk farging. Mosaikkbildene viser en hel tidlig embryonal plate i en aksial seksjon (A1) og representative bilder av bovin anulus under embryonal utvikling, modning og begynnende degenerasjon (A2-A8). (B1-B3) Anulus fra menneskelige IVDer ble oppnådd intraoperativt. En kontinuerlig reduksjon i cellulær tetthet kan observeres under embryonal plateutvikling. Et høyere romlig organisasjonscellemønster ser ut til å være til stede spesielt rundt fødselen. I den voksne menneskelige platen under degenerasjon øker den cellulære tettheten igjen og økende klyngedannelse kan observeres. Skala bar 100 μm. Wog: uker med svangerskap. Denne figuren er endret fra Bonnaire, F.C. et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Reduksjon i cellulær tetthet gjennom utvikling og modning av den bovine intervertebrale platen. Gjennomsnittlig (standardavvik) celleantall per mm² er illustrert med søylediagrammer for bovin anulus fibrosus (A) og bovin nucleus pulposus (B). En klar reduksjon av cellulær tetthet kan observeres spesielt i den embryonale perioden som fortsetter i mindre grad minst til full modning av platen (n = 72). Wog: uker med svangerskap. Denne figuren er endret fra Bonnaire, F.C. et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Apotomeavbildning av mellomvirvelskiven (IVD). Bikanalsbilde som viser cytoplasma (rød, Actin-farging) og kjernen (blå, DAPI kjernefysisk farging). (A) I den intakte IVD, i tillegg til det dominerende romlige mønsteret av enkle kondrocytter, finnes det også par. (B) I degenererte anuluscelleklynger finnes. Skalalinje 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1. Apotome avbildning av et par i mellomvirvelskiven (IVD) som en 3D-modell. Tokanalsbilder som viser cytoplasma (rød, Actin-farging) og kjernen (blå, DAPI kjernefysisk farging) av et par. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2. Apotome avbildning av en klynge i mellomvirvelskiven (IVD) som en 3D-modell. Bikanalsbilder som viser cytoplasma (rød, Actin-farging) og kjernen (blå, DAPI kjernefysisk farging) av en klynge. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Tabell 1: Bovin embryonal utvikling, modning og vekst etter fødselen med sine ulike milepæler. Wog - uker med svangerskap. Svangerskapstid ca. 283 dager, naturlig forventet levetid 20-25 år20,23,24. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av fluorescensmikroskopi forsterket av mosaikkavbildning og optisk seksjonering, evaluerte vi det romlige arrangementet av kondrocytter i anulus av lumbale IVD gjennom utvikling, modning og degenerasjon. Mens degenerativt vev kunne høstes fra pasienter som fikk ryggradskirurgi for skivedegenerering, krevde analyse av embryonal periode og modningsfase bruk av en modellorganisme (storfe). Høye cellulære tettheter ble notert i anulus under tidlig embryonal utvikling. I det videre utviklingsforløpet kunne man observere postnatal vekst og modning en markert reduksjon i cellulær tetthet. I humant vev med avansert skivedegenerasjon kunne vi da kvantifisere en økning i cellulær tetthet i anulus fibrosus.
Den raske økningen i vevsvolum kombinert med aktivt deling og biosyntetisk aktive notochordale celler er sannsynlige årsaker til endringene i cellulær tetthet observert i embryoet25. Mekanismene som cellulær tetthet igjen øker med degenerasjon, forblir imidlertid fortsatt uklare. Degenerative prosesser i anulus fører til en rekke patologiske endringer, inkludert økt vevsinnvandring og betennelse, oppregulering av matriseforringende enzymer og vekstfaktorproduksjon, og også endringer i cellulæritet26,27,28.
Når vi vurderer celletilstedeværelse som en funksjon av cellulær romlig organisasjon basert på mønstre kjent fra leddbrusk7,9 fant vi ingen gjenkjennelig romlig organisasjon i tidlige embryonale plater der cellene ser ut til å være tett pakket og som vi anså for å være til stede som enkeltceller22. Dette funnet er i samsvar med resultatene fra embryonal leddbrusk7. I den sunne modne anulus representerer enkeltceller det dominerende romlige mønsteret22. Par og strengformasjoner kan imidlertid også observeres22. Jo mer degenererer vevet i menneskelige plater, jo høyere andel celler som finnes i klynger22. Den fysiopatologiske modellen foreslått av Rolauffs i leddbrusk7,9,29 viser en spennende likhet med våre funn. Tidligere studier på IVD-degenerasjon hadde også allerede skissert klyngedannelse som et kjennetegn på platedegenerering14,30,31,32,33. Siden disse klyngene for det meste finnes i høyt degenerert vev, kan klyngedannelse indikere et mislykket forsøk på vevet for å reparere degenerativ skade34. Etablering av en sterk sammenheng mellom det lokalt dominerende kondrocyttmønsteret og vevselastisiteten, kan en høy funksjonell relevans av disse mønstrene demonstreres i leddbrusk10,11. Det kan spekuleres i at en slik funksjonell relevans også gjelder for romlig kondrocyttorganisasjon i IVD.
Fluorescens histologiske analyser er en lett å komme forbi og attraktive midler for å analysere morfologiske endringer i vev. Når du prøver å histologisk analysere IVD, er det tydelige tekniske vanskeligheter som må overvinnes: For det første gjør den begrensede tilgjengeligheten av menneskelig vev det viktig å velge en tilstrekkelig dyremodellorganisme som de aspektene av sykdommen kan studeres der menneskelige prøver ikke kan oppnås. For forskningsspørsmålet som ble tatt opp i denne studien, valgte vi en storfedyrmodell.
For det andre er behandling av kollagen type I-rik IVD mye mer utfordrende enn for de fleste andre menneskelige vev. Det tette kollagen type I-fibernettverket sprer sterkt fluorescerende lys og skaper et høyt bakgrunnsstøysignal. Dette problemet løses best ved hjelp av en teknikk som tillater subtraksjon eller eliminering av et slikt bakgrunnssignal. En kjent metode for å gjøre det er konfokal mikroskopi. Mens bildekvaliteten til kondokale ervervede LASER-bilder vanligvis er utmerket, er ulempene ved denne teknikken at den er relativt tidkrevende, og som sådan tillater den ikke analyse av større vevsområder ved hjelp av mosaikkavbildning. For det andre er konfektmikroskop relativt dyre og ikke tilgjengelige overalt. En mye raskere og billigere måte å filtrere ut bakgrunnsstøy på er å utføre optisk seksjonering, for eksempel ved hjelp av en Apotome.
For å kunne tolke funnene riktig, er det viktig å også riktig tildele vevet som skal analyseres til opprinnelsen i IVD. Selv om denne oppgaven er relativt enkel når du har en hel storfeskive å velge mellom, kan det være svært utfordrende når du mottar menneskelig vev fra operasjonsteateret. Det karakteristiske trekk ved anulus fibrosus er det svært tette kollagen type I-nettverket i en vinkel-ply fiber orientering. Kjernen er derimot en amorf gelatinøs struktur der ingen høyere kollagenarkitektur er synlig for det blotte øye. Mellomsonen ligger mellom de to ekstremene og har også en klar kollagenfiberarkitektur, men den er mye mykere og mindre tett enn anulus fibrosus. Den bruskaktige endeplaten består av hyaline brusk, presenterer ikke med en kollagenarkitektur gjenkjennelig av det blotte øye, men det er ganske "glasslignende" som begrepet "hyaline" antyder. I motsetning til kjernen massosus er det imidlertid også veldig stivt, kan ikke deformeres, og ligger på subkondralbenet som ofte fortsatt kan gjenkjennes ved inspeksjon av vevet.
Når vevsopprinnelsen er riktig identifisert, må vevet fortsatt være riktig orientert for seksjonering for å få standardiserte bilder som også tillater en riktig kvalitativ og kvantitativ avlesning. I orientering til andre avbildningsteknikker som magnetisk resonansavbildning foreslår vi to standard analyseplan: en median-sagittal seksjon og en i aksialplanet. Disse to flyene vil også gi et godt inntrykk av arkitekturen til kollagen type I-fibernettverket til anulus. Ved tolkning av funnene fra F-aktinfarging må man huske på at frysing av vevsprøvene kan forårsake cytoskeletale strukturendringer35 som imidlertid ikke bør påvirke den romlige kondrocyttorganisasjonen.
Å fullt ut forstå cellulær biologi av IVD er en av de fortsatt åpne utfordringene i vår forståelse av plate degenerasjon og regenerering36. Spørsmål som noen ganger virker trivielle, for eksempel det fysiologiske arrangementet av celler i sunt vev eller spørsmålet om cellulær omorganisering under degenerasjon, forblir til dags dato ubesvart. Den oppnådde kunnskapen kan tillate oss å bruke denne bildebaserte degenerasjonsmarkøren for å evaluere vevskvaliteten, undersøke reversibiliteten til klyngedannelse og dermed muligens definere et terapeutisk vindu der degenererende prosessene fortsatt kan målrettes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker våre medforfattere fra de opprinnelige publikasjonene for deres hjelp og støtte. Vi takker Charlotte Emma Bamberger for å ha bidratt til å skaffe apotome-bildene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S.
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N.
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
