Summary
Vi presenterar en metod för att undersöka rumsliga chondrocyte organisation i anulus fibrosus av intervertebral skivan med hjälp av en optisk avsnittsmetod.
Abstract
Intervertebral skiva (IVD) degeneration är en ledande orsak till låg ryggsmärta och det medför en hög grad av nedskrivning för de drabbade individerna. För att avkoda skivdegeneration och för att kunna utveckla regenerativa metoder är en grundlig förståelse av IVD: s cellulära biologi avgörande. En aspekt av denna biologi som fortfarande förblir obesvarad är frågan om hur celler rumsligt är ordnade i ett fysiologiskt tillstånd och under degeneration. De biologiska egenskaperna hos IVD och dess tillgänglighet gör denna vävnad svår att analysera. Denna studie undersöker rumsliga chondrocyte organisation i anulus fibrosus från tidiga embryonala utveckling till slut-steg degeneration. En optisk sektionsmetod (Apotome) tillämpas för att utföra högupplösta färgningsanalyser med hjälp av embryonal vävnad av nötkreatur som djurmodell och vävnad från människa som erhållits från patienter som genomgår ryggkirurgi. Från en mycket hög chondrocyttäthet i den tidiga embryonala nötkreaturskivan minskar antalet celler under dräktigheten, tillväxten och mognaden. I mänskliga skivor åtföljde en ökning av cellulär densitet progressionen av vävnad degeneration. Som redan har visats i ledbrosk representerar klusterbildning en karakteristisk egenskap hos avancerad skiva degeneration.
Introduction
Den intervertebral skivan (IVD) är en broskbaserad struktur som biokemiskt och med avseende på cellulär arkitektur vid första anblicken liknar på många sätt ledbrosk1. Faktum är att både IVD-degeneration och artros (OA) av ledbrosk kännetecknas av att ledutrymmet förskred på grund av broskslitage, subkonndralcyst och osteofytbildning och subkonndral skleros2,3. Trots dessa till synes likheter arkitektur och funktionella roll av båda vävnader skiljer sig. Medan matrisen av ledbrosk huvudsakligen består av ett arkadbildande kollagen typ II-nätverk, består IVD av tre olika typer av vävnad: kollagen typ II-rik kärnmassa i mitten tar upp axiella belastningar och överför dem till en omfattande ring av tätt packade cirkulära kollagen typ I-fibrer som kallas anulus fibrosus. Deras funktion är att absorbera de översatta axiella tryck som tas emot av proteoglykan- och vattenrika kärnan med sin draghållna longitudinella fiberstyrka. Högst upp och längst upp i varje kärna och anulus bildar en hyalinebrosksk ändplatta korsningen till de intilliggande kotorna4 (figur 1).
I ledbrosk finns fyra distinkta rumsliga korndrocytmönster: par, strängar, dubbla strängar, små respektive stora kluster5,6,7 ( figur2). Förändringar i detta mönster är associerade med OA-debut och progression8,9. Rumslig chondrocytorganisation är också vägledande för en direkt funktionell egenskap hos brosk, nämligen dess styvhet, vilket understryker den funktionella relevansen av denna bildbaserade graderingsmetod10,11. Dessa mönster kan dessutom identifieras med redan befintlig kliniskt tillgänglig teknik12. På grund av likheterna mellan IVD och artikulärt brosk, kan det antas att karakteristiska chondrocyte mönster finns också i IVD. Klusterbildning är ett fenomen som också observeras i den degenererade IVD13,14.
När man försöker analysera rumslig cellulär organisation i IVD är det nödvändigt att övervinna flera tekniska svårigheter som inte finns när man undersöker ledbrosk:
För det första är bearbetningen av själva vävnaden mycket mer utmanande än med det homogena hyalinbrosket som till stor del består av kollagen typ II. IVD:s huvudsakliga fiberkomponent är kollagentyp I, vilket gör det mycket svårare att generera tunna histologiska sektioner. Medan i hyaline ledbrosk även tjocka sektioner lätt kan analyseras på grund av vävnadens "glasliknande" natur, är IVD: s kollagen typ I-nätverk optiskt mycket ogenomträngligt. Av denna anledning är ett starkt bakgrundsljud ett vanligt problem i IVD: s histologi. Ett snabbt och billigt sätt att penetrera denna optiskt täta vävnad är användningen av en optisk sektionsanordning, t.ex. med hjälp av en apotom. I en sådan apotom sätts ett galler in i belysningsvägen för ett konventionellt fluorescensmikroskop. Framför gallret placeras en planparallell glasplatta. Detta lutar fram och tillbaka och projicerar därmed rutnätet i bilden i tre olika lägen. För varje z-position skapas tre råa bilder med det projicerade rutnätet och läggs ovanpå. Med hjälp av speciell programvara kan det out of focus ljuset beräknas ut. Den underliggande principen är att om rutnätet är synligt är den informationen i fokus, om inte anses den vara ur fokus. Med denna teknik kan välfokuserade och högupplösta bilder förvärvas inom rimlig tid.
För det andra är vävnaden svår att få tag på från mänskliga donatorer. Vid total knäledsplastik kan hela ledens yta erhållas för ytterligare analys under operationen. Även om artros i en diarthrodial led också är en sjukdom i hela leden, finns det ändå starka fokala skillnader i broskets kvalitet med vanligtvis vissa områden i leden fortfarande intakta, till exempel på grund av minskad belastning i det området. Denna situation är annorlunda i IVD, där kirurgi vanligtvis endast utförs när skivan är globalt förstörd. När vävnaden erhålls från mänskliga donatorer från operationsrummet är den också mycket fragmenterad och det är nödvändigt att korrekt fördela vävnaden till en av de tre brosktyperna i IVD innan du gör ytterligare analyser. För att möjliggöra mer detaljerade analyser av även större vävnadssektioner och för att undersöka den embryonala utvecklingen av IVD är valet av en djurmodellorganism därför nödvändigt.
När man väljer en sådan modellorganism är det viktigt att ha ett system som är jämförbart med den mänskliga skivan med avseende på dess anatomi och dimensioner, dess mekaniska belastning, den nuvarande cellpopulationen samt dess vävnadssammansättning. För den presenterade tekniken här föreslår vi användning av bovin ländkotor skiva vävnad: En kritisk egenskap hos den mänskliga skivan som resulterar i dess låga regenerativa potential är förlusten av notokordal celler under mognad i kärnan. Men i många modellorganismer kan inteochordala celler detekteras hela sitt liv länge. De flesta av de få djur som förlorar sina notokordala celler som får, getter eller chondrodystrophig hundar har en IVD som är mycket mindre än mänskliga skivor. Endast ländryggsskivor av nötkreatur med en jämförbar sagittal skivdiameter med den hos ivds för människa15.
En nyckelfaktor som leder till tidig skivdegenerering är överdriven mekanisk belastning. De intradiskala trycken hos en stående ko i ländryggen är cirka 0,8 MPa med ryggraden justerad horisontellt. Förvånansvärt är dessa tryck jämförbara med de ländryggs intradiskala tryck som rapporterats för den erigerade mänskliga ryggraden (0,5 MPa)15,16. Även mängden vatten och proteoglykaner i nötkreaturskivor är jämförbar med IVD från unga människor17. Därför, även om rörelsesegmentens faktiska rörelsemönster kan skilja sig åt i fyrdubbla djur från den tvåbenta människan, med avseende på total lastning och skivegenskaper, är koen mycket närmare mänsklig biologi än andra etablerade djurmodeller för IVD som får och hundar.
I detta protokoll presenterar vi en teknik hur man analyserar förändringar i IVD ur synvinkeln av rumsliga chondrocyte organisation från tidiga embryonala utveckling till slutstadiet degeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För analys av embryonal utveckling och mognad användes nötkreaturskivor. För att utvärdera degenerering av IVD analyserades mänskliga prover.
Human IVD vävnad erhölls från patienter som genomgår kirurgi för ländkotor skiva degeneration, skiva prolapse eller spinal trauma i institutionen för ortopedisk kirurgi, universitetssjukhuset i Tübingen och BG Trauma Centre Tübingen. Fullständigt godkännande från etikkommittén erhölls innan studien påbörjades (projektnummer 244/2013BO2). Skriftligt informerat samtycke mottogs från alla patienter före deltagande. Metoderna utfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.
Nötkreatursvävnad erhölls från bayerska statens kontor för hälsa och livsmedelssäkerhet/Oberschleißheim och från en destrueringsanläggning i Warthausen (Tyskland). Lokala och veterinära myndigheters godkännande mottogs för vävnad från döda djur.
1. Provskörd
- Human IVD-vävnad: Placera intraoperativt erhållna IVD-prover omedelbart i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 2% (v/v) penicillin-streptomycin och 1,2% av (v/v) amphotericin B. Förvara vid 4 °C tills vidare bearbetning. Bearbeta vävnaden inom 48 timmar. Alternativt kan du lagra vävnaderna vid -20 °C i flera veckor.
- Bovin IVD-vävnad: Se till att vävnaden skördas från djuren inom 24 timmar efter dödsfallet.
Återförsluta nötkreaturskivorna med de omgivande kotorna från de döda djuren i blocket. Transportera den frusna vävnaden på torris och förvara vid -20 °C tills vidare bearbetning.
OBS: Om endast fluorescensanalyser är avsedda och inga ytterligare biokemiska kvantifieringsmetoder som ELISA eller PCR planeras, utför vävnadsfixeringen enligt nedan. Detta gör det möjligt att hålla vävnaden längre i lagring innan den behöver bearbetas. För att förhindra försämring av vävnadsmatrisen, utför fixering inom 48 timmar efter skörd om inte vävnaden fryses direkt.
2. Provberedning
- Tina den frusna vävnaden vid rumstemperatur. Bearbeta vävnaden så snart inga iskristaller längre kan kännas vid digital skonsam komprimering av vävnaden.
OBS: Utför beredning av vävnaden i DMEM i en Petriskål. - Identifiera ursprunget för den mänskliga IVD-vävnaden (anulusfibus, mellanzon, nucleus pulposus eller broskig endplate) baserat på makroskopiska egenskaper som kollagentäthet och orientering.
- Ta rörelsesegmentet som består av bovin IVD-skivan med sina två intilliggande ryggkotor och dissekera skivan som helhet från subkondralbenet med hjälp av ett kirurgiskt blad (blad nummer 15).
- Använd två anatomiska tångar för att vända skivan för att nå områden som är mer centrerade. Utför dissekeringen. Se till att återförsluta kärnan pulposus sist eftersom den är mycket tunnare än anulus, benägen att riva, och det kommer inte av på ett definierat sätt lätt.
- Identifiera broskets olika områden.
- Klipp ut intresseområdet från hela skivan med hjälp av ett kirurgiskt blad (bladnummer 20 eller 22). Alternativt kan du använda ett kryomeblad.
OBS: Eftersom nötkreatursskivor kommer i ett block som en del av ryggraden kan skivorna beredas in-toto. Detta gör korrekt identifiering av de olika typerna av brosk mycket lättare. Vid dissekering av skivan på det sätt som beskrivs ovan förblir den broskiga endplaten på kotorna. Om detta område ska undersökas tas det bäst bort från det underliggande benet med en mejsel som arbetar i en något böjd tangentiell riktning.
- Om embryona har en kron-rumpalängd på mindre än 20 cm, se till att embryona bearbetas för att bevara IVD:s vävnadsarkitektur. Utför inte någon dissekering av ryggkotorna i dessa fall.
- När skivan har omplacerades i toto, identifiera de olika områdena i brosket.
- Utför avkalkningen i etylendiamintetraakuletsyra (EDTA) (20% (w/v); pH = 7,4) vid rumstemperatur. Välj volym beroende på provstorleken - hela vävnaden måste vara väl täckt med EDTA.
- Ändra avkalkningslösningen dagligen som kan gå i upp till 5 dagar beroende på vävnadens storlek.
- Kontrollera att avkalkningen lyckas med en 20 gauge nål som tränger in i ryggkotorna utan märkbart motstånd.
OBS: Den dagliga förändringen av avkalkningslösningen är viktig för att förhindra att kelatbindemedlet EDTA mättnad för att bibehålla reaktionseffektiviteten. Det förhindrar också bakteriell kolonisering.
3. Gradering av provålder, integritet och degenerering
- Klassificera den mänskliga skivvävnaden i en av de fem följande kategorierna med hjälp av klinisk information samt röntgen och magnetisk resonanstomografi18 (figur 3).
OBS: Kategori I: För att fungera som nästan friska prov använd anulus utan några radiologiska tecken på IVD degeneration härrör från akut spinal trauma.
Kategori II: För att illustrera en situation med akut inflammation med början degeneration använd vävnad från mellanzonen från patienter med kliniska symtom med en varaktighet på mindre än 4 veckor.
Kategori III: För att beskriva en situation där den inflammatoriska reaktionen redan hade haft tid att påverka vävnaden och cellerna ta vävnad från patienter som opererades för ett nukleärt prolaps men med en symptom varaktighet som överstiger 4 veckor.
Kategori IV: För måttlig skivdegeneration välj anulus som erhållits från kirurgi med interbody fusion för degenerativ skivsjukdom med en Pfirrmann-poäng på 3 eller 4 i magnetisk resonanstomografi19.
Kategori V: För slutfas degeneration process anulus erhålls från kirurgi med interbody fusion för degenerativ skiva sjukdom med en Pfirrmann poäng på 5. - Klassificera nötkreatursvävnaden på grundval av djurets utvecklingsstadium/ålder i någon av de åtta kategorierna, som visas i tabell 1.
- Beräkna dräktighetsåldern på embryonas kron-rumpalängd baserat på formeln som föreslås av Keller:
Dräktighetsålder i månader =
OBS: Djur under de första 4 veckorna av dräktigheten närvarande med en kron-rumpa längd på 0,8-2,2 cm20.
- Beräkna dräktighetsåldern på embryonas kron-rumpalängd baserat på formeln som föreslås av Keller:
4. Vävnadsfixering
- Fixera proverna i 10x provvolymen av 4% (w/v) formaldehydlösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) över natten vid 4 °C.
OBS: Formaldehydlösningen penetrerar vävnaden med en hastighet av ca 1 mm/timme från varje riktning. För mycket små eller mycket stora prover kan en justering av exponeringstiden vara nödvändig. - Förvara vävnaden i PBS vid 4 °C tills vidare bearbetning.
5. Histologic sektionering
- Bädda in proverna i vattenlösligt inbäddningsmedium på kryotonedrotten.
- Placera vävnaden på ratten så att antingen ett axiellt plan genereras eller ett plan som skär kollagen typ I lameller vinkelrätt (t.ex. ett median sagittalt sektionsplan).
OBS: Vävnaden måste täckas helt av inbäddningsmediet.
- Placera vävnaden på ratten så att antingen ett axiellt plan genereras eller ett plan som skär kollagen typ I lameller vinkelrätt (t.ex. ett median sagittalt sektionsplan).
- Dela upp den inbäddade vävnaden med en tjocklek av 70 μm i humanprover och 40 μm i nötkreatursprover med hjälp av en vanlig kryom.
OBS: Skillnaden i sektionstjocklek beror på skillnaden i vävnadsintegritet mellan den intakta nötkreatursskivan och den mycket degenererade mänskliga vävnaden. - Samla sektionerna på en glasrutschbana.
- Omringa vävnadssektionerna med en hydrofobisk penna.
- Skölj sektionerna 3 gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna det vattenlösliga inbäddningsmediet.
6. Fluorescensfärgning
- Tillsätt 60 μL 1% (v/v) DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) samt 1% (v/v) Actin Tracking färgning (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) i PBS och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
OBS: Färgningsprotokollet som beskrivs här är att visualisera kärnan med DAPI kärnfärgning (blå) och cytoplasman med Hjälp av Actin Tracking Stain (röd). IVD har en stark autofluorescens på grund av kollagenfibrerna i den gröna kanalen. Mängden vätska som tillsätts sektionerna i detta protokoll är avsedd för sektioner av en storlek av ca 5 mm x 5 mm. För större sektioner måste detta belopp ökas i enlighet därmed. Utför alla arbeten i rum utan direkt solljusexponering och med dämpade lampor för att förhindra blekning av färgämnet. - Ta bort färgningsvätskan med en pipett och tvätta tre gånger med 60 μL PBS varje gång.
- Tillsätt ett lämpligt monteringsmedium och täck sektionerna med en täcklapp.
OBS: Se till att det inte finns några luftbubblor som fastnar när du lägger till täcksvittan. Detta görs bäst genom att starta kontakten med slipen med glidningen på en fälg och låt sedan glidningen komma ner långsamt.
7. Mikroskopisk avbildning och bearbetning
- Placera en bild med en fläckig sektion på mikroskopets provhållare.
OBS: På grund av IVD: s täta kollagen typ I-nätverk gör det spridda ljuset vävnaden svår att visualisera med konventionell fluorescensmikroskopi. Ett sätt att lösa detta problem är att utföra optisk sektion med strukturerad belysning. Detta gör det också möjligt att återge en tredimensionell projektion av hela provet i båda kanalerna (blå och röd). Detta görs bäst med hjälp av den strukturerade belysningsinställningen och Mosaic-läget med en 10x förstoringsmållins för att få en översikt över provet samt 3D-rekonstruktioner av enskilda mönster. - Starta den strukturerade belysningsanordningen.
- Utför enstaka synfältsbilder med lämpligt fluorescensmikroskop, fluorescensfilter och tillräcklig belysning.
OBS: Justera exponeringstiden för alla filter som används för att standardisera bildförvärvet. För att få en korrekt representation av provet med en bild med högre upplösning sektionerna med en högre förstoring (t.ex. 20x mål). - Efterbehandla bilderna genom att optimera intensiteten och ljusstyrkan med hjälp av en bildoptimeringsprogramvara som är kompatibel med fluorescensmikroskopet.
- Utför enstaka synfältsbilder med lämpligt fluorescensmikroskop, fluorescensfilter och tillräcklig belysning.
- För att visualisera avsnittet som helhet använder du mosaikavbildningstekniken
- Öppna förvärvsinställningarna (tryck på 6D- Förvärv) från verktygsfältspanelen.
- Justera mosaikinställningarna (i MosaiX Register) och definiera antalet kolumner och rader med synfältsbilder som senare ska sammanfogas till en översiktsbild.
- Tryck på Inställningar och justera fokuskorrigeringen för enskilda paneler.
OBS: Det är nästan omöjligt för en stor vävnadssektion att ha hela vävnadsytan i ett enda fokusplan. Bildpaneler på olika fokusnivåer kan tas av "MosaiX Acquisition". - Om du vill starta förvärvet av bildpanelerna trycker du på Start.
- Sy de avbildade plattorna med hjälp av stygnfunktionen(Stitching button) med 20% överlappning ingår i programvaran.
- Efterbehandla bilderna genom att optimera intensiteten och ljusstyrkan med hjälp av en bildoptimeringsprogramvara som är kompatibel med fluorescensmikroskopet.
- För att analysera den rumsliga chondrocyte organisationen, använd 3D-funktionen som ingår i programvaran.
- Justera z-stack-inställningarna. Definiera skanningsparametrarna: definiera start- och stopppositionerna i z-axeln och segmentavståndet genom att aktivera start-/stoppknappen.
OBS: Programvaran beräknar automatiskt antalet segment. - Om du vill börja ta fram bild z-staplarna trycker du på Start.
- Efterbehandla bilderna genom att optimera intensiteten och ljusstyrkan med hjälp av en bildoptimeringsprogramvara som är kompatibel med fluorescensmikroskopet.
- Justera z-stack-inställningarna. Definiera skanningsparametrarna: definiera start- och stopppositionerna i z-axeln och segmentavståndet genom att aktivera start-/stoppknappen.
- Exportera bilderna med ett filformat som är kompatibelt med bildbehandlingsprogramvaran.
OBS: Exportera 3D-rekonstruktionerna som enskilda bilder eller/och som en interaktiv 3D-modell eller i videoformat.
8. Bedömning av cellulärt mönster och densitet
- Öppna de exporterade mosaikbilderna av hela vävnadssektionen i ett lämpligt bildbehandlingsprogram.
- Definiera de områden som är föremål för celldensitetsbedömning genom att definiera områden av intresse på 500 μm x 500 μm i bilderna.
OBS: Alla paneler som inte har tillräcklig bildkvalitet är undantagna från analys. - Identifiera enskilda cellulära mönster.
OBS: Enstaka celler definieras som enskilda celler - helt inkapslade i den intilliggande matrisen. Par definieras som två intilliggande celler i närheten (<25 μm) varigenom cellerna är sammankopplade genom sina matriser (se figur 2). Strängformationer är minst tre kondrocyter i linje (från mitten av kärnorna <25 μm). Dessa celler omfattas av en intakt matris och matrissammankopplingar kan ses mellan varje cell. Kluster representerar flera celler som ligger i direkt närhet till varandra (<25 μm) och är inkapslade i en stor lucka utan matris. - Använd en plugin-instickning för cellantal för kvantitativ analys av cellmönstren.
OBS: Cytoplasmafärgningen representerar en verifieringsmetod för att identifiera de olika rumsliga mönstren. - Beräkna celldensiteten genom att dividera de räknade cellerna med storleken på den valda intresseregionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av mosaikbilder kan IVD: s arkitektur med sitt täta kollagenfibernätverk i anulus och den mjukare kärnan tydligt kännas igen (figur 4). En kontinuerlig minskning av celldensiteten kan observeras under embryonal utveckling (figur 5). I de tidiga stadierna av IVD-utvecklingen finns en celltäthet på 11 435 celler/mm² i bovin anulusfibus och 17 426 celler/mm² i bovinkärnans pulposus, men dessa siffror minskar snabbt till 1 011 celler/mm² (bovin anulusfibus) och 488 celler/mm² (bovin kärnmassa) fram till födseln. Hos vuxna nötkreatur ses 71 celler/mm² (anulus fibrosus) resp. 106 celler/mm² (nucleus pulposus)(figur 6 A-B). Genom att använda tvåkanalsavbildning med Apotome kan du visualisera 3D-arkitekturen för de rumsliga mönstren (figur 7).
Bild 1. Makroskopisk anatomi av den intervertebral skivan. Schematisk ritning av den intervertebral skivan som visar kärnan pulposus (röd), direkt runt den mellanzonen (rosa), och sedan i cirkulära lager runt den anulus fibrosus. Notera tillförselns vinkelriktning för kollagen typ I-fibrer i anulusfibus. Axiell belastning till kärnan kan således översättas till axiella dragkrafter i kollagenfibrerna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2. Schematisk illustration av olika rumsliga organisationsmönster av kondrocyter. Beroende på vävnaden finns chondrocyter som enstaka celler, par eller strängar i friskt brosk. Med början degeneration ändras dessa mönster till att bilda dubbla strängar, små kluster och sedan stora kluster i slutfas degenerering. Denna siffra har ändrats från Danalache, M. m.fl.21. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3. Olika villkor för den intervertebral skivan (IVD). ( A-D') Sagittal T2-viktad magnetisk resonanstomografi av den mänskliga ländryggen (A-D), med det förstorade rörelsesegmentet L4/L5 (A'-D'). Den ventrala sidan av patienten ansikten vänster, dorsala sidan vänder sig höger med ryggrad kanalen med sin vita signal för ryggmärgsvätskan. (A,A') Intakt IVD med anulus visas med en hypointense (svart) signal på grund av det höga kollagen typ I-halten och kärnan visas mycket ljusare (hyperintense) på grund av det höga innehållet av vattenbindande proteoglykaner (Pfirrmann grad19 I). (B,B') Början IVD degeneration med en förlust av vattensignalen från kärnan pulposus och där skillnaden mellan anulus och kärnan går förlorad (Pfirrmann grad19 IV). C,C') Akut nukleära prolapse med fortfarande en framträdande vattensignal i området av kärnan vägledande för en annars intakt IVD och skivan vävnad utskjutande dorsally in i ryggrad kanalen. (D,D') Avancerad skivdegeneration med en till stor del förstörd IVD med en fullständig förlust av vattensignalen i skivan, ventral och dorsal spondylophytebildning och subkondral skleros av ryggkotorna motsvarande en Pfirrmann grad19 av V. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Mosaik fluorescens imaging av intervertebral skiva (IVD). Arkitekturen i IVD med sitt täta kollagenfibernätverk i anulus fibrosus och den mjukare kärnan kan tydligt kännas igen. DAPI-nukleär färgning (vit) i axiella (A1) och sagittal (A2) planet visar cellfördelningen och arrangemanget inom IVD. Förstorade representativa områden från dessa mosaikbilder visas i B1-B4 och C1-C4 som illustrerar den rumsliga chondrocytorganisationen - i detta fall enstaka celler (grön låda), par (blå låda) och strängar (gul låda). A: skalstång 1 000 μm, B1-B4:skalstång 200 μm, C1-C4: skalstång: 50 μm. Denna siffra har ändrats från Bonnaire, F.C. etal.22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5. Olika utvecklings- och mognadsstadier av bovin anulus fibrosus och mänskliga degenererande anulus fibrosus. DAPI kärnfärgning. Mosaikbilderna visar en hel tidig embryonal skiva i ett axiellt avsnitt (A1) och representativa bilder av bovin anulus under embryonal utveckling, mognad och början degeneration (A2-A8). (B1-B3) Anulus från mänskliga IVDs erhölls intraoperatively. En kontinuerlig minskning av cellulär densitet kan observeras under embryonal skivutveckling. En högre rumslig organisation cellulära mönster verkar vara närvarande särskilt runt födseln. I den vuxna mänskliga skivan under degeneration ökar celltätheten igen och ökande klusterbildning kan observeras. Skalstång 100 μm. Wog: veckor av dräktighet. Denna siffra har ändrats från Bonnaire, F.C. etal.22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6. Minskning av cellulär densitet under hela utvecklingen och mognaden av den bovin intervertebral skivan. Medelvärdet (standardavvikelsen) per mm² illustreras av stapeldiagram för bovin anulus fibrosus (A) och bovinkärnans pulposus (B). En tydlig minskning av celltätheten kan observeras särskilt under embryonal period som fortsätter i mindre utsträckning åtminstone tills skivan mognar helt (n=72). Wog: veckor av dräktighet. Denna siffra har ändrats från Bonnaire, F.C. etal.22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7. Apotom imaging av den intervertebral skivan (IVD). Bikanalsbild som visar cytoplasman (röd, Actinfärgning) och kärnan (blå, DAPI nukleär färgning). ( A) I den intakta IVD, förutom det dominerande rumsliga mönstret av enstaka kondrocyter, finns par också. (B) I degenererade anulus cell kluster kan hittas. Skalstreck 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Apotom imaging av ett par i intervertebral skiva (IVD) som en 3D-modell. Bikanalsbilder som visar cytoplasman (röd, Actinfärgning) och kärnan (blå, DAPI nukleär färgning) av ett par. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2. Apotom imaging av ett kluster i den intervertebral skivan (IVD) som en 3D-modell. Tvåkanaliga bilder som visar cytoplasman (röd, Aktinfärgning) och kärnan (blå, DAPI kärnfärgning) i ett kluster. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Tabell 1: Embryonal utveckling, mognad och tillväxt efter födseln med sina olika milstolpar. Wog - veckor av dräktighet. Dräktighetsperiod ca 283 dagar, naturlig förväntad livslängd 20-25 år20,23,24. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av fluorescence mikroskopi förstärkt av mosaik imaging och optiska avsnitt, utvärderade vi det rumsliga arrangemanget av chondrocytes i anulus av ländkotor IVD under hela utveckling, mognad och degeneration. Medan degenerativ vävnad kunde skördas från patienter som fick ryggradskirurgi för skivdegeneration, krävde analys av embryonal period och mognadsfasen användning av en modellorganism (nötkreatur). Höga cellulära densiteter noterades i anulus under tidiga embryonala utveckling. Under den fortsatta utvecklingen kunde postnatal tillväxt och mognad observeras en uttalad minskning av cellulär densitet. I mänsklig vävnad med avancerad skivdegeneration kunde vi sedan kvantifiera en ökning av cellulär densitet i anulus fibrosus.
Den snabba ökningen av vävnadsvolymen i kombination med aktivt delande och biosyntetiskt aktiva notokordala celler är sannolika orsaker till de förändringar i celltätheten som observerats i embryot25. Mekanismerna genom vilka cellulär densitet igen ökar med degeneration är dock fortfarande oklara. Degenerativa processer av anulus leder till en rad patologiska förändringar inklusive ökad vävnadsin innervation och inflammation, uppreglering av matrisnedbrytande enzymer och tillväxtfaktorproduktion, och även förändringar i cellulärhet26,27,28.
När vi överväger cellnärvaro som en funktion av cellulär rumslig organisation baserad på mönster som är kända från ledbrosk7,9 hittade vi ingen igenkännlig rumslig organisation i tidiga embryonala skivor där cellerna verkar vara tätt packade och som vi ansåg vara närvarande som enstaka celler22. Detta konstaterande överensstämmer med resultaten från embryonalt ledbrosk7. I den friska mogna anulus representerar enstaka celler det dominerande rumsliga mönstret22. Par och strängformationer kan dock också observeras22. Ju mer degenererar vävnaden i mänskliga skivor, desto högre andel celler som finns i kluster22. Den fysiopatiska modellen som föreslås av Rolauffs i ledbrosk7,9,29 visar en spännande likhet med våra resultat. Tidigare studier om IVD-degeneration hade också redan beskrivit klusterbildning som ett kännetecken för skivdegeneration14,30,31,32,33. Eftersom dessa kluster mestadels kan hittas i mycket degenererade vävnader, kan klusterbildning indikera ett misslyckat försök av vävnaden att reparera den degenerativa skadan34. Etablera en stark korrelation mellan lokalt dominerande kondrocyt mönster och vävnad elasticitet, en hög funktionell relevans av dessa mönster kan påvisas i artikulärt brosk10,11. Det kan spekuleras att en sådan funktionell relevans också gäller rumsliga kondrocyt organisation i IVD.
Fluorescens histologiska analyser är ett lätt att komma med och attraktiva sätt att analysera morfologiska förändringar i vävnader. När man försöker histologiskt analysera IVD finns det distinkta tekniska svårigheter som måste övervinnas: För det första gör den begränsade tillgången på mänsklig vävnad det viktigt att välja en adekvat djurmodellorganism med vilken dessa aspekter av sjukdomen kan studeras där mänskliga prover inte kan erhållas. För den forskningsfråga som togs upp i denna studie valde vi en modell för nötkreatur.
För det andra är bearbetning av kollagen typ I-rik IVD mycket mer utmanande än för de flesta andra mänskliga vävnader. Det täta kollagen typ I-fiber-nätverket sprider starkt det fluorescerande ljuset vilket skapar en hög bakgrundsbrussignal. Det här problemet åtgärdas bäst med hjälp av en teknik som gör det möjligt att subtraktion eller eliminera sådan bakgrundssignal. En välkänd metod för att göra det är konfokal mikroskopi. Medan bildkvaliteten hos konfokal förvärvade LASER-bilder vanligtvis är utmärkt, är nackdelarna med denna teknik att det är relativt tidskrävande och som sådan tillåter det inte analys av större vävnadsområden med hjälp av mosaikavbildning. För det andra är konfokala mikroskop relativt dyra och inte tillgängliga överallt. Ett mycket snabbare och billigare sätt att filtrera bort bakgrundsljud är att utföra optisk sektion, t.ex. med hjälp av en Apotome.
För att korrekt kunna tolka resultaten är det viktigt att också korrekt fördela vävnaden som ska analyseras till sitt ursprung i IVD. Även om denna uppgift är relativt enkel när man har en hel nötkreaturskiva att välja mellan, kan det vara mycket utmanande när man tar emot mänsklig vävnad från operationssalen. Det karakteristiska inslaget hos anulusfibsus är dess mycket täta kollagen typ I nätverk i en vinkel-ply fiber orientering. Kärnan är däremot en amorf gelatinstruktur där ingen högre kollagenarkitektur är synlig för blotta ögat. Mellanzonen ligger mellan dessa två extrema och har också en tydlig kollagenfiberarkitektur, men den är mycket mjukare och mindre tät än anulus fibrosus. Den broskiga endplate består av hyaline brosk, presenterar inte med en kollagen arkitektur igenkännlig med blotta ögat men det är ganska "glasliknande" som termen "hyaline" föreslår. Till skillnad från kärnan pulposus är den dock också mycket styv, kan inte deformeras och ligger på subkondralbenet som ofta fortfarande kan kännas igen genom inspektion av vävnaden.
När vävnadens ursprung har identifierats korrekt måste vävnaden fortfarande vara korrekt orienterad för sektionering för att erhålla standardiserade bilder som också möjliggör en korrekt kvalitativ och kvantitativ avläsning. I orientering till andra bildframställning tekniker såsom magnetic-resonance imaging föreslår vi två standard analys-plan: en median-sagittal avsnitt och en i axial planet. Dessa två plan kommer också att ge ett gott intryck av arkitekturen i anulus kollagen typ I-fibernätverk. Vid tolkning av resultaten från F-aktin färgning måste det hållas i åtanke att frysning av vävnadsprover kan orsaka cytoskeletal struktur förändringar35 som dock inte bör påverka den rumsliga kondrocyt organisationen.
Att fullt ut förstå IVD: s cellulära biologi är en av de fortfarande öppna utmaningarna i vår förståelse av skivdegeneration och regenerering36. Frågor som ibland verkar triviala, såsom det fysiologiska arrangemanget av celler i frisk vävnad eller frågan om cellulär omorganisation under degeneration, förblir hittills obesvarade. Den erhållna kunskapen kan tillåta oss att använda denna bildbaserade degeneration markör för att utvärdera vävnad kvalitet, undersöka reversibilitet kluster bildas och därmed eventuellt definiera ett terapeutiskt fönster där de degenererande processerna fortfarande kan framgångsrikt riktas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar våra medförfattare från de ursprungliga publikationerna för deras hjälp och stöd. Vi tackar Charlotte Emma Bamberger för att hon hjälpte till att förvärva apotombilderna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S.
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N.
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
