Summary
Vi præsenterer en metode til at undersøge rumlig chondrocyt organisation i anulus fibrosus af den intervertebrale disk ved hjælp af en optisk sektionsmetode.
Abstract
Intervertebraral disc (IVD) degeneration er en førende årsag til lændesmerter, og det indebærer en høj grad af svækkelse for de berørte personer. At afkode diskdegeneration og være i stand til at udvikle regenerative tilgange en grundig forståelse af den cellulære biologi IVD er afgørende. Et aspekt af denne biologi, der stadig er ubesvaret, er spørgsmålet om, hvordan celler er rumligt arrangeret i en fysiologisk tilstand og under degeneration. De biologiske egenskaber af IVD og dets tilgængelighed gør dette væv vanskeligt at analysere. Den foreliggende undersøgelse undersøger rumlig chondrocyt organisation i anulus fibrøst fra tidlig embryonal udvikling til slutstadiet degeneration. En optisk sektionsmetode (Apotom) anvendes til at udføre farvningsanalyser med høj opløsning ved hjælp af embryonalt væv fra kvæg som dyremodel og humant diskvæv fremstillet af patienter, der gennemgår rygoperation. Fra en meget høj chondrocyttæthed i den tidlige embryonale kvægskive falder antallet af celler under svangerskab, vækst og modning. I menneskelige diske, en stigning i cellulære tæthed ledsaget progression af væv degeneration. Som det allerede var blevet påvist i ledbrusk, udgør klyngedannelse et karakteristisk træk ved avanceret diskdegeneration.
Introduction
Den intervertebrale disk (IVD) er en bruskbaseret struktur, der biokemisk og med hensyn til cellulær arkitektur ved første øjekast ligner på mange måder ledbrusk1. Faktisk er både IVD degeneration og slidgigt (OA) af ledbrusk karakteriseret ved ledplads indsnævring på grund af brusk slid, subchondral cyste og slidgigt dannelse, og subchondral sklerose2,3. På trods af disse tilsyneladende ligheder arkitektur og funktionelle rolle begge væv er forskellige. Mens matrixen af ledbrusk hovedsageligt er dannet af et arkadedannende kollagen type II-netværk, består IVD af tre forskellige typer væv: kollagentypen II-rig kerne pulposus i midten optager aksial belastninger og overfører dem til en omfattende ring af tætpakkede cirkulære kollagen type I fibre, der kaldes anulus fibrøse. Deres funktion er at absorbere de oversatte aksiale tryk modtaget af proteoglycan- og vandrige kerne med deres trækstyrke langsgående fiber. Øverst og nederst i hver kerne og anulus danner en hyaline brusk endplate krydset til de tilstødende hvirvler4 (Figur 1).
I ledbrusk kan man finde fire forskellige rumlige chondrocytmønstre: par, strenge, dobbeltstrenge, små henholdsvis store klynger5,6,7 ( Figur2). Ændringer i dette mønster er forbundet med OA debut og progression8,9. Spatial chondrocyt organisation er også vejledende for en direkte funktionel egenskab brusk, nemlig dens stivhed, understreger den funktionelle relevans af denne billedbaserede klassificering tilgang10,11. Disse mønstre kan desuden identificeres med allerede eksisterende klinisk tilgængelig teknologi12. På grund af lighederne mellem IVD og ledbrusk, kan det være en hypotese, at karakteristiske chondrocyt mønstre er også til stede i IVD. Klyngedannelse er et fænomen , der også observeres i den degenererede IVD13,14.
Når man forsøger at analysere rumlige cellulære organisation i IVD, er det nødvendigt at overvinde flere tekniske vanskeligheder, der ikke er til stede, når man undersøger ledbrusk:
For det første er behandlingen af selve vævet langt mere udfordrende end med den homogene hyaline brusk, som i vid udstrækning består af kollagen type II. IVD's vigtigste fiber komponent er kollagen type I, hvilket gør det meget vanskeligere at generere tynde histologiske sektioner. Mens der i hyaline ledbrusk selv tykke sektioner let kan analyseres på grund af den "glas-lignende" karakter af vævet, kollagen type I netværk af IVD er optisk meget uigennemtrængelig. Af denne grund er en stærk baggrundsstøj et almindeligt problem i ivd'ens histologi. En hurtig og billig måde at trænge ind i dette optisk tætte væv er brugen af en optisk sektionsanordning, f.eks. ved hjælp af et Apotom. I et sådant Apotom indsættes et gitter i belysningsvejen af et konventionelt fluorescensmikroskop. Foran gitteret placeres en plan-parallel glasplade. Dette vipper frem og tilbage og projicerer dermed gitteret i billedet i tre forskellige positioner. For hver z-position oprettes og overlejres tre rå billeder med det projicerede gitter. Ved hjælp af speciel software kan det ude af fokus lys beregnes ud. Det grundlæggende princip er, at hvis gitteret er synligt, er disse oplysninger i fokus, hvis ikke de anses for at være ude af fokus. Med denne teknik kan godt fokuserede og højopløselige billeder erhverves på en rimelig tid.
For det andet er vævet svært at komme med fra menneskelige donorer. Når du gør total knæ udskiftning, hele overfladen af leddet kan opnås til yderligere analyse under operationen. Selv om slidgigt af en diarthrodial led er også en sygdom i hele leddet, der er ikke desto mindre stærke fokusforskelle i kvaliteten af brusk med normalt nogle områder af leddet stadig er intakt, for eksempel på grund af reduceret belastning i dette område. Denne situation er anderledes i IVD, hvor kirurgi normalt kun udføres, når disken er globalt ødelagt. Ved opnåelse af væv fra menneskelige donorer fra operationsstuen er vævet også meget fragmenteret, og det er nødvendigt at tildele vævet korrekt til en af de tre brusktyper af IVD, før du foretager yderligere analyser. For at muliggøre mere detaljerede analyser af også større vævssektioner og undersøge ivd'ens embryonale udvikling er valget af en dyremodelorganisme derfor nødvendigt.
Når man vælger en sådan modelorganisme, er det vigtigt at have et system, der kan sammenlignes med den menneskelige disk med hensyn til dens anatomi og dimensioner, dens mekaniske belastning, den nuværende cellepopulation samt dens vævssammensætning. Med henblik på den præsenterede teknik her foreslår vi brugen af kvæg lændeskivevæv: En kritisk egenskab ved den menneskelige disk, der resulterer i dens lave regenerative potentiale, er tabet af ikke-okochordale celler under modning i kernen. Men i mange modelorganismer kan ikke-uvise celler detekteres hele deres levetid. De fleste af de få dyr, der mister deres ikke-okktale celler såsom får, geder eller chondrodystrophig hunde har en IVD, der er meget mindre end menneskelige diske. Kun lændekvægskiver, der er til stede med en sammenlignelig sagittal skivediameter end dem, der er af humane IVD'er15.
En nøglefaktor, der fører til tidlig diskdegeneration, er overdreven mekanisk belastning. De intradiscale tryk af en stående ko i lændehvirvelsøjlen er omkring 0,8 MPa med rygsøjlen justeret vandret. Overraskende disse tryk kan sammenlignes med lænde intradiscalt tryk rapporteret for oprejst menneskelige rygsøjlen (0,5 MPa)15,16. Også mængden af vand og proteoglycaner i kvægskiver kan sammenlignes med mængden af IVD fra unge mennesker17. Selv om bevægelsessegmenternes faktiske bevægelsesmønster kan variere i firdobbelt dyr fra det tobenet menneske med hensyn til den samlede belastnings- og diskegenskaber, er koen derfor meget tættere på menneskelig biologi end andre etablerede dyremodeller for IVD såsom får og hunde.
I denne protokol præsenterer vi en teknik, hvordan man analyserer ændringer i IVD fra synspunktet om rumlig chondrocyt organisation fra tidlig embryonal udvikling til slutstadiet degeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Til analyse af embryonal udvikling og modning blev der anvendt kvægskiver. For at evaluere degeneration af IVD blev humane prøver analyseret.
Human IVD væv blev fremstillet af patienter, der gennemgår kirurgi for lændeskive degeneration, disk prolaps, eller spinal traumer i Institut for Ortopædkirurgi, Universitetshospitalet i Tübingen og BG Trauma Center Tübingen. Der blev opnået fuld etisk udvalgsgodkendelse inden undersøgelsens påbegyndelse (projektnummer 244/2013BO2). Skriftligt informeret samtykke blev modtaget fra alle patienter før deltagelse. Metoderne blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
Kvægvævet er fremstillet af det bayerske statskontor for sundhed og fødevaresikkerhed/Oberschleißheim og fra en destruktionsfabrik i Warthausen (Tyskland). De lokale og veterinære myndigheders godkendelse blev modtaget for væv fra døde dyr.
1. Prøvehøst
- Humant IVD-væv: Anbring straks intraoperativt fremstillede IVD-prøver i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 2 % (v/v) penicillin-streptomycin og 1,2 % af (v/v) amphotericin B. Opbevares ved 4 °C indtil videre behandling. Proces vævet inden for 48 timer. Alternativt kan vævene opbevares ved -20 °C i flere uger.
- Kvæg IVD-væv: Sørg for at høste vævet fra dyrene inden for 24 timer efter døden.
Resect kvægskiverne med de omgivende hvirvler fra de døde dyr en-bloc. Transport af det frosne væv på tøris og opbevares ved -20 °C, indtil det er yderligere forarbejdning.
BEMÆRK: Hvis der kun er tilsigtet fluorescensanalyser, og der ikke planlægges yderligere biokemiske kvantificeringsmetoder som ELISA eller PCR, skal du udføre vævsfikseringen som forklaret nedenfor. Dette gør det muligt at holde vævet længere på lager, før det skal behandles. For at forhindre forringelse af vævsmatrixen skal der udføres fiksering inden for 48 timer efter høsten, medmindre vævet fryses direkte.
2. Prøveforberedelse
- Optø det frosne væv ved stuetemperatur. Behandl vævet, så snart ingen iskrystaller kan mærkes mere ved digital blid kompression af vævet.
BEMÆRK: Udfør tilberedning af vævet i DMEM i en petriskål. - Identificere oprindelsen af den menneskelige IVD væv (anulus fibrøst, mellemzone, kerne pulposus, eller brusk endplate) baseret på makroskopiske egenskaber såsom kollagen tæthed og orientering.
- Tag bevægelsessegmentet bestående af kvæg IVD-skiven med de to tilstødende hvirvler, og disseker disken som helhed fra subchondralbenet ved hjælp af et kirurgisk blad (klinge nummer 15).
- Brug to anatomiske sammenkrumper til at vende disken for at nå områder mere centreret. Udfør dissektionen. Sørg for at resect kernen pulposus sidste som det er meget tyndere end anulus, tilbøjelige til at rive, og det kommer ikke ud på en defineret måde let.
- Identificer de forskellige områder af brusk.
- Skær interesseområdet ud af hele disken ved hjælp af et kirurgisk blad (bladnummer 20 eller 22). Alternativt kan du bruge en kryotomblad.
BEMÆRK: Da kvægskiverne kommer en-bloc som en del af rygsøjlen, kan skiverne tilberedes in-toto. Dette gør korrekt identifikation af de forskellige typer brusk meget lettere. Når disken dissekeres på den ovenfor beskrevne måde, forbliver den brusk endplate på ryghvirvlerne. Hvis dette område skal undersøges, tages det bedst af den underliggende knogle med en mejsel, der arbejder i en let bøjet tangentiel retning.
- I tilfælde af at embryoner er af en krone-rump længde på mindre end 20 cm, skal du sørge for at behandle embryonerne i toto for at bevare vævsarkitekturen i IVD. Udfør ikke dissektion af ryghvirvlerne i disse tilfælde.
- Når disken er blevet resected in-toto, identificere de forskellige områder af brusk.
- Afkalkningen udføres i ethylendiamintetraaceticsyre (EDTA) (20% (w/v); pH = 7,4) ved stuetemperatur. Vælg volumen afhængigt af stikprøvestørrelsen - hele vævet skal være godt dækket af EDTA.
- Skift afkalkningsopløsningen dagligt, som kan gå i op til 5 dage afhængigt af vævets størrelse.
- Kontroller, at afkalkningen lykkes med en 20 Gauge nål, der trænger ind i ryghvirvlerne uden bemærkelsesværdig modstand.
BEMÆRK: Den daglige ændring af afkalkningsopløsningen er vigtig for at forhindre chelate binder EDTA i mætning for at opretholde reaktionseffektivitet. Det forhindrer også bakteriel kolonisering.
3. Klassificering af stikprøvens alder, integritet og degeneration
- Klassificere det humane diskvæv i en af de fem følgende kategorier ved hjælp af klinisk information samt røntgen- og magnetisk resonansbilleddannelse18 (Figur 3).
BEMÆRK: Kategori I: For at tjene som nær-sund prøve bruge anulus uden nogen radiologiske tegn på IVD degeneration stammer fra akut spinal traumer.
Kategori II: For at illustrere en situation med akut betændelse med begyndende degeneration brug væv fra mellemzonen fra patienter med kliniske symptomer med en varighed på mindre end 4 uger.
Kategori III: At beskrive en situation, hvor den inflammatoriske reaktion allerede havde haft tid til at påvirke væv og celler tage væv fra patienter, der blev opereret for en nuklear prolaps, men med en symptomvarighed på over 4 uger.
Kategori IV: For moderat diskdegeneration vælge anulus opnået ved kirurgi med interbody fusion for degenerative disk sygdom med en Pfirrmann score på 3 eller 4 i magnetisk resonans imaging19.
Kategori V: For slutstadiet degeneration proces anulus opnået ved kirurgi med interbody fusion for degenerative disk sygdom med en Pfirrmann score på 5. - Klassificere kvægvævet på grundlag af dyrets udviklingsstadium/alder i en af de otte kategorier, som vist i tabel 1.
- Beregn drægtighedsalderen på embryonernes krone-rumplængde baseret på den formel, som Keller foreslår:
Svangerskabsalder i måneder =
BEMÆRK: Dyr i de første 4 uger af svangerskabet til stede med en krone-rump længde på 0,8-2,2 cm20.
- Beregn drægtighedsalderen på embryonernes krone-rumplængde baseret på den formel, som Keller foreslår:
4. Vævsfiksering
- Fiksere prøverne i 10x volumenet af prøven på 4% (w/v) formaldehydopløsning i fosfatbuffered saltvand (PBS) over natten ved 4 °C.
BEMÆRK: Formaldehydopløsningen trænger ind i vævet med en hastighed på ca. 1 mm/time fra hver retning. For meget små eller meget store prøver kan det være nødvendigt at justere eksponeringstiden. - Opbevar vævet i PBS ved 4 °C indtil videre behandling.
5. Histologisk sektion
- Integrer prøverne i vandopløseligt indlejringsmedium på kryotomknappen.
- Placer vævet på knappen, således at enten en aksial plan genereres eller et plan, der skærer kollagen type I lameller vinkelret (f.eks en median sagittal sektionsopseende plan).
BEMÆRK: Vævet skal være fuldt dækket af indlejringsmediet.
- Placer vævet på knappen, således at enten en aksial plan genereres eller et plan, der skærer kollagen type I lameller vinkelret (f.eks en median sagittal sektionsopseende plan).
- Det indlejrede væv i en tykkelse på 70 μm i humanprøver og 40 μm i kvægprøver ved hjælp af en standard kryotom.
BEMÆRK: Forskellen i sektiontykkelse skyldes forskellen i vævsintegritet mellem den intakte kvægskive og det stærkt degenererede humane væv. - Saml sektionerne på en glasrutschebane.
- Omring vævssektionerne med en hydrofob pen.
- Skyl sektionerne 3 gange med fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne det vandopløselige indlejringsmedium.
6. Fluorescens farvning
- Der tilsættes 60 μL på 1 % (v/v) AF DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) samt 1 % (v/v) Actin Tracking farvning (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) i PBS og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Den farvning protokol beskrevet her er at visualisere kernen ved hjælp af DAPI nukleare farvning (blå) og cytoplasma ved hjælp af Actin Tracking Stain (rød). IVD har en stærk autofluorescence på grund af kollagenfibrene i den grønne kanal. Mængden af væske, der tilsættes til sektionerne i denne protokol, er beregnet til sektioner af en størrelse på ca. 5 mm x 5 mm. For større sektioner skal dette beløb forhøjes tilsvarende. Udfør alle værker i rum uden direkte sollys eksponering og med dæmpede lys for at forhindre blegning farvestoffet. - Fjern farvningsvæsken med en pipette og vask tre gange med 60 μL PBS hver gang.
- Tilsæt et passende monteringsmedium og dæk sektionerne med et dækselstræk.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler fanget, når dækslet tilsættes. Dette gøres bedst ved at starte kontakten af slip med diaset på en kant og derefter lade slip komme langsomt ned.
7. Mikroskopisk billeddannelse og behandling
- Placer et dias med en plettet sektion på prøveholderen af mikroskopet.
BEMÆRK: På grund af ivd'ens tætte kollagentype I-netværk gør det spredte lys vævet vanskeligt at visualisere ved hjælp af konventionel fluorescensmikroskopi. En måde at løse dette problem på er at udføre optisk sektion ved hjælp af struktureret belysning. Dette gør det også muligt at gøre en tredimensionel projektion af hele prøven i begge kanaler (blå og rød). Dette gøres bedst ved hjælp af den strukturerede belysning indstilling og Mosaic-mode med en 10x forstørrelse objektiv linse for at få et overblik over prøven samt 3D rekonstruktioner af individuelle mønstre. - Start den strukturerede belysningsanordning.
- Udfør enkelt billeddannelse med et passende fluorescensmikroskop, fluorescensfiltre og tilstrækkelig belysning.
BEMÆRK: Juster eksponeringstiden for alle de filtre, der bruges til at standardisere billedopsamlingen. For at få en nøjagtig repræsentation af prøven ved et billede med højere opløsning sektionerne med en højere forstørrelse (f.eks 20x mål). - Efterbehandling billederne ved at optimere intensiteten og lysstyrken ved hjælp af et billede optimering software kompatibel med fluorescens mikroskop.
- Udfør enkelt billeddannelse med et passende fluorescensmikroskop, fluorescensfiltre og tilstrækkelig belysning.
- For at visualisere afsnittet som helhed skal du bruge mosaikbilledteknikken
- Åbn anskaffelsesindstillingerne (tryk på 6D- Acquisition) fra værktøjslinjepanelet.
- Juster mosaikindstillingerne (i MosaiX Register) og definer antallet af kolonner og rækker af synsfeltbilleder, der senere skal flettes til ét oversigtsbillede.
- Tryk på Installation, og juster fokuskorrektionen af de enkelte felter.
BEMÆRK: Det er næsten umuligt for en stor vævssektion at have hele vævsoverfladen i et enkelt fokusplan. Billedfliser på forskellige brændpunkter kan tages af 'MosaiX Acquisition'. - Tryk på Startfor at starte anskaffelsen af billedfliserne.
- Sy de afbildede fliser ved hjælp af syningsfunktionen(Syningsknap) med 20% overlapning indarbejdet i softwaren.
- Efterbehandling billederne ved at optimere intensiteten og lysstyrken ved hjælp af et billede optimering software kompatibel med fluorescens mikroskop.
- Hvis du vil analysere den rumlige chondrocyt-organisation, skal du bruge den 3D-funktion, der er integreret i softwaren.
- Juster indstillingerne for z-stack. Definer scanningsparametrene: Definer start- og stoppositionerne i z-aksen og udsnitsafstanden ved at aktivere knappen Start/Stop.
BEMÆRK: Softwaren beregner automatisk antallet af udsnit. - Tryk på Startfor at starte anskaffelsen af billed-z-stakkene.
- Efterbehandling billederne ved at optimere intensiteten og lysstyrken ved hjælp af et billede optimering software kompatibel med fluorescens mikroskop.
- Juster indstillingerne for z-stack. Definer scanningsparametrene: Definer start- og stoppositionerne i z-aksen og udsnitsafstanden ved at aktivere knappen Start/Stop.
- Eksporter billederne med et filformat, der er kompatibelt med billedbehandlingssoftwaren.
BEMÆRK: Eksporter 3D-rekonstruktionerne som individuelle billeder eller/og som en interaktiv 3D-model eller i et videoformat.
8. Identifikation af cellemønster og tæthedsvurdering
- Åbn de eksporterede mosaikbilleder af hele vævsafsnittet i et passende billedbehandlingsprogram.
- Definer de områder, der er genstand for celletæthedsvurdering, ved at definere interesseområder på 500 μm x 500 μm på billederne.
BEMÆRK: Alle felter, der ikke har en tilstrækkelig billedkvalitet, er ikke medtaget i analysen. - Identificer individuelle cellemønstre.
BEMÆRK: Enkelte celler defineres som individuelle celler - fuldt indkapslet i den tilstødende matrix. Par defineres som to tilstødende celler i umiddelbar nærhed (<25 μm), hvorved cellerne forbindes gennem deres matrixer (se figur 2). Strengformationer er mindst tre chondrocytter justeret i linje (fra midten af kernerne <25 μm). Disse celler er omfattet af en intakt matrix og matrix sammenkoblinger kan ses mellem hver celle. Klynger repræsenterer flere celler, der er placeret i umiddelbar nærhed af hinanden (<25 μm) og er indkapslet i en stor lakune uden matrix. - Brug en plug-in til celletælling til kvantitativ analyse af cellemønstrene.
BEMÆRK: Cytoplasmafarvningen repræsenterer en verifikationsmetode til at identificere de forskellige rumlige mønstre. - Beregn celletætheden ved at dividere de optalte celler med størrelsen på det valgte interesseområde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af mosaikbilleder kan IVD's arkitektur med sit tætte kollagenfibernetværk i anulus og den blødere kerne klart genkendes (Figur 4). Et kontinuerligt fald i celletætheden kan observeres under embryonal udvikling (Figur 5). Mens der i de tidlige stadier af IVD udvikling en celletæthed på 11.435 celler / mm² i kvæg anulus fibrøst og 17.426 celler / mm² i kvægkerne prædikestolen kan findes, disse tal falder hurtigt til 1.011 celler / mm² (kvæg anulus fibrosus) og 488 celler / mm² (kvægkerne pulposus) indtil fødslen. Hos det voksne kvæg ses 71 celler/mm² (anulus fibrøst) resp. 106 celler/mm² (kernemasse) (figur 6 A-B). Brug bi-kanals billeddannelse med Apotome gør det muligt at visualisere 3D-arkitekturen af de rumlige mønstre (Figur 7).
Figur 1. Makroskopisk anatomi af den intervertebrale disk. Skematisk tegning af den intervertebrale disk, der viser kernen pulposus (rød), direkte omkring det mellemzonen (pink), og derefter i cirkulære lag omkring det anulus fibrøst. Bemærk lag-vinkel retning af kollagen type I fibre i anulus fibrøst. Den aksiale belastning til kernen kan således oversættes til aksiale trækkræfter af kollagenfibrene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk illustration af forskellige rumlige organisatoriske mønstre af chondrocytter. Afhængigt af væv chondrocytter findes som enkeltceller, par eller strenge i sund brusk. Med begyndelsen degeneration disse mønstre ændre sig til at danne dobbelt strenge, små klynger og derefter store klynger i slutningen af fase degeneration. Dette tal er blevet ændret fra Danalache, M. et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Forskellige betingelser for den intervertebrale disk (IVD). (A-D') Sagittal T2-vægtet magnetisk resonansbilleddannelse af den menneskelige lændehvirvelsøjle (A-D), med det forstørrede bevægelsessegment L4/L5 (A'-D'). Den ventrale side af patienten vender mod venstre, rygsiden vender lige med rygmarvskanalen med sit hvide signal til cerebrospinalvæsken. (A,A') Intakt IVD med anulus vises med en hypunktense (sort) signal på grund af den høje kollagen type I indhold og kernen vises meget lysere (hyperintense) på grund af det høje indhold af vandbindende proteoglycaner (Pfirrmann grade19 I). (B, B') Begyndende IVD-degeneration med tab af vandsignalet fra kernen pulposus og hvor sondringen mellem anulus og kerne går tabt (Pfirrmann klasse19 IV). (C, C) Akut nuklear prolaps med stadig en fremtrædende vand signal i det område af kernen vejledende for en ellers intakt IVD og diskvæv fremspringende dorsally ind i rygmarvskanalen. (D,D') Avanceret diskdegeneration med en stort set ødelagt IVD med et fuldstændigt tab af vandsignalet i skiven, ventral og dorsal spondylofytdannelse og subchondral sklerose af ryghvirvlerne svarende til en Pfirrmann-klasse19 af V. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mosaik fluorescens billeddannelse af den intervertebrale disk (IVD). Arkitekturen af IVD med sin tætte kollagen fibernet i anulus fibrøst og blødere kerne kan klart genkendes. DAPI-nukleare farvning (hvid) i den aksiale (A1) og sagittal (A2) plan viser cellefordeling og arrangement inden for IVD. Forstørrede repræsentative områder fra disse mosaikbilleder vises i B1-B4 og C1-C4, der illustrerer den rumlige chondrocyt organisation - i dette tilfælde enkelte celler (grøn boks), par (blå boks) og strenge (gul boks). A: skalastang 1.000 μm, B1-B4: skalastang 200 μm, C1-C4: skalastang: 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Bonnaire, F.C. et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Forskellige udviklings- og modningsstadier af kvæg anulus fibrøst og menneskelig degenererende anulus fibrøst. DAPI nukleare farvning. Mosaikbillederne viser en hel tidlig embryonisk skive i en aksial sektion (A1) og repræsentative billeder af kvæg anulus under embryonal udvikling, modning og begyndende degeneration (A2-A8). (B1B3) Anulus fra menneskelige IVD'er blev opnået intraoperativt. Et kontinuerligt fald i celletætheden kan observeres under embryonal diskudvikling. En højere rumlig organisation cellulært mønster synes at være til stede især omkring fødslen. I den voksne menneskelige disk under degeneration øges den cellulære tæthed igen, og stigende klyngedannelse kan observeres. Skalastang 100 μm. Ugevis af svangerskabet. Dette tal er blevet ændret fra Bonnaire, F.C. et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Reduktion i cellulær tæthed gennem udvikling og modning af kvæg intervertebrale disk. Det gennemsnitlige (standardafvigelse) celletal pr. mm² illustreres af søjlediagrammer for kvæg anulusfibrøse(A) og kvægkernemassen(B). En klar reduktion af celletætheden kan observeres især i den embryonale periode, som i mindre grad fortsætter indtil fuld modning af disken (n=72). Ugevis af svangerskabet. Dette tal er blevet ændret fra Bonnaire, F.C. et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Apotombilleddannelse af den intervertebrale disk (IVD). Bi-kanal billede, der viser cytoplasma (rød, Actin farvning) og kernen (blå, DAPI nukleare farvning). (A) I den intakte IVD findes der ud over det fremherskende rumlige mønster af enkelte chondrocytter også par. (B) I degenererede anuluscelleklynger findes. Skalalinje 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1. Apotombilleddannelse af et par i den intervertebrale disk (IVD) som en 3D-model. Bi-kanal billeder, der viser cytoplasma (rød, Actin farvning) og kernen (blå, DAPI nukleare farvning) af et par. Klik her for at downloade denne video.
Video 2. Apotombilleddannelse af en klynge i den intervertebrale disk (IVD) som en 3D-model. Bi-kanal billeder, der viser cytoplasma (rød, Actin farvning) og kernen (blå, DAPI nukleare farvning) af en klynge. Klik her for at downloade denne video.
Tabel 1: Udvikling, modning af kvæg og vækst efter fødslen med de forskellige milepæle. Wog - ugers svangerskab. Drægtighedsperiode ca. 283 dage, naturlig forventet levetid 20-25 år20,23,24. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af fluorescensmikroskopi forstærket af mosaikbilleddannelse og optisk sektion evaluerede vi det rumlige arrangement af chondrocytter i anulus af lænde IVD gennem udvikling, modning og degeneration. Mens degenerativt væv kunne høstes fra patienter, der fik rygsøjlen kirurgi for diskdegeneration, analyse af den embryonale periode og modning fase krævede brug af en model organisme (kvæg). Høje cellulære tætheder blev noteret i anulus under tidlig embryonal udvikling. I det videre udviklingsforløb kunne postnatal vækst og modning observeres et udtalt fald i celletætheden. I humant væv med avanceret diskdegeneration, kunne vi derefter kvantificere en stigning i cellulær tæthed i anulus fibrøst.
Den hurtige stigning i vævsvolumen kombineret med aktivt dividere og biosyntetisk aktive ikke-okochordale celler er sandsynlige årsager til de ændringer i celletætheden, der observeres i embryoet25. De mekanismer, hvormed cellulær tæthed igen stiger med degeneration, er dog stadig uklare. Degenerative processer af anulus føre til en række patologiske ændringer, herunder øget væv innervation og betændelse, upregulation af matrix-nedbrydende enzymer og vækstfaktor produktion, og også ændringer i cellulære26,27,28.
Når man overvejer celletilstedeværelse som en funktion af cellulær rumlig organisation baseret på mønstre kendt fra ledbrusk7,9 fandt vi ingen genkendelig rumlig organisation i tidlige embryonale diske, hvor cellerne synes at være tæt pakket, og som vi anså for at være til stede som enkeltceller22. Dette fund er i overensstemmelse med resultaterne fra embryonale ledbrusk7. I den sunde modne anulus repræsenterer enkelte celler det fremherskende rumlige mønster22. Par og strengformationer kan dog også observeres22. Jo mere degenerere vævet i menneskelige diske, jo højere andel af celler, der kan findes i klynger22. Den fysiopatologiske model foreslået af Rolauffs i ledbrusk7,9,29 viser en spændende lighed med vores resultater. Tidligere undersøgelser af IVD-degeneration havde også allerede skitseret klyngedannelse som et kendetegn for diskdegeneration14,30,31,32,33. Da disse klynger for det meste kan findes i stærkt degenererede væv, klyngedannelse kan indikere et mislykket forsøg på væv til at reparere degenerative skader34. Etablering af en stærk sammenhæng mellem lokalt fremherskende chondrocyt mønster og væv elasticitet, en høj funktionel relevans af disse mønstre kunne påvises i ledbrusk10,11. Det kan spekuleres i, at en sådan funktionel relevans også gælder for rumlig chondrocyt organisation i IVD.
Fluorescens histologiske analyser er en nem at komme med og attraktive midler til at analysere morfologiske ændringer i væv. Når man forsøger at histologisk analysere IVD, er der forskellige tekniske vanskeligheder, der skal overvindes: For det første gør den begrænsede tilgængelighed af humant væv det vigtigt at vælge en passende dyremodelorganisme, som disse aspekter af sygdommen kan studeres med, hvor menneskelige prøver ikke kan opnås. Til det forskningsspørgsmål, der behandles i denne undersøgelse, valgte vi en kvægmodel.
For det andet er forarbejdning af kollagentypen I-rich IVD meget mere udfordrende end for de fleste andre menneskelige væv. Den tætte kollagen type I-fiber netværk stærkt spreder fluorescerende lys skabe en høj baggrundsstøj signal. Dette problem løses bedst ved hjælp af en teknik, der tillader subtraktion eller eliminering af et sådant baggrundssignal. En velkendt metode til at gøre det er konfokal mikroskopi. Mens billedkvaliteten af confocal erhvervet LASER-billeder er normalt fremragende, ulemperne ved denne teknik er, at det er relativt tidskrævende, og som sådan tillader det ikke analyse af større vævsområder ved hjælp af mosaikbilleddannelse. For det andet konfokale mikroskoper er relativt dyre og ikke tilgængelige overalt. En meget hurtigere og billigere måde at bortfiltrere baggrundsstøj på er at udføre optisk sektion f.eks. ved hjælp af en Apotome.
For at kunne fortolke resultaterne korrekt er det vigtigt også at tildele det væv, der skal analyseres korrekt, til dets oprindelse i IVD. Mens denne opgave er relativt enkel, når man har en hel kvægskive at vælge imellem, kan det være meget udfordrende, når man modtager humant væv fra operationsteatret. Det karakteristiske træk ved anulus fibrosus er dens meget tætte kollagen type I netværk i en vinkel-lags fiber orientering. Kernen, derimod, er en amorf gelatinøs struktur, hvor ingen højere kollagen arkitektur er synlig for det blotte øje. Mellemzonen ligger mellem disse to extrema og besidder også en klar kollagen fiber arkitektur, men det er meget blødere og mindre tæt end anulus fibrøst. Den bruskiske endeplade består af hyaline brusk, ikke til stede med en kollagen arkitektur genkendelige af det blotte øje, men det er temmelig "glas-lignende" som udtrykket "hyaline" antyder. I modsætning til kernen pulposus er det dog også meget stiv, kan ikke deformeres, og er beliggende på subchondral knoglen, som ofte stadig kan genkendes ved inspektion af vævet.
Når vævsoprindelse er korrekt identificeret, skal vævet stadig være korrekt orienteret for at få standardiserede billeder, som også muliggør en ordentlig kvalitativ og kvantitativ udlæsning. I orientering til andre billeddannelse teknikker såsom magnetisk resonans imaging foreslår vi to standard analyse-planer: en median-sagittal sektion og en i den aksiale plan. Disse to fly vil også give et godt indtryk af arkitekturen af kollagen type I-fiber netværk af anulus. Ved fortolkningen af resultaterne fra F-actin farvning skal det huskes, at frysning af vævsprøverne kan forårsage cytoskeletale strukturændringer35, som dog ikke bør påvirke den rumlige chondrocytorganisation.
For fuldt ud at forstå den cellulære biologi IVD er en af de stadig åbne udfordringer i vores forståelse af diskdegeneration og regenerering36. Spørgsmål, der undertiden synes trivielle, såsom det fysiologiske arrangement af celler i sundt væv eller spørgsmålet om cellulær reorganisering under degeneration, forbliver til dato ubesvarede. Den opnåede viden kan give os mulighed for at bruge denne billedbaserede degenerationsmarkør til at evaluere vævskvaliteten, undersøge reversibiliteten af klyngedannelse og dermed muligvis definere et terapeutisk vindue, hvor de degenererende processer stadig kan målrettes med succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker vores medforfattere fra de oprindelige publikationer for deres hjælp og støtte. Vi takker Charlotte Emma Bamberger for at hjælpe med at erhverve apotom billeder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S.
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N.
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
