Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Probenvorbereitung zur bioinformatischen Analyse der DNA-Methylierung: Assoziationsstrategie für Adipositas und verwandte Merkmalsstudien

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/62598
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 4, 5, 1, 1, 6, 7, 8, 9, 6
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Die vorliegende Studie beschreibt den Workflow zur Verwaltung von DNA-Methylierungsdaten, die durch Microarray-Technologien erhalten werden. Das Protokoll veranschaulicht die Schritte von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse. Alle Verfahren werden detailliert beschrieben, und das Video zeigt die wesentlichen Schritte.

Abstract

Fettleibigkeit ist direkt mit dem Lebensstil verbunden und wurde mit DNA-Methylierungsveränderungen in Verbindung gebracht, die Veränderungen in der Adipogenese und den Lipidspeicherprozessen verursachen können, die zur Entwicklung der Krankheit beitragen. Wir demonstrieren ein vollständiges Protokoll von der Selektion bis zur epigenetischen Datenanalyse von Patienten mit und ohne Adipositas. Alle Schritte aus dem Protokoll wurden in einer Pilotstudie getestet und validiert. 32 Frauen nahmen an der Studie teil, in der 15 Personen mit Adipositas nach dem Body-Mass-Index (BMI) klassifiziert wurden (45,1 ± 5,4 kg/m2); und 17 Personen wurden ohne Adipositas nach BMI klassifiziert (22,6 ± 1,8 kg/m2). In der Gruppe mit Adipositas wurden 564 CpG-Stellen im Zusammenhang mit der Fettmasse durch lineare Regressionsanalyse identifiziert. Die CpG-Standorte befanden sich in den Promotorregionen. Die Differentialanalyse ergab 470 CpGs hypomethylierte und 94 hypermethylierte Stellen bei Personen mit Adipositas. Die am stärksten hypomethylierten angereicherten Wege waren in der RUNX, WNT-Signalgebung und Reaktion auf Hypoxie. Die hypermethylierten Signalwege waren mit Insulinsekretion, Glucagon-Signalisierung und Ca2 + verbunden. Wir kommen zu dem Schluss, dass das Protokoll DNA-Methylierungsmuster und merkmalsbezogene DNA-Methylierung effektiv identifiziert hat. Diese Muster könnten mit einer veränderten Genexpression in Verbindung gebracht werden, die die Adipogenese und die Lipidspeicherung beeinflusst. Unsere Ergebnisse bestätigten, dass ein fettleibiger Lebensstil epigenetische Veränderungen in der menschlichen DNA fördern könnte.

Introduction

Groß angelegte Omics-Technologien werden zunehmend in Studien zu chronischen Krankheiten eingesetzt. Ein interessantes Merkmal dieser Methoden ist die Verfügbarkeit einer großen Menge an generierten Daten für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Daher ist eine Forderung nach Standardisierung der Protokolle entstanden, um einen technischen Vergleich zwischen Studien zu ermöglichen. Die vorliegende Studie schlägt die Standardisierung eines Protokolls zur Gewinnung und Analyse von DNA-Methylierungsdaten vor, wobei eine Pilotstudie als Anwendungsbeispiel verwendet wird.

Der negative Energieverbrauch überwiegt in der modernen menschlichen Lebensweise, was zu einer übermäßigen Ansammlung von Fettgewebe und folglich zur Entwicklung von Fettleibigkeit führt¹. Viele Faktoren haben die Fettleibigkeitsraten erhöht, wie Sesshaftigkeit, kalorienreiche Diäten und stressige Routinen. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzte, dass 1,9 Milliarden Erwachsene im Jahr 2016 fettleibig waren, was bedeutet, dass mehr als 20% der Weltbevölkerung über 30 kg / m2 BMI2 haben. Das jüngste Update von 2018 ergab, dass die Prävalenz von Fettleibigkeit in den Vereinigten Staaten von Amerika (USA) höher als 42% war3.

Epigenetik ist die strukturelle Anpassung chromosomaler Regionen, um veränderte Aktivitätszustände zu registrieren, zu signalisieren oder aufrechtzuerhalten4. Die DNA-Methylierung ist eine reversible chemische Veränderung in den Cytosin-Guanosin-Dinukleotid-Stellen (CpG-Stellen), die 5-Methylcytosin-pG (5mCpG) bildet. Es kann die Genexpression modulieren, indem es den Zugang der Transkriptionsmaschinerie zur DNA5,6,7,8 reguliert. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu verstehen, welche CpG-Sites mit Adipositas-bezogenen Merkmalen assoziiert sind9. Viele Faktoren können die ortsspezifische DNA-Methylierung unterstützen oder verhindern. Notwendige Enzyme für diesen Prozess, wie DNA-Methyltransferasen10 (DNTMs) und Ten-Eleven-Translokationen (TETs), können die DNA-Methylierung oder Demethylierung unter Umwelteinflüssen fördern11.

Angesichts des wachsenden Interesses an DNA-Methylierungsstudien in den letzten Jahren war die Wahl der am besten geeigneten Analysestrategie zur präzisen Beantwortung jeder Frage ein wesentliches Anliegen der Forscher12,13,14. Das 450K DNA-Methylierungsarray ist die beliebteste Methode, die in mehr als 360 Publikationen14 zur Bestimmung des DNA-Methylierungsprofils verwendet wird. Es kann die Methylierung von bis zu 485.000 CpGs in 99% der bekannten Gene bestimmen15. Dieses Array wurde jedoch eingestellt und durch das EPIC ersetzt, das 850.000 CpG-Standorte abdeckt. Das vorliegende Protokoll kann sowohl für 450K als auch für EPIC16,17,18 angewendet werden.

Das Protokoll wird Schritt für Schritt in Abbildung 1 dargestellt und umfasst die folgenden Schritte: Populationsauswahl, Probenahme, Versuchsvorbereitung, DNA-Methylierungspipeline und bioinformatische Analyse. Eine in unserem Labor durchgeführte Pilotstudie wird hier demonstriert, um die Schritte des vorgeschlagenen Protokolls zu veranschaulichen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des vorgestellten Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

Die Ethikkommission des Ribeirão Preto Medical School University Hospital der Universität von São Paulo (HCRP-USP) genehmigte die Studie (CAAE: 14275319.7.0000.5440). Die Teilnehmer unterzeichneten die Einverständniserklärung, und alle Verfahren wurden nach der Erklärung von Helsinki durchgeführt.

1. Grundgesamtheit und Stichproben

  1. Rekrutieren Sie Teilnehmer mit einem BMI >30 kg/m2 für die Studie. Für die vorliegende Studie wurden 32 Frauen aus einer Beimischungspopulation19 im Alter zwischen 18 und 60 Jahren rekrutiert.
    HINWEIS: Im HCRP-USP wurden höhere Adipositasraten hauptsächlich bei Frauen beobachtet20. Teilnehmer mit Adipositas mit einem BMI ≥30 kg/m2 (n = 15) wurden aus der Ambulanz für Stoffwechselerkrankungen in HCRP-USP rekrutiert. Die Teilnehmer ohne Adipositas, mit einem BMI zwischen 18,5 kg/m2 und 24,9 kg/m2 (n = 17), wurden aus anderen Kliniken rekrutiert und hatten keine schweren Erkrankungen; Die klinischen Daten sind in Tabelle 1 dargestellt.
  2. Schließen Sie schwangere Frauen, stillende Mütter, Raucher und Alkoholkonsumenten aus.

2. Anthropometrie und Körperzusammensetzung

  1. Messen Sie das Gewicht der Teilnehmer mit einer digitalen anthropometrischen Skala von 200 kg. Stellen Sie sicher, dass Sie Schuhe und überschüssige Kleidung ausziehen.
  2. Beurteilen Sie die Höhe mit einem Stadiometer mit einer Graduierung von 0,5 cm. Die Teilnehmer wurden angewiesen, barfuß zu stehen, die Füße zusammen und die Arme an ihren Seiten21.
  3. Sammeln Sie die Fettmasse (FM) Informationen mit einer elektrischen Bioimpedanz. Nach 12 Stunden Fasten mit einer leeren Harnblase beurteilen. Platzieren Sie die Teilnehmer in Rückenlage, mit gespreizten Beinen und parallelen Armen, ohne den Körper zu berühren. Weisen Sie die Teilnehmer an, sämtliches Metallzubehör zu entfernen22.
  4. Ermitteln Sie den Taillenumfang (WC) mit einem unausziehbaren Maßband mit einer Graduierung von 0,1 mm. Das Klebeband wurde horizontal um die mittlere Taille gelegt, direkt über den Hüftknochen. Die Messung erfolgte kurz nach einem Ausatmen. Nach Angaben der Centers for Diseases Control and Prevention (CDC) beträgt der WC-Grenzwert für Frauen 88 cm23.

Tabelle 1: Bevölkerungsmerkmale Alle Variablen waren parametrisch (p > 0,05, Shapiro Wilk), und die Unterschiede wurden mit einem unabhängigen t-Test bewertet, in dem p < 0,05 als signifikant angesehen wurde. *p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Sammlung von biologischem Material

  1. Sammeln Sie peripheres Blut nach 12 Stunden Fasten, wie zuvor beschrieben24.
  2. Sammeln Sie 4 ml der Vollblutproben in Entnahmeröhrchen mit Antikoagulans (z. B. EDTA) und lagern Sie sie für den Transport auf Eis.

4. DNA-Extraktion

  1. Zentrifen Sie jedes Röhrchen, das das Blut enthält, bei 2.000 x g für 10 min. Sammeln Sie etwa 300 μL der Buffy-Schicht (weiße Interphase).
  2. Extrahieren Sie DNA aus dem peripheren Blut mit einem kommerziell erhältlichen Instrument (siehe Materialtabelle), wie zuvor beschrieben25. Eluieren Sie die DNA in 480 μL ultrareinem H2O.
  3. Beurteilen Sie die DNA-Konzentration und -Qualität mit einem Fluorometer. Die Integrität wurde mit einer 1%igen Agarosegel-Analyse25 bewertet. In einem Gefrierschrank bei -80 °C lagern.

5. Vorbereitung vor der Methylierungsanalyse

  1. Stellen Sie sicher, dass die Proben die minimale DNA-Konzentration aufweisen (500 ng ist der ideale Anfangsinput, um zu beginnen), aber die Verdünnung kann zwischen den Proben in diesem Schritt variieren.
  2. Einige Reagenzien sind nicht im Microarray-Kit26 enthalten, also kaufen Sie sie separat27.
  3. Überprüfen Sie, ob das Kit alle während des Eingriffs verwendeten Reagenzien enthält. sie sind unersetzlich. Überprüfen Sie das Verfallsdatum aller Reagenzien. Stellen Sie sicher, dass auch andere Reagenzien und Lösungen verfügbar sind, die nicht im Kit enthalten sind (95% Formamid/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, absolutes Ethanol, 2-Propanol).
    ACHTUNG: Formamid ist ein flüchtiges Reagenz; Die Qualität der Ergebnisse kann verbessert werden, wenn das Produkt frisch ist. Die Integrität und Qualität von Formamid und absolutem Ethanol wird als kritisch angesehen, da sie den vom Hersteller vorgeschlagenen Färbeprozess beeinflussen können. Bei den ausgewählten Alkoholen muss es sich um hochreine Produkte handeln, die für die molekularbiologische Analyse spezifisch sind.
  4. Sobald das Microarray-Kit erworben wurde, laden Sie die Chips Decode Maps (DMAPs) herunter. Diese Dateien sind 24-48 h nach dem Versand des Kits auf der Website des Herstellers verfügbar und werden am Ablaufdatum28 ausgeschlossen. Um die genannten Dateien herunterzuladen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Stellen Sie sicher, dass ein Computer mit Internetzugang verfügbar ist. Führen Sie den Download mit dem Software Decode File Client durch.
    2. Stellen Sie vor der Installation des Programms sicher, dass der Computer über ausgehenden und eingehenden Zugriff verfügt, der von der Institution gewährt wird. Für den Decode File Client gelten keine Sicherheitseinschränkungen.
    3. Melden Sie sich mit der Option Access by BeadChip bei der Decode File Client-Software an. Diese Anmeldung erfolgt mit MyIllumina Benutzer-ID und Passwort. Eine Registrierung auf dieser Seite ist erforderlich28.
    4. Nachdem Sie sich am Decode File Client angemeldet haben, geben Sie die unten aufgeführten Informationen in die entsprechenden Felder auf der Software-Startseite ein28: Liste der Barcodes; Liste der Box-IDs; Bestellnummer (PO); und Kundenauftragsnummer (denken Sie daran, die Buchstaben, die auf die Zahlen folgen, nicht anzugeben).
    5. Wählen Sie die herunterzuladenden DMAPs entsprechend der Barcode-Nummer in der Kaufbox aus und geben Sie das Ziel im Dialogfeld an, um die DMAPs zu speichern.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche, um den Download zu starten.
      HINWEIS: Stellen Sie am Ende des Downloads sicher, dass die heruntergeladenen Ordner nicht leer sind und speichern Sie die Dateien sicher, da sie für den letzten Schritt erforderlich sind, um die Experimente in Intensitätsdatendateien (IDAT-Dateien) zu konvertieren. Nach dem Ablaufdatum kann Illumina die DMAP-Daten aus seiner Online-Datenbank entfernen.

6. DNA-Methylierungspipeline

HINWEIS: Das DNA-Methylierungsexperiment ist in 4 Tage unterteilt (Abbildung 1). Befolgen Sie die Empfehlungen und Spezifikationen des Herstellers, um genaue Ergebnisse zu erhalten.

  1. Tag 1: Bisulfit-Behandlung
    1. Beginnen Sie mit der Denaturierung von 500 ng genomischer DNA und fügen Sie dann die Konversionsreagenzien hinzu. Um diesen Schritt durchzuführen, befolgen Sie die Empfehlungen der Bisulfit- und Microarray-Kits29.
    2. Behandeln Sie die denaturierte DNA mit 130 μL des Bisulfit-Konversionsreagenzes in der vom Hersteller angegebenen Standardkonzentration.
    3. Inkubieren Sie das Rohr in einem Thermocycler für 16 Zyklen bei 95 °C für 30 s und 50 °C für 1 h. Den Thermocycler für 10 min auf 4 °C herunterfahren.
    4. Führen Sie den Waschschritt durch, indem Sie 100 μL des Waschpuffers hinzufügen und dann mit voller Geschwindigkeit für 30 s zentrifugieren. Die Konzentration ist in der Bedienungsanleitung nicht angegeben, und der Hersteller standardisiert die Volumina.
      HINWEIS: Dieses Reagenz wird mit dem Kit geliefert und muss nicht verdünnt oder zubereitet werden.
  2. Tag 2: Amplifikation - Methylierungsassay, manuelles Protokoll
    1. Heizen Sie den Hybridisierungsofen auf 37 °C vor und lassen Sie die Temperatur ausgleichen.
    2. Bringen Sie ein Barcode-Etikett auf eine 0,8-ml-Mikrotiterplatte auf.
    3. Tauen Sie die Verstärkungsreagenzien (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix und Multi-Sample Amp Master Mix) bei Raumtemperatur auf (diese Reagenzien werden mit dem Kit geliefert und müssen nicht verdünnt oder zubereitet werden). Führen Sie dann eine sanfte Inversion mindestens 10x durch, bis der gesamte Inhalt der Röhrchen vermischt ist.
    4. Dosieren Sie 20 μL des Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) in die Vertiefungen der Platte.
    5. Übertragen Sie 4 μL der DNA-Probe von der in Bisulfit umgewandelten Platte zu den entsprechenden Vertiefungen auf der 0,8 ml-Platte. Notieren Sie an dieser Stelle die ID der ursprünglichen DNA-Probe auf dem Labor-Tracking-Formular, das den Plattenvertiefungen entspricht.
    6. Geben Sie 4 μL 0,1 N NaOH in jede Vertiefung der Platte, die den Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) und die DNA-Probe enthält.
    7. Versiegeln Sie die Platte mit einer Kunststoffdichtung.
    8. Wirbeln Sie die Platte, um die Reagenzien mit den Proben bei 1.600 U / min für 1 min für 1 min zu mischen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren und die Versiegelung vorsichtig entfernen.
    9. Pipette 68 μL Random Primer Mix (RPM) in jede Vertiefung der Platte. Pipette 75 μL Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) in jede Vertiefung der Platte (ohne die vorherige Lösung zu entfernen). Verwenden Sie ein neues Siegel, um die Platte abzudecken.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Vertiefungen mit der Platte zu kombinieren und richtig auszurichten.
    10. Wirbeln Sie die abgedichtete Platte bei 1.600 U / min für 1 min ein. Im Hybridisierungsofen für 20-24 h bei 37 °C inkubieren.
  3. Tag 3: Hybridisierung - Methylierungsassay, manuelles Protokoll
    1. Den Block auf 37 °C vorheizen.
    2. Tauen Sie den Inhalt des Röhrchens bei Raumtemperatur auf. Kehren Sie die FMS-Röhrchen (Fragmentation Solution) vorsichtig und vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.
    3. Entfernen Sie die Platte vorsichtig aus dem Hybridisierungsofen. Pulszentrifugieren Sie die Platte bei 280 x g.
    4. Entfernen Sie nun das Siegel von der Platte. In jede Vertiefung der Platte, die eine Probe enthält, fügen Sie 50 μL Fragmentierungslösung (FMS) hinzu und verschließen Sie die Platte erneut. Wirbeln Sie die Platte bei 1.600 U / min für 1 min ein.
    5. Zentrifugieren Sie die Platte bei 280 x g für einige Sekunden (führen Sie eine Pulszentrifugation durch). Legen Sie dann die abgedichtete Platte für 1 h bei 37 °C auf den Heizblock.
    6. Wenn beschlossen wurde, das Experiment anzuhalten und die Platte einzufrieren, tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf und zentrifugieren Sie sie bei 280 x g. Wenn es nicht eingefroren ist, überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 6.3.7 fort.
    7. Lassen Sie den Heizblock auf 37 °C vorheizen.
    8. Lassen Sie den Waschpuffer bei Raumtemperatur auftauen. Wenn es aufgetaut ist, drehen Sie es mindestens 10x um, um den Inhalt zu mischen.
    9. Entfernen Sie das Siegel von der Platte.
    10. 100 μL Fällungslösung (PM1) in jede Vertiefung der Platte, die Proben enthält, geben.
    11. Versiegeln Sie die Platte erneut mit dem Siegel.
    12. Wirbeln Sie die Platte bei 1.600 U / min für 1 min ein.
    13. 5 min bei 37 °C inkubieren.
    14. Dann für 1 min in die Pulszentrifuge bei 280 x g geben.
      HINWEIS: Stellen Sie die Zentrifuge für den nächsten Schritt auf 4 °C ein.
    15. Entfernen Sie vorsichtig das Siegel von der Platte und entsorgen Sie es.
    16. 300 μL 2-Propanol (100%) zu jeder Vertiefung, die die Probe enthält.
    17. Versiegeln Sie die Platte mit äußerster Sorgfalt mit einer neuen Dichtung. Achten Sie darauf, den Teller nicht zu schütteln.
    18. Drehen Sie die Platte mindestens 10x um und mischen Sie den gesamten Inhalt.
    19. 30 min bei 4 °C inkubieren.
    20. Zentrifuge bei 3.000 x g bei 4 °C für 20 min.
      HINWEIS: Entfernen Sie am Ende von Schritt 6.3.20 sofort die Zentrifugenplatte.
    21. Entfernen Sie das Siegel von der Platte und entsorgen Sie es.
    22. Drehen Sie die Platte schnell um und lassen Sie die Flüssigkeit auf einem Pad abtropfen, um den Überstand zu entsorgen. Dann schlagen Sie die Platte in einem trockenen Bereich auf einem Papiertuch, um die Flüssigkeit abzulassen.
    23. Klopfen Sie mehrmals für 1 Minute fest oder bis alle Vertiefungen frei von Flüssigkeit sind.
    24. Lassen Sie die Platte invertiert und unbedeckt für 1 h bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass blaue Pellets am Boden der Brunnen zu sehen sind.
    25. Den Hybridisierungsofen auf 48 °C vorheizen.
    26. Schalten Sie den Heizblock zum Vorwärmen ein. Erlauben Sie 20 Minuten für diesen Vorgang.
    27. Auftauen der Reuspension, Hybridisierung und Waschlösung bei Raumtemperatur. Mindestens 10x invertieren. Stellen Sie sicher, dass in der Lösung kein Salz ausgefällt ist.
    28. Fügen Sie 46 μL Reuspensions-, Hybridisierungs- und Waschlösung (RA1) zu jeder Vertiefung der Platte hinzu.
      HINWEIS: Alle verbleibenden Reagenzien müssen für die Färbe- und Hybridisierungsschritte reserviert werden.
    29. Bringen Sie das Siegel auf die Platte auf. Verwenden Sie eine Aluminiumdichtung, um die Platte abzudecken. Halten Sie fest, um die Abdichtung gleichmäßig durchzuführen.
    30. Überprüfen Sie, ob alle Brunnen sicher geschlossen sind, um Verdunstung zu vermeiden.
    31. Legen Sie die neu versiegelte Platte vorsichtig in den Hybridisierungsofen und inkubieren Sie sie bei 48 °C für 1 h.
    32. Wirbeln Sie die Platte bei 1.800 U / min für 1 min auf.
    33. Pulszentrifuge bei 280 x g.
    34. Übertragen Sie die Platte bei 95 °C für 1 h auf den Heizblock.
    35. Bereiten Sie die Hybridisierungskammern (Hyb) vor, indem Sie sie zusammenstellen. Geben Sie 400 μL Befeuchtungspuffer (PB2) in die Reservoirs der Hyb-Kammern ab. Setzen Sie den Deckel sofort auf.
    36. Laden Sie jede Probe von der Platte in die Probeneingangsöffnung des Microarrays.
    37. Laden Sie die Hyb-Kammereinsätze mit den Microarrays in die Hyb-Kammer. Schließen Sie die Hyb-Kammer quer, um eine mögliche Verschiebung der Hyb-Kammer zu vermeiden.
      HINWEIS: Hyb-Kammern müssen bei 48 °C für mindestens 16 h, aber nicht länger als 24 h inkubiert werden.
  4. Tag 4: Färben - Methylierungsassay, manuelles Protokoll
    1. Suspendiert die Färbelösung 4 mit 330 ml 100% EtOH und erhält ein Endvolumen von 350 ml. Schütteln Sie die Flasche Färbelösung 4 kräftig, um eine vollständige Reussuspension zu gewährleisten. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
      HINWEIS: Färbelösung 4 kann bis zu 2 Wochen bei einer Temperatur zwischen 2 °C und 8 °C gelagert werden.
    2. Entfernen Sie die Kammern aus dem Hybridisierungsofen und lassen Sie sie vor dem Öffnen 30 Minuten auf der Bank abkühlen.
    3. Während die Hyb-Kammer abkühlt, füllen Sie zwei Waschbehälter mit Wash Buffer (200 ml pro Waschbehälter). Denken Sie daran, jeden Behälter als "Wash Buffer" (PB1 und PB2) zu kennzeichnen.
    4. Füllen Sie das Microarray-Ausrichtungszubehör mit 150 ml Waschpuffer.
    5. Trennen Sie die Abstandshalter aus Kunststoff und reinigen Sie gegebenenfalls das Glas.
    6. Um die Microarray-Objektträger zu waschen, befestigen Sie die Drahtschlaufe am Gitter und tauchen Sie die Tropfausrüstung in die Behälter mit 200 ml Waschpuffer für insgesamt 10x.
    7. Entfernen Sie alle Einsätze aus der Hybridisierungskammer und entfernen Sie jedes Array aus den Einsätzen. Entfernen Sie das Siegel.
      HINWEIS: Berühren Sie während der Entfernung nicht die freiliegenden Matrizen.
    8. Achten Sie beim Entfernen der Microarray-Objektträger aus der Hybridisierungskammer darauf, dass Sie nichts verschütten.
    9. Waschen Sie die Microarrays in der Waschpufferlösung (PB1) langsam und leicht und bewegen Sie sich 10x auf und ab. Wechseln Sie zu einer frischen PB1-Lösung und führen Sie die Wäsche durch, indem Sie die Microarrays in der Lösung langsam 10x nach oben und unten bewegen.
    10. Entfernen Sie das Microarray aus dem Behälter und bestätigen Sie, dass keine Rückstände vorhanden sind.
    11. Verwenden Sie einen transparenten Abstandshalter an der Oberseite jedes Microarrays und führen Sie die Abstandshalter zu den entsprechenden Positionen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nur die transparenten Abstandshalter zu verwenden, nicht die weißen.
    12. Positionieren Sie die Ausrichtungsleiste auf dem Ausrichtungszubehör.
    13. Legen Sie eine Glasrückplatte auf die Oberseite des durchsichtigen Abstandshalters. Achten Sie darauf, das gesamte Microarray abzudecken. Befestigen Sie dann Metallklemmen an den Durchflusskammern. Verwenden Sie bei Bedarf eine Schere, um die Enden der Abstandshalter der Durchflusskammer zu trimmen.
    14. Waschen Sie die Hybridisierungskammerbehälter sofort mit ddH2O und schrubben Sie sie mit einer kleinen Reinigungsbürste. Lassen Sie keinen Befeuchtungspuffer im Reservoir verbleiben.
    15. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, der für das Extending and Staining Microarray verantwortlich ist.
      HINWEIS: Lassen Sie alle Durchflusskammern horizontal auf dem Labortisch montiert. Behandeln Sie sie nur, wenn der gesamte Färbeschritt bereit ist. Erhitzen Sie die Aufhängungs-, Hybridisierungs- und Waschlösung auf eine Temperatur zwischen 20 °C und 25 °C. Mischen Sie vorsichtig, bis kein Kristall in der Lösung zu sehen ist.
    16. Platzieren Sie die Reagenzien nacheinander in einem Rack. Wenn einige gefroren sind, lassen Sie sie bei Raumtemperatur und kehren Sie sie dann mindestens 10x um, um die Lösungen zu mischen.
    17. Füllen Sie den Wasserthermostat auf das entsprechende Niveau.
    18. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Temperatur auf 44 °C ein.
    19. Entfernen Sie alle Blasen, die am Kammergestell befestigt sind.
    20. Führen Sie Tests am Kammerrack mit einem Temperaturfühler durch. Alle getesteten Standorte müssen zwischen 44 °C ± 0,5 °C liegen.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen ohne Unterbrechung ausgeführt werden.
    21. Wenn das Rack eine Temperatur von 44 °C erreicht, platzieren Sie schnell jede Baugruppe in der Durchflusskammer.
      HINWEIS: Für die folgenden Schritte pipettieren Sie alle Reagenzien in die hintere Glasplatte.
    22. Pipette 150 μL Reuspensions-, Hybridisierungs- und Waschlösung (RA1). Dann 30 Minuten inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt 5x.
    23. 450 μL Färbelösung 1 (XC1) pipettieren und 10 min inkubieren.
    24. Pipette 450 μL Färbelösung 2 (XC2) und 10 min inkubieren.
    25. 200 μL Two-Color Extension Master Mix (TEM) pipettieren und 15 min inkubieren.
    26. 450 μL 95% Formamid/1 mM EDTA pipettieren und 1 min inkubieren. Zweimal wiederholen.
    27. 5 min inkubieren
    28. Verringern Sie die Temperatur des Kammerracks auf 32 °C (angezeigt auf Superior Two-Color Master Mix).
    29. 450 μL Fleckenlösung 3 (XC3) pipettieren und 1 min inkubieren. 1x wiederholen.
    30. Warten Sie, bis das Rack in der Kammer die richtige Temperatur erreicht hat.
      HINWEIS: Um das Microarray-Bild unmittelbar nach dem Färbevorgang zu lesen, schalten Sie den Scanner in diesem Stadium ein.
    31. Geben Sie nun 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM) ab, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation.
    32. Geben Sie dann 450 μL Fleckenlösung 3 (XC3) ab, gefolgt von einer 1-minütigen Inkubation. Wiederholen Sie 1x.
    33. Warten Sie 5 Minuten und fügen Sie dann 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten.
    34. Geben Sie nun 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM) ab, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation.
    35. Geben Sie dann 450 μL Fleckenlösung 3 (XC3) ab, gefolgt von einer 1-minütigen Inkubation. Wiederholen Sie 1x.
    36. Warten Sie 5 min.
    37. 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) hinzufügen und 10 min inkubieren.
    38. Fügen Sie 450 μL Stain Microarray Solution 3 (XC3) hinzu und inkubieren Sie für 1 Minute, dann wiederholen Sie es erneut.
    39. Warten Sie 5 min.
      HINWEIS: Führen Sie das folgende Wiederholungsschema aus: Schritt 6.4.34., Schritt 6.4.35. und Schritt 6.4.36.; Schritt 6.4.37., 6.4.38. und Schritt 6.4.39.; Schritt 6.4.34., Schritt 6.4.35. und Schritt 6.4.36.
    40. Entfernen Sie nun sofort die Durchflusskammern aus dem Rack und legen Sie sie vorsichtig horizontal auf den Labortisch. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur Umgebungstemperatur ist.
    41. 6.4.41.310 ml Waschlösung (PB1) für jedes Microarray in einen Waschbehälter geben.
    42. Entfernen Sie die Metallklemmen und das Glas und schließlich das Microarray.
    43. Legen Sie die Microarrays auf ein Färbegestell und legen Sie sie in den Waschbehälter mit 10x PB1-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Barcodes von demjenigen abgewandt sind, der sie handhabt, und dass alle Microarrays untergetaucht sind.
    44. Bewegen Sie sich langsam und leicht mit Auf- und Abwärtsbewegungen 10x. Das Microarray sollte vollständig aus der Lösung entfernt werden, bevor es wieder untergetaucht wird. Dann lassen Sie es für 5 Minuten unter Wasser bleiben.
    45. Schütteln Sie das Reagenz von Stain Solution 4 (XC4) kräftig, um eine vollständige Reussuspension zu gewährleisten. 310 ml XC4 in einen Waschbehälter geben.
      HINWEIS: Lassen Sie die Lösung nicht länger als 10 Minuten im Waschbehälter sitzen.
    46. Bewegen Sie den Färbeständer leicht in den anderen Behälter mit XC4.
    47. Bewegen Sie sich langsam und leicht mit Auf- und Abwärtsbewegungen 10x. Stellen Sie sicher, dass das Microarray vollständig aus der Lösung entfernt wird, bevor es wieder untergetaucht wird.
    48. Lassen Sie dann das Microarray für 5 Minuten unter Wasser bleiben.
    49. Bewegen Sie den Färbeständer aus der Lösung und legen Sie ihn mit den Barcodes nach oben in einen Rohrhalter.
    50. Entfernen Sie das Microarray vorsichtig mit einer Verriegelungszange und legen Sie es zum Trocknen auf ein Regal.
    51. Trocknen Sie sie mit dem Vakuum-Exsikkator für 50-55 min bei 675 mm Hg (0,9 bar).
    52. Reinigen Sie die Rückseite jedes Microarrays mit EtOH.
      VORSICHT: Vermeiden Sie es, die Streifen zu berühren, und lassen Sie EtOH in keiner Weise auf die Streifen tropfen.
    53. Fahren Sie mit der Abbildung des Microarrays fort.
    54. Lagern Sie das Microarray vorsichtig in einer Aufbewahrungsbox bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Microarray-Bilder müssen innerhalb von 72 Stunden aufgenommen werden.

7. Bioinformatik-Analyse

HINWEIS: Es ist notwendig, einige Attribute der Art des Microarrays zu ändern (z. B. sollte arraytype = "450k" durch arraytype = "EPIC" ersetzt werden). Der Autor der ChAMP-Pipeline beschreibt detailliert alle Felder, die geändert werden sollten, um Arrays auf der Bioconductor-Seite des Pakets zu analysieren30.

  1. Musterblatt
    1. Übertragen Sie die IDAT-Dateien auf den Computer, um mit der bioinformatischen Analyse fortzufahren31. Erstellen Sie ein Beispielblatt, um die Datenanalyse durchzuführen31.
      HINWEIS: Für diese Tabellenkalkulationsdatei sind drei Spalten erforderlich. Die erste ist Sample_name. Diese Spalte muss die Namen oder Codes enthalten, die zur Identifizierung der Beispiele verwendet wurden. Die zweite ist die Sentrix_position. Diese Spalte platziert den entsprechenden R01C01 der Proben, wobei R01 für die Chipzeile verantwortlich ist und die Spalte als C01 bezeichnet wird. Die dritte wesentliche Spalte ist die Sentrix_ID und sie ist verantwortlich für den Empfang der Nummer, die das Microarray identifiziert. Stellen Sie sicher, dass Sie die richtigen Zahlen eingeben. Es ist möglich, andere Informationen auf dem Beispielblatt als Variablenwerte hinzuzufügen. Im vorliegenden Experiment wurden Daten aus der Metallanalyse einbezogen.
  2. ChAMP-Pipeline
    1. Installieren Sie RStudio (V.4.0.2) auf dem Computer, um die Analyse durchzuführen30.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Computer über mindestens 8 G RAM verfügt. Die Datenanalyse wird mit einer geringeren Menge an RAM Probleme haben oder abstürzen.
    2. Öffnen Sie nach der Installation RStudio und installieren Sie das ChAMP Bioconductor package30 über die entsprechende Kommandozeile (siehe Ergänzungsmaterial 1).
      HINWEIS: Wenn am Ende der Installation ein Fehler auftritt, installieren Sie die erforderlichen ChAMP-Bibliotheken manuell, nacheinander26.
    3. Importieren Sie nun die Rohdaten und führen Sie die Analyse durch. Siehe ergänzendes Material 1.
      champ.load() importiert die Rohdaten und führt den Filtervorgang durch, wobei Sonden mit niedrigem Erkennungs-Pval, Multihit-Sites, Nicht-CG-Sonden, CpG-Sites in der Nähe von SNPs und CpGs in sexuellen Chromosomen ausgeschlossen werden.
      champ.impute() führt die KNN-Imputation als Standard aus.
      Champ. QC ruft Datenqualitätsdiagramme ab (z. B. Dichtediagrammdiagramm).
      Champ. SVD wertet Batcheffekte basierend auf den bereitgestellten Metadaten im Beispielblatt aus.
      champ.refbase() führt eine Zellentypschätzung und -korrektur durch.
      Champ. DMP( ) ruft differentiell methylierte Positionen und Merkmalsassoziationen wie die Fettmasse ab, um die DNA-Methylierung zwischen den Gruppen zu überprüfen und die Parameter zu ändern, wie in Ergänzungsmaterial 1 gezeigt.
  3. Anreicherung (String DB)
    HINWEIS: Die funktionelle Anreicherung wird verwendet, um die biologischen Funktionen einer Reihe von Genen abzuleiten.
    1. Um Daten in einer Zeichenfolge anzureichern, wählen Sie die Liste der Ziele aus, die angereichert und als Eingabe verwendet werden sollen: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. Wählen Sie für organismus homo sapiens und drücken Sie die Schaltfläche Suchen.
    3. Um durch die Anreicherung zu navigieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse.
  4. GEO-Einreichung
    1. Speichern Sie die Daten in einem öffentlichen Repository wie dem GEO von NCBI. Registrieren Sie sich dazu für das Einreicherkonto.
      HINWEIS: Schließen Sie die GEO-Einreichung (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) ab, indem Sie das Metadatenblatt mit beschreibenden Informationen und Protokollen für das Gesamtexperiment und einzelne Proben herunterladen. GEO-Archiveinreichungen können in jeder Tabellenkalkulationssoftware erstellt werden. Fügen Sie zweitens die Rohdatendatei hinzu, die aus dem Skript cell-ranger count für alle Bibliotheken generiert wurde, in das Verzeichnis. IDAT und zugeordnete Dateien oder ein Matrixarbeitsblatt enthalten nicht normalisierte Daten. Der dritte Ordner sind die verarbeiteten Datendateien. Die Matrixtabelle ist eine Tabellenkalkulation, die die endgültigen, normalisierten Werte enthält, die über Zeilen und Stichproben hinweg vergleichbar sind und vorzugsweise wie in einem begleitenden Manuskript beschrieben verarbeitet werden.
    2. Legen Sie verarbeitete Datendateien, die aus dem Skript cell-ranger count für alle Bibliotheken generiert wurden, im Verzeichnis ab. Verwenden Sie die FTP-Server-Anmeldeinformationen des GEO-Einreichers, um das Verzeichnis zu übertragen, das alle drei Komponenten enthält.

Representative Results

Nach der Verwendung der ChAMP-Pipeline wurden 409.887 Sonden in der Analyse nach allen Filtern berücksichtigt (unqualifizierte CpGs, Nicht-CG-Sonden, CpG in der Nähe von SNPs, Multihit-Sites und CpGs im Zusammenhang mit XY); Ein Schema ist in Abbildung 2 dargestellt.

Figure 2
Abbildung 2: Pipeline der bioinformatischen Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Darüber hinaus ergab das Dichtediagramm, dass alle Proben ähnliche Dichten der Betaverteilung im Zusammenhang mit den Qualitätskontrollschritten aufwiesen. Diese Analyse wertet die Verteilung der Beta-Werte aus und zeigt auf, ob es Proben gibt, die ausgeschlossen werden müssen. In dieser Charge wurden aufgrund dieser Analyse keine Proben ausgeschlossen.

Figure 3
Abbildung 3: Beta-Werte-Dichtediagramm, das mit dem ChAMP-Paket erhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die SVD-Analyse (Singular Value Decomposition) wurde verwendet, um die Hauptkomponenten zu überprüfen, die die Variabilität der DNA-Methylierungsdaten signifikant beeinflusst haben. Die Daten zeigten, dass BMI, WC (p < 1e10-5) und FM (p < 0,05) einen signifikanten Einfluss auf die Datenvariabilität hatten (Abbildung 4).

Figure 4
Abbildung 4: Analyse der Einzelwertzerlegung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Zelltypschätzung ergab, dass sowohl natürliche Killerzellen (NK) als auch B-Zellen bei adipösen Frauen höher waren (Abbildung 5).

Figure 5
Abbildung 5: Zellanteile, die nach Housemans Methode geschätzt werden. Gran: Granulozyt. CD4T: Helfer-T-Zelle, Lymphozyten. CD8T: zytotoxische T-Zelle, Lymphozyten. Mono: Monozyt. B-Zelle: B-Lymphozyten. NK: natürliche Killerzellen, Lymphozyten. *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die DNA-Methylierungsniveaus zwischen übergewichtigen und nicht fettleibigen Frauen unterschieden sich vor und nach der Zelltypkorrektur. Vor der DNA-Methylierungsdatenkorrektur für Zelltypen wurden 43.463 differentiell methylierte Positionen (DMPs) beobachtet, und 3.329 CpGs blieben danach signifikant. 445 CpG-Standorte befanden sich in intergenen Regionen (IGR) und 2.884 in genen Regionen, wobei die meisten in der Promotorregion lagen (n = 1.438). Die Verteilung entlang aller Regionen war TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), First Exon (n = 273), Body (n = 724) und 3'UTR (n = 59). Unter Berücksichtigung der Δβ-Werte <-0,05 und >0,05 waren 162 CpGs hypomethyliert und 576 bei adipösen Personen hypermethyliert (Abbildung 6). Die Daten sind in der GEO-Datenbank unter dem Registercode GSE166611 verfügbar.

Figure 6
Abbildung 6: Differentiell methylierte Positionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Es ist möglich, die unterschiedliche Methylierung zwischen den Gruppen zu bewerten und CpG-Stellen zu finden, die mit bestimmten Merkmalen in Methylierungsstudien assoziiert sind. Für Fettmassenstudien wurden 13.222 CpG-Stellen gefunden. 6.159 CpGs in der Promotorregion waren mit der Fettmasse verbunden, wobei 470 hypermethyliert und 94 hypomethyliert waren (Abbildung 7), und die entsprechenden Gene wurden angereichert (Tabelle 2).

Figure 7
Abbildung 7: Promotorregionen von hypomethylierten und hypermethylierten Genen, unabhängig voneinander bezogen auf die Fettmasse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 2: Funktionelle Anreicherung der Gene aus den differentiell methylierten CpG-Standorten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzungsmaterial 1: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

DNA-Methylierungsarrays sind aufgrund ihres Kosten-Nutzen-Verhältnisses die am häufigsten verwendeten Methoden für den Zugang zur DNA-Methylierung14. Die vorliegende Studie beschrieb ein detailliertes Protokoll unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Microarray-Plattform zur Bewertung der DNA-Methylierung in einer Pilotstudie, die in einer brasilianischen Kohorte durchgeführt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse der Pilotstudie bestätigten die Wirksamkeit des Protokolls. Abbildung 3 zeigt die Vergleichbarkeit der Stichprobe und die vollständige Bisulfit-Konvertierung32.

Als Qualitätskontrollschritt empfahl der ChAMP-Algorithmus den Ausschluss von CpGs-Standorten während des Filterprozesses. Ziel des Ausschlusses von Sonden ist es, die Datenanalyse zu verbessern und Bias zu eliminieren. Die minderwertigen CpGs (p-Werte unter 0,05) wurden entfernt, um experimentelles Rauschen im Datensatz zu eliminieren. Die Ziele blieben in der Dichtediagrammanalyse erhalten. Zhou33 beschrieb die Bedeutung der Filterung von CpGs in der Nähe von SNPs, um Diskrepanzen zu vermeiden, eine Fehlinterpretation der Methylierung polymorpher Cytosine und die Verursachung von Schaltfarbe des Typ-I-Sondendesigns34. Da XY-Chromosomen durch Prägung unterschiedlich beeinflusst werden, haben Heiss und Just35 die Bedeutung der Filterung dieser Sonden verstärkt, da bei Frauen die Probleme mit der Hybridisierung Störfaktoren sein können35.

Das Verfallsdatum der DMAPs, das Eröffnungsdatum des Formamids, die analytische Qualität des absoluten Ethanols und die Gesamtleukozytenzahl gelten als kritische Schritte im Protokoll.

Darüber hinaus ist nach unseren Beobachtungen die Zelltypschätzung für die Durchführung der bioinformatischen Analyse unerlässlich. Die Houseman-Methode führt die Zelltypschätzung durch, wie in Tians Studie30 beschrieben. Diese Methode basiert auf 473 spezifischen CpG-Standorten, die die Prozentsätze der wichtigsten Zelltypen wie Granulozyten, Monozyten, B-Zellen und T-Zellen vorhersagen können36. Wir haben die empfohlene Funktion "myRefbase" aus dem ChAMP-Paket verwendet. Nach der Schätzung passt der ChAMP-Algorithmus die Beta-Werte an und eliminiert diese Verzerrung aus dem Datensatz. Dieser Schritt ist in Studien, die sich auf Fettleibigkeit konzentrieren, von entscheidender Bedeutung, da diese Population aufgrund ihres chronischen Entzündungszustands einen erheblichen Unterschied in den weißen Blutkörperchen aufweist.

Wir haben nur die ursprüngliche Kappenkarte für das gängige PCR-Siegel in Bezug auf Methodenmodifikation und Fehlerbehebung geändert. Nach jedem Zentrifugationsprozess wurde die Dichtung gegen eine neue ausgetauscht. Wir konnten die Standard-Heißsiegelung nicht verwenden und passten sie mit Aluminiumfolie um die Platte an.

Obwohl kommerzielle Assays als Goldstandard für epigenetische Studien angesehen wurden, könnte eine Einschränkung des Protokolls die Spezifität der Reagenzien und Geräte einer einzigartigen Marke sein37,38,39,40. Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen von Indikatoren, die es ermöglichen, den korrekten Fortschritt des Experiments zu identifizieren41.

Die Standardisierung des vorliegenden Protokolls stellt einen großartigen Leitfaden für die epigenetische Forschung dar, reduziert menschliche Fehler während des Prozesses und ermöglicht eine erfolgreiche Datenanalyse und Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien.

Nach unseren Ergebnissen eignen sich DNA-Methylierungsexperimente für Studien, die Personen mit und ohne Adipositas vergleichen43. Auch die vorgeschlagene bioinformatische Analyse lieferte qualitativ hochwertige Daten und konnte in groß angelegten Studien berücksichtigt werden.

Mit Hilfe der SVD-Analyse identifizierten wir, dass die Adipositas-bezogenen Merkmale (BMI, WC und FM) die Variabilität in DNA-Methylierungsdaten beeinflussten. Als signifikantes Ergebnis zeigt die Zelltypschätzung, dass sowohl natürliche Killerzellen (NK) als auch B-Zellen bei Frauen mit Adipositas höher waren als bei Frauen ohne Adipositas (Abbildung 5). Die höhere Anzahl dieser Zellen könnte durch den minderwertigen Entzündungszustand dieser Individuen erklärt werden44. Wir beobachteten, dass Patienten mit Adipositas hypo- und hypermethylierte CpGs in Promotorregionen von Genen haben, die mit der Fettmasse assoziiert sind. Die meisten Stellen waren hypomethyliert, was mit dem natürlichen Anstieg der Spiegel der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei diesen Individuen zusammenhängen könnte. Dieser oxidative Stresszustand kann Guaninperturbance an der Dinukleotidstelle fördern, 8-Hydroxy-2'-desoxyguanosin (8-OHdG) bilden, was zu einer 5mCp-8-OHdG-Dinukleotidstelle führt und die Rekrutierung von TET-Enzymen verursacht. All diese Ereignisse könnten für die Förderung der DNA-Hypomethylierung und Hypermethylierung durch verschiedene Wirkmechanismen verantwortlich sein45.

Darüber hinaus scheint die Rate der Adipogenese bei Personen mit Fettleibigkeit zu steigen, wobei etwa 10% der neuen Zellen zu alten Zellen werden46,47. Epigenetische Beiträge, die die fettleibige Umgebung betonen, können die Proliferations- und Differenzierungsraten der Zellen verändern und die Entwicklung der Fettmasse begünstigen48. Epigenetische Veränderungen können auch adipogene Programme beeinflussen und ihre Entwicklung erleichtern oder einschränken. Primäre Transkriptionsfaktoren (PPARγ oder C / EBPα) oder die Assemblierung von Multiproteinkomplexen, die in nachgeschalteten Promotorregionen positioniert sind, die durch Ein- oder Ausschließen epigenetisch modifizierender Enzyme betrieben werden, regulieren die Genexpression durch Hyper- oder Hypomethylierung45. Der PPARγ-Signalweg wurde zuvor beschrieben, um den WNT-Signalweg zu verändern, der in dieser Studie Gene angereichert hatte. Obwohl noch nicht bekannt ist, wie die WNT-Signalgebung während der Adipogenese auftritt, haben neuere Studien berichtet, dass sie eine wesentliche Rolle im Adipozytenstoffwechsel spielen könnte, insbesondere unter adikogenen Bedingungen49.

Disclosures

Die Autoren dieses Artikels haben keine Interessenkonflikte und haben keine finanzielle Offenlegung zu erklären.

Acknowledgments

Wir möchten Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) dafür danken, dass er zur Verfügung stand, um alle Zweifel am ChAMP-Paket zu beantworten. Wir danken auch Guilherme Telles, Msc. für seinen Beitrag sowohl zu den technischen als auch zu den wissenschaftlichen Fragen aus diesem Papier; Er machte wichtige Überlegungen zur Epigenetik und zu Videoaufnahme- und Formatierungstechniken (guilherme.telles@usp.br). Finanzierung von Verbrauchsmaterialien: São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2018/24069-3) und National Council for Scientific and Technological Development (CNPq: #408292/2018-0). Persönliche Förderung: (FAPESP: #2014/16740-6) und Academic Excellence Program von Coordination for Higher Education Staff Development (CAPES: 88882.180020/2018-01). Die Daten werden uneingeschränkt öffentlich und frei zugänglich gemacht. Adresskorrespondenz an NYN (E-Mail: nataliayumi@usp.br) oder CBN (E-Mail: carla@fmrp.usp.br).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol J.T. Baker B5924-03
Agarose gel Kasvi K9-9100
Electric bioimpedance Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Corning 46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit ZymoResearch, Irvine, CA, USA D5001
Formamide Sigma F9037
FMS—Fragmentation solution Illumina 11203428 Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip Illumina
Maxwell Instrument Promega, Brazil AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix Illumina 11202880 Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix Illumina 11203410 Supplied Reagents
NaOH F. MAIA 114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization Illumina 11291245 Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization Illumina 11191130 Supplied Reagents
2-propanol Emsure 10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution Illumina 11292441 Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix Illumina 15010230 Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix Illumina 11288046 Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix Illumina 11208309 Supplied Reagents
Ultrapure EDTA Invitrogen 155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) ByoSystems 4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) Thermo Fisher Scientific AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1 Illumina 11208288 Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2 Illumina 11208296 Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3 Illumina 11208392 Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4 Illumina 11208430 Supplied Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
  2. World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
  3. Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
  4. Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
  5. Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  6. Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
  7. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
  8. Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  9. Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
  10. Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
  11. Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
  12. Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
  13. Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
  14. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
  15. Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
  16. Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
  17. Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
  18. Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
  19. Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
  20. Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
  21. Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
  22. Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
  23. Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
  24. Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
  25. Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
  26. Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
  27. Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
  28. Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
  29. Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
  30. Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
  31. Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
  32. Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
  33. Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
  34. Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
  35. Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
  36. Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
  37. Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
  38. Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
  39. Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
  40. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  41. Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
  42. Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
  43. Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
  44. DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
  45. Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
  46. Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
  47. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
  48. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
  49. Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).

Tags

Genetik Ausgabe 183 DNA-Methylierung Fettleibigkeit ChAMP Bioinformatik Epigenetik Fettmasse Body-Mass-Index
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues,… More

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J. B., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter