Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Provberedning till bioinformatikanalys av DNA-metylering: Associeringsstrategi för fetma och relaterade egenskapsstudier

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/62598
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 4, 5, 1, 1, 6, 7, 8, 9, 6
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Den föreliggande studien beskriver arbetsflödet för att hantera DNA-metyleringsdata erhållna med mikroarray-teknik. Protokollet visar steg från provberedning till dataanalys. Alla procedurer beskrivs i detalj, och videon visar de viktiga stegen.

Abstract

Fetma är direkt kopplad till livsstil och har associerats med DNA-metyleringsförändringar som kan orsaka förändringar i adipogenesen och lipidlagringsprocesserna som bidrar till utvecklingen av sjukdomen. Vi demonstrerar ett komplett protokoll från urval till epigenetisk dataanalys av patienter med och utan fetma. Alla steg från protokollet testades och validerades i en pilotstudie. 32 kvinnor deltog i studien, där 15 individer klassificerades med fetma enligt Body Mass Index (BMI) (45,1 ± 5,4 kg/m2); och 17 individer klassificerades utan fetma enligt BMI (22,6 ± 1,8 kg/m2). I gruppen med fetma identifierades 564 CpG-platser relaterade till fettmassa genom linjär regressionsanalys. CpG-webbplatserna var i promotorregionerna. Differentialanalysen fann 470 CpGs hypometylerade och 94 hypermetylerade platser hos individer med fetma. De mest hypometylerade berikade vägarnavar i RUNX, WNT-signalering och svar på hypoxi. De hypermetylerade vägarna var relaterade till insulinsekretion, glukagonsignalering och Ca2+. Vi drar slutsatsen att protokollet effektivt identifierade DNA-metyleringsmönster och egenskapsrelaterad DNA-metylering. Dessa mönster kan associeras med förändrat genuttryck, vilket påverkar adipogenes och lipidlagring. Våra resultat bekräftade att en obesogen livsstil kan främja epigenetiska förändringar i mänskligt DNA.

Introduction

Storskalig omikteknik har i allt högre grad använts i studier av kroniska sjukdomar. En intressant egenskap hos dessa metoder är tillgången till en stor mängd genererade data till det vetenskapliga samfundet. Därför har ett krav på att standardisera protokollen uppstått för att möjliggöra teknisk jämförelse mellan studier. Den föreliggande studien föreslår standardisering av ett protokoll för att erhålla och analysera DNA-metyleringsdata, med hjälp av en pilotstudie som ett tillämpligt exempel.

Negativ energiförbrukning dominerar i modern mänsklig livsstil, vilket leder till en överdriven ackumulering av fettvävnad och följaktligen utvecklingen av fetma¹. Många faktorer har ökat fetma, såsom sedentarism, kaloririka dieter och stressiga rutiner. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattade att 1,9 miljarder vuxna var överviktiga 2016, vilket innebär att mer än 20% av världens befolkning har över 30 kg / m2 BMI2. Den senaste uppdateringen från 2018 avslöjade att förekomsten av fetma i USA (USA) var högre än 42%3.

Epigenetik är den strukturella anpassningen av kromosomala regioner för att registrera, signalera eller upprätthålla förändrade aktivitetstillstånd4. DNA-metylering är en reversibel kemisk förändring i cytosin-guanosin-dinukleotiderna (CpG-ställen) och bildar 5-metylcytosin-pG (5mCpG). Det kan modulera genuttryck genom att reglera transkriptionsmaskineriets åtkomst till DNA5,6,7,8. I detta sammanhang är det viktigt att förstå vilka CpG-webbplatser som är associerade med fetma-relaterade egenskaper9. Många faktorer kan stödja eller förhindra platsspecifik DNA-metylering. Nödvändiga enzymer för denna process, såsom DNA-metyltransferaser10 (DNTM) och tio-elva translokationer (TET), kan främja DNA-metylering eller demetylering under miljöexponering11.

Med tanke på det växande intresset för DNA-metyleringsstudier under de senaste åren har valet av den lämpligaste analysstrategin för att exakt svara på varje fråga varit en viktig fråga för forskare12,13,14. 450K DNA-metyleringsmatrisen är den mest populära metoden som används i mer än 360 publikationer14 för att bestämma DNA-metyleringsprofilen. Det kan bestämma metyleringen av upp till 485 000 CpGs som finns i 99% av kända gener15. Denna matris har dock avbrutits och ersatts med EPIC, som täcker 850 000 CpG-webbplatser. Det nuvarande protokollet kan tillämpas för både 450K och EPIC16,17,18.

Protokollet presenteras steg för steg i figur 1 och omfattar följande steg: populationsval, provtagning, experimentberedning, DNA-metyleringspipeline och bioinformatikanalys. En pilotstudie utförd i vårt laboratorium demonstreras här för att illustrera stegen i det föreslagna protokollet.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt över det presenterade protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Etikkommittén för Ribeirão Preto Medical School University Hospital vid University of São Paulo (HCRP-USP) godkände studien (CAAE: 14275319.7.0000.5440). Deltagarna undertecknade samtyckesblanketten och alla förfaranden genomfördes enligt Helsingforsdeklarationen.

1. Befolkning och urval

  1. Rekrytera deltagare med BMI >30 kg/m2 till studien. För den aktuella studien rekryterades 32 kvinnor från en blandningspopulation19 mellan 18 och 60 år.
    OBS: I HCRP-USP observerades högre fetma främst hos kvinnor20. Deltagare med fetma, med BMI ≥30 kg / m2 (n = 15), rekryterades från polikliniken för metaboliska sjukdomar i HCRP-USP. Deltagarna utan fetma, med BMI mellan 18,5 kg/m2 och 24,9 kg/m2 (n = 17), rekryterades från andra kliniker och hade inga allvarliga sjukdomar; Kliniska data visas i tabell 1.
  2. Uteslut kvinnor som är gravida, ammande mödrar, rökare och konsumerar alkohol.

2. Antropometri och kroppssammansättning

  1. Mät deltagarnas vikt med hjälp av en digital antropometrisk skala på 200 kg. Se till att ta bort skor och överflödiga kläder.
  2. Bedöm höjden med hjälp av en stadiometer med en 0,5 cm gradering. Deltagarna instruerades att stå barfota, fötterna tillsammans och armarna vid sina sidor21.
  3. Samla in fettmassa (FM) information med hjälp av en elektrisk bioimpedans. Efter 12 timmars fasta, bedöm med en tom urinblåsa. Placera deltagarna i ryggläge, med benen isär och armarna parallella utan att röra kroppen. Instruera deltagarna att ta bort alla metalltillbehör22.
  4. Få midjemåttet (WC) med hjälp av ett outökningsbart måttband med en 0,1 mm gradering. Tejpen placerades horisontellt runt mitten av midjan, strax ovanför höftbenen. Mätningen skedde strax efter ett andetag. Enligt Centers for Diseases Control and Prevention (CDC) är WC-cut-off för kvinnor 88 cm23.

Tabell 1: Befolkningsegenskaper. Alla variabler var parametriska (p > 0,05, Shapiro Wilk), och skillnader utvärderades med hjälp av ett oberoende t-test, där p < 0,05 ansågs signifikant. *p < 0,0001. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

3. Insamling av biologiskt material

  1. Samla perifert blod efter 12 timmars fasta, som beskrivits tidigare24.
  2. Samla 4 ml av hela blodproverna i uppsamlingsrör med antikoagulantia (t.ex. EDTA) och förvara dem på is för transport.

4. DNA-extraktion

  1. Centrifugera varje rör som innehåller blodet vid 2000 x g i 10 min. Samla cirka 300 μL av buffy coat (vit interfas).
  2. Extrahera DNA från perifert blod med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt instrument (se materialförteckningen), som beskrivits tidigare25. Eluera DNA i 480 μL ultrarent H2O.
  3. Bedöm DNA-koncentration och kvalitet med hjälp av en fluorometer. Integriteten utvärderades med hjälp av en 1% agarosgelanalys25. Förvara i frys vid -80 °C.

5. Beredning före metyleringsanalys

  1. Se till att proverna har den lägsta DNA-koncentrationen (500 ng är den perfekta initiala ingången för att starta), men utspädningen kan variera mellan proverna i detta steg.
  2. Vissa reagenser ingår inte i microarray kit26, så köp dem separat27.
  3. Kontrollera om satsen innehåller alla reagenser som används under proceduren. de är oersättliga. Kontrollera utgångsdatumet för alla reagenser. Se till att andra reagenser och lösningar som inte finns i satsen också finns tillgängliga (95% formamid/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, absolut etanol, 2-propanol).
    VARNING: Formamid är ett flyktigt reagens; kvaliteten på resultaten kan förbättras om produkten är färsk. Integriteten och kvaliteten på formamid och absolut etanol anses vara kritiska eftersom de kan påverka färgningsprocessen som föreslås av tillverkaren. De valda alkoholerna måste vara ultrarena produkter som är specifika för molekylärbiologisk analys.
  4. När microarray-satsen har förvärvats laddar du ner Chips Decode Maps (DMP). Dessa filer finns tillgängliga på tillverkarens webbplats 24-48 timmar efter att satsen har skickats och är uteslutna på utgångsdatumet28. För att ladda ner de nämnda filerna, utför stegen nedan.
    1. Se till att en dator med internetuppkoppling är tillgänglig. Utför nedladdningen med hjälp av Software Decode File Client.
    2. Innan du installerar programmet ska du se till att datorn har utgående och inkommande åtkomst som beviljats av institutionen. Avkodningsfilklienten har inga säkerhetsbegränsningar.
    3. Logga in på programvaran Decode File Client med alternativet Access by BeadChip. Denna inloggning utförs med MyIllumina användar-ID och lösenord. Anmälan på denna sida krävs28.
    4. När du har loggat in på Decode File Client anger du informationen nedan i deras respektive fält på programvarans hemsida28: Lista över streckkoder; Lista över Box Ids; Inköpsordernummer (PO); och Försäljningsordernummer (kom ihåg att inte inkludera bokstäverna som följer siffrorna).
    5. Välj de DMP:er som ska hämtas enligt streckkodsnumret i inköpsrutan och ange destinationen i dialogrutan för att spara DMP:erna.
    6. Klicka på knappen för att starta nedladdningen.
      OBS: I slutet av nedladdningen, se till att de nedladdade mapparna inte är tomma och lagra filerna säkert, eftersom de kommer att behövas för det sista steget för att konvertera experimenten till Intensitetsdatafiler (IDAT-filer). Efter utgångsdatumet kan Illumina ta bort DMAP:s data från sin onlinedatabas.

6. DNA-metyleringsrörledning

OBS: DNA-metyleringsexperimentet är uppdelat i 4 dagar (Figur 1). Följ tillverkarens rekommendationer och specifikationer för att få exakta resultat.

  1. Dag 1: Bisulfitbehandling
    1. Börja med att denaturera 500 ng genomiskt DNA och tillsätt sedan omvandlingsreagenserna. För att utföra detta steg, följ rekommendationerna från bisulfit- och mikroarraysatserna29.
    2. Behandla det denaturerade DNA:t med 130 μL av bisulfitomvandlingsreagenset vid den standardkoncentration som tillverkaren tillhandahåller.
    3. Inkubera röret i en termocyklist i 16 cykler vid 95 °C i 30 s och 50 °C i 1 timme. Ramp ner termocykeln till 4 ° C i 10 min.
    4. Utför tvättsteget genom att tillsätta 100 μL av tvättbufferten och centrifugera sedan med full hastighet i 30 s. Koncentrationen finns inte i användarhandboken, och tillverkaren standardiserar volymerna.
      OBS: Detta reagens levereras med satsen och behöver inte spädas eller beredas.
  2. Dag 2: Amplifiering - Metyleringsanalys, manuellt protokoll
    1. Förvärm hybridiseringsugnen till 37 ° C och låt temperaturen balansera.
    2. Applicera en streckkodsetikett på en 0,8 ml mikroplatta.
    3. Tina amplifieringsreagenserna (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix och Multi-Sample Amp Master Mix) vid rumstemperatur (dessa reagenser levereras med satsen och behöver inte spädas eller beredas). Utför sedan en mild inversion minst 10x tills rörens hela innehåll är blandat.
    4. Fördela 20 μL av Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) i plattans brunnar.
    5. Överför 4 μL av DNA-provet från den bisulfitomvandlade plattan till motsvarande brunnar på 0,8 ml-plattan. Registrera nu det ursprungliga DNA-provets ID på laboratoriespårningsformuläret som motsvarar plattbrunnarna.
    6. Dispensera 4 μL av 0,1 N NaOH i varje brunn på plattan som innehåller Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) och DNA-provet.
    7. Försegla plattan med en plasttätning.
    8. Vortex plattan för att blanda reagenserna med proverna vid 1 600 rpm i 1 min. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur och ta försiktigt bort tätningen.
    9. Pipettera 68 μL Random Primer Mix (RPM) i varje brunn på plattan. Pipettera 75 μL Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) i varje brunn på plattan (utan att ta bort den tidigare lösningen). Använd en ny tätning för att täcka plattan.
      OBS: Var noga med att kombinera brunnarna med plattan och orientera den korrekt.
    10. Virvla den förseglade plattan vid 1 600 rpm i 1 min. Inkubera i hybridiseringsugnen i 20-24 timmar vid 37 °C.
  3. Dag 3: Hybridisering - metyleringsanalys, manuellt protokoll
    1. Förvärm blocket till 37 °C.
    2. Tina innehållet i röret vid rumstemperatur. Invertera försiktigt och försiktigt fragmenteringslösningsrören (FMS) minst 10x för att blanda innehållet noggrant.
    3. Ta försiktigt bort plattan från hybridiseringsugnen. Pulscentrifugera plattan vid 280 x g.
    4. Ta nu bort tätningen från plattan. Tillsätt 50 μL fragmenteringslösning (FMS) i varje brunn på plattan som innehåller ett prov och försegla plattan igen. Virvla plattan vid 1 600 rpm i 1 min.
    5. Centrifugera plattan vid 280 x g i några sekunder (utför pulscentrifugering). Placera sedan den förseglade plattan på värmeblocket vid 37 ° C i 1 timme.
    6. Om det beslutades att pausa experimentet och frysa plattan, tina den vid rumstemperatur och centrifugera den vid 280 x g. Om den inte är frusen hoppar du över det här steget och går till steg 6.3.7.
    7. Låt värmeblocket förvärmas till 37 °C.
    8. Låt tvättbufferten tina vid rumstemperatur. När den tinas, invertera den minst 10x för att blanda innehållet.
    9. Ta bort tätningen från plattan.
    10. Tillsätt 100 μL utfällningslösning (PM1) till varje brunn på plattan som innehåller prover.
    11. Försegla plattan igen med tätningen.
    12. Virvla plattan vid 1 600 rpm i 1 min.
    13. Inkubera vid 37 ° C i 5 min.
    14. Placera sedan i pulscentrifugen vid 280 x g i 1 min.
      OBS: Ställ centrifugen på 4 °C för nästa steg.
    15. Ta försiktigt bort tätningen från plattan och kasta den.
    16. Tillsätt 300 μL 2-propanol (100%) till varje brunn som innehåller provet.
    17. Försegla plattan med stor försiktighet med en ny tätning. Var försiktig så att du inte skakar tallriken.
    18. Invertera plattan minst 10x, blanda hela innehållet.
    19. Inkubera vid 4 °C i 30 min.
    20. Centrifug vid 3 000 x g vid 4 °C i 20 min.
      OBS: I slutet av steg 6.3.20, ta omedelbart bort centrifugplattan.
    21. Ta bort tätningen från plattan och kasta den.
    22. Invertera snabbt plattan och töm vätskan på en kudde för att kasta supernatanten. Slå sedan på plattan i ett torrt område på en pappershandduk för att tömma vätskan.
    23. Knacka fast flera gånger i 1 min eller tills alla brunnar är fria från vätska.
    24. Låt plattan vara inverterad och avtäckt i 1 timme vid rumstemperatur.
      OBS: Det förväntas se blå pellets i botten av brunnarna.
    25. Förvärm hybridiseringsugnen till 48 °C.
    26. Slå på värmeblocket för att förvärma. Tillåt 20 minuter för denna process.
    27. Tina Resuspension, hybridisering och tvättlösning vid rumstemperatur. Invertera minst 10x. Kontrollera att det inte finns något salt utfällt i lösningen.
    28. Tillsätt 46 μL Resuspension, Hybridization och Wash Solution (RA1) till varje brunn på plattan.
      OBS: Eventuella återstående reagenser måste reserveras för färgnings- och hybridiseringsstegen.
    29. Applicera tätningen på plattan. Använd en aluminiumtätning för att täcka plattan. Håll fast för att utföra tätningen jämnt.
    30. Kontrollera om alla brunnar är säkert stängda för att undvika avdunstning.
    31. Placera försiktigt den nyförseglade plattan i hybridiseringsugnen och inkubera vid 48 ° C i 1 timme.
    32. Virvla plattan vid 1 800 rpm i 1 min.
    33. Pulscentrifug vid 280 x g.
    34. Överför plattan till värmeblocket vid 95 °C i 1 timme.
    35. Förbered hybridiseringskamrarna (Hyb) genom att placera dem tillsammans. Fördela 400 μL befuktningsbuffert (PB2) i hybkamrarnas behållare. Sätt på locket omedelbart.
    36. Ladda varje prov från plattan i mikroarrayens provingångsöppning.
    37. Lägg hybkammarens insatser som innehåller mikromatriserna i hybkammaren. Stäng Hyb-kammaren på tvären för att undvika eventuell förskjutning av Hyb-kammaren.
      OBS: Hybkammare måste inkuberas vid 48 ° C i minst 16 timmar, men inte mer än 24 timmar.
  4. Dag 4: Färgning - metyleringsanalys, manuellt protokoll
    1. Återsuspendera färgningslösningen 4 med 330 ml 100% EtOH, vilket ger en slutlig volym på 350 ml. Skaka flaskan Staining Solution 4 kraftigt för att säkerställa fullständig återpension. Förvara vid rumstemperatur.
      OBS: Färgningslösning 4 kan förvaras i upp till 2 veckor vid en temperatur mellan 2 °C och 8 °C.
    2. Ta bort kamrarna från hybridiseringsugnen och låt dem svalna på bänken i 30 minuter innan de öppnas.
    3. Medan Hyb-kammaren kyler, fyll två tvättbehållare med tvättbuffert (200 ml per tvättbehållare). Kom ihåg att märka varje behållare som "Tvättbuffert" (PB1 och PB2).
    4. Fyll tillbehören för microarray-justering med 150 ml tvättbuffert.
    5. Separera plast distanserna och rengör vid behov glaset.
    6. För att tvätta mikroarray-bilderna, fäst trådslingan på gallret och sänk ner dropputrustningen i behållarna med 200 ml tvättbuffert i totalt 10x.
    7. Ta bort alla skär från hybridiseringskammaren och ta bort varje matris från insatserna. Ta bort tätningen.
      OBS: Vidrör inte de exponerade matriserna under borttagningen.
    8. Var försiktig så att du inte spiller något när du tar bort mikroarray-bilderna från hybridiseringskammaren.
    9. Tvätta mikroarrayerna i tvättbufferten (PB1) -lösningen långsamt och lätt och rör dig upp och ner 10x. Flytta till en ny PB1-lösning och utför tvätten genom att långsamt flytta mikroarrayerna 10x upp och ner i lösningen.
    10. Ta bort mikroarray från behållaren och bekräfta frånvaron av rester.
    11. Använd en transparent distans högst upp i varje mikroarray och led distanserna till motsvarande positioner.
      OBS: Var noga med att endast använda de transparenta distanserna, inte de vita.
    12. Placera justeringsstången på justeringstillbehöret.
    13. Placera en glasplatta på toppen av den klara distansen; var noga med att täcka hela mikroarrayen. Fäst sedan metallklämmor på flödeskamrarna. Använd vid behov sax för att trimma ändarna på flödeskammarens distanser.
    14. Tvätta omedelbart hybridiseringskammarens behållare med ddH2O och skrubba med en liten rengöringsborste. Låt inte någon befuktningsbuffert finnas kvar i behållaren.
    15. Gå vidare till nästa steg som ansvarar för förlängnings- och färgningen av mikroarray.
      OBS: Lämna alla flödeskammare horisontellt monterade på laboratoriebänken. Hantera dem bara igen när hela färgningssteget är klart. Värm Resuspension, hybridisering och tvättlösning till en temperatur mellan 20 ° C och 25 ° C. Blanda försiktigt tills ingen kristall ses i lösningen.
    16. Placera reagenserna i ett rack i följd. Om några är frysta, lämna dem vid rumstemperatur och invertera dem sedan minst 10x för att blanda lösningarna.
    17. Fyll vattencirkulationspumpen till lämplig nivå.
    18. Slå på pumpen och ställ in temperaturen på 44 °C.
    19. Ta bort eventuella bubblor som är fästa på kammarstället.
    20. Utför tester på kammarstället med en temperatursond. Alla testade platser måste vara mellan 44 °C ± 0,5 °C.
      OBS: Följande steg måste utföras utan avbrott.
    21. När racket når en temperatur på 44 ° C, placera snabbt varje enhet i flödeskammaren.
      OBS: För följande steg, pipettera alla reagenser i den bakre glasplattan.
    22. Pipett 150 μL resuspension, hybridisering och tvättlösning (RA1). Inkubera sedan i 30 min. Upprepa detta steg totalt 5x.
    23. Pipettera 450 μL färglösning 1 (XC1) och inkubera i 10 min.
    24. Pipettera 450 μL färglösning 2 (XC2) och inkubera i 10 min.
    25. Pipettera 200 μL Two-Color Extension Master Mix (TEM) och inkubera i 15 min.
    26. Pipettera 450 μL med 95 % formamid/1 mM EDTA och inkubera i 1 min.
    27. Inkubera i 5 min.
    28. Sänk temperaturen på kammarstället till 32 °C (anges på Superior Two-Color Master Mix).
    29. Pipettera 450 μL Stain Solution 3 (XC3) och inkubera i 1 min.
    30. Vänta tills racket i kammaren når rätt temperatur.
      OBS: För att läsa microarray-bilden omedelbart efter färgprocessen, slå på skannern i detta skede.
    31. Dispensera nu 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM), följt av en 10 minuters inkubation.
    32. Fördela sedan 450 μL fläcklösning 3 (XC3), följt av 1 min inkubation. Upprepa 1x.
    33. Vänta i 5 minuter och tillsätt sedan 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) och inkubera i 10 min.
    34. Dispensera nu 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM), följt av en 10 minuters inkubation.
    35. Fördela sedan 450 μL fläcklösning 3 (XC3), följt av 1 min inkubation. Upprepa 1x.
    36. Vänta i 5 min.
    37. Tillsätt 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) och inkubera i 10 min.
    38. Tillsätt 450 μL Stain Microarray Solution 3 (XC3) och inkubera i 1 min och upprepa sedan igen.
    39. Vänta i 5 min.
      OBS: Gör följande repetitionsschema: Steg 6.4.34., Steg 6.4.35. och steg 6.4.36.; Steg 6.4.37. Steg 6.4.34., Steg 6.4.35. och Steg 6.4.36.
    40. Ta nu omedelbart bort flödeskamrarna från racket och placera dem försiktigt horisontellt på laboratoriebänken. Se till att temperaturen är ambient.
    41. 6.4.41.Placera 310 ml tvättlösning (PB1) för varje mikroarray i en tvättbehållare.
    42. Ta bort metallklämmorna och glaset, och slutligen mikroarrayen.
    43. Placera mikroarrayerna på ett färgställ och placera dem i tvättbehållaren som innehåller 10x PB1-lösning. Se till att streckkoderna är vända bort från den som hanterar dem och att alla mikroarrayer är nedsänkta.
    44. Rör dig långsamt och lätt med upp och ner rörelser 10x. Mikroarrayen ska avlägsnas helt från lösningen innan den sänks ner igen. Låt den sedan förbli nedsänkt i 5 minuter.
    45. Skaka kraftigt stain solution 4 (XC4) -reagenset för att säkerställa total återpension. Placera 310 ml XC4 i en tvättbehållare.
      OBS: Låt inte lösningen sitta i tvättbehållaren i mer än 10 minuter.
    46. Flytta färgstativet lätt till den andra behållaren med XC4.
    47. Rör dig långsamt och lätt med upp och ner rörelser 10x. Se till att mikroarrayen tas bort helt från lösningen innan den sänks ner igen.
    48. Låt sedan mikroarray förbli nedsänkt i 5 minuter.
    49. Flytta färgningsstället ur lösningen och placera det i en rörhållare med streckkoderna uppåt.
    50. Ta försiktigt bort mikroarrayen med låstång och placera dem på en hylla för att torka.
    51. Torka dem med vakuumtorkatorn i 50-55 min vid 675 mm Hg (0,9 bar).
    52. Rengör baksidan av varje mikroarray med EtOH.
      VARNING: Undvik att röra ränderna och låt inte EtOH droppa på ränderna på något sätt.
    53. Fortsätt att avbilda mikroarrayen.
    54. Förvara försiktigt mikroarrayen i en förvaringslåda vid rumstemperatur.
      OBS: Microarray-bilder måste tas inom 72 timmar.

7. Bioinformatik analys

OBS: Det är nödvändigt att ändra vissa attribut av typen av mikroarray (t.ex. arraytype = "450k" bör ersättas med arraytype = "EPIC"). Författaren till ChAMP-pipelinen beskriver i detalj alla fält som bör ändras för att analysera matriser på bioledarsidan i paketet30.

  1. Exempel på ark
    1. Överför IDAT-filerna till datorn för att fortsätta med bioinformatikanalys31. Skapa ett exempelblad för att utföra dataanalysen31.
      Obs!: Tre kolumner är viktiga för den här kalkylarksfilen. Den första är Sample_name. Den här kolumnen måste innehålla de namn eller koder som används för att identifiera exemplen. Den andra är Sentrix_position. Denna kolumn placerar motsvarande R01C01 av proverna, där R01 är ansvarig för chipraden och kolonnen kallas C01. Den tredje väsentliga kolumnen är Sentrix_ID, och den är ansvarig för att ta emot numret som identifierar mikroarrayen. Se till att sätta rätt nummer. Det är möjligt att lägga till annan information på provbladet som variabelvärden. I det aktuella experimentet inkluderades data från metallanalysen.
  2. ChAMP-rörledning
    1. Installera RStudio (V.4.0.2) på datorn för att utföra analysen30.
      OBS: Se till att datorn har minst 8 G RAM. Dataanalys kommer att kämpa eller krascha med en lägre mängd RAM.
    2. Efter installationen öppnar du RStudio och installerar ChAMP Bioconductor-paketet30 med respektive kommandorad (se Kompletterande material 1).
      OBS: Om det finns något fel i slutet av installationen, installera de nödvändiga ChAMP-biblioteken manuellt, en efter en26.
    3. Importera nu rådata och utför analysen. Se kompletterande material 1.
      champ.load () importerar rådata och gör filtreringsprocessen, exklusive sonder med låg detektionspval, multihit-platser, icke-CG-sonder, CpG-platser nära SNP och CpG som finns i sexuella kromosomer.
      champ.impute() utför KNN-imputation som standard.
      Champ. QC hämtar datakvalitetsdiagram (t.ex. densitetsdiagram).
      Champ. SVD utvärderar batcheffekter baserat på angivna metadata i exempelbladet.
      champ.refbase() utför celltypsuppskattning och korrigering.
      Champ. DMP( ) hämtar differentiellt metylerade positioner och egenskapsassociationer såsom fettmassa för att kontrollera DNA-metyleringen mellan grupper och ändra parametrarna, som visas i kompletterande material 1.
  3. Berikning (sträng DB)
    OBS: Funktionell anrikning används för att härleda de biologiska funktionerna hos en uppsättning gener.
    1. Om du vill utöka data i en sträng väljer du listan över mål som ska berikas och användas som indata från: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. För organism, välj homo sapiens och tryck på sökknappen.
    3. För att navigera genom berikningen, klicka på knappen Analys.
  4. GEO-inlämning
    1. Deponera data på en offentlig lagringsplats som NCBI:s GEO. För detta, registrera dig för inlämningskontot.
      OBS: Slutför GEO-inlämningen (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) genom att ladda ner metadatabladet med beskrivande information och protokoll för det övergripande experimentet och enskilda prover. GEO-arkivinlämningar kan skapas i vilket kalkylprogram som helst. För det andra lägger du till rådatafilen som genereras från cell-ranger count-skriptet för alla bibliotek i katalogen. IDAT och associerade filer eller ett matriskalkylblad innehåller icke-normaliserade data. Den tredje mappen är de bearbetade datafilerna. Matristabellen är ett kalkylblad som innehåller de slutliga, normaliserade värdena jämförbara mellan rader och prover och helst bearbetade enligt beskrivningen i ett medföljande manuskript.
    2. Placera bearbetade datafiler som genereras från cell-ranger count-skriptet för alla bibliotek i katalogen. Använd GEO-avsändarens FTP-serverautentiseringsuppgifter för att överföra katalogen som innehåller alla tre komponenterna.

Representative Results

Efter att ha använt ChAMP-rörledningen beaktades 409 887 sonder i analysen efter alla filter (okvalificerade CpGs, icke-CG-sonder, CpG nära SNP, multihit-platser och CpGs relaterade till XY); ett schema representeras i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Pipeline av bioinformatikanalysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Dessutom avslöjade densitetsdiagrammet att alla prover hade liknande densiteter i betafördelningen relaterade till kvalitetskontrollstegen. Denna analys utvärderar fördelningen av betavärden och påpekar om det finns några prover som behöver uteslutas. I denna sats uteslöts inga prover baserat på denna analys.

Figure 3
Figur 3: Beta-värden densitetsdiagram erhållet med ChAMP-paketet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Analysen av singular value decomposition (SVD) användes för att verifiera de huvudkomponenter som signifikant påverkade DNA-metyleringsdatavariabiliteten. Uppgifterna visade att BMI, WC (p < 1e10-5) och FM (p < 0,05) hade en signifikant effekt på datavariabiliteten (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Analys av singularvärdesnedbrytning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Celltypsuppskattning avslöjade att både naturliga mördarceller (NK) och B-celler var högre hos överviktiga kvinnor (Figur 5).

Figure 5
Figur 5: Cellfraktioner uppskattade med Housemans metod. Gran: granulocyt. CD4T: hjälpare T-cell, lymfocyt. CD8T: cytotoxisk T-cell, lymfocyt. Mono: monocyt. B-cell: B-lymfocyt. NK: naturliga mördarceller, lymfocyter. *p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.

DNA-metyleringsnivåerna mellan överviktiga och icke-överviktiga kvinnor skilde sig före och efter celltypskorrigering. Före korrigering av DNA-metyleringsdata för celltyper observerades 43 463 differentiellt metylerade positioner (DMP) och 3 329 CpG förblev signifikanta efter. 445 CpG-platser var i intergena regioner (IGR) och 2 884 var igena regioner, med de flesta i promotorregionen (n = 1 438). Fördelningen längs alla regioner var TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), första exon (n = 273), kropp (n = 724) och 3'UTR (n = 59). Med tanke på Δβ-värden <-0,05 och >0,05 hypometylerades 162 CpG och 576 hypermetylerades hos överviktiga jämfört med icke-överviktiga individer (Figur 6). Uppgifterna finns tillgängliga i GEO-databasen under registerkoden GSE166611.

Figure 6
Figur 6: Differentiellt metylerade positioner. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Det är möjligt att utvärdera de olika metyleringarna mellan grupper och hitta CpG-platser associerade med specifika egenskaper i metyleringsstudier. För fettmassstudier hittades 13 222 CpG-platser. 6 159 CpG i promotorregionen var relaterade till fettmassa, med 470 hypermetylerade och 94 hypometylerade (figur 7), och respektive gener berikades (tabell 2).

Figure 7
Figur 7: Promotorregioner av hypometylerade och hypermetylerade gener, oberoende relaterade till fettmassa. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 2: Funktionell anrikning av generna från de differentiellt metylerade CpG-platserna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande material 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

DNA-metyleringsmatriser är de mest använda metoderna för att få tillgång till DNA-metylering på grund av deras kostnads-nyttoförhållande14. Den föreliggande studien beskrev ett detaljerat protokoll med hjälp av en kommersiellt tillgänglig mikroarrayplattform för att utvärdera DNA-metylering i en pilotstudie utförd i en brasiliansk kohort. De erhållna resultaten från pilotstudien bekräftade protokollets effektivitet. Figur 3 visar provets jämförbarhet och den fullständiga bisulfitomvandlingen32.

Som ett kvalitetskontrollsteg rekommenderade ChAMP-algoritmen uteslutning av CpGs-webbplatser under filtreringsprocessen. Syftet med att utesluta sonder är att förbättra dataanalysen och eliminera bias. CpG:er av låg kvalitet (p-värden lägre än 0,05) togs bort för att eliminera experimentellt brus i datauppsättningen. Målen förblev godkända i densitetsdiagramanalysen. Zhou33 beskrev vikten av att filtrera CpGs nära SNP för att undvika missmatchningar, feltolkning av polymorfa cytosiners metylering och orsaka switchfärg av typ I-sonddesign34. Eftersom XY-kromosomer påverkas differentiellt av imprinting, förstärkte Heiss och Just35 vikten av att filtrera dessa sonder eftersom problemen med hybridisering hos kvinnor kan vara förvirrande faktorer35.

DMAP: s utgångsdatum, formamidens öppningsdatum, den analytiska kvaliteten hos den absoluta etanolen och det totala leukocytantalet anses vara kritiska steg i protokollet.

Enligt våra observationer är dessutom celltypsuppskattningen avgörande för att utföra bioinformatikanalysen. Houseman-metoden utför celltypsuppskattningen som beskrivs i Tians studie30. Denna metod är baserad på 473 specifika CpG-platser som kan förutsäga procentandelarna av de viktigaste celltyperna, såsom granulocyter, monocyter, B-celler och T-celler36. Vi använde den rekommenderade funktionen "myRefbase" från ChAMP-paketet. Efter uppskattningen justerar ChAMP-algoritmen betavärdena och eliminerar denna bias från datauppsättningen. Detta steg är avgörande i studier som fokuserar på fetma eftersom denna befolkning har en betydande skillnad i vita blodkroppar på grund av deras kroniska inflammatoriska tillstånd.

Vi ändrade bara den ursprungliga lockkartan för den vanliga PCR-tätningen angående metodmodifiering och felsökning. Efter varje centrifugeringsprocess byttes tätningen mot en ny. Vi kunde inte använda standard värmetätning och anpassade den med aluminiumfolie runt plattan.

Även om kommersiella analyser har ansetts vara en guldstandard för epigenetiska studier, kan en begränsning av protokollet vara specificiteten hos reagenserna och utrustningen från ett unikt varumärke37,38,39,40. En annan begränsning är bristen på indikatorer som gör det möjligt att identifiera experimentets korrekta framsteg41.

Standardiseringen av detta protokoll utgör en bra guide för epigenetisk forskning, vilket minskar mänskliga fel under processen och möjliggör framgångsrik dataanalys och jämförbarhet mellan olika studier.

Enligt våra resultat är DNA-metyleringsexperiment lämpliga för studier som jämför individer med och utan fetma43. Den föreslagna bioinformatikanalysen gav också högkvalitativa data och kunde övervägas i storskaliga studier.

Med hjälp av SVD-analysen identifierade vi att de fetma-relaterade egenskaperna (BMI, WC och FM) påverkade variationen i DNA-metyleringsdata. Som ett signifikant resultat indikerar celltypsuppskattningen att både naturliga mördarceller (NK) och B-celler var högre hos kvinnor med fetma än hos kvinnor utan fetma (Figur 5). Det högre antalet av dessa celler kan förklaras av dessa individers låggradiga inflammatoriska tillstånd44. Vi observerade att patienter med fetma har hypo- och hypermetylerade CpGs i promotorregioner av gener associerade med fettmassa. De flesta av platserna var hypometylerade, vilket kan relateras till den naturliga ökningen av reaktiva syrearter (ROS) nivåer hos dessa individer. Detta oxidativa stresstillstånd kan främja guaninstörning vid dinukleotidstället, bilda 8-hydroxi-2'-deoxiguanosin (8-OHdG), vilket resulterar i en 5mCp-8-OHdG dinukleotidplats och orsakar rekrytering av TET-enzymer. Alla dessa händelser kan vara ansvariga för att främja DNA-hypometylering och hypermetylering genom olika verkningsmekanismer45.

Dessutom verkar graden av adipogenes öka hos individer med fetma, med cirka 10% av nya celler till gamla celler46,47. Epigenetiska bidrag, med betoning på den obesogena miljön, kan förändra cellernas proliferations- och differentieringshastigheter, vilket gynnar utvecklingen av fettmassa48. Epigenetiska förändringar kan också påverka adipogena program, underlätta eller begränsa deras utveckling. Primära transkriptionsfaktorer (PPARγ eller C / EBPα) eller sammansättningen av multiproteinkomplex, placerade i nedströms promotorregioner som drivs av att inkludera eller utesluta epigenetiska modifierande enzymer, reglerar genuttryck genom hyper- eller hypometylering45. PPARγ-vägen har tidigare beskrivits för att förändra WNT-vägen, som hade gener berikade i denna studie. Även om det fortfarande är okänt hur WNT-signalering sker under adipogenesen har nya studier rapporterat att det kan ha viktiga roller i adiptocytmetabolismen, särskilt under obesogena förhållanden49.

Disclosures

Författarna till denna artikel har inga intressekonflikter och har ingen finansiell information att deklarera.

Acknowledgments

Vi vill tacka Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) för att vara tillgänglig för att svara på alla tvivel om ChAMP-paketet. Vi tackar också Guilherme Telles, Msc. för hans bidrag både till de tekniska och vetenskapliga frågorna från denna uppsats; han gjorde viktiga överväganden angående epigenetik och videoinspelnings- och formateringstekniker (guilherme.telles@usp.br). Finansiering av förbrukningsvaror: São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2018/24069-3) och National Council for Scientific and Technological Development (CNPq: #408292/2018-0). Personlig finansiering: (FAPESP: # 2014/16740-6) och Academic Excellence Program från Coordination for Higher Education Staff Development (CAPES: 88882.180020/2018-01). Uppgifterna kommer att offentliggöras och fritt tillgängliga utan begränsningar. Adresskorrespondens till NYN (e-post: nataliayumi@usp.br) eller CBN (e-post: carla@fmrp.usp.br).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol J.T. Baker B5924-03
Agarose gel Kasvi K9-9100
Electric bioimpedance Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Corning 46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit ZymoResearch, Irvine, CA, USA D5001
Formamide Sigma F9037
FMS—Fragmentation solution Illumina 11203428 Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip Illumina
Maxwell Instrument Promega, Brazil AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix Illumina 11202880 Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix Illumina 11203410 Supplied Reagents
NaOH F. MAIA 114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization Illumina 11291245 Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization Illumina 11191130 Supplied Reagents
2-propanol Emsure 10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution Illumina 11292441 Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix Illumina 15010230 Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix Illumina 11288046 Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix Illumina 11208309 Supplied Reagents
Ultrapure EDTA Invitrogen 155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) ByoSystems 4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) Thermo Fisher Scientific AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1 Illumina 11208288 Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2 Illumina 11208296 Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3 Illumina 11208392 Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4 Illumina 11208430 Supplied Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
  2. World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
  3. Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
  4. Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
  5. Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  6. Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
  7. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
  8. Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  9. Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
  10. Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
  11. Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
  12. Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
  13. Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
  14. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
  15. Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
  16. Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
  17. Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
  18. Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
  19. Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
  20. Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
  21. Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
  22. Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
  23. Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
  24. Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
  25. Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
  26. Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
  27. Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
  28. Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
  29. Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
  30. Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
  31. Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
  32. Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
  33. Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
  34. Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
  35. Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
  36. Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
  37. Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
  38. Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
  39. Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
  40. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  41. Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
  42. Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
  43. Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
  44. DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
  45. Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
  46. Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
  47. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
  48. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
  49. Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).

Tags

Genetik utgåva 183 DNA-metylering fetma ChAMP bioinformatik epigenetik fettmassa kroppsmassindex
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues,… More

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J. B., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter