Summary
本研究描述了管理通过微阵列技术获得的DNA甲基化数据的工作流程。该协议演示了从样品制备到数据分析的步骤。详细描述了所有程序，视频显示了重要的步骤。
Abstract
肥胖与生活方式直接相关，并且与DNA甲基化变化有关，这些变化可能导致脂肪生成和脂质储存过程的改变，从而导致疾病的发展。我们展示了从选择到有或没有肥胖患者的表观遗传学数据分析的完整方案。该协议的所有步骤都在试点研究中进行了测试和验证。32名妇女参加了这项研究，其中15人根据体重指数（BMI）被归类为肥胖（45.1±5.4公斤/平方米）;根据BMI（22.6±1.8 kg / m2）对17个没有肥胖的个体进行分类。在肥胖组中，通过线性回归分析鉴定了564个与脂肪量相关的CpG位点。CpG站点位于发起方区域。差异分析发现，肥胖个体中有470个CpGs低甲基化位点和94个高甲基化位点。RUNX中最低甲基化的富集途径是 RUNX， WNT 信号传导和对缺氧的反应。高甲基化途径与胰岛素分泌、胰高血糖素信号传导和Ca2+有关。我们得出结论，该协议有效地鉴定了DNA甲基化模式和与性状相关的DNA甲基化。这些模式可能与基因表达的改变有关，影响脂肪生成和脂质储存。我们的研究结果证实，致肥胖的生活方式可以促进人类DNA的表观遗传变化。
Introduction
大规模组学技术越来越多地用于慢性病研究。这些方法的一个有趣的特点是向科学界提供大量生成的数据。因此，出现了标准化方案的需求，以便对研究进行技术比较。本研究建议使用试点研究作为应用示例，对获取和分析DNA甲基化数据的方案进行标准化。
负能量消耗在现代人类生活方式中占主导地位，导致脂肪组织过度积累，从而导致肥胖的发展¹。许多因素增加了肥胖率，例如久坐不动，高热量饮食和紧张的日常工作。世界卫生组织（WHO）估计，2016年有19亿成年人肥胖，这意味着超过20%的世界人口BMI2超过30公斤/平方米。2018 年的最新更新显示，美国（USA）的肥胖患病率高于 42%3。
表观遗传学是染色体区域的结构适应性，以记录，信号或延续改变的活性状态4。DNA甲基化是胞嘧啶-鸟苷二核苷酸位点（CpG位点）的可逆化学改变，形成5-甲基胞嘧啶-pG（5mCpG）。它可以通过调节转录机制对DNA的访问来调节基因表达5，6，7，8。在这种情况下，了解哪些CpG位点与肥胖相关特征相关是至关重要的9。许多因素可以支持或阻止位点特异性DNA甲基化。该过程所需的酶，如DNA甲基转移酶10 （DNTMs）和10-11转位（TETs），可以在环境暴露下促进DNA甲基化或去甲基化11。
考虑到过去几年对DNA甲基化研究的兴趣日益浓厚，选择最合适的分析策略来精确回答每个问题一直是研究人员的基本关注点12，13，14。450K DNA甲基化阵列是最受欢迎的方法，在360多篇出版物中使用14来确定DNA甲基化谱。它可以确定位于99%已知基因中的多达485，000个CpG的甲基化15。但是，该阵列已停产，取而代之的是 EPIC，覆盖 850，000 个 CpG 站点。目前的协议可以同时适用于450K和EPIC16，17，18。
该方案在 图1 中逐步呈现，包括以下步骤：群体选择，采样，实验制备，DNA甲基化管道和生物信息学分析。这里演示了在我们实验室进行的试点研究，以说明拟议方案的步骤。
图 1：所介绍协议的示意图。请单击此处查看此图的放大版本。
Protocol
圣保罗大学里贝朗普雷图医学院大学医院（HCRP-USP）的伦理委员会批准了这项研究（CAAE：14275319.7.0000.5440）。与会者签署了同意书，所有程序均按照《赫尔辛基宣言》进行。
1. 人口和抽样
- 招募BMI>30 kg / m2的参与者进行研究。在本研究中，招募了来自混合人群的32名女性19，年龄在18至60岁之间。
注意：在HCRP-USP中，主要在女性中观察到较高的肥胖率20。肥胖的参与者，BMI≥30 kg / m2 （n = 15），从HCRP-USP的代谢疾病门诊诊所招募。没有肥胖的参与者，BMI在18.5 kg / m2 和24.9 kg / m2 （n = 17）之间，是从其他诊所招募的，没有严重的疾病;临床数据如 表1所示。 - 排除孕妇、哺乳期母亲、吸烟者和饮酒者。
2. 人体测量学和身体成分
- 使用200公斤数字人体测量秤测量参与者的体重。确保脱掉鞋子和多余的衣服。
- 使用刻度为 0.5 cm 的测距仪评估高度。参与者被指示赤脚站立，双脚并拢，双臂交叉21。
- 使用电动生物阻抗收集脂肪量（FM）信息。禁食 12 小时后，用膀胱空置进行评估。将参与者置于仰卧位，双腿分开，手臂平行，不接触身体。指示参与者取下所有金属配件22。
- 使用具有0.1 mm刻度的不可伸缩的卷尺获得腰围（WC）。胶带水平放置在中腰周围，就在髋骨上方。测量发生在呼气后。根据疾病控制和预防中心（CDC）的数据，女性的WC截止值为88 cm23。
表1：人口特征。 所有变量都是参数化的（p >0.05，Shapiro Wilk），并使用独立t检验评估差异，其中p<0.05被认为是显着的。*p < 0.0001。 请点击此处下载此表格。
3. 生物材料的收集
- 禁食 12 小时后采集外周血，如前所述24。
- 将 4 mL 全血样本收集在装有抗凝剂（例如 EDTA）的收集管中，并将其储存在冰上以进行运输。
4. 基因提取
- 将含有血液的每管以2，000× g 离心10分钟。收集约300μL的浅黄色外套（白色间相）。
- 如前所述，使用市售仪器从外周血中提取DNA（见 材料表）25。在480μL超纯H 2 O中洗脱DNA。
- 使用荧光计评估DNA浓度和质量。使用1%琼脂糖凝胶分析评估完整性25。储存在-80°C的冰箱中。
5. 甲基化分析前的制备
- 确保样品具有最低的DNA浓度（500 ng是开始的理想初始输入），但在此步骤中，稀释度可能因样品而异。
- 微阵列试剂盒26 中不包含某些试剂，因此请单独购买27。
- 检查试剂盒是否包含手术过程中使用的所有试剂;它们是不可替代的。检查所有试剂的有效期。确保试剂盒中未提供的其他试剂和溶液也可用（95%甲酰胺/ 1 mM EDTA，0.1 N NaOH，无水乙醇，2-丙醇）。
注意：甲酰胺是一种挥发性试剂。如果产品是新鲜的，结果的质量可以提高。甲酰胺和无水乙醇的完整性和质量被认为是至关重要的，因为它们会影响制造商提出的染色工艺。所选醇必须是分子生物学分析专用的超纯产品。 - 获取微阵列套件后，下载芯片解码图谱（DMAP）。这些文件在套件发货后 24-48 小时内可在制造商网站上找到，并在到期日期排除28。要下载上述文件，请执行以下步骤。
- 确保有可上网的电脑可用。使用软件解码文件客户端执行下载。
- 在安装程序之前，请确保计算机具有机构授予的出站和入站访问权限;解码文件客户端没有安全限制。
- 使用“通过 BeadChip 访问”选项登录到解码文件客户端软件。此登录是使用MyIllumina用户ID和密码执行的。此页面上需要注册28。
- 登录到解码文件客户端后，在软件主页的相应字段中输入下面列出的信息28：条形码列表;方框编号列表;采购订单号 （PO）;和销售订单号（请记住不要包含数字后面的字母）。
- 根据购买框中的条形码编号选择要下载的 DMAP，并在对话框中指定目的地以保存 DMAP。
- 单击该按钮开始下载。
注意：在下载结束时，请确保下载的文件夹不为空并安全地存储文件，因为在最后一步中，将实验转换为强度数据文件（IDAT 文件），这是必需的。到期日后，Illumina可能会从其在线数据库中删除DMAP数据。
6. DNA甲基化管道
注意：DNA甲基化实验分为4天（图1）。遵循制造商的建议和规格以获得准确的结果。
- 第1天：亚硫酸氢盐治疗
- 首先使500 ng的基因组DNA变性，然后加入转化试剂。要执行此步骤，请遵循亚硫酸氢盐和微阵列试剂盒的建议29。
- 用130μL亚硫酸氢盐转化试剂以制造商提供的标准浓度处理变性DNA。
- 将管子在热循环器中孵育16个循环，在95°C下孵育30秒，50°C孵育1小时。将热循环器升压至4°C10分钟。
- 通过加入100μL洗涤缓冲液，然后全速离心30s来执行洗涤步骤。用户指南中未提供浓度，制造商对体积进行了标准化。
注意：该试剂盒随附，无需稀释或制备。
- 第2天：扩增 - 甲基化测定，手动实验方案
- 将杂交炉预热至37°C，让温度平衡。
- 将条形码标签贴在0.8 mL微孔板上。
- 在室温下解冻扩增试剂（多样品扩增混合物1，随机引物混合物和多样品放大器预混液）（这些试剂随试剂盒一起提供，不需要稀释或制备）。然后，进行至少10次的轻柔反转，直到管子的全部内容物混合。
- 将20μL多样品扩增混合物1（MA1）分配到板的孔中。
- 将4μLDNA样品从亚硫酸氢盐转化板转移到0.8mL板上的相应孔中。此时，将原始DNA样品的ID记录在与板孔对应的实验室跟踪表上。
- 将4μL0.1 N NaOH分配到含有多样品扩增混合物1（MA1）和DNA样品的板的每个孔中。
- 用塑料密封密封板。
- 涡旋板，将试剂与样品以1，600rpm混合1分钟。在室温下孵育10分钟，并小心取下密封。
- 将68μL随机底漆混合物（RPM）移入板的每个孔中。将75μL多样品放大器预混液（MSM）移入板的每个孔中（不去除先前的溶液）。使用新的密封件覆盖板。
注意：注意将孔与板结合并正确定位。 - 以1，600 rpm的速度涡旋密封板1分钟。在37°C的杂交炉中孵育20-24小时。
- 第3天：杂交 - 甲基化测定，手动实验方案
- 将块预热至37°C。
- 在室温下解冻管内的内容物。小心地轻轻地将碎片溶液（FMS）管倒置至少10倍，以彻底混合内容物。
- 小心地从杂交炉中取出板。脉冲离心板，浓度为280× g。
- 现在从板上取下密封件。在含有样品的板的每个孔中，加入50μL片段化溶液（FMS）并再次密封板。以1，600 rpm的速度涡旋板1分钟。
- 将板以280× g 离心几秒钟（进行脉冲离心）。然后，将密封板放在37°C的加热块上1小时。
- 如果决定暂停实验并冷冻板，请在室温下解冻，然后以280× g离心。如果未冻结，请跳过此步骤并转到步骤 6.3.7。
- 离开加热块预热至37°C。
- 将洗涤缓冲液在室温下解冻。解冻时，将其倒置至少10倍以混合内容物。
- 从板上取下密封件。
- 向含有样品的板的每个孔中加入100μL沉淀溶液（PM1）。
- 用密封件再次密封板。
- 以1，600 rpm的速度涡旋板1分钟。
- 在37°C孵育5分钟。
- 然后，放入脉冲离心机中以280× g 离心1分钟。
注意：将离心机设置为4°C以进行下一步。 - 小心地从板上取下密封件并丢弃。
- 向含有样品的每个孔中加入300μL2-丙醇（100%）。
- 使用新的密封件极其小心地密封板。注意不要摇晃盘子。
- 将板倒置至少10倍，混合整个内容物。
- 在4°C孵育30分钟。
- 在4°C下以3，000× g 离心20分钟。
注意：在步骤6.3.20结束时，立即取出离心机板。 - 从板上取下密封件并丢弃。
- 快速倒置板并将垫上的液体排出以丢弃上清液。然后，在纸巾上将盘子打在干燥的地方以排出液体。
- 用力敲击几次，持续1分钟，或直到所有孔都不含任何液体。
- 将板倒置并在室温下揭开1小时。
注意：预计在井的底部会看到蓝色颗粒。 - 将杂交炉预热至48°C。
- 打开加热块进行预热。此过程需要 20 分钟。
- 在室温下解冻重悬，杂交和洗涤溶液。反转至少 10 倍。检查溶液中是否没有盐沉淀。
- 向板的每个孔中加入46μL重悬，杂交和洗涤溶液（RA1）。
注意：任何剩余的试剂必须保留用于染色和杂交步骤。 - 将密封件涂在板上。使用铝制密封件盖住板材。紧紧握住以均匀地进行密封。
- 检查所有孔是否安全关闭以避免蒸发。
- 小心地将新密封的板放入杂交炉中，并在48°C下孵育1小时。
- 以1，800 rpm的速度涡旋板1分钟。
- 脉冲离心机，280 x g。
- 将板转移到95°C的加热块1小时。
- 通过将杂交（Hyb）腔室放在一起来准备它们。将400μL加湿缓冲液（PB2）分配到Hyb室的储液槽中。立即盖上盖子。
- 将每个样品从板中加载到微阵列的样品入口开口中。
- 将含有微阵列的 Hyb 室插入物加载到 Hyb 室中。横向关闭 Hyb 室，以避免可能移动 Hyb 室。
注意：Hyb室需要在48°C下孵育至少16小时，但不超过24小时。
- 第4天：染色 - 甲基化测定，手动实验方案
- 将染色溶液4与330 mL的100%EtOH重悬，获得350 mL的最终体积。用力摇晃染色液4瓶，以确保完全重悬。保持在室温下。
注意：染色液4可以在2°C至8°C的温度下储存长达2周。 - 从杂交炉中取出腔室，让它们在工作台上冷却30分钟，然后打开。
- 在 Hyb 室冷却时，用洗涤缓冲液填充两个洗涤容器（每个洗涤容器 200 mL）。请记住将每个容器标记为“洗涤缓冲液”（PB1和PB2）。
- 将微阵列对齐附件填充 150 mL 洗涤缓冲液。
- 分离塑料垫片，如有必要，清洁玻璃。
- 要清洗微阵列载玻片，请将导线环连接到网格上，并将滴水设备浸入装有200 mL洗涤缓冲液的容器中，共10次。
- 从杂交室中取出所有插入物，并从插入物中取出每个阵列。取下密封。
注意：在移除过程中，请勿触摸暴露的基质。 - 从杂交室中取出微阵列载玻片时，请注意不要溢出任何东西。
- 缓慢而轻柔地洗涤洗涤缓冲液（PB1）溶液中的微阵列，上下移动10倍。移动到新鲜的PB1溶液中，并通过在溶液中缓慢地上下移动微阵列10倍来进行洗涤。
- 从容器中取出微阵列并确认没有残留物。
- 在每个微阵列的顶部使用透明垫片，并将垫片引导到相应的位置。
注意：请注意仅使用透明垫片，不要使用白色垫片。 - 将对齐条放在对齐附件上。
- 将玻璃背板放在透明垫片的顶部;小心覆盖整个微阵列。然后，将金属夹具连接到流室。如有必要，使用剪刀修剪流室垫片的末端。
- 立即使用ddH 2 O清洗杂交室储液槽，并用小清洁刷擦洗。不要让任何加湿缓冲液留在储液槽中。
- 转到负责延伸和染色微阵列的下一步。
注：将所有流动室水平安装在实验室工作台上。仅当整个染色步骤准备就绪时，才重新处理它们。将重悬，杂交和洗涤溶液加热至20°C至25°C之间的温度。 轻轻混合，直到在溶液中看不到晶体。 - 按顺序将试剂放入架中。如果有任何冷冻，请将它们留在室温下，然后将它们倒置至少10倍以混合溶液。
- 将水循环器加注到适当的水平。
- 打开泵并将温度设置为44°C。
- 取出附着在腔室机架上的所有气泡。
- 使用温度探头在腔室机架上进行测试。所有测试位置必须在 44 °C ± 0.5 °C 之间。
注意：必须不间断地执行以下步骤。 - 当机架温度达到44°C时，迅速将每个组件放入流动室中。
注：对于以下步骤，请将所有试剂移入背面玻璃板上。 - 移液器150μL重悬，杂交和洗涤溶液（RA1）。然后，孵育30分钟。重复此步骤总共 5 次。
- 移取450μL染色溶液1（XC1）并孵育10分钟。
- 移取450μL染色溶液2（XC2）并孵育10分钟。
- 移取200μL双色延伸预混液（TEM）并孵育15分钟。
- 移取450μL95%甲酰胺/ 1mM EDTA，孵育1分钟。
- 孵育5分钟。
- 将腔室机架的温度降低至32°C（在高级双色预混液上表示）。
- 移取450μL染色液3（XC3）并孵育1分钟。
- 等待腔室中的机架达到正确的温度。
注：要在着色过程后立即读取微阵列图像，请在此阶段打开扫描仪。 - 现在分配250μL高级双色预混液（STM），然后孵育10分钟。
- 然后，分配450μL染色液3（XC3），然后孵育1分钟。重复1次。
- 等待5分钟，然后加入250μL防污2色预混液（ATM）并孵育10分钟。
- 现在分配250μL高级双色预混液（STM），然后孵育10分钟。
- 然后，分配450μL染色液3（XC3），然后孵育1分钟。重复1次。
- 等待5分钟。
- 加入250μL防污2色预混液（ATM）并孵育10分钟。
- 加入450μL染色微阵列溶液3（XC3）并孵育1分钟，然后再次重复。
- 等待5分钟。
注意：执行以下重复方案：步骤 6.4.34、步骤 6.4.35。和步骤 6.4.36;步骤6.4.37.、6.4.38和步骤6.4.39;步骤 6.4.34、步骤 6.4.35 和步骤 6.4.36。 - 现在，立即从机架上取动室，并小心地将它们水平放置在实验室工作台上。确保温度为环境温度。
- 6.4.41.将每个微阵列的310 mL洗涤溶液（PB1）放入洗涤容器中。
- 取下金属夹和玻璃，最后取下微阵列。
- 将微阵列放在染色架上，并将它们放在含有10x PB1溶液的洗涤容器中。确保条形码正对着处理它们的人，并且所有微阵列都被淹没。
- 缓慢而轻柔地移动，上下移动10倍。在再次浸没之前，应将微阵列从溶液中完全除去。然后，让它保持浸没5分钟。
- 用力摇动染色液4（XC4）试剂，以确保完全重悬。将 310 mL XC4 放入洗涤容器中。
注意：不要让溶液在洗涤容器中放置超过10分钟。 - 用XC4将染色架轻轻移至另一个容器。
- 缓慢而轻柔地移动，上下移动10倍。确保在再次浸没之前将微阵列从溶液中完全除去。
- 然后，让微阵列保持浸没5分钟。
- 将染色支架从溶液中移出，并将其放在管架中，条形码朝上。
- 使用锁定镊子小心地取出微阵列，并将其放在架子上晾干。
- 使用真空干燥器在675毫米汞柱（0.9巴）下干燥50-55分钟。
- 使用 EtOH 清洁每个微阵列的背面。
注意：避免触摸条纹，不要让EtOH以任何方式滴落在条纹上。 - 继续对微阵列进行成像。
- 小心地将微阵列储存在室温下的储物盒中。
注意：微阵列图像必须在72小时内拍摄。
- 将染色溶液4与330 mL的100%EtOH重悬，获得350 mL的最终体积。用力摇晃染色液4瓶，以确保完全重悬。保持在室温下。
7. 生物信息学分析
注意：有必要更改微阵列类型的某些属性（例如，arraytype = “450k”应替换为 arraytype = “EPIC”）。ChAMP 管道的作者详细描述了应修改以分析软件包 Bioconductor 页面上的阵列的所有字段30。
- 样品表
- 将IDAT文件传输到计算机以继续进行生物信息学分析31。创建示例工作表以执行数据分析31。
注意：三列对于此电子表格文件至关重要。首先是Sample_name。此列必须包含用于标识样本的名称或代码。第二个是Sentrix_position。该列放置样品的相应R01C01，其中R01负责芯片行，该列称为C01。第三个基本列是Sentrix_ID，它负责接收标识微阵列的数字。确保输入正确的数字。可以在示例工作表上添加其他信息作为变量值。在本实验中，包括了金属分析的数据。
- 将IDAT文件传输到计算机以继续进行生物信息学分析31。创建示例工作表以执行数据分析31。
- 中安普管道
- 在计算机上安装 RStudio （V.4.0.2） 以执行分析30。
注：确保计算机至少有 8 G RAM。数据分析将在较低的RAM量下挣扎或崩溃。 - 安装完成后，打开 RStudio 并使用相应的命令行安装 ChAMP 生物导体软件包30 （请参阅 补充材料 1）。
注意：如果在安装结束时出现任何错误，请逐个手动安装所需的 ChAMP 库26。 - 现在，导入原始数据并执行分析。见 补充材料1。
champ.load（） 导入原始数据并执行过滤过程，不包括具有低检测 pval 的探针、多点命中位点、非 CG 探针、靠近 SNP 的 CpG 位点以及位于性染色体中的 CpG。
champ.impute（） 将 KNN 插补作为默认值执行。
冠军。QC 检索数据质量图（例如，密度图）。
冠军。SVD 根据示例工作表中提供的元数据评估批处理效应。
champ.refbase（） 执行细胞类型估计和校正。
冠军。DMP（） 检索差异甲基化位置和性状关联，如脂肪质量，以检查组之间的DNA甲基化并改变参数，如 补充材料1所示。
- 在计算机上安装 RStudio （V.4.0.2） 以执行分析30。
-
扩充（字符串数据库）
注意：功能富集用于推断一组基因的生物学功能。- 要丰富字符串中的数据，请选择要丰富并将其用作输入的目标列表：https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
=multiple_identifiers - 对于生物体，选择智人，然后按搜索按钮。
- 要浏览扩充，请单击“分析”按钮。
- 要丰富字符串中的数据，请选择要丰富并将其用作输入的目标列表：https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
-
地球观测提交
- 将数据存入NCBI的GEO等公共存储库。为此，请注册提交者帐户。
注：通过下载包含整个实验和单个样本的描述性信息和实验方案的元数据表，完成GEO提交（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/）。可以在任何电子表格软件中创建 GEO 存档提交。其次，将从所有库的单元格游侠计数脚本生成的原始数据文件添加到目录中。IDAT 和关联的文件或矩阵工作表包含非规范化数据。第三个文件夹是已处理的数据文件。矩阵表是一个电子表格，其中包含在行和样本之间可比的最终标准化值，最好按照任何随附手稿中的描述进行处理。 - 将从所有库的 cell-ranger 计数脚本生成的已处理数据文件放入目录中。使用 GEO 提交者的 FTP 服务器凭据传输包含所有三个组件的目录。
- 将数据存入NCBI的GEO等公共存储库。为此，请注册提交者帐户。
Representative Results
使用ChAMP管道后，在所有过滤器（不合格的CpG，非CG探针，SNP附近的CpG，多命中位点以及与XY相关的CpG）之后，分析中考虑了409，887个探针; 图 2 中显示了一个方案。
图 2：生物信息学分析的管道。请单击此处查看此图的放大版本。
此外，密度图显示，所有样品的β分布密度与质量控制步骤相似。此分析评估 beta 值的分布，并指出是否有任何样本需要排除。在这一批中，没有根据该分析排除任何样品。
图 3：使用 ChAMP 软件包获得的 Beta 值密度图。请单击此处查看此图的大图。
采用奇异值分解（SVD）分析验证了显著影响DNA甲基化数据变异性的主成分。数据显示，BMI、WC（p <1e10-5）和FM（p <0.05）对数据变异性有显著影响（图4）。
图 4：奇异值分解分析。请单击此处查看此图的放大图。
细胞类型估计显示，肥胖女性的自然杀伤细胞（NK）和B细胞都较高（图5）。
图5：通过豪斯曼方法估计的细胞分数。颗粒：粒细胞。 CD4T：辅助性T细胞，淋巴细胞。CD8T：细胞毒性T细胞，淋巴细胞。单核细胞：单核细胞。B细胞：B淋巴细胞。NK：自然杀伤细胞，淋巴细胞。*p < 0.05。 请点击此处查看此图的放大版本。
肥胖和非肥胖女性之间的DNA甲基化水平在细胞类型校正之前和之后都存在差异。在对细胞类型进行DNA甲基化数据校正之前，观察到43，463个差异甲基化位置（DMP），之后观察到3，329个CpG仍然显着。445个CpG位点位于基因间区域（IGR），2，884个位于基因区域，大多数位于启动子区域（n = 1，438）。沿所有区域的分布分别为TSS1500（n = 612），TSS200（n = 826），5'UTR（n = 390），第一个外显子（n = 273），主体（n = 724）和3'UTR（n = 59）。考虑到Δβ值<-0.05和>0.05，与非肥胖个体相比，肥胖者中有162个CpG被低甲基化，576个CpG被高甲基化（图6）。这些数据可在GEO数据库中获得，注册代码为GSE166611。
图 6：差异甲基化位置。请单击此处查看此图的放大版本。
可以评估组间不同的甲基化，并在甲基化研究中发现与特定性状相关的CpG位点。对于脂肪量研究，发现了13，222个CpG位点。启动子区域的6，159个CpG与脂肪量有关，其中470个高甲基化和94个低甲基化（图7），并且各自的基因富集（表2）。
图 7：低甲基化和高甲基化基因的启动子区域，与脂肪量独立相关。请单击此处查看此图的放大版本。
表2：来自差异甲基化CpG位点的基因的功能富集。请点击此处下载此表格。
补充材料1：请点击此处下载本文件。
Discussion
DNA甲基化阵列是获取DNA甲基化最常用的方法，因为它们具有成本效益14。本研究描述了一种详细的方案，该方案使用市售的微阵列平台在巴西队列中进行的试点研究中评估DNA甲基化。从试点研究中获得的结果证实了该方案的有效性。 图3 显示了样品的可比性和完整的亚硫酸氢盐转化率32。
作为质量控制步骤，ChAMP算法建议在过滤过程中排除CpGs站点。排除探针的目的是改进数据分析并消除偏差。去除低质量的CpG（p值低于0.05）以消除数据集中的实验噪声。目标在密度图分析中保持通过状态。Zhou33 描述了在SNP附近过滤CpG的重要性，以避免不匹配，误解多态性胞嘧啶的甲基化，并导致I型探针设计的开关颜色34。此外，由于XY染色体受到印记的差异性影响，Heiss和Just35 强调了过滤这些探针的重要性，因为在女性中，杂交问题可能是混淆因素35。
DMAP的有效期、甲酰胺开放日期、无水乙醇的分析质量和总白细胞计数被认为是方案中的关键步骤。
此外，根据我们的观察，细胞类型估计对于进行生物信息学分析至关重要。豪斯曼方法执行细胞类型估计，如Tian的研究30中所述。该方法基于473个特定的CpG位点，可以预测最重要细胞类型的百分比，例如粒细胞，单核细胞，B细胞和T细胞36。我们使用了ChAMP软件包中推荐的函数“myRefbase”。估计后，ChAMP 算法会调整 beta 值，并从数据集中消除此偏差。这一步在专注于肥胖的研究中至关重要，因为由于其慢性炎症状态，这一人群在白细胞中具有相当大的差异。
我们仅更改了普通PCR密封的原始盖图，涉及方法修改和故障排除。每次离心过程后，密封件都更换为新的密封件。我们不能使用标准的热封，而是在板周围使用铝箔进行调整。
虽然商业检测被认为是表观遗传学研究的黄金标准，但该协议的一个局限性可能是来自独特品牌的试剂和设备的特异性37，38，39，40。另一个限制是缺乏能够识别实验正确进展的指标41。
本方案的标准化代表了表观遗传学研究的重要指南，减少了过程中的人为错误，并允许成功的数据分析和不同研究之间的可比性。
根据我们的结果，DNA甲基化实验适用于比较有和没有肥胖的个体的研究43。此外，拟议的生物信息学分析提供了高质量的数据，可以在大规模研究中加以考虑。
使用SVD分析，我们发现肥胖相关性状（BMI，WC和FM）影响了DNA甲基化数据的变异性。作为一项重要结果，细胞类型估计表明，肥胖女性的自然杀伤细胞（NK）和B细胞均高于非肥胖女性（图5）。这些细胞的较高计数可以通过这些个体的低度炎症状态来解释44。我们观察到，肥胖患者在与脂肪量相关的基因的启动子区域中具有低甲基化和高甲基化的CpG。大多数位点被低甲基化，这可能与这些个体中活性氧（ROS）水平的自然增加有关。这种氧化应激条件可能促进鸟嘌呤在二核苷酸位点的扰动，形成8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG），导致5mCp-8-OHdG二核苷酸位点，并引起TET酶募集。所有这些事件都可能通过不同的作用机制促进DNA低甲基化和高甲基化45。
此外，肥胖个体的脂肪发生率似乎增加，大约10%的新细胞为旧细胞46，47。表观遗传贡献强调致肥胖环境，可以改变细胞的增殖和分化速率，有利于脂肪团的发育48。表观遗传变化也会影响脂肪生成程序，促进或限制其发展。主要转录因子（PPARγ或C / EBPα）或多蛋白复合物的组装，位于下游启动子区域，通过包括或排除表观遗传修饰酶来操作，通过高甲基化或低甲基化调节基因表达45。PPARγ通路以前曾被描述为改变WNT通路，该通路在这项研究中富集了基因。虽然目前尚不清楚WNT信号传导在脂肪生成过程中是如何发生的，但最近的研究表明，它可能在脂肪细胞代谢中具有重要作用，特别是在致肥胖条件下49。
Disclosures
本文的作者没有利益冲突，也没有财务披露要声明。
Acknowledgments
我们要感谢袁田博士（tian.yuan@ucl.ac.uk）能够回答有关ChAMP软件包的所有疑问。我们还感谢Guilherme Telles，Msc.从本文对技术和科学问题的贡献;他对表观遗传学和视频捕获和格式化技术（guilherme.telles@usp.br）进行了重要考虑。耗材资助：圣保罗研究基金会（FAPESP）（#2018/24069-3）和国家科学技术发展委员会（CNPq：#408292/2018-0）。个人资助：（FAPESP：#2014/16740-6）和高等教育人员发展协调学术卓越计划（CAPES：88882.180020/2018-01）。数据将不受限制地公开和免费提供。与NYN（电子邮件：nataliayumi@usp.br）或CBN（电子邮件：carla@fmrp.usp.br）的通信地址。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
| Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
| Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q - RJL System | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
| EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
| HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
| Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
| MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
| MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
| NaOH | F. MAIA | 114700 | |
| PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
| PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
| 2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
| RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
| RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
| STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
| TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
| Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
| XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
| XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
| XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
| XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |
References
- Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
- World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
- Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
- Bird, A.
- Kouzarides, T.
- Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
- Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
- Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
- Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
- Shen, L., Waterland, R. A.
- Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
- Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
- Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y.
- Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
- Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
- Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
- Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
- Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
- Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
- Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
- Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
- Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
- Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
- Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
- Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
- Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
- Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
- Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
- Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
- Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
- Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
- Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
- Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
- Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
- Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
- Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
- Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
- Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
- Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
- Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
- Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
- Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).
