Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Montering av cellemikrokering støttede og suspenderte Lipid Bilayer-modeller for studiet av molekylære interaksjoner

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62599
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

Summary

Denne protokollen beskriver dannelsen av celle som etterligner uni-lipid og multi-lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Disse in vitro-modellene kan tilpasses for å inkorporere en rekke lipidtyper og kan brukes til å undersøke ulike molekyl- og makromolekylinteraksjoner.

Abstract

Modellcellemembraner er et nyttig screeningverktøy med anvendelser som spenner fra tidlig legemiddeloppdagelse til toksisitetsstudier. Cellemembranen er en avgjørende beskyttende barriere for alle celletyper, som skiller de interne cellulære komponentene fra det ekstracellulære miljøet. Disse membranene består i stor grad av en lipidbilayer, som inneholder ytre hydrofile hodegrupper og indre hydrofobe halegrupper, sammen med ulike proteiner og kolesterol. Lipidenes sammensetning og struktur spiller en avgjørende rolle i reguleringen av biologisk funksjon, inkludert interaksjoner mellom celler og cellulær mikromiljøet, som kan inneholde legemidler, biologiske giftstoffer og miljøgifter. I denne studien beskrives metoder for å formulere uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert celle som etterligner lipid-bilayers. Tidligere ble uni-lipid fosfatidylkolin (PC) lipid bilayers samt multi-lipid placental trophoblast-inspirert lipid bilayers utviklet for bruk i å forstå molekylære interaksjoner. Her vil metoder for å oppnå begge typer bilayermodeller bli presentert. For celler som etterligner multi-lipid bilayers, bestemmes ønsket lipidsammensetning først via lipidekstraksjon fra primære celler eller cellelinjer etterfulgt av flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Ved hjelp av denne sammensetningen fremstilles lipid vesicles ved hjelp av en tynnfilmhydrerings- og ekstruderingsmetode, og deres hydrodynamiske diameter og zetapotensial er preget. Støttede og suspenderte lipid-bilayers kan deretter dannes ved hjelp av kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D) og på en porøs membran for bruk i henholdsvis en parallell kunstig membranpermeabilitetsanalyse (PAMPA). De representative resultatene fremhever reproduserbarhet og allsidighet av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller. Metodene som presenteres kan hjelpe til med rask, facile vurdering av interaksjonsmekanismene, som permeasjon, adsorpsjon og innebygging, av ulike molekyler og makromolekyler med cellemembran, som hjelper til med screening av narkotikakandidater og prediksjon av potensiell cellulær toksisitet.

Introduction

Cellemembranen, som hovedsakelig består av fosfolipider, kolesterol og proteiner, er en avgjørende komponent i alle levende celler1. Med organisering drevet av lipid amfifilitet fungerer cellemembranen som en beskyttende barriere og regulerer hvordan cellen samhandler med omgivelsene2. Flere cellulære prosesser er avhengige av lipid- og proteinsammensetningen av membranen1,2. For eksempel er cellemembraninteraksjoner viktige for effektiv legemiddellevering3. Legemidler, biologer, nanomaterialer, biologiske giftstoffer og miljøgifter kan påvirke integriteten til en cellemembran, og dermed påvirke cellulær funksjon4. Konstruksjonen av in vitro-cellemimikeringsmembranmodeller basert på lipidsammensetningen av cellemembraner har potensial til å gi facile verktøy for å forbedre studiet av den potensielle effekten av disse materialene på celler.

Modell lipid bilayers inkluderer lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Støttede lipidbilayere er en modell av fosfolipidcellemembranen som vanligvis brukes i bioteknologiske applikasjoner der lipid vesicles brister på et støttet substratmateriale5,6,7,8,9. En vanlig teknikk som brukes til å overvåke bilayerdannelse er kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D), som undersøker adsorpsjon av vesikler i forhold til bulkvæskeegenskapene in situ8,10,11,12,13,14 . Tidligere har QCM-D blitt brukt til å demonstrere at under strømningsforhold, når en kritisk vesicle dekning av fosfatidylkolin (PC) lipid vesikler oppnås på overflaten, bryter de spontant inn i stive lipidbilayers15. Tidligere arbeid har også undersøkt støttet lipidbilayerformasjon med varierende lipidsammensetninger16, inkorporering av lipidproteiner17,18,19, og bruk av polymerputer20, noe som gir støttede lipidbilayere som er i stand til å etterligne ulike aspekter av cellemembranfunksjonen.

Lipid bilayers har blitt brukt til å etterligne ulike biologiske barrierer fra sub-cellulære til organnivåer, inkludert mitokondrie, rød blodlegeme og levercellemembraner ved å endre fosfolipid-, kolesterol- og glykolipidkomponentene21. Disse mer komplekse multi-lipid vesikler kan kreve flere metoder for å oppnå vesicle brudd, avhengig av lipid sammensetningen. For eksempel har tidligere studier brukt et α-spiralisk (AH) peptid avledet fra hepatitt C-virusets ikke-strukturelle protein 5A for å indusere bilayerdannelse ved å destabilisere adsorbert lipid vesikler22,23. Ved hjelp av dette AH-peptidet har støttede lipidbilayere som etterligner placentalceller tidligere blitt dannet24. Det store potensialet for støttede lipidbilayers for biomedisinske applikasjoner har blitt demonstrert med undersøkelser som spenner over molekylær og nanopartikkeltransport25,26, miljøtoksiske interaksjoner27, proteinmontering og funksjon17,18,19, peptidarrangement og innsetting28,29, legemiddelscreening30og mikrofluidiske plattformer31.

Suspendert lipid bilayers har blitt brukt til farmasøytisk screening studier via en parallell kunstig membran permeabilitet analyse (PAMPA) hvor en lipid bilayer er suspendert over en porøs hydrofob innsats32,33,34,35. PAMPA lipidmodeller er utviklet for forskjellige biologiske grensesnitt, inkludert blod-hjerne, bukkal, tarm og transdermale grensesnitt36. Ved å kombinere både de støttede lipid-bilayer- og PAMPA-teknikkene, kan adsorpsjon, permeabilitet og innebygging av forbindelser i lipidkomponenter av ønsket vev eller celletype studeres grundig.

Denne protokollen beskriver fabrikasjon og anvendelse av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller for å undersøke flere molekylære interaksjoner. Fremstilling av både uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert lipid bilayers er detaljert. For å danne en støttet lipidbilayer utvikles lipid vesikler først ved hjelp av tynnfilmhydrering og ekstruderingsmetoder etterfulgt av fysisk-kjemisk karakterisering. Dannelse av en støttet lipidbilayer ved bruk av QCM-D-overvåking og fabrikasjon av suspenderte lipidmembraner til bruk i PAMPA diskuteres. Til slutt undersøkes multi-lipid vesicles for utvikling av mer komplekse cellemimikeringsmembraner. Ved hjelp av begge typer fremstilte lipidmembraner demonstrerer denne protokollen hvordan dette verktøyet kan brukes til å studere molekylære interaksjoner. Totalt sett konstruerer denne teknikken cellemimikering lipid bilayers med høy reproduserbarhet og allsidighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utvikling av uni-lipid vesicles

  1. Tynnfilmhydreringsmetode
    1. Forberedelse og lagring av lipid lagerløsninger
      MERK: Alle trinn ved bruk av kloroform må utføres i en kjemisk avtrekkshette. Kloroform skal alltid pipetteres ved hjelp av løsemiddelsikre pipettespisser av karbonfiber. Oppløsninger som inneholder kloroform skal alltid oppbevares i hetteglass av glass.
      1. Forbered en 10 mg / ml lipidoppløsning ved å legge til riktig volum kloroform i hetteglasset som inneholder lipidpulveret og bland godt. For eksempel, tilsett 20 ml kloroform til 200 mg L-α-fosfatidylkolin (egg, kylling) (eggPC). Lagerløsningen kan gjøres i en annen konsentrasjon om nødvendig.
        MERK: Hvis pulverlipiden ble lagret i en ampulle, etter tilsetning av kloroformoverføring til et hetteglass med en polytetrafluoretylen (PTFE) fôret hette.
      2. Forsegle hetteglasshetten med Parafilm og oppbevar den ved -20 °C i opptil 6 måneder.
    2. Dannelse av en tørr lipidfilm
      1. Tilsett riktig volum lipidoppløsning i et rent hetteglass med glass som trengs for en endelig vesiclekonsentrasjon på 2,5 mg/ml. For eksempel, for å danne 1 ml egg PC vesicles ved 2,5 mg / ml, pipette 250 μL egg PC lagerløsning i hetteglasset.
        MERK: Det klargjorte volumet kan avhenge av ekstruderprosessen som brukes (se trinn 1.3). Mini ekstruder maksimalt anbefalt volum er 1 ml mens det store ekstrudervolumområdet er 5-50 ml.
      2. Fjern kloroform fra lipid lagerløsning ved hjelp av en strøm av N2 gass (ultrapure 5.0 Grade).
      3. For å sikre full fjerning av kloroform, koble den tørkede lipidfilmen til vakuum og la den stå i minst 4 timer.
        MERK: Prosessen kan stoppes her. Hvis lipidfilmen ikke skal brukes umiddelbart etter støvsuging, må den oppbevares i en tørkeapparat til den brukes. Vi har observert at disse lipidfilmene gir lignende kvalitet vesicles etter 1 ukes lagring under disse forholdene; vesiclekvaliteten etter lengre lagringsvarigheter, om nødvendig, bør utforskes nærmere.
    3. Utføre fryse-tine-virvel sykluser
      1. Forbered en Tris natriumklorid (NaCl) bufferløsning som inneholder 10 mM Tris base og 100 mM NaCl. Rehydrer den tørkede lipidfilmen med det nødvendige volumet av Tris NaCl-buffer for å gi en endelig vesiclekonsentrasjon på 2,5 mg / ml og virvel i ca. 15-30 s.
      2. Overfør vesicle suspensjon i en beholder med tørris til frossen, ca 30 min. Etter at prøven er helt frossen, tin suspensjonen i et 30-40 °C vannbad. Virvel den tinte vesicle suspensjon.
        MERK: Væske N2 kan brukes i stedet for tørris. Overfør vesicle suspensjon til flytende nitrogen i 30 s, og deretter umiddelbart tine i en 80°C vannbad.
      3. Gjenta trinn 1.1.3.2 ytterligere 4 ganger, for totalt 5 fryse-tine-virvel sykluser.
  2. Ekstrudering
    MERK: Etter at fryse-tining-virvel sykluser er fullført, multilamellar vesicles dannes. Ekstrudering hjelper til med å redusere størrelse og utvikle store unilamellar vesicles.
    1. Mini (1 ml) ekstruderprosess
      1. Rengjør alle komponenter i ekstruderen grundig med et mildt vaskemiddel i ultrarent vann og skyll minst tre ganger med ultrarent vann for å sikre at alt vaskemiddel fjernes. Tørk med N2 gass.
      2. Monter de to innvendige membranstøttene og O-ringene (indre diameter på 12,7 mm; ytre diameter på 15,2 mm). Plasser hver membranstøtte slik at O-ringen vender opp.
      3. Forsmart en filterstøtte med ultrarent vann. Plasser den på membranstøtteoverflaten inne i O-ringen. Gjenta for den andre interne membranstøtten.
      4. Plasser en intern membranstøtte i ekstruderens ytre foringsrør. Plasser en 100 nm polykarbonatmembran på den indre membranstøtten, rett over filterstøtten.
        MERK: Polykarbonatmembranene lagres separat mellom biter av blått farget papir. Fjern separasjonspapiret før du setter det inn i membranstøtten.
      5. Plasser den andre interne membranstøtten i ekstruderens ytre foringsrør med O-ringen og filterstøttesiden vendt mot polykarbonatmembranen. Fest PTFE-lageret i holdermutteren og skru den lukket med ekstruderens ytre foringsrør. Fest ekstruderen inn i varmeblokken.
      6. Legg lipid vesicle suspensjonen i en av sprøytene og plasser sprøyten i ekstrudervarmeblokken, og sett nålen helt inn i den ene enden av ekstruderen. Sett den andre, tomme sprøyten inn i motsatt side og lås i begge sprøytene ved hjelp av armklemmene på varmeblokken.
        MERK: Plasser om nødvendig ekstrudervarmeblokken på en kokeplate og sett temperaturen til en verdi over overgangstemperaturen på lipiden. Sett inn et termometer i holderen som er innebygd i varmeblokken for nøyaktige temperaturavlesninger, og vent til ønsket temperatur er nådd (~15 min). Egg PC lipid vesicles krever ikke varme under ekstrudering.
      7. Skyv vesicle-suspensjonen langsomt inn i den tomme sprøyten, og deretter tilbake i den opprinnelige sprøyten. Overvåk for trykkendringer gjennom ekstrudering som indikerer en lekkasje. Gjenta 20 ganger til for totalt 21 passerer gjennom polykarbonatmembranen. Overfør lipidhyllene til et rent hetteglass for oppbevaring.
        MERK: Antall profiler kan optimaliseres avhengig av lipidsammensetningen.
      8. Hvis varme ble brukt, la ekstrudert vesicle suspensjon nå romtemperatur. Oppbevar de ekstruderte lipid vesiklene ved 4 °C til videre bruk.
        MERK: Den anbefalte vesicle oppbevaringsvarigheten er svært avhengig av lipidsammensetningen, og vesicle fysikokjemiske egenskaper (f.eks. hydrodynamisk diameter, zetapotensial) bør overvåkes over tid. For eksempel har egg PC vesikler blitt lagret i minst to uker uten endring i vesicle størrelse eller bilayer formasjonskapasitet.
    2. Stor (5-50 ml) ekstruderprosess
      MERK: Følg trinn 1.2.2.1-1.2.2.5 hvis det er behov for varme for valgt lipid. Hopp til trinn 1.2.2.5 hvis det ikke er behov for varme. Trinn 1.2.2.1-1.2.2.4 er ikke nødvendig for egg PC.
      1. Fyll en 1 L kolbe med omvendt osmose (RO) vann.
        MERK: Ikke bruk ultrarent vann til å sirkulere gjennom 50 ml-systemet, da det kan føre til at metallioner lekker ut av ekstrudersylinderen.
      2. Plasser 1 L-kolben i et vannbad på en kokeplate og sett varmeplaten til en temperatur over overgangstemperaturen på lipiden.
      3. Fest prøvesylinderen til kolben med fleksible slanger via innløpet på prøvesylinderen. Fest slangen på sylinderens utløp til toppen av 1 L-kolben. Fest slangen både ved innløpet og uttaket etter behov. Dette vil skape en enveis strøm av vannet gjennom prøvesylinderen.
      4. Slå på pumpen for å starte vannsirkulasjonen. Hvis det er behov for varme, må det ta ca. 30-45 minutter før prøvesylinderen når ønsket temperatur.
      5. Koble hetten på prøvesylinderen til en nitrogentank via den fleksible kontakten som er festet til trykkavlastningsventilenheten.
      6. Rengjør alle deler av 50 ml ekstruderen med 70 % (v/v) etanol.
      7. Monter ekstruderen ved å plassere den store hullskjermstøtten, sintret disk, avløpsskiver og polykarbonatmembran i rommet i ekstruderens nedre støtte. Koble ekstruderens øvre og nedre støtter ved hjelp av de fire skruene og stram til.
      8. Fest ekstruderenheten til prøvesylinderen ved å skru til bunnen og stramme med en skiftenøkkel for å feste den.
        MERK: Hvis det brukes varme, plasserer du et termometer i sylinderen og venter til vannet har nådd ønsket temperatur før du fortsetter. Dette vil sikre at prøvetemperaturen opprettholdes gjennom hele ekstruderingsprosessen.
      9. Fyll prøvesylinderen med ultrarent vann. Ekstruder vannet gjennom ekstruderenheten før du legger prøven i prøvesylinderen. Dette gjøres for å for-våte membranene, som ligner mini ekstruderen.
        MERK: Kontroller at hetten er skrudd helt på og at trykkavlastningsventilen er helt lukket før du slår på nitrogenet. Minimalt trykk er nødvendig for dette trinnet (~ 5-10 psi).
      10. Tilsett lipid vesicle suspensjon i prøvesylinderen og skru toppen lukket. Øk trykket langsomt til prøven begynner å dryppe fra ekstruderenheten med en hastighet på ca. 2-3 dråper/ s i et rent hetteglass.
        MERK: Ikke øk trykket raskt på dette trinnet, da for mye trykk kan påvirke membranene negativt og føre til mislykket ekstrudering.
      11. Når alle prøvene er ekstrudert, slår du av N 2-tilførselen og slipper trykket i prøvesylinderen ved å åpne trykkavlastningsventilen langsomt. Hell lipid vesiklene tilbake i prøvesylinderen og gjenta trinn 1.2.2.11, 9 ganger til for totalt 10 profiler.
        MERK: Det nødvendige trykket for ekstrudering kan reduseres med økende antall profiler, ettersom prøven blir mer homogen og nærmere i størrelse til porestørrelsen på polykarbonatmembranen.
      12. Oppbevar ekstrudert lipid vesicle suspensjon ved 4 °C til videre bruk.

2. Karakterisering av lipid vesicles

  1. Måling av hydrodynamisk diameter ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS)
    1. Vortex lipid vesikler og pipette 50 μL av lipid vesicle suspensjon i en engangs lavvolum cuvette. Deksel for å forhindre forurensning med støv og rusk.
    2. Last vesicle-fjæringen inn i DLS-instrumentet, skriv inn prøvedetaljene og utfør målingen ved hjelp av den tilknyttede programvaren.
  2. Zeta-potensial
    1. Forbered en brettet kapillær zetacelle ved å vaske med ultrarent vann, 70% etanol og ultrapure vann ved hjelp av sprøyter som kobles til inngangene til cellen. Skyv væsken forsiktig gjennom cellen 3-4 ganger og tøm cellen helt før du bytter til neste løsning.
    2. Virvel lipid vesicles og forberede en 1:10 (v / v) fortynning av lipid vesicles i ultrapure vann.
    3. Last den fortynnede lipid vesicle suspensjonen. Fjern luftbobler ved å skyve suspensjonen frem og tilbake mellom sprøytene. Fest proppene til hvert innløp.
      MERK: Det er viktig å fjerne alle bobler, da dette vil påvirke målingen.
    4. Plasser zetacellen i prøvekammeret, og sørg for at elektrodene er i kontakt. Lukk prøvekammertoppen. Skriv inn eksempeldetaljene i den tilknyttede programvaren, og samle inn måling.

3. Danner en uni-lipid støttet lipid bilayer ved hjelp av QCM-D

  1. Forberedelser til løsninger
    1. Forbered en 2% (w / v) natrium dodecylsulfat (SDS) løsning i ultrarent vann. Bland på en røreplate til den er helt oppløst. Aliquot arbeidsløsninger på minst 10 ml ultrarent vann, 2% SDS og Tris NaCl.
    2. Forbered en fortynning av lipid vesicles i Tris NaCl buffer. Konsentrasjonen av vesicles er avhengig av søknaden. For egg-PC har konsentrasjoner i området 0,01-0,5 mg/ml vist seg å resultere i vellykket støttet lipidbilayerformasjon.
  2. Rengjøring av silikabelagte kvartskrystallsensorer
    MERK: Rengjøring av QCM-D-krystaller avhenger av overflatematerialet til sensoren som brukes. For å danne støttede lipid-bilayers brukes silikabelagte kvartskrystaller i denne protokollen og beskrevet nedenfor som tilpasset produsentens standard driftsprosedyre.
    1. Sett den silikabelagte kvartskrystallsensoren inn i strømningsmodulen, slik at "t" på krystallen stemmer overens med "t" på modulen. Skru strømningsmodulen lukket.
      MERK: Hvis QCM-D-grepet gjør det mulig å koble til og kjøre flere strømningsmoduler samtidig, gjentar du følgende prosedyrer for tilleggsmodulene etter behov.
    2. Sett strømningsmodulen inn i instrumentets base med elektrodene fra strømningsmodulen som kobles til analysatorsystemet. Lås modulen på plass.
    3. Koble innløps- og utløpsslangen til strømningsmodulen og pumpen. Plasser slangen i holdebeskyttelsen og lukk lokket på analysatorsystemet. Plasser en avfallsbeholder ved pumpens utløp for å samle inn brukte løsninger.
    4. For å utføre rengjøringen, slå først på pumpen. Sett strømningshastigheten til 400 μL/min. Sett innløpsslangen i ultrarent vann og strømning 5-10 ml gjennom modulen.
    5. Sett innløpsslangen i 2 % SDS og strømning 5-10 ml gjennom modulen. Sett innløpsslangen tilbake i ultrarent vann og strømning 10-20 ml gjennom modulen. Fjern innløpsslangen fra oppløsningen og strømningsluften gjennom slangen til all væske er kastet ut.
      MERK: Rengjøringsprotokollen ovenfor brukes daglig før og etter hver måling. En grundig rengjøring kan utføres etter behov. Kort sagt, for å utføre en grundig rengjøring, demonter strømningsmodulene. Alle komponenter unntatt elektrodesiden av strømningsmodulen skal nedsenkes i 2% (w / v) SDS og bad sonikert, etterfulgt av grundig skylling med ultrarent vann og tørking med en strøm av N2 gass. Komponenten i strømningsmodulen som inneholder elektrodepinnene, må aldri komme i kontakt med væske.
    6. Fjern sensoren fra strømningsmodulen og skyll sensoren med ultrarent vann. Tørk sensoren med en gassstrøm av N2. Tørk strømningsmodulen med en gassstrøm av N2. Sørg for at elektroden alltid er fri for væske.
    7. I en kjemisk avtrekkshette setter du den silikabelagte kvartskrystallsensoren inn i et ultrafiolett (UV)/ozonrengjøringsinstrument. Slå på instrumentet og la det bli behandlet i minst 2 minutter. Fjern følerne forsiktig og gå tilbake til strømningsmodulen.
  3. Danne en Tris NaCl-opprinnelig plan
    1. Slå på analysatorinstrumentet for å koble til den tilknyttede programvaren og stille inn temperaturen til ønsket verdi for den støttede lipid-bilayeren. La temperaturen stabilisere seg til ønsket inngang.
      MERK: Hvis den innstilte temperaturen er over romtemperaturen, bør alle oppløsninger varmes opp til samme temperatur ved hjelp av en varmeblokk.
    2. Konfigurer målingen og finn alle sensorresonansfrekvenser og -avledninger for overtoner 3, 5, 7, 9, 11 og 13 før du starter målingen.
      MERK: 1m overtone kan ses bort fra, da denne harmoniske er altfor følsom og produserer støyende data.
    3. Slå på pumpen og sett strømningshastigheten til 175 μL/min eller ønsket eksperimentell strømningshastighet.
    4. Tørk av innløpsslangen med etanol før du setter den inn i Tris NaCl. Start målingen og begynn å flyte Tris NaCl.
      MERK: Data samles inn og overvåkes i sanntid. Endringen fra luft til væske i strømningsmodulen vil bli observert i datainnsamlingsprogramvaren ved en rask spredningsendring (ΔD) økning og frekvensendring (ΔF) reduksjon.
    5. La Tris NaCl strømme gjennom modulen i 5-10 min, slik at baseline ΔF- og ΔD-verdiene i væske forblir stabile.
  4. Danner en uni-lipid støttet lipid bilayer
    1. Stopp pumpen og fjern innløpsslangen fra Tris NaCl-oppløsningen og sett forsiktig inn i lipid vesicle-løsningen. Tilbakestrømning i 5 s for å fjerne eventuelle luftbobler fra innløpsslangen, og fortsett deretter fremoverstrømmen. Start målingen i programvaren på nytt for å nullstille grunnlinjen.
      MERK: Pass på at du unngår luftbobler i slangen, som kan strømme gjennom modulen og forstyrre bilayerformasjonen og dataregistreringen.
    2. Flow lipid vesicles til bilayer formasjon observeres i sanntid i datainnsamling programvare (minst 8 min for egg PC vesicles).
    3. Gjenta trinn 3.4.1 for å endre innløpsslangen fra lipid vesicles tilbake til Tris NaCl buffer.
      MERK: Hvis ønsket anvendelse er å studere molekylære interaksjoner, fortsett direkte til trinn 6.1 uten å stoppe løsningsflyten eller datainnsamlingen. Hvis bilayerformasjonen er endepunktet, går du videre til trinn 3.4.4.
    4. Stopp målingen i programvaren, og lagre filen. Stopp pumpen.
    5. Rengjør strømningsmodulen og silikabelagt kvartskrystallsensor ved å følge protokolltrinnene 3.2.4 og 3.2.5.

4. Danner en suspendert lipid bilayer

MERK: Protokollen for å danne en suspendert lipidbilayer er tilpasset fra den parallelle kunstige membranpermeabilitetsanalysen (PAMPA) som leveres av produsenten av filterplaten37.

  1. Solubiliser ønsket lipid i dodekan ved 20 mg/ml (f.eks. 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DOPC)).
  2. Tilsett 5 μL lipidoppløsning i donorrommet, som er en porøs polyvinylliddifluorid (PVDF) 96-brønns multiscreen-filterplate (0,45 μm porestørrelse).
  3. Senk umiddelbart filterplaten ned i akseptorrommet, som er en transportmottakerplate som inneholder 300 μL 1× fosfatbufret saltvann (PBS). Tilsett 200 μL 1× PBS i donorrommet.
    MERK: Kontroller av filtre med kun lipid og ubehandlede filtre eksponert for 1× PBS kan inkluderes.
  4. Fortsett direkte til pkt. 6.2 for å undersøke molekylære interaksjoner med den suspenderte lipid-bilayeren. Det anbefales å fullføre studien innen 16 timer etter å ha dannet den suspenderte bilayeren.

5. Utvikle multi-lipid celle etterligning vesicles og bilayers

  1. Lipidekstraksjon fra pattedyrceller
    MERK: Lipidutvinning følger Bligh-Dyer-tilnærmingen38.
    1. Kultur ønsket cellelinje etter behov. Etter å ha oppnådd 70-80% samløp (T75 kolbe), løsne celler ved hjelp av trypsin-etylendiamintretaacetic acid ved 37 °C i 5 minutter.
    2. Sentrifuger celler ved 200 × g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet i 1 ml ultrapure vann.
    3. Tilsett 3,75 ml av en 1:2 (v/v) blanding av kloroform:metanol i celleopphenget og virvelen i 15 minutter. Tilsett deretter 1,25 ml kloroform og virvel i 1 min. Til slutt tilsettes 1,25 ml vann og virvel i 1 min.
    4. Sentrifuger celleblanding ved 1000 x g i 10 min. Samle det nederste laget av væske, som inneholder lipider i den organiske fasen. Tørk under en strøm av N2 gass.
    5. Kvantifisere lipidinnholdet ved hjelp av flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) ved hjelp av en C18 omvendt fase, 3,5 μm × 50 mm kolonne.
    6. For den mobile fasen, forberede to løsninger, den første med 60:40 (v / v) acetonitrile: vann og den andre med 90:10 (v / v) isopropanol: acetonitrile. Ammoniumformat bør legges til begge løsningene ved en endelig konsentrasjon på 10 mM. Over 60 min, øk den mobile fasegradienten fra 35% (v / v) av den andre løsningen til 95% (v / v).
    7. Oppdag avløpet i negativ iioniseringsmodus, med påfølgende fullskanning MS og tandem MS/MS. Identifiser de enkelte fosfolipidartene fra deres masse-til-lading (m/z) forhold. Analyser massespektraet fra kollisjonsindusert dissosiasjonsfragmentering ved hjelp av LIPID MAPS massespektrometrianalyseverktøy. Få ekstraherte ionkromatogrammer for å integrere området under kurven, og bestemme overflod av hver lipidart.
    8. Utfør trinn 5.1.5-5.1.7 for en lipidstandard som inneholder de viktigste lipidklassene for å bestemme de relative deteksjonsfølsomhetene for hver forskjellige fosfolipidklasse.
  2. Utvikle multi-lipid vesicles
    1. Følg trinnene i 1.1.1 for å klargjøre lipidlagerløsninger for lipider som representerer hver ønskede bilayerkomponent, som identifisert i trinn 5.1.
    2. Basert på lipidsammensetningene hentet fra trinn 5.1, legg til riktig volum lipid / kloroform lager i et rent hetteglass som trengs for en endelig vesiclekonsentrasjon på 2,5 mg / ml. Fjern bulkklorformtørkingsløsning under en strøm av N2 gass.
    3. Følg trinn 1.1.2, 1.1.3 og 1.2 for å danne multi-lipid vesicles. Følg trinn 2 for vesicle-karakterisering.
  3. Danner en multi-lipid støttet lipid bilayer ved hjelp av QCM-D
    MERK: Noen multi-lipid vesikler kan resultere i spontan lipid vesicle brudd og bilayer formasjon ligner uni-lipid PC vesikler presentert i trinn 3. Imidlertid kan mer komplekse multi-lipid vesikler kreve ekstern inngang for å hjelpe i vesicle brudd. Her brukes AH-peptidet til å destabilisere det ytre pakningsvedlegget til vesicleen som resulterer i bilayerdannelse. Andre metoder for å oppnå destabilisering og vesicle brudd kan vurderes om ønskelig.
    1. Følg trinn 3 for å danne den multi-lipid støttede lipid-bilayeren ved hjelp av multi-lipid vesicles dannet i trinn 5.2.
    2. Hvis spontan brudd på vesikler i en bilayer ikke observeres, forsøk vesicle destabilisering ved hjelp av AH-peptidet. Forbered AH-peptidet (peptidsekvens: H-Ser−Gly−Ser−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−Trp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp−Phe−Lys−Thr−Trp−Leu−Gln−Ser−Lys−Leu−Asp−Tyr−Lys−Asp-NH2) oppløsning ved 13 μM i Tris NaCl med 1% (v/v) dimetylsulfoksid, DMSO.
    3. Følg trinn 3.4.1-3.4.3. Etter trinn 3.4.3, bytt innløpsslangen til AH-peptidløsningen. Introduser løsningen i strømningsmodulen til ΔF og ΔD er observert fra det nye løsningstillegget. Stopp pumpen og la AH-peptidet inkubere med vesiklene i 10 min.
    4. Bytt innløpsslangen inn i Tris NaCl og start strømmen for å fjerne AH-peptidet fra de rupturede vesiklene som fører til vellykket dannelse av en lipidbilayer.
      MERK: Hvis den ønskede applikasjonen skal studere molekylære interaksjoner, fortsetter du retningen til trinn 6.1 uten å stoppe løsningsflyten eller datainnsamlingen.
    5. Stopp målingen i programvaren, og lagre filen. Stopp pumpen.
    6. Rengjør strømningsmodulen og silikabelagt kvartskrystallsensor ved å følge protokolltrinnene 3.2.4-3.2.6.
  4. Suspenderte multi-lipid bilayers
    1. Solubiliser blandingen av ønskede lipider i dodekan ved 20 mg/ml.
    2. Utgjør en 5 μL lipidblandingsløsning ved hjelp av ønsket cellemimileringssammensetning.
    3. Følg trinn 4.2 og 4.3.
      MERK: Fortsett direkte til trinn 6.2 for å undersøke molekylære interaksjoner med den suspenderte lipid-bilayeren.

6. Molekylinteraksjonsstudier med uni-lipid og multi-lipid bilayers

  1. Studere molekylære interaksjoner med en støttet lipidbilayer ved hjelp av QCM-D
    1. Forbered en løsning av ønsket molekyl for å undersøke adsorpsjon med en støttet lipidbilayer. For eksempel, lag en løsning på 200 μM di (2-etylhexyl) ftalat (DEHP) i Tris NaCl med 1% (v / v) DMSO.
    2. Hvis molekylløsningen fremstilles i Tris NaCl, kan den strømmes direkte etter trinn 3.4.3 for en uni-lipid bilayer eller 5.3.4 for en multi-lipid bilayer. Hvis molekylet må fremstilles i et annet løsningsmiddel, må du i stedet sette innløpsslangen i ønsket løsningsmiddel alene i minst 5 min (f.eks. Tris NaCl med 1% (v / v) DMSO for DEHP).
      MERK: Viskositetsendringer på grunn av løsningsmidlet kan overvåkes og vurderes ved å strømme det før og etter innføring av interessemolekylet.
    3. Bytt innløpsslangen inn i løsningen som inneholder molekylet av interesse og strømning i minst 5 minutter. Strømmen kan også stoppes og væske som inneholder ønsket molekyl får lov til å inkubere med bilayeren om ønskelig.
    4. Bytt innløpsslangen tilbake til molekylløsningsmidlet alene hvis noe annet enn Tris NaCl. Flyt i minst 5 min. Deretter bytter du innløpsslangen til Tris NaCl og strømmer i minst 5 minutter.
    5. Stopp målingen i programvaren, og lagre filen. Stopp pumpen.
    6. Rengjør strømningsmodulen og silikabelagt kvartskrystallsensor ved å følge protokolltrinnene 3.2.4-3.2.6.
  2. Studere molekylære interaksjoner med suspenderte lipid-bilayere ved hjelp av PAMPA
    1. Forbered en løsning av ønsket molekyl. For eksempel, forberede en 200 μM DEHP i 1× PBS med 1% (v / v) DMSO.
    2. Forbered en ny transportmottakerplate med 300 μL frisk 1x PBS per brønn.
    3. Umiddelbart etter trinn 3.3 for en uni-lipid suspendert bilayer eller 4.4.3 for en multi-lipid suspendert bilayer, fjern 1× PBS fra donorrommet på multiscreen filterplaten og erstatt med 200 μL av testløsningen. Senk straks ned i transportmottakerplaten som er klargjort i trinn 6.2.2.
    4. Inkuber med skånsom gynging i ønsket tid (f.eks. 2 timer) ved 25 °C.
    5. Etter inkubasjon, samle 150 μL av løsningen fra donor- og akseptorrommene. Mål molekylkonsentrasjonen i begge prøvene ved hjelp av en passende metode basert på egenskapene til dette molekylet.
      1. Bruk for eksempel et mikroplatespektrofotometer med riktig absorbansbølgelengde, for eksempel 280 nm for DEHP, og sammenlign med en standardkurve av interessemolekylet.
    6. Beregn tilsynelatende permeabilitet (Papp) av interessemolekylet ved hjelp av følgende ligninger:
      Equation 1 (1)
      Hvor Equation 2 (2)
      MERK: [testforbindelse]akseptor er konsentrasjonen av interessemolekylet (f.eks. og [testforbindelse]initial er den første konsentrasjonen av molekylet. A er membranområdet, t er tiden, VD er donorvolumet, og VA er akseptorvolumet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver metoder for å danne støttede og suspenderte lipid-bilayere (figur 1). Det første trinnet for å danne en støttet lipid bilayer er å utvikle lipid vesicles. Mini ekstruderen gjør det mulig å tilberede små mengder lipid vesicles (1 ml eller mindre), mens den store ekstruderen gjør det mulig å fremstille 5-50 ml lipid vesicles i en batch. Størrelsesfordelinger av uni-lipid vesicles dannet av enten mini eller stor ekstruder er vist i figur 2A. Ettersom den store ekstruderen bruker høytrykks N2-gass for å skyve vesicle-løsningen gjennom polykarbonatmembranen, resulterer lipid vesikler i en gjennomsnittlig størrelsesfordeling ved målet 100 nm hydrodynamisk diameter. Miniekstruderen resulterer også i en jevn fordeling, selv om vesicle hydrodynamisk diameter er litt større enn polykarbonat porestørrelsen, noe som er typisk for denne manuelle metoden for ekstrudering.

Figur 2B-D sammenligner størrelse, polydispersitet og zetapotensial for uni-lipid egg PC vesicles og to multi-lipid vesicles sammensetning. Tabell 1 sammenligner den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren til hver lipid vesiclesammensetning. Sammensetningen av den første multi-lipid vesicle (ML1) er representativ for placental-trophoblast-inspirerte lipid vesikler med en sammensetning på 57:15:8:8:12 % (w/w) pc: fosfatidyletanolamin (PE): fosfatidylinositol (PI): fosfatidylserin (PS): sphingomyelin (SPH). Størrelsesfordelingen av egg-PC-vesicles og ML1 vesicles er svært ensartede og nesten identiske, med små forskjeller i gjennomsnittlig polydispersitet (Figur 2A, B). Som forventet, på grunn av forskjeller i sammensetning, ble zetapotensialet til egg-PCen en-lipid vesikler og ML1 vesicle funnet å variere (Figur 2D). Den andre multi-lipid vesicle (ML2) er 60% egg PC og 40% 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-ethylphosphocholine (EPC). Den positive ladningen av EPC førte til et positivt zetapotensial for disse vesiklene (figur 2D), og en økning i polydispersitetsindeksen til ML2 vesicles ble også observert sammenlignet med egg-PC eller ML1 vesicles, sannsynligvis et resultat av den spesifikke sammensetningen av disse vesiklene.

QCM-D kan brukes til å danne støttede lipid-bilayere via vesicle-brudd på en silikabelagt sensor, og ΔF og ΔD under denne prosessen overvåkes i sanntid. ΔF er omvendt relatert til masseendringer, og økt ΔD indikerer økning i strukturfluiditeten. Etter hvert som vesicles adsorberer til sensoren, reduseres ΔF og ΔD øker. Når vesicle nå en kritisk vesicle dekning på overflaten, vil det være et platå av ΔF og ΔD. Til slutt, som vesicles brudd, en ΔF økning og ΔD reduksjon observeres, på grunn av frigjøring av innkapslet vann fra ruptured vesicles og dannelse av stive bilayer, henholdsvis. Figur 3 viser ΔF og ΔD som forekommer som vesicles adsorb og brudd på overflaten for uni-lipid og multi-lipid bilayer formasjoner. Uni-lipid egg PC vesicles lett adsorb til overflaten som vist av ΔF nedgang og ΔD økning. Kritisk vesicle dekning nås innen 5 min, hvoretter vesikler begynner å briste. Den totale ΔF observert ved støttet egg PC bilayer formasjon er ~-25 Hz, med ΔD på ~ 0.

ML1 vesicles tar lengre tid å adsorb sammenlignet med egg PC vesicles og i motsetning til disse vesicles, de ikke spontant briste, men forbli stabil på overflaten. I stedet har et AH-peptid lov til å inkubere med adsorberte vesikler som forårsaker brudd når AH-peptidet fjernes med en Tris NaCl-skylling. Under brudd og bilayerdannelse observeres ΔF-økningen og ΔD-reduksjonen, som ligner egg-PC-vesicles. ΔF av denne multi-lipid bilayer resulterer i ca -28 Hz og ΔD på ca 1 × 10-6 . Selv om de kan sammenlignes med egg-PC lipid-bilayeren, indikerer disse små forskjellene i ΔF og ΔD sannsynligvis den økte fluiditeten til bilayeren på grunn av de mange lipidtypene som er tilstede i strukturen.

Etter bilayerdannelse kan disse strukturene brukes til å studere interaksjoner med forskjellige forbindelser. Med støttede lipidbilayere kan ΔF og ΔD analyseres før og etter innføring av forbindelsen. Som et eksempel vises DEHP-interaksjon med støttede en- og multi-lipid (ML1) bilayers i figur 4A,B. I dette tilfellet observeres lignende nivåer av DEHP-adsorpsjon for begge lipidbilayertyper (figur 4A). Imidlertid ble forskjeller i ΔD observert mellom bilayers, med en større ΔD sett for egg PC bilayer sammenlignet med ML1 bilayer (Figur 4B). Mens den støttede lipid-bilayeren tillater studiet av adsorpsjon og potensiell innbygging av forbindelser av interesse sammen med potensiell lipidfjerning, kan suspenderte lipid-bilayers gi informasjon om permeabiliteten på tvers av bilayeren ved hjelp av en PAMPA. Ved DEHP ble det observert lite permeasjon for både uni- og ML1-bilayere (figur 4C). P-appen beregnet for DEHP på tvers av en uni-lipid (~5,5 × 10-11 cm/s) og multi-lipid bilayer (~6,5 × 10-6 cm/s) var karakteristisk for lav permeabilitet. Imidlertid kan andre forbindelser føre til større permeabilitet, som kan undersøkes ved hjelp av denne teknikken.

Figure 1
Figur 1: Prosessen med å danne støttede lipid-bilayere (øverst) og suspenderte lipid-bilayers (nederst).

Figure 2
Figur 2: Uni-lipid og multi-lipid vesicle karakterisering. (A) Hydrodynamisk diameterfordeling av egg PC vesicles dannet ved hjelp av en mini ekstruder og stor ekstruder. (B) Hydrodynamisk diameterfordeling av uni-lipid vesicles som inneholder egg PC og to multi-lipid formuleringer, ML1 (57:15:8:8:12 % (m/w) PC:PE:PI:PS:SPH) og ML2 (60:40 % (w/w) egg PC:EPC). (C) Polydispersitetsindekser av uni-lipid og multi-lipid vesicles. (D) Zeta potensialer av uni-lipid og multi-lipid vesicles. Resultatene vises som gjennomsnittlig ± standardavvik. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) med Tukeys post hoc-analyse (α=0,05, p<0,05 ble ansett som statistisk signifikant, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Uni-lipid egg PC bilayer formasjon (ΔF i lyseblå og ΔD i lys rød) og en multi-lipid bilayer formasjon (57:15:8:8:12 % (m/w) PC:PE:PI:PS:SPH) (ΔF i mørkeblått og ΔD i mørk rød) overvåket over tid ved hjelp av QCM-D. Stiplede linjer indikerer løsningsendringer for uni-lipid bilayerformasjon (lyseblå) og multi-lipid bilayerformasjon (mørk blå). Egg PC bilayer er dannet av ~ 15 min, mens multi-lipid bilayer tar ~ 45 min og krever tilsetning av AH peptid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Molekylinteraksjoner med støttede og suspenderte lipid-bilayere. (A) ΔF på grunn av DEHP interaksjon med uni-lipid og multi-lipid (57:15:8:8:12% (m/w) PC:PE:PI:PS:SPH) bilayers. (B) ΔD på grunn av DEHP interaksjon med uni-lipid og multi-lipid bilayers. (C) Prosent av DEHP gjennomsyret av uni-lipid og multi-lipid suspenderte bilayers. Resultatene vises som gjennomsnittlig ± standardavvik. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av studentens t-test(α=0,05, p<0,05 ble ansett som statistisk signifikant, *p<0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Uni-lipid vs. multi-lipid Komposisjon Extruder Hydrodynamisk diameter (nm)
Uni-lipid 100% egg PC Mini 165 ± 1
Uni-lipid 100% egg PC Stor 108 ± 2
Multi-lipid 57:15:8:8:12 % (m/w) PC:PE:PI:PS:SPH Stor 109 ± 1
Multi-lipid 60:40 % (m/w) egg PC:EPC Stor 91.0 ± 0,2

Tabell 1: Lipid vesicle hydrodynamiske diametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen tillater dannelse av lipid vesicles, støttede lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Her presenteres kritiske trinn for å danne hver av disse strukturene. Når du danner lipid vesicles, er det viktig å ekstrudere over overgangstemperaturen til lipid39. Når du er under overgangstemperaturen, er lipiden fysisk til stede i sin bestilte gelfase39. I denne bestilte fasen er hydrokarbon lipidhalene fullt utvidet, noe som gjør ekstrudering utfordrende39. Ved oppvarming over overgangstemperaturen blir lipiden mer uorden, noe som resulterer i den flytende krystallinske fase39. Lipidens hydrokarbonhaler er mer flytende ved disse temperaturene, noe som gir vellykket ekstrudering39. Lipidegenskaper som hodegruppesammensetning, metning og ladning vil påvirke overgangstemperaturen. Det er også viktig å fjerne all kloroform når du danner lipidfilmen, da gjenværende kloroform vil påvirke vesicledannelse og egenskaper negativt etter rehydrering.

Under støttet lipidbilayerformasjon ved hjelp av QCM-D er det avgjørende for den silikabelagte kvartskrystallsensoren å være i uberørt tilstand. Sensorene kan brukes på nytt, men må kontrolleres hver gang for riper, rusk eller annen slitasje og kastes hvis det blir funnet ufullkommenhet, da sensorfeil kan påvirke vesicle adsorpsjon og bilayerdannelse. Den grunnleggende frekvensen til piezoelektrisk kvartssensor er 5 MHz, med ΔF og ΔD overvåket ved rare overtoner (3, 5, 7, 9, 11 og 13). Å sikre at de grunnleggende resonansfrekvensene for hver overtone som ble funnet før måling, ligner på de forventede teoretiske verdiene, kan bidra til å identifisere et mulig krystallproblem. Innsamling av målinger fra flere overtoner er viktig for viskoelastisk modellering ved hjelp av de oppnådde dataene. Det er også viktig å sikre at luft ikke innføres i systemet under væskestrømning gjennom QCM-D-strømningsmodulene. Luft vil føre til et luft-væske skift som vil bli observert i sanntid datainnsamling og føre til tap av integritet av lipid bilayer. For å danne multi-lipid støttede lipid bilayers har vi notert bruken av et AH peptid for å indusere vesicle brudd. Avhengig av lipidsammensetningen kan andre metoder utforskes for å indusere vesiclebrudd, for eksempel varierende ionstyrke, temperatur og strømning. For eksempel har endring av buffersaltkonsentrasjonen blitt brukt til å oppnå multi-lipid bilayers, for eksempel de som etterligner bakterielle membraner som inkluderer PE og fosfatidylglyserol (PG) i sammensetningen. 40 Under suspendert lipidbilayerdannelse er det viktig at lipider velges som er løselige i dodekane, for eksempel DOPC38,39. Avhengig av bruksområdet og spesielt for cellemembran som etterligner bilayers, kan det være tilrådelig å utføre sammenligningspermeabilitetsstudier mellom suspenderte lipidbilayers og cellemonolayers dannet på porøse innsatser42,43,44.

Det er mange trinn i denne protokollen som kan tilpasses eller endres for et bestemt program. Lipidene og sammensetningene som brukes, konsentrasjonen av lipid vesicle suspensjon, volum av vesiler forberedt, vesicle rehydrering buffer, antall passerer gjennom ekstruderen, polykarbonat membran pore størrelse, kvarts krystall substrat materiale, QCM-D strømningshastighet, molekylære interaksjoner studert, tid for interaksjon, og temperaturen kan alle tilpasses, noe som gjør dette til en allsidig tilnærming. Ekstruderingsprosessene som er beskrevet her, kan også brukes til å danne terapeutiske liposomer. For eksempel har både mini ekstruderen og den store ekstruderen blitt brukt til å danne antifungale liposomer som forblir stabile i minst 140 dager ved 4 °C i ultrarent vann45. Andre metoder for vesicle eller lipid bilayer formasjon og karakterisering kan også vurderes for sammenligning eller ytterligere verifisering. Sonikering er for eksempel en annen teknikk som brukes til å danne lipid vesicles46, og teknikker som kryooverføringselektronmikroskopi kan brukes til å bekrefte lamellitet15,45. Atomkraftmikroskopi47, overflateplasmonresonans48, og nøytronreflektivitet49 kan også brukes i kombinasjon med QCM-D for å studere støttede lipidbilayere50. Suspendert lipid bilayers har også blitt dannet i mikrofluidiske enheter30,51 i tillegg til å bruke filteret og mottakerens brønnplater diskutert i denne protokollen.

Mens metoden beskrevet her kan gi facile lipid bilayers som etterligner cellulær lipidsammensetning, gir de bare informasjon om molekylære interaksjoner med disse lipidene. Proteiner er også viktige komponenter i cellemembranen og kan påvirke adsorpsjon, permeabilitet og aktive og passive transportegenskaper. Dermed vil fremme disse modellen lipid bilayers å innlemme proteiner resultere i ytterligere celle etterligning egenskaper, som kan forbedre informasjonen hentet fra disse tilnærmingene. For eksempel inkorporerte en nylig studie proteiner i støttede lipidbilayere ved å bruke mesoporøse silikasubstrater som gir en skreddersydd overflateporstørrelse for å inkorporere innfødte transmembranproteiner52. Bruksområder der disse bilayers vil være spesielt viktig inkluderer toksisitet testing og farmasøytisk screening studier24,27. Totalt sett legger allsidigheten og reproduserbarheten til disse cellemimimeringsmodellene til deres nytte for en rekke undersøkelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt eller konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation under Grant No. 1942418 tildelt A.S., og et National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildelt C.M.B.H., under Grant No. 1644760. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation. Forfatterne takker Dr. Noel Vera-González for lipid vesicle karakterisering datainnsamling. Forfatterne takker professor Robert Hurt (Brown University) for bruken av hans Zetasizer. Forfatterne takker Brown University Mass Spectrometry Facility, spesielt Dr. Tun-Li Shen for hjelp med kvantifisering av lipidsammensetning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
  2. Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
  3. Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177 (2020).
  4. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  5. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  6. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  7. Mingeot-Leclercq, M. -P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
  8. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  9. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  10. Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
  11. Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
  12. Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
  13. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
  14. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
  15. Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
  16. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  17. Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
  18. Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
  19. Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a, Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
  20. Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
  21. Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
  22. Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
  23. Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
  24. Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
  25. Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
  26. Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
  27. Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923 (2020).
  28. Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
  29. Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
  30. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  31. Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
  32. Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
  33. Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
  34. Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
  35. Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
  36. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  37. Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
  38. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  39. Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
  40. Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
  41. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  42. Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
  43. Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
  44. Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
  45. Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
  46. Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
  47. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
  48. Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
  49. Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  50. Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801 (2016).
  51. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  52. Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

Tags

Bioingeniør utgave 174
Montering av cellemikrokering støttede og suspenderte Lipid Bilayer-modeller for studiet av molekylære interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., … More

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter