Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكشف المباشر عن الأيزوليفوغلاندين في الأنسجة باستخدام بروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي D11 scFv والتألق المناعي

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62603
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4,6, 4, 5, 3, 4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لقياس الأيزوليفوغلاندين في الأنسجة عن طريق التألق المناعي باستخدام الجسم المضاد ScFv D11 المترافق بالفوسفاتيز القلوي. تستخدم نماذج ارتفاع ضغط الدم في كل من الفئران والبشر لشرح الإجراءات خطوة بخطوة والمبادئ الأساسية المرتبطة بقياس isolevuglandin في عينات الأنسجة.

Abstract

Isolevuglandins (IsoLGs) هي كيتوالدهيدات جاما عالية التفاعل تتكون من H2-isoprostanes من خلال بيروكسيد الدهون وبروتينات التشابك مما يؤدي إلى التهاب وأمراض مختلفة بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم. يعد الكشف عن تراكم IsoLG في الأنسجة أمرا بالغ الأهمية في تسليط الضوء على مشاركتها في عمليات المرض. ومع ذلك ، فإن قياس IsoLGs في الأنسجة أمر صعب للغاية ، والأدوات المتاحة حاليا ، بما في ذلك تحليل قياس الطيف الكتلي ، شاقة ومكلفة للغاية. نصف هنا طريقة جديدة للكشف في الموقع عن IsoLGs في الأنسجة باستخدام D11 ScFv القلوي الفوسفاتيز المترافق والجسم المضاد المؤتلف لعرض العاثيات ينتج في الإشريكية القولونية بواسطة المجهر المناعي. تم استخدام أربعة عناصر تحكم للتحقق من صحة التلطيخ: (1) التلوين مع وبدون D11 ، (2) التلوين بمستخلص البكتيريا حول البلازما باستخدام رابط الفوسفاتيز القلوي ، (3) تلطيخ الأجسام المضادة scFV غير ذي الصلة ، و (4) التحكم التنافسي مع IsoLG قبل التلطيخ. نثبت فعالية D11 القلوي المقترن بالفوسفاتيز في كل من الأنسجة البشرية والفأر مع أو بدون ارتفاع ضغط الدم. من المحتمل أن تكون هذه الطريقة بمثابة أداة مهمة لدراسة دور IsoLGs في مجموعة واسعة من عمليات المرض.

Introduction

Isolevuglandins (IsoLGs) ، المعروف أيضا باسم isoketals ، هي أيزومرات من عائلة 4-ketoaldehyde ، وهي منتجات بيروكسيد الدهون ، وتتفاعل مع الأمينات الأولية على البروتينات 1,2 وتقترب منها. وقد تورطت IsoLGs في العديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية ومرض الزهايمر والرئة والكبد ، والعديد من أنواع السرطان3. تمت دراسة IsoLGs على نطاق واسع في مساهمتها في أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) ، والتي تشكل عبئا صحيا واقتصاديا كبيرا على مستوى العالم ، بما في ذلك الولايات المتحدة. تشير التقديرات إلى أن 92.1 مليون من البالغين في الولايات المتحدة لديهم نوع واحد على الأقل من الأمراض القلبية الوعائية ، مع توقعات تقديرية لعام 2030 تصل إلى 43.9٪ من السكان البالغين في الولايات المتحدة4. خفض ضغط الدم والكوليسترول والإقلاع عن التدخين يقلل من المخاطر العامة وحدوث أحداث الأمراض القلبية الوعائية5.

ارتفاع ضغط الدم أو ارتفاع ضغط الدم هو عامل خطر رئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية ويؤثر على ما يقرب من نصف سكان الولايات المتحدة6. وقد وجدت الدراسات السابقة أن الالتهاب هو السبب الكامن وراء ارتفاع ضغط الدم وأن IsoLGs تلعب دورا7. تحفز محفزات ارتفاع ضغط الدم ، بما في ذلك الأنجيوتنسين II ، والكاتيكولامينات ، والألدوستيرون ، والملح الغذائي الزائد ، تراكم IsoLG في الخلايا المقدمة للمستضد بما في ذلك الخلايا المتغصنة (DCs) ، والتي بدورها تنشط الخلايا التائية للتكاثر وإنتاج السيتوكينات الالتهابية التي تساهم في ارتفاع ضغط الدم 8,9.

في السابق ، تم قياس IsoLGs بواسطة الكيمياء المناعية ، وقياس الطيف الكتلي ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، وقياس التدفق الخلوي10,11. لتسهيل قياس IsoLGs ، تم تطوير جسم مضاد مؤتلف متغير شظية أحادي السلسلة (scfv) (D11) ضد IsoLGs12. في البداية ، احتوى هذا الجسم المضاد D11 على علامة E-tag من الأحماض الأمينية 11 وتطلب جسما مضادا ثانويا للكشف عن الكيمياء المناعية11. ومع ذلك ، كان من الصعب العثور على جسم مضاد ثانوي موثوق به ضد العلامة الإلكترونية بعد توقف الشركة المصنعة عن إنتاجه. لذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول موثوق به للتلطيخ المناعي ل IsoLGs باستخدام D11 المترافق مع الفوسفاتيز القلوي (D11-AP) ، والذي أظهرناه في الفئران والأنسجة البشرية مع وبدون ارتفاع ضغط الدم.

Protocol

وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة فاندربيلت على جميع الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة. يتم إيواء الفئران ورعايتها وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر. أعطى جميع الأشخاص موافقة خطية مستنيرة قبل التسجيل في الدراسة على النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة فاندربيلت. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي.

1. تحضير البلازميدات التي تشفر بروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي D11 ونواقل التحكم السلبية

  1. قم ببناء نسخة معدلة من بلازميد pCANTAB5E13,14 حيث يتم ربط مقطع متغير جزء السلسلة الواحدة (scFv) في نهايته 3 'بتسلسل ترميز الفوسفاتيز القلوي البكتيري (AP).
    ملاحظة: مباشرة في اتجاه مجرى موقع تقييد NotI لتسلسل scFv ، لم يعد البلازميد المعدل يحتوي على تسلسل الترميز الخاص بالعلامة الإلكترونية وبدلا من ذلك يشفر تسلسل الرابط GGSGGHMGSGG ، متبوعا بتسلسل AP (رقم انضمام GenBank AXY87039.1 ، T16-K464) 15,16. في اتجاه مجرى AP ، سيقوم البلازميد بتشفير علامات 8xHis و DYKDDDDK. في نهاية 3 'من العلامات ، ينتهي تسلسل الترميز بكودون توقف العنبر. يسمى البلازميد المعدل pCANTAB5-AP.
  2. استنساخ D11 scFv (رقم انضمام بنك الجينات AAW28931.1) إلى pCANTAB5-AP مع مواقع تقييد SfiI / NotI.
  3. استنساخ D20 scFv إلى pCANTAB5-AP مع مواقع تقييد SfiI / NotI.
    ملاحظة: D20 scFv هو عنصر تحكم سلبي مصمم لتقييم نمط تفاعل الأنسجة ل scFv غير ذي صلة. تم اختيار scFv في الأصل بواسطة عرض العاثيات لقدرته على التفاعل مع مجموعة الجليكان المعروفة باسم A2.
  4. قم بإنشاء متجه "فارغ" عن طريق إزالة جزء scFv من البلازميد بالكامل واستبداله بتسلسل ترميز "رابط AP" يتكون من الأحماض الأمينية GGGGSGRAGSGGGGS.
  5. تحويل جميع البلازميدات إلى TG1 E. coli المختصة وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية ، على ألواح أجار 0.5٪ تحتوي على 2xYT مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين و 2٪ جلوكوز (2xYTAG) وسط.
    ملاحظة: السلالات التي تحتوي على جين supE (مثل TG1 E. coli) لا تثبط كودون إيقاف الكهرمان بنسبة 100٪. تتراوح التقديرات من 0.8 إلى 20٪ من الوقت ، لذلك لا يزال هناك الكثير من المنتجات التي تنتهي فقط في اتجاه مجرى BAP ، حيث إنها مخصصة لهذه التجارب17. تستخدم TG1 E. coli بشكل أساسي لأسباب عملية ، مثل تقليل الوقت والتكاليف ، وتوافقها مع نظام التعبير عن البروتين pCANTAB ، واستخدامها في عرض العاثيات ، والذي يتم إجراؤه عادة في المختبر. في اتجاه مجرى كودون التوقف الكهرماني الذي يلي BAP هو تتابع للجين III. نادرا ما يجب التعبير عن بروتينات اندماج GeneIII حتى يعمل عرض العاثية على النحو المنشود لأن بروتينات اندماج scFv-geneIII تتداخل مع بروتين الجين III المعين لإعادة إصابة البكتيريا الساذجة. لذلك ، يجب أن توجد بروتينات الجينات الخالية من الاندماج أثناء تجميع virion لتوليد العاثية العاملة ، أي أن منتجات بروتين scFv-geneIII عادة ما تكون نادرة نسبيا داخل البكتيريا. تتأثر كل من D11-AP و D20-AP والمتجه الفارغ وجميع التركيبات المستخدمة في هذه المقالة بالمثل بتعبير بروتين الاندماج الجيني III العرضي. لا تزال هناك اختلافات ملحوظة في كيفية تصرف هذه البروتينات.
  6. اختر مستعمرة فردية وقم بتلقيح 5 مل جديدة من ثقافة 2xYTAG. اترك البكتيريا تنمو طوال الليل عند 30 درجة مئوية وتهتز عند 150 دورة في الدقيقة.
  7. قم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من 85٪ 2xYTAG و 15٪ جلسرين.
  8. حافظ على مخزون الجلسرين في فريزر -80 درجة مئوية.

2. التعبير عن البروتين وتوليد مستخلص periplasmic

ملاحظة: توليد المستخلص المحيطي هو طريقة شائعة الاستخدام للتعبير عن البروتين في عرض العاثية ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن تكوين روابط ثاني كبريتيد مهم في SCFv وتوليد الأجسام المضادة. تتجنب الطريقة الحاجة إلى توليد المحللات (التي تحتوي عادة على أجسام التضمين) وتضمن طي البروتينات بشكل صحيح. يحتوي pCANTAB على تسلسل إشارة gIII في المنبع لجزء scFv من بروتين الاندماج D11-BAP. يضمن تسلسل الإشارة نقل البروتين إلى الفضاء المحيطي للبكتيريا ، ثم يتم شق تسلسل الإشارة. يوفر الفضاء المحيطي بيئة مؤكسدة ، وهو أمر بالغ الأهمية للتكوين السليم لجسور ثاني كبريتيد. تستخدم الصدمة التناضحية لاشتقاق المستخلصات المحيطة بالبلازما لأنها تعطل الغشاء الخارجي بما يكفي لإطلاق البروتينات المحيطة في الوسط المحيط ، مع الحفاظ على البكتيريا سليمة.

  1. قم بتلقيح مخزون الجلسرين TG1 E. coli الذي يحتوي على البلازميدات ذات الصلة في مزرعة 60 مل من 2xYTAG والاستزراع طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 150 دورة في الدقيقة.
  2. للحث على التعبير البروتيني ، يتم زرع الحبيبات البكتيرية عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق ، وإعادة التعليق في 60 مل من وسط 2xYTA ، والاستزراع طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يساعد التبديل من 2xTYAG إلى وسيط 2xYTA في تحريض تعبير البروتين18 بشكل كاف. عندما يكون الجلوكوز موجودا في الوسط البكتيري ، يتم قمع مروج lac لأن البكتيريا تستهلك الجلوكوز بشكل تفضيلي وتتجاهل اللاكتوز ، حيث يستهلك الجلوكوز طاقة أقل للمعالجة. عند إزالة الجلوكوز بعد التبديل المتوسط ، تعتمد البكتيريا على الكربوهيدرات التي يوفرها الوسط 2xTY. يحتوي مستخلص الخميرة (المكون Y في 2xYT) على الكربوهيدرات ، من بينها اللاكتوز ، وبالتالي فهو قادر على دفع تعبير البروتين من خلال مروج lac. IPTG ليس ضروريا مع بنية pCANTAB ويمكن أن يؤدي إلى تعبير مفرط عن البروتين ، إلى جانب أجسام التضمين التي تؤدي إلى بروتين غير وظيفي.
  3. توليد مقتطفات حول البلازما عن طريق الصدمة التناضحية.
    1. مزارع بكتيرية بيليه عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق.
    2. أعد التعليق في 20 مل من 1xTES (0.2 M Tris-HCl pH 8.0 ، 0.5 mM EDTA ، 0.5 M sucrose) واحتضانها لمدة 1 ساعة على الجليد.
    3. حبيبات مرة أخرى عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق ، وأعد تعليقها في 15 مل من 0.05 متر تريس ، درجة الحموضة 7.6.
  4. احتضان هذا التعليق على الجليد لمدة 1 ساعة ، ثم أوضح عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق.
  5. انقل المواد الطافية إلى أنبوب جديد واحفظها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الحاجة إليها إما للتنقية أو الاستخدام المباشر في التجارب.
  6. تقييم تحلل الخلية من خلال وجود D11-BAP نشط في ELISA. أضف 3-5 ميكرولتر من المستخلص المحيطي إلى مل واحد من pNPP ، ثم لاحظ ما إذا كان تغيير اللون يحدث خلال ال 10 دقائق التالية (ينتقل اللون من الأصفر الصافي إلى الأصفر المكثف).
    ملاحظة: يمكن مقارنة اللون جنبا إلى جنب مع أنبوب pNPP الذي لم يتلق أي محللة أو أنبوب من pNPP الذي تلقى محللات من بكتيريا TG1 الساذجة. تحديد كمي مع امتصاص عند 405 نانومتر.

4. توصيف عيار D11-AP في ELISA

  1. قم بتغطية صفيحة بوليسترين 384 بئرا طوال الليل عند 4 درجات مئوية بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 25 ميكرولتر / بئر (PBS) (1.8 مللي متر KH 2 PO 4 ، 10 mM Na 2 HPO4 ،2.7mM KCl ، 137 mM NaCl) تحتوي إما على 5 ميكروغرام / مل من ألبومين مصل الفأر (MSA) (التحكم السلبي) ، أو 5 ميكروغرام / مل من IsoLG / MSA (التحكم الإيجابي).
  2. أفرغ الطبق وجففه. يغسل مرة واحدة مع PBS + 0.1٪ توين (PBS-T). أفرغ الطبق وجففه.
  3. املأ اللوحة ب PBS-T كمخزن مؤقت مانع (120 ميكرولتر / بئر). احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أفرغ الطبق وجففه. تطبيق التخفيفات التسلسلية 1: 2 من المستخلصات المحيطة ب D11-AP عند 25 ميكرولتر / بئر ومخففة في PBS-T. قم بتضمين بئر واحد يحتوي على PBS-T فقط كعنصر تحكم سلبي.
    ملاحظة: نطاقات التخفيف النموذجية للمستخلصات المحيطة هي 1: 8 - 1: 4096. بالنسبة لحجم فحص 25 ميكرولتر ، ابدأ ب 50 ميكرولتر من تركيز البدء "1: 8": 6.25 ميكرولتر مستخلص محيطي و 43.75 ميكرولتر PBS-T. بعد ذلك ، قم بإجراء تخفيف 2 أضعاف عن طريق إزالة 25 ميكرولتر من هذا المحلول وإضافته إلى البئر التالي الذي يحتوي على 25 ميكرولتر من PBS-T وماصة لأعلى ولأسفل. يحتوي هذا البئر الآن على التخفيف "1:16". استمر في تكرار التخفيف ثنائي الطي لإنشاء سلسلة التخفيف 1: 2 الموصوفة.
  5. احتضان لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. أفرغ الطبق وجففه. يغسل 5 مرات مع PBS-T. أفرغ وجفف.
  7. تحضير محلول pNPP عن طريق إذابة 1 جم من pNPP في 1 لتر من 930 mM ثنائي إيثانولامين (98٪ محلول مخزون مخفف 1:10 في H 2 O)، مع 0.5 mM MgCl2 وتعديله إلى الرقم الهيدروجيني 9.5 مع حمض الهيدروكلوريك.
  8. تطبيق 25 ميكرولتر / بئر محلول pNPP لتطوير AP. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وتحديد الامتصاص عند 405 نانومتر داخل كل بئر باستخدام قارئ لوحة متوافق.
  9. قارن الإشارة المتولدة من آبار IsoLG / MSA بالضوضاء الناتجة عن آبار MSA وابحث عن نطاق التخفيفات التي تكون فيها الإشارة أعلى بمقدار 5 أضعاف على الأقل من الضوضاء.
  10. ارسم سلسلة تخفيف إشارة D11-AP هذه على رسم بياني ، وحدد النطاق الخطي للمنحنى ، وحدد التخفيف حيث يمكن ملاحظة 50٪ من الإشارة.
    ملاحظة: إذا كان هذا التخفيف يعادل 1:1,000 تقريبا، فيمكن استخدام محلول D11-AP بتركيز 1:10 في IHC/IF.

5. التألق المناعي

  1. قطع المقاطع التسلسلية من الفئران والأنسجة البشرية المغروسة بالبارافين (بسمك 5 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم ووضعها في حمام ماء دافئ (37 درجة مئوية). قم بتركيب أقسام الأنسجة على شرائح زجاجية واتركها تجف طوال الليل.
    ملاحظة: لهذه الدراسة ، تم الحصول على الشريان الأورطي من الفئران. تم الحصول على أقسام القولون من البشر العاديين وارتفاع ضغط الدم من شبكة الأنسجة البشرية التعاونية فاندربيلت.
  2. اغمر الشرائح في الزيلين ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لإزالة الأنسجة من البارافين.
  3. إعادة ترطيب الأنسجة في غسلتين لكل من 95٪ و 70٪ و 50٪ من الإيثانول في H2O.
  4. اغسل الشرائح في محلول ملحي مخزن تريس (TBS) بنسبة 0.1٪ Tween20 (TBST) ثلاث مرات بغسل سريع عن طريق ملء حامل الشريحة ب TBST ثم التخلص من TBST.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح المائية في TBST عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع قبل استرجاع المستضد.
  5. لإجراء استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة للشرائح ، ضع الشرائح في محلول سترات الصوديوم المسخن مسبقا (80-95 درجة مئوية) (10 مللي متر سترات الصوديوم ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 6.0) واحتضانها في قدر ضغط مضبوط على 4 دقائق على ضغط مرتفع لوقت استرجاع مستضد إجمالي قدره 20 دقيقة.
  6. أخرجي الشرائح من قدر الضغط واتركيها تبرد لمدة 20 دقيقة إلى درجة حرارة الغرفة.
  7. اغسل الشرائح في TBST ثلاث مرات بغسل سريع.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في TBST بعد استرجاع المستضد لمدة لا تزيد عن أسبوع قبل تلطيخها.
  8. أضف 2٪ BSA مذاب في TBST لمنع الشرائح. قم بتغطية الشرائح بشريط من فيلم البارافين واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  9. تجاهل المخزن المؤقت للحظر من الشرائح.
  10. أضف 200 ميكرولتر من 1:10 D11-AP في TBST إلى الشرائح وقم بتغطيتها بشريط من فيلم البارافين.
  11. احتضان في غرفة مرطبة لتقليل تبخر محلول الأجسام المضادة لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  12. اغسل الشرائح ثلاث مرات في TBST.
  13. تطوير مع مطور الفوسفاتيز القلوي اللوني أو الفلوري للكيمياء المناعية أو التألق المناعي ، على التوالي. اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام TBST لإزالة المطور الزائد ومنع المزيد من تطور الألوان.
  14. ينزلق Counterstain مع صبغة Hoechst النووية عند 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني للتألق المناعي. اغسل الشرائح مرة واحدة في TBST لإزالة أي بقع مضادة زائدة.
  15. ضع أغطية باستخدام وسيط التثبيت.
  16. عرض الشرائح تحت مجهر ضوئي مقلوب للكيمياء المناعية أو مجهر فلوري متحد البؤر للتألق المناعي.

6. الضوابط السلبية

ملاحظة: يمكن إجراء أربع تجارب تحكم سلبية لتأكيد خصوصية تلطيخ D11-AP ل IsoLG. يجب إجراء تجارب التحكم السلبية في نفس مجموعة التلوين في نفس الظروف.

  1. في تجربة التحكم السلبية الأولى ، احتضان الأنسجة مع D11-AP المخفف في TBST أو TBST وحده.
  2. احتضان الأنسجة مع D11-AP المخفف في TBST واستخراج periplasmic البكتيرية دون D11-AP (AP Linker) المخفف في TBST.
  3. قم بإجراء اختبار تنافسي باستخدام IsoLG / MSA أو MSA غير المقرب كما هو موضح سابقا12.
    1. تحضير IsoLG و IsoLG المقرب إلى ألبومين مصل الفأر (MSA) كما هو موضح سابقا19 ، بنسبة مولية تبلغ 8 IsoLG: 1 MSA (8: 1 IsoLG / MSA).
    2. تمييع D11-AP 1:10 في TBST.
    3. احتضان D11-AP المخفف مع 50 ميكروغرام / مل IsoLG / MSA أو MSA غير مقرب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. أضف D11-AP مع IsoLG / MSA أو D11-AP مع MSA غير المقرب إلى الأنسجة للتلطيخ.
  4. استخدم الجسم المضاد SCFV غير ذي الصلة ، D20 ، لتلطيخ الأنسجة لمجموعة التحكم السلبية النهائية.

Representative Results

في التجارب التمثيلية ، تم استخدام D11 scfv مع اقتران الفوسفاتيز القلوي (D11-AP) في التألق المناعي للكشف عن IsoLGs الموجودة في الفئران المعالجة بالأنجيوتنسين II مقارنة بالفئران الوهمية العادية والبشر المصابين بارتفاع ضغط الدم مقارنة بالبشر العاديين الضغط. عولجت الفئران بالأنجيوتنسين II بجرعة 490 نانوغرام / كجم / دقيقة لمدة أسبوعين ، وتم تأكيد ارتفاع ضغط الدم مع زيادة ضغط الدم الانقباضي مقارنة بالفئران الوهمية10. لضمان خصوصية D11-AP ، تم تلطيخ الأنسجة مع أو بدون وجود D11-AP. كما هو موضح في تلطيخ D11-AP ، أظهر الشريان الأورطي للفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين II تركيزا مرتفعا من IsoLGs عند مقارنته بالفئران الضابطة (الشكل 1). كان تلطيخ الخلفية أو التألق الذاتي محدودا ، كما هو موضح في عناصر التحكم السلبية التي لم تكن ملطخة ب D11-AP.

تم استخدام D11-AP للكشف عن IsoLGs الموجودة في الأنسجة المعوية للمرضى البشريين المصابين بارتفاع ضغط الدم (HTN) أو البشر العاديين (NTN). تم تحديد حالة ارتفاع ضغط الدم من سجلات المستشفى مثل ضغط الدم الانقباضي فوق 140 وضغط الدم الانبساطي فوق 80 مم زئبق. الباحثون الذين طوروا بروتوكول التألق المناعي ل D11-AP أعمى عن حالة ارتفاع ضغط الدم في الأنسجة البشرية. تم تلطيخ المقاطع في وجود وغياب D11-AP لضمان خصوصية الأجسام المضادة وإظهار تلطيخ الخلفية أو التألق الذاتي. كما هو موضح في الشكل 2 ، وجدنا أن الأنسجة من المرضى الذين يعانون من HTN لديها تركيزات مرتفعة من IsoLGs مقارنة بالمرضى الذين يعانون من NTN. أظهر التلوين بدون D11-AP أيضا الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية والتألق الذاتي. يتم التعبير عن الفوسفاتيز القلوي الداخلي المنشأ بواسطة ظهارة معوية ، وبالتالي فإن التألق المحدود للأنسجة الملطخة بدون D11-AP يظهر أن استرجاع المستضد المستخدم في هذا البروتوكول كان كافيا في تعطيل الفوسفاتيز القلوي الداخلي الموجود في الأنسجة. بالاقتران مع النتائج في الفئران ، تظهر هذه النتائج أيضا أن بروتوكول التألق المناعي يظهر بشكل فعال ارتفاع IsoLGs في ارتفاع ضغط الدم عند مقارنته بالحالة المعيارية للضغط.

تم عزل D11-AP وتخزينه في المستخلص البكتيري حول البلازموم. تم تلطيخ أنسجة الفئران والأنسجة البشرية ب D11-AP والمستخلص المحيطي الذي يحتوي على رابط AP بدون D11 للتأكد من أن العوامل الأخرى التي قد تكون موجودة في المستخلص المحيطي ، مثل الفوسفاتيز القلوي الزائد أو غير المقترن ، لا تساهم في التلوين الملاحظ في الأنسجة المعالجة ب D11-AP (الشكل 3). أدت الأنسجة الملطخة ب D11-AP إلى تلطيخ أكثر إشراقا مقارنة بالأنسجة الملطخة بمستخلص محيطي. تؤكد هذه النتائج أن D11-AP يلطخ الأنسجة ، وأن التلوين ليس بسبب الفوسفاتيز القلوي البكتيري غير المترافق الذي يمكن أن يكون موجودا في المستخلص المحيطي ويؤدي إلى تلطيخ خاطئ ل IsoLGs أو يساهم في تلطيخ الخلفية.

تم إجراء مراقبة تنافسية عن طريق احتضان D11-AP مسبقا مع IsoLG المقرب إلى MSA أو MSA غير المقرب قبل تلطيخ الأنسجة لإظهار خصوصية D11-AP إلى IsoLG. إذا كان D11-AP خاصا ب IsoLG ، فإن الجسم المضاد سيرتبط ب IsoLG-MSA ، مما يؤدي إلى استنفاد توافر D11-AP لتلطيخ الأنسجة ، وسيكون ل D11-AP المحتضن ب MSA غير المقرب تلطيخ مماثل ل D11-AP العادي. في الأنسجة الملطخة ب D11-AP المحتضنة مسبقا مع منافس IsoLG ، وجدنا تلطيخا متناقصا مقارنة بالأنسجة الملطخة ب D11-AP دون أي حضانة مسبقة (الشكل 4). في الأنسجة الملطخة ب D11-AP المحتضنة مسبقا مع MSA غير المقرب ، وجدنا أن التلوين مشابه للتلطيخ الذي لوحظ في الأنسجة التي تحتوي على D11-AP. تظهر هذه النتائج خصوصية D11-AP إلى IsoLGs بسبب انخفاض تلطيخ الأنسجة عندما تم تحضين D11-AP مسبقا مع IsoLG / MSA ، ولكن ليس MSA غير المقتبس. في السيطرة السلبية النهائية ، تم تلطيخ أنسجة الفئران ب D11-AP أو الجسم المضاد scFv غير ذي الصلة ، D20. أدى تلطيخ الشريان الأورطي للفأر باستخدام D11-AP إلى تلطيخ قوي مقارنة ب D20 مما يشير إلى خصوصية D11-AP إلى IsoLGs في الشريان الأورطي لارتفاع ضغط الدم (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: التألق المناعي للشريان الأورطي في الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم وضغط الدم الطبيعي. تم تلطيخ الشرايين من الأنجيوتنسين II والفئران الوهمية مع وبدون D11-AP (D11) لإظهار وجود IsoLGs. (أ) شريان من فأر معالج بالأنجيوتنسين II تم فحصه باستخدام D11-AP (أخضر) ومضاد نووي (أرجواني) ، (ب) شريان من فأر معالج بوهمية تم فحصه باستخدام D11-AP ، (ج) شريان من فأر معالج بالأنجيوتنسين II بدون D11-AP ، (د) شريان من فأر معالج بوهمية تحكم بدون D11-AP (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التألق المناعي للأنسجة المعوية البشرية من مرضى ارتفاع ضغط الدم وضغط الدم الطبيعي. تم تلطيخ الأنسجة من المرضى الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم (HTN) والبشر العاديين (NTN) مع وبدون D11-AP (D11) لإظهار وجود IsoLGs في المرضى الذين يعانون من HTN. (أ) أنسجة HTN ملطخة ب D11-AP (أخضر) وصبغة مضادة نووية (أرجواني) ، (ب) أنسجة NTN ملطخة ب D11-AP ، (ج) أنسجة HTN ملطخة بدون D11-AP ، (د) أنسجة NTN ملطخة بدون D11-AP (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: فأر وأنسجة بشرية ملطخة بمستخلص محيطي مع D11-AP وبدونه. تم تلطيخ الفئران والأنسجة البشرية بمستخلصات محيطية مع وبدون D11-AP. تظهر الصور تلطيخا محدودا للأنسجة بمستخلص محيطي بدون D11-AP ، مما يدل على أن التلوين يرجع في الغالب إلى ارتباط D11-AP بدلا من مكون آخر قد يكون موجودا في المستخلص المحيطي. (أ) الشريان الأورطي للفأر Ang الملطخ ب D11-AP (أخضر) و antistain نووي (أرجواني) ، (B) الشريان الأورطي للفأر Ang ملطخ بمستخلص محيطي ، (C) الشريان الأورطي للفأر الشامي الملطخ ب D11-AP ، (د) الشريان الأورطي للفأر الشامي الملطخ بمستخلص محيطي ، (ه) الأنسجة المعوية البشرية لارتفاع ضغط الدم الملطخة ب D11-AP ، (F) الأنسجة المعوية البشرية ارتفاع ضغط الدم الملطخة بمستخلص periplasmic ، (G) الأنسجة المعوية البشرية المعيارية الملطخة ب D11-AP ، (H) الأنسجة المعوية البشرية المعيارية الملطخة بمستخلص محيطي (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحكم التنافسي في أوعية فئران أنج والشام. في هذه الرقابة التنافسية ، تم تحضين D11-AP مسبقا باستخدام MSA المقترب من IsoLG أو MSA غير المقتبس. تم استخدام D11-AP دون أي حضانة مسبقة كعنصر تحكم. تظهر هذه النتائج خصوصية D11-AP إلى IsoLGs لأن هناك انخفاضا في تلطيخ الأنسجة مع منافس IsoLG-MSA مقارنة ب D11-AP. يرجع هذا الانخفاض إلى IsoLG وليس MSA لأن الحضانة المسبقة ل MSA غير المقترضة أدت إلى تلطيخ مشابه للتحكم D11-AP. أنجيوتنسين II (A) والشام (B) الشريان الأورطي للفأر الملطخ ب D11-AP (أخضر) ومضاد نووي (أرجواني) ، أنجيوتنسين II (C) و شام (D) الشريان الأورطي للفأر ملطخ ب D11-AP بعد احتضانه ب IsoLG-MSA و Angiotensin II (E) و Sham (F) الشريان الأورطي للفأر الملطخ ب D11-AP بعد احتضانه ب MSA غير المقرب (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الشريان الأورطي للفأر ملطخ ب D11 و scFv غير ذي صلة ، D20. تم تلطيخ أنسجة الفئران ب D11-AP ومقارنتها بجسم مضاد تحكم غير ذي صلة ، D20 ، وهو خاص بالبروتين السكري A2. أدى تلطيخ الأنسجة باستخدام D11-AP (أخضر) ومضاد نووي (أرجواني) (A) إلى تألق مناعي مكثف مقارنة ب D20 (أخضر) ومضاد نووي (أرجواني) (B) مما يشير إلى خصوصية D11-AP إلى IsoLGs (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تم استخدام D11 على نطاق واسع للكشف عن البروتينات المقترب من IsoLG في الخلايا أو الأنسجة كعلامة للالتهاب أو الإجهاد التأكسدي في المرض8،9،20. في السابق ، احتوى D11 على علامة E وتطلب تطوير IHC استخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للعلامة E مترافق مع HRP10،20،21. هنا ، قمنا بتطوير وتحسين بروتوكول للكشف عن البروتينات المقترب من IsoLG باستخدام الجسم المضاد D11 المترافق مع الفوسفاتيز القلوي بدلا من E-tag ، مما يلغي الحاجة إلى حضانة ثانوية للأجسام المضادة.

لتحديد خصوصية D11-AP ، تم إجراء أربع تجارب تحكم سلبية. قمنا بتنفيذ البروتوكول دون وجود D11 وكان لدينا الحد الأدنى من التطوير. هذه النتائج لها مؤشر مزدوج: الفوسفاتيز القلوي الداخلي لا يساهم في التطور ، والتلوين الملاحظ يرجع إلى D11 وليس عاملا مساهما آخر. بعد ذلك ، قمنا بتلوين الشرائح باستخدام رابط AP بدون D11. أسفرت هذه التجربة عن القليل من التلوين ، مما يشير إلى أن AP الحر أو عوامل أخرى في المستخلص المحيطي لا تسبب البقعة التي نلاحظها في وجود D11. لضمان خصوصية D11 إلى IsoLG ، قمنا باحتضان D11-AP مسبقا باستخدام IsoLG المنقى قبل تلطيخ الشرائح. لقد رأينا انخفاضا في التطور مما يشير إلى أن D11-AP كان مرتبطا ببروتين IsoLG ، وبالتالي استنفاد كمية D11-AP المجانية لربطها ب IsoLG الموجود في الأنسجة. أخيرا ، للتأكد من أن D11-AP كان مرتبطا ب IsoLG وليس بروتين MSA الذي كان IsoLG ملزما به ، قمنا باحتضان D11-AP مسبقا مع MSA فقط. لم تكن هناك تغييرات في التطوير ، مما يشير إلى أن D11-AP لم يكن مرتبطا ب MSA ولكن بروتين IsoLG. أخيرا ، كان الباحثون الذين طوروا بروتوكول التلوين أعمى عن حالة ارتفاع ضغط الدم للأنسجة المعوية البشرية. الاختلافات في التلوين التي لوحظت بين المرضى الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم والمرضى الذين يعانون من ضغط الدم الطبيعي لم تكن بسبب التحيز وقد تم وصفها سابقا22،23.

على الرغم من أن بروتوكولنا للكشف عن البروتينات المقترب من IsoLG باستخدام الجسم المضاد D11 المترافق مع الفوسفاتيز القلوي بدلا من E-tag صارم وقوي ويلغي الحاجة إلى حضانة ثانوية للأجسام المضادة ، إلا أنه يحتوي على بعض القيود. أحد القيود هو أننا استخدمنا D11 مترافقا مع الفوسفاتيز القلوي في المستخلص المحيطي ، ويمكن أن يكون هناك تلطيخ خاطئ للفوسفاتيز القلوي الداخلي في المستخلص المحيطي أو أنسجة معينة ، مثل الأمعاء24. ومع ذلك ، تضمنت الخطوة الأولى لتطوير هذا البروتوكول تعطيل الفوسفاتيز القلوي الداخلي الذي قد يكون موجودا في الأنسجة25. في البداية ، تم اختبار حمض الأسيتيك البارد ، BME ، و Levamisole26 من أجل الكفاءة. لم يقلل أي من هذه تماما من وجود الفوسفاتيز القلوي الداخلي النشط. تم استخدام الحرارة لإلغاء تنشيط الفوسفاتيز القلوي 27 ، لذلك اختبرنا التعطيل الحراري للفوسفاتيزالقلوي في مخازن مختلفة. وجدنا أن الشرائح المثبتة على التسخين والرطبة في المخزن المؤقت للسيترات تقضي على معظم الفوسفاتيز القلوي الداخلي. تم تطوير الشرائح في البداية باستخدام ركيزة كيميائية / فلورية ، ولكن عند تصويرها بدون هذه الركيزة ، كان هناك قدر كبير من التألق الذاتي. VectorRed هو ركيزة تتطور في وجود الفوسفاتيز القلوي لإنتاج كروموجين يمكن تصوره في نطاق قناة Texas Red / TRITC. باستخدام هذه الركيزة ، تمكنا من مراقبة الإشارة بسهولة أكبر فوق التألق الذاتي في الخلفية. يجب توخي الحذر أثناء عملية التلوين لتقليل تلطيخ الأضرار. تجفيف الأنسجة على الشرائح بعد الترطيب حتى يؤدي التصوير إلى زيادة التطور. يجب تسعير D11-AP وتخزينه عند -20 درجة مئوية. يجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة عند العمل مع D11-AP. يمكن أن يؤثر المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) أيضا على النشاط الأنزيمي للفوسفاتيز القلوي ويجب عدم استخدامه كمخزن مؤقت للغسيل28. كما هو الحال مع أي نهج قائم على الأجسام المضادة ، يجب إجراء اختبار شامل وتحسين للتأكد من أن التلوين محدد ، وأن الإشارة ليست أكثر أو أقل تضخيما.

في الختام ، قمنا بتطوير بروتوكول محسن قوي وصارم وقوي للكشف عن البروتينات المقترب من IsoLG باستخدام الجسم المضاد D11 المترافق مع الفوسفاتيز القلوي بدلا من E-tag. يقدم هذا البروتوكول العديد من المزايا: أولا ، استخدام D11 كبروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي أرخص. تم اشتقاق D11 في الأصل من مكتبة الأجسام المضادة للعاثيات التي لا يمكن تسويقها وكانت مكلفة لتنقيتها. على الرغم من أن D11 في مستخلص E. coli periplasmic يمكن أن يوفر بديلا غير مكلف ، إلا أنه كان غير فعال في معظم المقايسات. ثانيا ، يسمح نهج اندماج الفوسفاتيز القلوي ل D11 scfv بالحصول على مراسل مفيد15 (الفوسفاتيز القلوي) مدمج فيه ولن يحتاج إلى تنقية لاستخدامه في المقايسات المناعية حيث أن الركائز متوفرة تجاريا. ثالثا ، يشكل الفوسفاتيز القلوي E. coli dimers29. لذا فإن D11 ، عند اندماجه في الفوسفاتيز القلوي ، سيشكل أيضا دايمرات وهذا يزيد من نشاط الجسم المضاد وارتباطه30. أخيرا ، يمكن بسهولة تنظيف D11 المترافق مع الفوسفاتيز القلوي في المستخلص المحيطي باستخدام Cibacron Blue Sepharose. D11 لديه نقطة متساوية الكهربية عالية (~ 9.2 درجة الحموضة). على هذا النحو ، يتم شحنه بشكل إيجابي ويمكن أن يرتبط ب Cibacron Blue من خلال تفاعلات pi-cation. يمكن إزالة معظم الشوائب الموجودة في مستخلص الإشريكية القولونية من الراتنج. يمكن بعد ذلك استخلاص D11 المترافق مع الفوسفاتيز القلوي باستخدام ملح عالي (~ 1.5M NaCl) في الماء. D11 المستحضر المترافق مع الفوسفاتيز القلوي مستقر تماما عند 4-8 درجة مئوية في محلول الملح العالي. وبالتالي ، قمنا بتطوير بروتوكول لا يجعل الجسم المضاد D11 متاحا بتكلفة منخفضة فحسب ، بل يلغي أيضا الخطوات الإضافية والحاجة إلى حضانة الأجسام المضادة الثانوية. يسهل هذا البروتوكول القياس القابل للتكرار ل IsoLGs ، والتي تتراكم في الأنسجة في أمراض متعددة حيث يلعب الإجهاد التأكسدي المتزايد دورا.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة K01HL130497 و R01HL147818 و R01HL144941 و R03HL155041 إلى A.K. نشكر المورد المشترك للأنسجة الرقمية - https://www.vumc.org/dhsr/46298 فاندربيلت هيلث ناشفيل ، تينيسي للتصور ومسح الشرائح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) Cytiva 28953766
200 Proof Ethanol Pharmco 111000200
2xYT powder MP Biomedicals 3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates ThermoFisher (NUNC) 242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) Carbosynth EN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) Carbosynth EB09335
Ampicillin, sodium salt Research Products International (RPI) A40040
Bovine Serum Albumin RPI A30075
Chemically competent TG1 E. coli Amid Biosciences TG1-201
Diethanolamine, >98% Sigma-Aldrich D8885
EDTA Sigma-Aldrich ED
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Mouting medium
Glucose Research Products International (RPI) G32045
Glycerol Sigma-Aldrich G7893
Histoclear National Diagnostics HS-200 Xylene alternative
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals ThermoFisher MK-2624-212
Imidazole Research Products International (RPI) I52000
MgCl2 (anhydrous) Sigma-Aldrich M8266
Mouse Serum Albumin (MSA) Sigma-Aldrich/Calbiochem 126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) Carbosynth EN13587
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Pressure Cooker Cuisinart CPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml ThermoFisher 66380
Sodium chloride (NaCl) Research Products International (RPI) S23020
Sodium Citrate Sigma-Aldrich 1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Research Products International (RPI) S23100
Sucrose Research Products International (RPI) S24065
Tris base Research Products International (RPI) T60040
Tris-buffered Saline Boston Bio-Products 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HCl Research Products International (RPI) T60050
Tween20 Sigma-Aldrich P9416
Vector Red Vector Labs SK-5105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56 (2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650 (2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418 (2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46 (2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

Tags

علم الأحياء ، العدد 173 ، isolevuglandins ، التألق المناعي ، الأجسام المضادة الفوسفاتيز القلوية المترافقة ScFv D11 ، وارتفاع ضغط الدم

Erratum

Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

الكشف المباشر عن الأيزوليفوغلاندين في الأنسجة باستخدام بروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي D11 scFv والتألق المناعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic,… More

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic, L., Pitzer, A., Davies, S. S., Layer, J. H., Mernaugh, R. L., Kirabo, A. Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (173), e62603, doi:10.3791/62603 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter