Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direkt detektion av isolevuglandiner i vävnader med användning av ett D11 scFv-alkaliskt fosfatasfusionsprotein och immunofluorescens

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62603
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4,6, 4, 5, 3, 4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denna artikel ger en detaljerad metod för mätning av isolevuglandiner i vävnader genom immunofluorescens med användning av alkalisk fosfataskonjugerad ScFv D11-antikropp. Hypertonimodeller hos både möss och människor används för att förklara steg-för-steg-procedurer och grundläggande principer associerade med isolevuglandinmätning i vävnadsprover.

Abstract

Isolevuglandiner (IsoLGs) är mycket reaktiva gammaketoaldehyder bildade från H2-isoprostaner genom lipidperoxidation och tvärbindningsproteiner som leder till inflammation och olika sjukdomar inklusive högt blodtryck. Detektion av IsoLG-ackumulering i vävnader är avgörande för att belysa deras engagemang i sjukdomsprocesserna. Mätning av IsoLGs i vävnader är dock extremt svårt, och för närvarande tillgängliga verktyg, inklusive masspektrometrianalys, är mödosamma och extremt dyra. Här beskrivs en ny metod för in situ-detektion av IsoLGs i vävnader med användning av alkaliskt fosfataskonjugerat D11 ScFv och en rekombinant fagdisplayantikropp producerad i E. coli genom immunofluorescerande mikroskopi. Fyra kontroller användes för att validera färgningen: (1) färgning med och utan D11, (2) färgning med bakteriellt periplasmatiskt extrakt med alkalisk fosfataslänkare, (3) irrelevant scFV-antikroppsfärgning och (4) konkurrenskontroll med IsoLG före färgningen. Vi demonstrerar effektiviteten av den alkaliska fosfataskonjugerade D11 i både humana och musvävnader med eller utan hypertoni. Denna metod kommer sannolikt att fungera som ett viktigt verktyg för att studera rollen av IsoLGs i en mängd olika sjukdomsprocesser.

Introduction

Isolevuglandiner (IsoLG), även kända som isoketaler, är isomerer av 4-ketoaldehydfamiljen, som är produkter av lipidperoxidation, och reagerar med och addukterar till primära aminer på proteiner 1,2. IsoLGs har varit inblandade i flera sjukdomar, inklusive kardiovaskulära, Alzheimers, lung- och leversjukdomar och många typer av cancer3. IsoLGs har studerats mest omfattande i deras bidrag till hjärt-kärlsjukdom (CVD), vilket är en betydande hälso- och ekonomisk börda globalt, inklusive USA. Det uppskattas att 92.1 miljoner amerikanska vuxna har minst en typ av CVD, med 2030 uppskattade prognoser som når 43.9% av den amerikanska vuxna befolkningen4. Att sänka blodtryck, kolesterol och rökavvänjning minskar den totala risken och förekomsten av CVD-händelser5.

Högt blodtryck eller högt blodtryck är en viktig riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom och drabbar ungefär hälften av den amerikanska befolkningen6. Tidigare studier har visat att inflammation är en bakomliggande orsak till högt blodtryck och att IsoLGs spelar en roll7. Hypertensiva stimuli, inklusive angiotensin II, katekolaminer, aldosteron och överskott av dietsalt, inducerar IsoLG-ackumulering i antigenpresenterande celler inklusive dendritiska celler (DC), som i sin tur aktiverar T-celler att proliferera och producera inflammatoriska cytokiner som bidrar till hypertoni 8,9.

Tidigare har IsoLGs mätts med immunhistokemi, masspektrometri, enzymkopplad immunosorbentanalys och flödescytometri10,11. För att underlätta mätningen av IsoLGs utvecklades en single-chain fragment variable (scfv) rekombinant antikropp (D11) mot IsoLGs12. Ursprungligen innehöll denna D11-antikropp en 11 aminosyra E-tag och krävde en sekundär antikropp för immunohistokemidetektion11. Det var dock svårt att hitta en tillförlitlig sekundär antikropp mot E-tag efter att tillverkaren avbröt sin produktion. Därför har vi utvecklat ett tillförlitligt protokoll för immunofluorescerande färgning av IsoLGs med D11 konjugerat med alkaliskt fosfatas (D11-AP), vilket vi har visat i mus- och humanvävnader med och utan hypertoni.

Protocol

Vanderbilt University's Institutional Animal Care and Use Committee godkände alla procedurer som beskrivs i detta manuskript. Möss hålls och vårdas i enlighet med Vägledning för vård och användning av försöksdjur. Alla försökspersoner gav skriftligt informerat samtycke innan de anmälde sig till studien som godkänts av Institutional Review Board vid Vanderbilt University. Alla procedurer utfördes enligt Helsingforsdeklarationen.

1. Beredning av plasmider som kodar för D11-alkaliskt fosfatasfusionsprotein och negativa kontrollvektorer

  1. Konstruera en modifierad version av plasmiden pCANTAB5E13,14 där segmentet med enkelkedjefragmentvariabel (scFv) vid dess 3'-ände är länkat till en sekvens som kodar för bakteriellt alkaliskt fosfatas (AP).
    OBS: Omedelbart nedströms scFv-sekvensens NotI-restriktionsställe innehåller den modifierade plasmiden inte längre kodningssekvensen för E-taggen och kodar istället länksekvensen GGSGGHMGSGG, följt av sekvensen för AP (GenBank anslutningsnummer AXY87039.1, T16-K464)15,16. Nedströms AP kommer plasmiden att koda 8xHis och DYKDDDDK-taggar. I slutet av taggarna 3' slutar kodningssekvensen med ett bärnstensstoppkodon. Den modifierade plasmiden kallas pCANTAB5-AP.
  2. Klona D11 scFv (GenBank anslutningsnummer AAW28931.1) till pCANTAB5-AP med SfiI / NotI-begränsningsplatserna.
  3. Klona D20 scFv till pCANTAB5-AP med SfiI / NotI-begränsningsplatserna.
    OBS: D20 scFv är en negativ kontroll utformad för att bedöma vävnadsinteraktionsmönstret för en irrelevant scFv. Denna scFv valdes ursprungligen av fagdisplay för dess förmåga att interagera med en glykangrupp som kallas A2.
  4. Generera en "tom" vektor genom att ta bort scFv-delen från plasmiden helt och ersätta den med en "AP-länkare" kodande sekvens bestående av aminosyror GGGGSGRAGSGGGGS.
  5. Omvandla alla plasmider till kompetenta TG1 E. coli och odla bakterier över natten vid 30 °C, på 0,5% agarplattor innehållande 2xYT kompletterat med 100 μg/ml ampicillin och 2% glukos (2xYTAG) medium.
    OBS: Stammar med supE-genen (såsom TG1 E. coli) undertrycker inte det gula stoppkodonet 100%. Uppskattningar varierar från 0,8 - 20% av tiden, så det finns fortfarande mycket produkt som slutar strax nedströms BAP, eftersom den är avsedd för dessa experiment17. TG1 E. coli används huvudsakligen av praktiska skäl, såsom minskning av tid och kostnader, deras kompatibilitet med pCANTAB-proteinuttryckssystemet och deras användning i fagdisplay, som vanligtvis utförs i laboratoriet. Nedströms det gula stoppkodonet efter BAP finns en sekvens för genIII. GeneIII-fusionsproteiner behöver uttryckas sällan för att fagdisplayen ska fungera som avsett eftersom scFv-geneIII-fusionsproteiner stör det specifika genIII-proteinet för att återinfektera naiva bakterier. Därför måste fusionsfria geneIII-proteiner existera under virionmontering för generering av fungerande, dvs scFv-geneIII-proteinprodukter är vanligtvis relativt sällsynta inuti bakterien. D11-AP, D20-AP, tom vektor och alla konstruktioner som används i denna artikel påverkas alla på samma sätt av enstaka geneIII-fusionsproteinuttryck. Det finns fortfarande observerade skillnader i hur dessa proteiner beter sig.
  6. Välj en enskild koloni och inokulera en ny 5 ml 2xYTAG-kultur. Låt bakterier växa över natten vid 30 °C och skaka vid 150 rpm.
  7. Pellet cellerna genom centrifugering vid 3 000 x g i 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 2 ml 85% 2xYTAG och 15% glycerol.
  8. Förvara glycerollagren i en frys på -80 °C.

2. Proteinuttryck och generering av periplasmatiskt extrakt

OBS: Generering av det periplasmatiska extraktet är en vanlig metod för proteinuttryck i fagvisning, främst på grund av att bildandet av disulfidbindningar är viktigt vid scFv och antikroppsgenerering. Metoden undviker behovet av att generera lysater (vanligen innehållande inklusionskroppar) och säkerställer att proteiner viks ordentligt. pCANTAB har en gIII-signalsekvens uppströms scFv-delen av fusionsproteinet D11-BAP. Signalsekvensen säkerställer att proteinet skickas till bakteriens periplasmatiska utrymme, och sedan klyvs signalsekvensen. Det periplasmatiska utrymmet ger en oxiderande miljö, vilket är avgörande för korrekt bildning av disulfidbroar. Osmotisk chock används för att härleda periplasmatiska extrakt eftersom det stör det yttre membranet tillräckligt för att frigöra de periplasmatiska proteinerna i det omgivande mediet, samtidigt som bakterien hålls intakt.

  1. Inokulera TG1 E. coli-glycerolstam som innehåller de relevanta plasmiderna i en 60 ml kultur av 2xYTAG och kultur över natten vid 30 °C med skakning vid 150 rpm.
  2. För att inducera proteinuttryck, pelletbakteriekulturer vid 3 000 x g i 10 minuter, resuspendera i 60 ml 2xYTA-medium och odla över natten vid 30 °C med skakning vid 150 rpm.
    OBS: Bytet från 2xTYAG till 2xYTA-medium hjälper till med tillräcklig induktion av proteinuttryck18. När glukos är närvarande i bakteriemediet undertrycks lac-promotorn eftersom bakterier företrädesvis konsumerar glukos och ignorerar laktos, eftersom glukos tar mindre energi att bearbeta. När glukos avlägsnas efter medieomkopplaren är bakterier beroende av kolhydraterna som tillhandahålls av 2xYT-mediet. Jästextrakt (Y-komponenten i 2xYT) innehåller kolhydrater, bland dem laktos, och kan därför driva proteinuttryck genom lac-promotorn. IPTG är inte nödvändigt med pCANTAB-konstruktionen och kan resultera i överdrivet proteinuttryck, tillsammans med inklusionskroppar som resulterar i icke-funktionellt protein.
  3. Generera periplasmatiska extrakt via osmotisk chock.
    1. Pelletbakteriekulturer vid 3 000 x g i 10 min.
    2. Resuspendera i 20 ml 1xTES (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M sackaros) och inkubera i 1 timme på is.
    3. Pellet igen vid 3 000 x g i 10 minuter och resuspendera i 15 ml 0,05 M Tris, pH 7,6.
  4. Inkubera suspensionen på is i 1 timme och klargör sedan genom centrifugering vid 5 000 x g i 10 minuter.
  5. Överför supernatanterna till ett nytt rör och förvara vid -20 °C tills de behövs för antingen rening eller direkt användning i experiment.
  6. Bedöm celllysen genom närvaro av aktiv D11-BAP i ELISA. Tillsätt 3-5 μL av det periplasmatiska extraktet till en ml pNPP, observera sedan om en färgförändring sker under de närmaste 10 minuterna (färgen går från klargul till intensiv gul).
    OBS: Färgen kan jämföras sida vid sida med ett rör av pNPP som inte har fått något lysat eller ett rör av pNPP som fått lysat av naiva TG1-bakterier. Kvantifiera med absorbans vid 405 nm.

4. Karakterisering av D11-AP-titer i ELISA

  1. Täck en polystyrenplatta med 384 brunnar över natten vid 4 °C med 25 μl/brunn fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (1,8 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na 2 HPO4,2,7mM KCl, 137 mM NaCl) innehållande antingen 5 μg/ml serumalbumin (MSA) på mus (negativ kontroll) eller 5 μg/ml IsoLG/MSA (positiv kontroll).
  2. Töm plattan och tryck torrt. Tvätta en gång med PBS + 0,1% Tween (PBS-T). Töm plattan och tryck torrt.
  3. Fyll plattan med PBS-T som en blockerande buffert (120 μl/brunn). Inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
  4. Töm plattan och tryck torrt. Applicera seriella 1:2-spädningar av periplasmatiska D11-AP-extrakt vid 25 μl/brunn och späd i PBS-T. Inkludera en brunn som endast innehåller PBS-T som en negativ kontroll.
    OBS: Typiska spädningsintervall för periplasmatiska extrakt är 1:8 - 1:4096. För en analysvolym på 25 μl börjar du med 50 μl av utgångskoncentrationen "1:8": 6,25 μl periplasmatiskt extrakt och 43,75 μl PBS-T. Utför sedan en 2-faldig utspädning genom att avlägsna 25 μL av denna lösning och tillsätta den till nästa brunn innehållande 25 μL PBS-T och pipettera den upp och ner. Denna brunn innehåller nu utspädningen "1:16". Fortsätt att upprepa den 2-faldiga utspädningen för att generera den beskrivna spädningsserien 1:2.
  5. Inkubera i 1,5 h vid rumstemperatur.
  6. Töm plattan och tryck torrt. Tvätta 5 gånger med PBS-T. Töm och tryck torrt.
  7. Bered pNPP-lösning genom att lösa 1 g pNPP i 1 liter 930 mM dietanolamin (98 % stamlösning utspädd 1:10 iH2O), med 0,5 mMMgCl2 och justerad till pH 9,5 med HCl.
  8. Applicera pNPP-lösning med 25 μl/brunn för att utveckla AP. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur och bestäm absorbansen vid 405 nm i varje brunn med en kompatibel plattläsare.
  9. Jämför signalen som genereras från IsoLG/MSA-brunnarna med bruset som genereras från MSA-brunnarna och hitta utspädningsområdet där signalen är minst 5 gånger högre än bruset.
  10. Plotta denna D11-AP-signalutspädningsserie på ett diagram, bestäm kurvans linjära område och bestäm utspädningen där 50% av signalen kan observeras.
    Om denna spädning motsvarar ca 1:1 000 kan D11-AP-lösningen användas i en koncentration på 1:10 i IHC/IF.

5. Immunofluorescens

  1. Skär seriella sektioner av mus- och humant paraffininbäddade vävnader (5 μm tjocka) med hjälp av en mikrotom och placera dem i ett varmt vattenbad (37 °C). Montera vävnadssektioner på glasskivor och låt torka över natten.
    OBS: För denna studie erhölls aortae från möss. Kolonsnitt av normotensiva och hypertensiva människor erhölls från Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network.
  2. Fördjupa glidbanor i xylen tre gånger i 5 minuter för att deparaffinisera vävnader.
  3. Rehydrera vävnader i 2 tvättar vardera av 95%, 70% och 50% etanol iH2O.
  4. Tvätta rutschkanor i Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 0,1 % Tween20 (TBST) tre gånger med snabbtvätt genom att fylla glidhållaren med TBST och sedan kassera TBST.
    OBS: Hydratiserade glas kan förvaras i TBST vid 4 °C i högst en vecka före antigenuttag.
  5. För att utföra värmeinducerad antigenhämtning av objektglas, placera objektglas i förvärmd (80-95 °C) natriumcitratbuffert (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) och inkubera i en tryckkokare inställd på 4 min vid högt tryck för en total antigenhämtningstid på 20 min.
  6. Ta bort objektglasen från tryckkokaren och låt dem svalna i 20 minuter till rumstemperatur.
  7. Tvätta rutschkanor i TBST tre gånger med snabbtvätt.
    OBS: Glas kan lagras i TBST efter antigenhämtning i högst en vecka före färgning.
  8. Tillsätt 2% BSA upplöst i TBST för att blockera bilder. Täck glasen med en remsa paraffinfilm och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
  9. Ta bort blockeringsbufferten från bilderna.
  10. Tillsätt 200 μL 1:10 D11-AP i TBST till bilderna och täck med en remsa paraffinfilm.
  11. Inkubera i en fuktad kammare för att minimera avdunstningen av antikroppslösningen i 3 timmar vid rumstemperatur.
  12. Tvätta rutschkanor tre gånger i TBST.
  13. Utveckla med en kolorimetrisk eller fluorescerande alkalisk fosfatasutvecklare för immunhistokemi respektive immunofluorescens. Tvätta bilder en gång med TBST för att ta bort överflödig utvecklare och förhindra ytterligare färgutveckling.
  14. Motfärgning med Hoechst nukleär fläck vid 1 μg/ml i PBS för immunofluorescens. Tvätta rutschkanor en gång i TBST för att ta bort överflödig motfläck.
  15. Applicera täckglas med monteringsmediet.
  16. Visa bilder under ett inverterat ljusmikroskop för immunhistokemi eller ett konfokalt fluorescerande mikroskop för immunofluorescens.

6. Negativa kontroller

OBS: Fyra negativa kontrollexperiment kan utföras för att bekräfta specificiteten av D11-AP-färgning för IsoLG. Negativa kontrollexperiment bör utföras i samma färgningsuppsättning under samma betingelser.

  1. I det första negativa kontrollexperimentet inkuberas vävnader med D11-AP utspätt i enbart TBST eller TBST.
  2. Inkubera vävnader med utspädd D11-AP i TBST och bakteriellt periplasmatiskt extrakt utan D11-AP (AP Linker) utspätt i TBST.
  3. Utför en kompetitiv analys med IsoLG/MSA eller icke-addukterad MSA enligt tidigare beskrivet12.
    1. Bered IsoLG och IsoLG addukterat till serumalbumin (MSA) på mus enligt beskrivningen19, i molförhållandet 8 IsoLG: 1 MSA (8:1 IsoLG/MSA).
    2. Späd D11-AP 1:10 i TBST.
    3. Inkubera utspädd D11-AP med 50 μg/ml IsoLG/MSA eller icke-addukterad MSA i 1 h vid rumstemperatur.
    4. Tillsätt D11-AP med IsoLG/MSA eller D11-AP med icke-addukterad MSA till vävnader för färgning.
  4. Använd irrelevant scFv-antikropp, D20, för att färga vävnader för den slutliga negativa kontrolluppsättningen.

Representative Results

I representativa experiment användes D11 scfv med en alkalisk fosfataskonjugering (D11-AP) i immunofluorescens för att detektera IsoLGs närvarande i angiotensin II-behandlade möss jämfört med normala skenmöss och människor med högt blodtryck jämfört med normotensiva människor. Möss behandlades med angiotensin II i en dos på 490 ng/kg/min i två veckor, och hypertoni bekräftades med ökat systoliskt blodtryck jämfört med skenmöss10. För att säkerställa specificiteten av D11-AP färgades vävnader med eller utan närvaro av D11-AP. Som visats av D11-AP-färgning visade aortan hos möss med angiotensin II-inducerad hypertoni förhöjd koncentration av IsoLGs jämfört med kontrollmöss (figur 1). Bakgrundsfärgning eller autofluorescens var begränsad, vilket visas av negativa kontroller som inte färgades med D11-AP.

D11-AP användes för att detektera IsoLGs närvarande i tarmvävnader hos humana patienter med hypertoni (HTN) eller normotensiva människor (NTN). Hypertonistatus fastställdes från sjukhusjournalerna som systoliskt blodtryck över 140 och diastoliskt blodtryck över 80 mmHg. Forskare som utvecklade immunofluorescensprotokoll för D11-AP var blinda för hypertonistatus hos mänskliga vävnader. Sektioner färgades i närvaro och frånvaro av D11-AP för att säkerställa antikroppsspecificitet och visa bakgrundsfärgning eller autofluorescens. Som visas i figur 2 fann vi att vävnader från patienter med HTN hade förhöjda koncentrationer av IsoLGs jämfört med patienter med NTN. Färgning utan D11-AP visade också minimal bakgrundsfärgning och autofluorescens. Endogent alkaliskt fosfatas uttrycks av tarmepitel, så den begränsade fluorescensen hos vävnader färgade utan D11-AP visar att antigenhämtningen som användes i detta protokoll var tillräcklig för att inaktivera endogent alkaliskt fosfatas närvarande i vävnader. I kombination med resultaten i möss visar dessa resultat också att immunofluorescensprotokollet effektivt visar förhöjda IsoLGs vid hypertoni jämfört med normotensiv status.

D11-AP isolerades och lagrades i det bakteriella periplasmatiska extraktet. Vävnader från möss och människa färgades med D11-AP och periplasmatiskt extrakt innehållande AP-länkaren utan D11 för att säkerställa att andra faktorer som kan förekomma i det periplasmatiska extraktet, såsom överskott eller icke-konjugerat alkaliskt fosfatas, inte bidrar till den färgning som observerats i vävnader behandlade med D11-AP (figur 3). Vävnader färgade med D11-AP resulterade i ljusare färgning jämfört med vävnader färgade med periplasmatiskt extrakt. Dessa resultat bekräftar att D11-AP färgar vävnaderna, och färgningen beror inte på icke-konjugerat bakteriellt alkaliskt fosfatas som potentiellt kan vara närvarande i det periplasmatiska extraktet och resultera i falsk färgning av IsoLGs eller bidra till bakgrundsfärgning.

En konkurrenskontroll utfördes genom förinkubation av D11-AP med IsoLG addukterat till MSA eller icke-addukterad MSA före färgning av vävnader för att visa specificiteten av D11-AP till IsoLG. Om D11-AP är specifikt för IsoLG, skulle antikroppen binda till IsoLG-MSA, vilket resulterar i en utarmad tillgänglighet av D11-AP för att färga vävnader, och D11-AP inkuberad med icke-addukterad MSA skulle ha liknande färgning som normal D11-AP. I vävnader färgade med D11-AP förinkuberade med IsoLG-konkurrenten fann vi minskad färgning jämfört med vävnader som färgades med D11-AP utan någon preinkubation (figur 4). I vävnader färgade med D11-AP preinkuberade med icke-addukterad MSA, fann vi att färgning liknade färgning observerad i vävnader med D11-AP. Dessa resultat visar specificiteten av D11-AP till IsoLGs på grund av minskad färgning av vävnader när D11-AP förinkuberades med IsoLG/MSA, men inte icke-addukterad MSA. I den slutliga negativa kontrollen färgades musvävnad med D11-AP eller irrelevant scFv-antikropp, D20. Färgning av musaorta med D11-AP resulterade i stark färgning jämfört med D20, vilket indikerar specificiteten av D11-AP till IsoLGs i hypertensiva aortae (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Aortans immunofluorescens hos hypertensiva och normotensiva möss. Artärer från angiotensin II och skeninfunderade möss färgades med och utan D11-AP (D11) för att visa närvaro av IsoLGs. (A) Artär från en angiotensin II-behandlad mus undersökt med D11-AP (grön) och nukleär motfläck (magenta), (B) Artär från en kontrollskenbehandlad mus sonderad med D11-AP, (C) Artär från en angiotensin II-behandlad mus utan D11-AP, (D) Artär från en kontrollskenbehandlad mus utan D11-AP (skalstapel = 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescens av humana tarmvävnader från hypertensiva och normotensiva patienter. Vävnader från patienter med hypertoni (HTN) och normotensiva människor (NTN) färgades med och utan D11-AP (D11) för att visa närvaro av IsoLGs hos patienter med HTN. a) HTN-vävnader färgade med D11-AP (grön) och nukleär motfläck (magenta), B) NTN-vävnader färgade med D11-AP, C) HTN-vävnader färgade utan D11-AP, D) NTN-vävnader färgade utan D11-AP (skalstapel =100 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Vävnader från möss och människor, färgade med periplasmatiskt extrakt med och utan D11-AP. Vävnader från mus och människa färgades med periplasmatiska extrakt med och utan D11-AP. Bilder visar begränsad färgning av vävnader med periplasmatiskt extrakt utan D11-AP, vilket visar att färgning främst beror på D11-AP-bindning snarare än en annan komponent som kan vara närvarande i periplasmatiskt extrakt. (A) Ang mus aorta färgad med D11-AP (grön) och nukleär motfläck (magenta), (B) Ang mus aorta färgad med periplasmatiskt extrakt, (C) Sham mus aorta färgad med D11-AP, (D) Sham mus aorta färgad med periplasmatiskt extrakt, (E) hypertensiv human tarmvävnad färgad med D11-AP, (F) hypertensiv human tarmvävnad färgad med periplasmatiskt extrakt, (G) normotensiv human tarmvävnad färgad med D11-AP, H) normotensiv mänsklig tarmvävnad färgad med periplasmatiskt extrakt (skalstapel = 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Konkurrenskontroll i fartyg av Ang och Sham möss. I denna konkurrenskontroll förinkuberades D11-AP med IsoLG-addukterad MSA eller icke-addukterad MSA. D11-AP utan någon förinkubation användes som kontroll. Dessa resultat visar specificiteten av D11-AP till IsoLGs eftersom det finns minskad färgning av vävnader med IsoLG-MSA-konkurrenten jämfört med D11-AP. Denna minskning beror på IsoLG och inte MSA eftersom den icke-addukterade MSA-förinkubationen resulterade i färgning som liknar D11-AP-kontrollen. Angiotensin II (A) och Sham (B) musaortae färgade med D11-AP (grön) och nukleär motfläck (magenta), angiotensin II (C) och Sham (D) musaortae färgade med D11-AP efter inkubation med IsoLG-MSA, angiotensin II (E) och Sham (F) musaortae färgade med D11-AP efter inkubation med icke-addukterad MSA (skalstång = 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Musaortae färgad med D11 och irrelevant scFv, D20. Musvävnad färgades med D11-AP och jämfördes med en irrelevant kontrollantikropp, D20, som är specifik för glykoprotein A2. Färgning av vävnad med D11-AP (grön) och nukleär motfläck (magenta) (A) resulterade i intensiv immunofluorescens jämfört med D20 (grön) och nukleär motfläck (magenta) (B) vilket indikerar specificitet av D11-AP till IsoLGs (skalstång = 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

D11 har använts i stor utsträckning för att detektera IsoLG-addukterade proteiner i celler eller vävnader som markör för inflammation eller oxidativ stress vid sjukdom 8,9,20. Tidigare innehöll D11 en E-tagg och IHC-utveckling krävde användning av en sekundär anti-E-taggantikropp konjugerad med HRP10,20,21. Här har vi utvecklat och optimerat protokoll för detektion av IsoLG-addukterade proteiner med hjälp av D11-antikroppen konjugerad med alkaliskt fosfatas i stället för E-tag, vilket eliminerar behovet av en sekundär antikroppsinkubation.

För att bestämma specificiteten hos D11-AP utfördes fyra negativa kontrollexperiment. Vi utförde protokollet utan närvaro av D11 och hade minimal utveckling. Dessa resultat har en tvåfaldig indikation: endogent alkaliskt fosfatas bidrar inte till utvecklingen, och den observerade färgningen beror på D11 och inte en annan bidragande faktor. Därefter färgade vi bilder med AP-länkaren utan D11. Detta experiment resulterade i liten färgning, vilket indikerar fri AP eller andra faktorer i det periplasmatiska extraktet orsakar inte fläcken vi observerar i närvaro av D11. För att säkerställa specificiteten av D11 till IsoLG förinkuberade vi D11-AP med renad IsoLG innan vi färgade bilder. Vi såg en minskning av utvecklingen vilket indikerar att D11-AP var bunden till IsoLG-protein, vilket uttömde mängden fri D11-AP för att binda till IsoLG närvarande i vävnaden. Slutligen, för att säkerställa att D11-AP var bindande till IsoLG och inte MSA-proteinet som IsoLG var bundet till, förinkuberade vi D11-AP endast med MSA. Det fanns inga förändringar i utvecklingen, vilket indikerar att D11-AP inte var bindande till MSA utan IsoLG-proteinet. Slutligen var forskare som utvecklade färgningsprotokollet blinda för hypertensiv status hos mänsklig tarmvävnad. Skillnaderna i färgning som observerades mellan patienter med hypertoni och patienter med normotension berodde inte på bias och har tidigare beskrivits22,23.

Även om vårt protokoll för detektion av IsoLG-addukterade proteiner med användning av D11-antikroppen konjugerad med alkaliskt fosfatas i stället för E-tag är rigorös och robust och eliminerar behovet av en sekundär antikroppsinkubation, har det vissa begränsningar. En begränsning är att vi använde D11 konjugerat med alkaliskt fosfatas i det periplasmatiska extraktet, och det kan finnas falsk färgning av endogent alkaliskt fosfatas i periplasmatiskt extrakt eller vissa vävnader, såsom tarm24. Det första steget för att utveckla detta protokoll inkluderade emellertid att inaktivera endogent alkaliskt fosfatas som kan vara närvarande i vävnader25. Inledningsvis testades kall ättiksyra, BME och Levamisol26 för effektivitet. Ingen av dessa minskade helt närvaron av aktivt endogent alkaliskt fosfatas. Värme har använts för att inaktivera alkaliskt fosfatas27, så vi testade värmedeaktivering av alkaliskt fosfatas i olika buffertar. Vi fann att värmemonterade och hydratiserade glas i citratbuffert eliminerade mest endogent alkaliskt fosfatas. Slides utvecklades ursprungligen med hjälp av ett kemiluminescerande / fluorescerande substrat, men när de avbildades utan detta substrat fanns det en hög mängd autofluorescens. VectorRed är ett substrat som utvecklas i närvaro av alkaliskt fosfatas för att producera en kromogen som kan visualiseras i Texas Red / TRITC-kanalområdet. Med hjälp av detta substrat kunde vi lättare observera signalen ovanför bakgrundsautofluorescens. Försiktighet bör vidtas under färgningsprocessen för att minimera artefaktisk färgning. Torkning av vävnader på objektglas efter hydrering tills avbildning har resulterat i ökad utveckling. D11-AP bör alikvoteras och lagras vid -20 °C. Flera frys-tina cykler bör undvikas vid arbete med D11-AP. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan också påverka den enzymatiska aktiviteten hos alkaliskt fosfatas och bör inte användas som tvättbuffert28. Som med alla antikroppsbaserade tillvägagångssätt måste grundlig testning och optimering utföras för att säkerställa att färgningen är specifik och att signalen inte är över eller under förstärkt.

Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett kraftfullt, rigoröst och robust optimerat protokoll för att detektera IsoLG-addukterade proteiner med användning av D11-antikroppen konjugerad med alkaliskt fosfatas i stället för E-tag. Detta protokoll ger flera fördelar: För det första är det billigare att använda D11 som ett alkaliskt fosfatasfusionsprotein. D11 härrörde ursprungligen från ett fagantikroppsbibliotek som inte kunde kommersialiseras och var dyrt att rena. Även om D11 i E. coli periplasmatiskt extrakt kunde ge ett billigt alternativ, var det ineffektivt i de flesta analyser. För det andra tillåter den alkaliska fosfatasfusionsmetoden D11 scfv att ha en användbar reporter15 (alkaliskt fosfatas) smält till den och skulle inte behöva renas för användning i immunanalyser eftersom substrat är kommersiellt tillgängliga. För det tredje bildar E. coli alkaliskt fosfatas dimerer29. Så D11, när det smälts till det alkaliska fosfataset, skulle också bilda dimerer och detta ökar antikroppens aviditet och bindningsaktivitet30. Slutligen kan D11 konjugerad med alkaliskt fosfatas i periplasmatiskt extrakt enkelt rengöras med Cibacron Blue Sepharose. D11 har en hög isoelektrisk punkt (~ 9,2 pH). Som sådan är den positivt laddad och kan binda till Cibacron Blue genom pi-katjoninteraktioner. De flesta föroreningarna i E. coli periplasmatiskt extrakt kan elueras av hartset. D11 konjugerad med alkaliskt fosfatas kan sedan elueras med högt salt (~ 1,5M NaCl) i vatten. Den eluerade D11 konjugerad med alkaliskt fosfatas är ganska stabil vid 4-8 °C i högsaltlösningen. Således har vi utvecklat ett protokoll som inte bara gör D11-antikroppen tillgänglig till en låg kostnad, utan också eliminerar de extra stegen och behovet av sekundär antikroppsinkubation. Detta protokoll underlättar reproducerbar mätning av IsoLG, som ackumuleras i vävnader vid flera sjukdomar där ökad oxidativ stress spelar en roll.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 och R03HL155041 till A.K. Vi tackar Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 för visualisering och bildskanning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) Cytiva 28953766
200 Proof Ethanol Pharmco 111000200
2xYT powder MP Biomedicals 3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates ThermoFisher (NUNC) 242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) Carbosynth EN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) Carbosynth EB09335
Ampicillin, sodium salt Research Products International (RPI) A40040
Bovine Serum Albumin RPI A30075
Chemically competent TG1 E. coli Amid Biosciences TG1-201
Diethanolamine, >98% Sigma-Aldrich D8885
EDTA Sigma-Aldrich ED
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Mouting medium
Glucose Research Products International (RPI) G32045
Glycerol Sigma-Aldrich G7893
Histoclear National Diagnostics HS-200 Xylene alternative
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals ThermoFisher MK-2624-212
Imidazole Research Products International (RPI) I52000
MgCl2 (anhydrous) Sigma-Aldrich M8266
Mouse Serum Albumin (MSA) Sigma-Aldrich/Calbiochem 126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) Carbosynth EN13587
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Pressure Cooker Cuisinart CPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml ThermoFisher 66380
Sodium chloride (NaCl) Research Products International (RPI) S23020
Sodium Citrate Sigma-Aldrich 1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Research Products International (RPI) S23100
Sucrose Research Products International (RPI) S24065
Tris base Research Products International (RPI) T60040
Tris-buffered Saline Boston Bio-Products 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HCl Research Products International (RPI) T60050
Tween20 Sigma-Aldrich P9416
Vector Red Vector Labs SK-5105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56 (2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650 (2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418 (2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46 (2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

Tags

Biologi utgåva 173 isolevuglandiner immunofluorescens alkaliskt fosfataskonjugerat ScFv D11-antikropp och hypertoni

Erratum

Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Direkt detektion av isolevuglandiner i vävnader med användning av ett D11 scFv-alkaliskt fosfatasfusionsprotein och immunofluorescens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic,… More

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic, L., Pitzer, A., Davies, S. S., Layer, J. H., Mernaugh, R. L., Kirabo, A. Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (173), e62603, doi:10.3791/62603 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter