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Summary
이 논문은 알칼리성 포스파타제 접합 ScFv D11 항체를 사용하여 면역형광법에 의해 조직에서 이소레부글란딘을 측정하기 위한 상세한 방법론을 제공합니다. 마우스와 인간 모두의 고혈압 모델은 조직 샘플에서 이돌부글란딘 측정과 관련된 단계별 절차 및 기본 원리를 설명하는 데 사용됩니다.
Abstract
이솔레부글란딘(IsoLG)은 H2-이소프로스테인에서 지질 과산화 및 가교 단백질을 통해 형성되는 반응성이 높은 감마 케토알데히드로 염증 및 고혈압을 포함한 다양한 질병을 유발합니다. 조직에서 IsoLG 축적의 검출은 질병 과정에 대한 IsoLG의 관여를 밝히는 데 중요합니다. 그러나 조직에서 IsoLG를 측정하는 것은 매우 어려우며 질량 분석 분석을 포함하여 현재 사용 가능한 도구는 힘들고 비용이 많이 듭니다. 여기에서는 면역형광 현미경으로 대장균에서 생산된 알칼리성 포스파타제 결합 D11 ScFv 및 재조합 파지 디스플레이 항체를 사용하여 조직에서 IsoLG를 현장 검출하는 새로운 방법을 설명합니다. 염색을 검증하기 위해 4개의 대조군이 사용되었다: (1) D11을 사용하거나 사용하지 않는 염색, (2) 알칼리성 포스파타제 링커를 사용한 박테리아 주변세포질 추출물로 염색, (3) 관련 없는 scFV 항체 염색, 및 (4) 염색 전 IsoLG를 사용한 경쟁적 대조군. 우리는 고혈압이 있거나 없는 인간 및 마우스 조직 모두에서 알칼리성 포스파타제 결합 D11의 효과를 입증합니다. 이 방법은 다양한 질병 과정에서 IsoLG의 역할을 연구하는 데 중요한 도구가 될 것입니다.
Introduction
이소케탈이라고도 하는 이솔레부글란딘(IsoLG)은 지질 과산화의 산물인 4-케토알데히드 계열의 이성질체이며 단백질 1,2의1차 아민과 반응하고 부가합니다. IsoLG는 심혈관, 알츠하이머, 폐 및 간 질환, 여러 유형의 암을 포함한 여러 질병에 연루되어 있습니다3. IsoLG는 미국을 포함하여 전 세계적으로 상당한 건강 및 경제적 부담인 심혈관 질환(CVD)에 대한 기여도에 대해 가장 광범위하게 연구되었습니다. 9,210만 명의 미국 성인이 적어도 한 가지 유형의 CVD를 가지고 있는 것으로 추정되며, 2030년에는 미국 성인 인구의 43.9%에 이를 것으로 추정된다4. 혈압, 콜레스테롤 및 금연을 낮추면 CVD 사건의 전반적인 위험과 발생이 감소한다5.
고혈압 또는 고혈압은 심혈관 질환의 주요 위험 요소이며 미국 인구의 약 절반에 영향을 미친다 6. 이전 연구에서는 염증이 고혈압의 근본 원인이며 IsoLG가 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다7. 안지오텐신 II, 카테콜아민, 알도스테론 및 과잉 식이 염을 포함한 고혈압 자극은 수지상 세포(DC)를 포함한 항원 제시 세포에서 IsoLG 축적을 유도하여 T 세포를 활성화시켜 고혈압에 기여하는 염증성 사이토카인을 증식 및 생성합니다 8,9.
이전에 IsoLG는 면역조직화학, 질량분석법, 효소결합면역분석법, 유세포 분석법으로 측정되었습니다10,11. IsoLGs의 측정을 용이하게 하기 위해, IsoLGs12에 대해 단일쇄 단편 변수(scfv) 재조합 항체(D11)를 개발하였다. 초기에, 이 D11 항체는 11개의 아미노산 E-tag를 함유하였고, 면역조직화학 검출을 위한 2차 항체를 필요로 하였다11. 그러나 제조업체에서 생산을 중단한 후 E-tag에 대해 신뢰할 수 있는 2차 항체를 찾기가 어려웠습니다. 따라서 우리는 알칼리성 포스파타제(D11-AP)와 결합된 D11을 사용하여 IsoLG의 면역형광 염색을 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발했으며, 이는 고혈압이 있거나 없는 마우스 및 인간 조직에서 입증되었습니다.
Protocol
밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 이 원고에 설명된 모든 절차를 승인했습니다. 마우스는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 사육되고 관리됩니다. 모든 피험자는 Vanderbilt University의 Institutional Review Board의 승인에 따라 연구에 등록하기 전에 서면 동의서를 제공했습니다. 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.
1. D11-알칼리성 포스파타제 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 및 음성 대조군 벡터의 제조
- 단일 사슬 단편 변수(scFv) 세그먼트가 3' 말단에서 박테리아 알칼리성 포스파타제(AP)를 암호화하는 서열에 연결된 pCANTAB5E 플라스미드13,14의 변형된 버전을 구성합니다.
참고: scFv 서열의 NotI 제한 부위의 바로 하류에서 변형된 플라스미드는 더 이상 E-태그의 코딩 서열을 포함하지 않고 대신 링커 서열 GGSGGHMGSGG를 인코딩한 다음 AP에 대한 서열을 인코딩합니다(GenBank 수탁 번호 AXY87039.1, T16-K464)15,16. AP의 다운스트림에서 플라스미드는 8xHis 및 DYKDDDDK 태그를 인코딩합니다. 태그의 3' 끝에서 코딩 시퀀스는 황색 정지 코돈으로 끝납니다. 변형된 플라스미드를 pCANTAB5-AP라고 합니다. - SfiI/NotI 제한 사이트를 사용하여 D11 scFv(GenBank 수탁 번호 AAW28931.1)를 pCANTAB5-AP에 복제합니다.
- SfiI/NotI 제한 사이트를 사용하여 D20 scFv를 pCANTAB5-AP로 복제합니다.
참고: D20 scFv는 관련 없는 scFv의 조직 상호작용 패턴을 평가하도록 설계된 음성 대조군입니다. 이 scFv는 원래 A2로 알려진 글리칸 그룹과 상호 작용하는 능력 때문에 파지 디스플레이에 의해 선택되었습니다. - 플라스미드에서 scFv 부분을 완전히 제거하고 이를 아미노산 GGGGSGRAGSGGGGS로 구성된 "AP 링커" 코딩 서열로 대체하여 "빈" 벡터를 생성합니다.
- 모든 플라스미드를 적격한 TG1 E. coli 로 변환하고 100μg/mL 암피실린과 2% 포도당(2xYTAG) 배지가 보충된 2xYT가 포함된 0.5% 한천 플레이트에서 30°C에서 밤새 박테리아를 성장시킵니다.
참고: supE 유전자를 가진 균주(예: TG1 E. coli)는 호박색 정지 코돈을 100% 억제하지 않습니다. 추정치는 0.8 - 20%의 시간 범위이므로, BAP의 바로 다운스트림에서 종료되는 생성물이 여전히 많이 존재한다17. TG1 대장균 은 주로 시간과 비용의 절감, pCANTAB 단백질 발현 시스템과의 호환성, 실험실에서 일반적으로 수행되는 파지 디스플레이에서의 사용과 같은 실용적인 이유로 사용됩니다. BAP에 이어 호박 정지 코돈의 하류는 geneIII에 대한 서열이다. scFv-geneIII 융합 단백질이 특정 유전자III 단백질을 방해하여 나이브 박테리아를 재감염시키기 때문에 GeneIII 융합 단백질은 파지 디스플레이가 의도한 대로 기능하기 위해 드물게 발현되어야 합니다. 그러므로, 융합이 없는 유전자III 단백질은 기능성 파지의 생성을 위해 비리온 조립 동안 존재할 필요가 있다, 즉, scFv-유전자III 단백질 생성물은 일반적으로 박테리아 내에서 비교적 드물다. D11-AP, D20-AP, 빈 벡터, 및 본 논문에 사용된 모든 구축물은 모두 간헐적인 geneIII 융합 단백질 발현에 의해 유사하게 영향을 받는다. 이러한 단백질이 어떻게 작용하는지에는 여전히 관찰된 차이가 있습니다. - 개별 콜로니를 선택하고 신선한 5mL의 2xYTAG 배양액을 접종합니다. 박테리아가 30°C에서 밤새 자라도록 하고 150rpm에서 진탕합니다.
- 실온에서 10분 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 상청액을 버리고 펠릿을 85% 2xYTAG 및 15% 글리세롤 2mL에 재현탁합니다.
- 글리세롤 스톡을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
2. 주변 세포질 추출물의 단백질 발현 및 생성
참고: 주변세포질 추출물의 생성은 파지 디스플레이에서 단백질 발현에 일반적으로 사용되는 방법이며, 이는 주로 이황화 결합의 형성이 scFv 및 항체 생성에 중요하기 때문입니다. 이 방법은 용해물(일반적으로 봉입체 포함)을 생성할 필요가 없고 단백질이 적절하게 접히도록 합니다. pCANTAB은 D11-BAP 융합 단백질의 scFv 부분의 상류에 있는 gIII 신호 서열을 갖는다. 신호 서열은 단백질이 박테리아의 주변 세포질 공간으로 셔틀된 다음 신호 서열이 절단되도록 합니다. 주변 세포질 공간은 산화 환경을 제공하며, 이는 이황화 다리의 적절한 형성에 중요합니다. 삼투압 쇼크는 박테리아를 온전하게 유지하면서 주변 세포질 단백질을 주변 배지로 방출할 수 있을 만큼 외막을 파괴하기 때문에 주변 세포질 추출물을 유도하는 데 사용됩니다.
- 관련 플라스미드를 함유하는 대장균 글리세롤 스톡을 2xYTAG의 60 mL 배양물에 접종하고, 150 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 밤새 배양한다.
- 단백질 발현을 유도하기 위해, 펠렛 박테리아 배양을 3,000 x g 에서 10분 동안 하고, 60 mL의 2xYTA 배지에 재현탁하고, 150 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 밤새 배양한다.
참고: 2xTYAG에서 2xYTA 배지로의 전환은 단백질 발현의 충분한 유도에 도움이 된다18. 포도당이 박테리아 배지에 존재할 때, 포도당이 처리하는 데 더 적은 에너지를 소비하기 때문에 박테리아가 우선적으로 포도당을 소비하고 유당을 무시하기 때문에 lac 프로모터가 억제됩니다. 배지 전환 후 포도당이 제거되면 박테리아는 2xYT 배지에서 제공하는 탄수화물에 의존합니다. 효모 추출물(2xYT의 Y 성분)은 유당을 포함한 탄수화물을 함유하고 있으므로 lac 프로모터를 통해 단백질 발현을 유도할 수 있습니다. IPTG는 pCANTAB 구조와 함께 필요하지 않으며 비기능성 단백질을 초래하는 봉입체와 함께 과도한 단백질 발현을 초래할 수 있습니다. - 삼투압 충격을 통해 주변 세포질 추출물을 생성합니다.
- 펠렛 박테리아 배양을 3,000 x g 에서 10분 동안 배양합니다.
- 20mL의 1xTES(0.2M Tris-HCl pH 8.0, 0.5M EDTA, 0.5M 자당)에 재현탁하고 얼음에서 1시간 동안 배양합니다.
- 다시 3,000 x g 에서 10분 동안 펠렛화하고, 0.05 M Tris, pH 7.6의 15 mL에 재현탁시킨다.
- 이 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 배양한 다음 5,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 정화합니다.
- 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 정제 또는 실험에 직접 사용하기 위해 필요할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
- ELISA에서 활성 D11-BAP의 존재에 의해 세포 용해를 평가합니다. 주변 세포질 추출물 3-5 μL를 pNPP 1mL에 넣은 다음 다음 10 분 동안 색 변화가 일어나는지 관찰하십시오 (색이 맑은 노란색에서 강렬한 노란색으로 변함).
참고: 색상은 용해물을 받지 않은 pNPP 튜브 또는 나이브 TG1 박테리아의 용해물을 받은 pNPP 튜브와 나란히 비교할 수 있습니다. 405nm에서 흡광도로 정량합니다.
4. ELISA에서 D11-AP 역가의 특성화
- 5μg/mL의 마우스 혈청 알부민(MSA)(음성 대조군) 또는 5μg/mL의 IsoLG/MSA(양성 대조군)를 포함하는 25μL/웰 인산염 완충 식염수(PBS)(1.8mM KH2PO4, 10mMNa2HPO4, 2.7mM KCl, 137mM NaCl)로 4°C에서 밤새 384웰 폴리스티렌 플레이트를 코팅합니다.
- 접시를 비우고 두드려 말리십시오. PBS + 0.1% 트윈(PBS-T)으로 한 번 세척합니다. 접시를 비우고 두드려 말리십시오.
- 블로킹 완충액(120μL/웰)으로 플레이트를 PBS-T로 채웁니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 접시를 비우고 두드려 말리십시오. D11-AP 주변세포질 추출물을 25μL/웰에서 연속 1:2 희석하여 PBS-T에 희석합니다. 음성 대조군으로 PBS-T만 포함하는 하나의 웰을 포함합니다.
참고: 주변세포질 추출물의 일반적인 희석 범위는 1:8 - 1:4096입니다. 25 μL 분석 부피의 경우, 시작 "1:8" 농도 50 μL(주변 세포질 추출물 6.25 μL 및 PBS-T 43.75 μL)로 시작합니다. 그런 다음 이 용액 25μL를 제거하고 PBS-T 25μL가 들어 있는 다음 웰에 추가하여 2배 희석을 수행하고 위아래로 피펫팅합니다. 이 우물에는 이제 "1:16" 희석이 포함되어 있습니다. 2배 희석을 계속 반복하여 설명된 1:2 희석 시리즈를 생성합니다. - 실온에서 1.5 시간 동안 배양하십시오.
- 접시를 비우고 두드려 말리십시오. PBS-T로 5번 세탁합니다. 비우고 두드려 말리십시오.
- 1 L의 930 mM 디에탄올아민 (H2O중 1:10으로 희석된 98% 원액)에 pNPP 1 g을 0.5 mMMgCl2 로 용해시키고 HCl로 pH 9.5로 조정하여 pNPP 용액을 제조한다.
- 25μL/웰 pNPP 용액을 적용하여 AP를 개발합니다. 실온에서 1시간 동안 배양하고 호환 가능한 플레이트 리더를 사용하여 각 웰 내에서 405nm에서 흡광도를 측정합니다.
- IsoLG/MSA 웰에서 생성된 신호를 MSA 웰에서 발생하는 노이즈와 비교하여 신호가 노이즈보다 5배 이상 높은 희석 범위를 찾습니다.
- 이 D11-AP 신호 희석 계열을 그래프에 표시하고, 곡선의 선형 범위를 결정하고, 신호의 50%를 관찰할 수 있는 희석을 설정합니다.
참고: 이 희석액이 약 1:1,000에 해당하는 경우 D11-AP 용액을 IHC/IF에서 1:10 농도로 사용할 수 있습니다.
5. 면역형광
- 마이크로톰을 사용하여 마우스 및 인간 파라핀 포매 조직(5μm 두께)의 연속 절편을 절단하고 온수 수조(37°C)에 넣습니다. 유리 슬라이드에 조직 섹션을 장착하고 밤새 건조시킵니다.
참고: 이 연구를 위해 대동맥은 생쥐에서 얻었습니다. 정상 혈압 및 고혈압 인간의 결장 절편은 Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network에서 얻었습니다. - 슬라이드를 자일렌에 5분 동안 세 번 담가 조직을 탈파라핀화합니다.
- 조직을H2O중 95%, 70% 및 50% 에탄올로 각각 2회 세척하여 재수화한다.
- 슬라이드 홀더에 TBST를 채운 다음 TBST를 폐기하여 0.1% Tween20(TBST)이 포함된 Tris-buffered saline(TBS)으로 슬라이드를 세 번 빠르게 세척합니다.
참고: 수화된 슬라이드는 항원 회수 전 일주일 이상 4°C에서 TBST에 보관할 수 있습니다. - 슬라이드의 열 유도 항원 검색을 수행하려면 예열된(80-95°C) 구연산 나트륨 완충액(10mM 구연산 나트륨, 0.05% 트윈 20, pH 6.0)에 슬라이드를 넣고 총 항원 검색 시간 20분 동안 고압에서 4분으로 설정된 압력솥에서 배양합니다.
- 압력솥에서 슬라이드를 제거하고 실온에서 20분 동안 식힙니다.
- 빠른 세척으로 TBST에서 슬라이드를 세 번 세척하십시오.
참고: 슬라이드는 항원 회수 후 염색 전 일주일 이상 TBST에 보관할 수 있습니다. - TBST에 용해된 2% BSA를 추가하여 슬라이드를 차단합니다. 슬라이드를 파라핀 필름 스트립으로 덮고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 슬라이드에서 차단 버퍼를 삭제합니다.
- TBST에 200μL의 1:10 D11-AP를 슬라이드에 추가하고 파라핀 필름 스트립으로 덮습니다.
- 실온에서 3시간 동안 항체 용액 증발을 최소화하기 위해 가습된 챔버에서 배양합니다.
- TBST에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
- 각각 면역조직화학 또는 면역형광을 위한 비색 또는 형광 알칼리성 포스파타제 현상액으로 개발합니다. TBST로 슬라이드를 한 번 세척하여 과도한 현상액을 제거하고 추가 발색을 방지합니다.
- 면역형광을 위해 PBS에서 1μg/mL의 Hoechst 핵 염색으로 슬라이드를 카운터스테인합니다. 과도한 카운터스테인을 제거하기 위해 TBST에서 슬라이드를 한 번 세척합니다.
- 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 적용합니다.
- 면역조직화학을 위한 도립광 현미경 또는 면역형광을 위한 컨포칼 형광 현미경으로 슬라이드를 볼 수 있습니다.
6. 음성 대조군
참고: IsoLG에 대한 D11-AP 염색의 특이성을 확인하기 위해 4가지 음성 대조군 실험을 수행할 수 있습니다. 음성 대조군 실험은 동일한 조건에서 동일한 염색 세트에서 수행해야 합니다.
- 첫 번째 음성 대조군 실험에서 TBST 또는 TBST 단독으로 희석된 D11-AP로 조직을 배양합니다.
- TBST에 희석된 D11-AP와 TBST에 희석된 D11-AP(AP 링커)가 없는 박테리아 주변세포질 추출물로 조직을 배양합니다.
- 앞서 설명한 대로 IsoLG/MSA 또는 비내전성 MSA로 경쟁적 분석을 수행합니다12.
- 앞서 설명한19와 같이 마우스 혈청 알부민(MSA)에 첨가된 IsoLG와 IsoLG를 8 IsoLG:1 MSA(8:1 IsoLG/MSA)의 몰비로 준비합니다.
- D11-AP 1:10을 TBST로 희석합니다.
- 희석된 D11-AP를 50μg/mL IsoLG/MSA 또는 부가되지 않은 MSA와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 염색을 위해 IsoLG/MSA가 있는 D11-AP 또는 내전되지 않은 MSA가 있는 D11-AP를 조직에 추가합니다.
- 관련 없는 scFv 항체인 D20을 사용하여 최종 음성 대조군 세트에 대한 조직을 염색합니다.
Representative Results
대표적인 실험에서, 알칼리성 포스파타제 접합체(D11-AP)를 갖는 D11 scfv를 면역형광법에 사용하여 정상 가짜 마우스와 비교하여 안지오텐신 II 처리 마우스에 존재하는 IsoLG를 검출하고, 정상 혈압 환자와 비교하여 고혈압이 있는 인간을 검출했습니다. 마우스는 2주 동안 490ng/kg/min의 용량으로 안지오텐신 II를 투여받았고, 고혈압은 가짜 마우스에 비해 수축기 혈압이 증가한 것으로 확인되었다10. D11-AP의 특이성을 보장하기 위해, 조직을 D11-AP의 존재 유무에 관계없이 염색하였다. D11-AP 염색에 의해 입증된 바와 같이, 안지오텐신 II 유발 고혈압이 있는 마우스의 대동맥은 대조군 마우스와 비교했을 때 IsoLG의 농도가 상승한 것으로 나타났습니다(그림 1). 배경 염색 또는 자가형광은 D11-AP로 염색되지 않은 음성 대조군에 의해 나타난 바와 같이 제한적이었다.
D11-AP는 고혈압(HTN) 또는 정상 혈압 환자(NTN)의 장 조직에 존재하는 IsoLG를 검출하는 데 사용되었습니다. 고혈압 상태는 병원 기록에서 수축기 혈압이 140 이상, 이완기 혈압이 80mmHg 이상으로 설정되었습니다. D11-AP에 대한 면역형광 프로토콜을 개발하는 연구원들은 인간 조직의 고혈압 상태에 대해 눈이 멀었습니다. 절편은 D11-AP의 존재 및 부재 하에서 염색되어 항체 특이성을 보장하고 배경 염색 또는 자가형광을 보여줍니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 HTN 환자의 조직은 NTN 환자에 비해 IsoLG의 농도가 높았습니다. D11-AP가 없는 염색은 또한 최소한의 배경 염색 및 자가형광을 나타내었다. 내인성 알칼리성 포스파타제는 장 상피에 의해 발현되므로, D11-AP 없이 염색된 조직의 제한된 형광은 이러한 프로토콜에 사용된 항원 검색이 조직에 존재하는 내인성 알칼리성 포스파타제를 불활성화시키는데 충분하였다. 마우스의 결과와 함께 이러한 결과는 면역형광 프로토콜이 정상 혈압 상태와 비교할 때 고혈압에서 상승된 IsoLG를 효과적으로 보여준다는 것을 보여줍니다.
D11-AP는 박테리아 주변세포질 추출물을 분리하여 저장하였다. 마우스 및 인간 조직은 D11-AP로 처리된 조직에서 관찰된 염색에 기여하지 않기 위해 주변세포질 추출물에 존재할 수 있는 다른 인자, 예컨대 과잉 또는 비접합 알칼리성 포스파타제와 같은 D11 없이 AP 링커를 포함하는 주변세포질 추출물로 염색하였다(도 3). D11-AP로 염색된 조직은 주변세포질 추출물로 염색된 조직에 비해 더 밝은 염색을 보였습니다. 이러한 결과는 D11-AP가 조직을 염색하고 있으며, 염색이 주변 세포질 추출물에 잠재적으로 존재할 수 있고 IsoLGs의 잘못된 염색을 초래하거나 배경 염색에 기여할 수 있는 비접합 박테리아 알칼리성 포스파타제로 인한 것이 아님을 확인합니다.
IsoLG에 대한 D11-AP의 특이성을 보여주기 위해 조직을 염색하기 전에 MSA에 내전된 IsoLG 또는 부가되지 않은 MSA와 함께 D11-AP를 사전 배양하여 경쟁적 대조군을 수행했습니다. D11-AP가 IsoLG에 특이적인 경우 항체가 IsoLG-MSA에 결합하여 염색 조직에 대한 D11-AP의 가용성이 고갈되고 내전되지 않은 MSA와 함께 배양된 D11-AP는 정상 D11-AP와 유사한 염색을 갖게 됩니다. 경쟁사 IsoLG로 사전 배양한 D11-AP로 염색한 조직에서는 사전 배양 없이 D11-AP로 염색한 조직에 비해 염색이 감소한 것을 확인할 수 있었습니다(그림 4). 부가되지 않은 MSA로 사전 배양된 D11-AP로 염색된 조직에서, 염색은 D11-AP를 사용한 조직에서 관찰된 염색과 유사함을 발견했습니다. 이러한 결과는 D11-AP가 IsoLG/MSA와 함께 사전 배양되었지만 비내전성 MSA가 아니었을 때 조직의 염색 감소로 인해 IsoLG에 대한 D11-AP의 특이성을 보여줍니다. 최종 음성 대조군에서, 마우스 조직을 D11-AP 또는 관련 없는 scFv 항체, D20으로 염색하였다. D11-AP로 마우스 대동맥을 염색한 결과 D20에 비해 강한 염색이 나타났으며, 이는 고혈압성 대동맥에서 IsoLGs에 대한 D11-AP의 특이성을 나타냅니다(그림 5).
그림 1: 고혈압 및 정상 혈압 마우스에서 대동맥의 면역형광. 안지오텐신 II 및 가짜 주입 마우스의 동맥을 D11-AP(D11)의 유무에 관계없이 염색하여 IsoLG의 존재를 표시했습니다. (A) D11-AP(녹색) 및 핵 대조염색(자홍색)으로 조사한 안지오텐신 II 처리 마우스의 동맥, (B) D11-AP로 조사된 대조군 가짜 처리된 마우스의 동맥, (C) D11-AP가 없는 안지오텐신 II 처리된 마우스의 동맥, (D) D11-AP가 없는 대조군 가짜 처리된 마우스의 동맥(스케일 막대 = 100μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 고혈압 및 정상 혈압 환자의 인간 장 조직의 면역형광. 고혈압 환자(HTN) 및 정상 혈압 환자(NTN)의 조직을 D11-AP(D11)와 함께 또는 사용하지 않고 염색하여 HTN 환자에서 IsoLG의 존재를 보여주었습니다. (A) D11-AP로 염색된 HTN 조직(녹색) 및 핵 대조염색(자홍색), (B) D11-AP로 염색된 NTN 조직, (C) D11-AP 없이 염색된 HTN 조직, (D) D11-AP 없이 염색된 NTN 조직(스케일 바 = 100μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: D11-AP가 있거나 없는 주변세포질 추출물로 염색된 마우스 및 인간 조직. 마우스 및 인간 조직은 D11-AP가 있거나 없는 주변세포질 추출물로 염색되었습니다. 이미지는 D11-AP가 없는 주변세포질 추출물을 사용한 조직의 제한된 염색을 보여주며, 이는 염색이 주변세포질 추출물에 존재할 수 있는 다른 성분보다는 대부분 D11-AP 결합에 기인한다는 것을 보여줍니다. (A) D11-AP로 염색한 Ang 마우스 대동맥(녹색) 및 핵 대조 염색(자홍색), (B) 주변 세포질 추출물로 염색한 Ang 마우스 대동맥, (C) D11-AP로 염색한 가짜 마우스 대동맥, (D) 주변 세포질 추출물로 염색된 가짜 마우스 대동맥, (E) D11-AP로 염색된 고혈압 인간 장 조직, (F) 주변세포질 추출물로 염색된 고혈압 인간 장 조직, (G) D11-AP로 염색된 정상 혈압 인간 장 조직, (H) 주변세포질 추출물로 염색된 정상 혈압 인간 장 조직(스케일 바 = 100μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Ang 및 Sham 마우스의 혈관에서의 경쟁 제어. 이 경쟁적 대조군에서 D11-AP는 IsoLG-adducted MSA 또는 non-adducted MSA와 함께 사전 배양되었습니다. 어떠한 예비배양도 하지 않은 D11-AP를 대조군으로 사용하였다. 이러한 결과는 D11-AP에 비해 IsoLG-MSA 경쟁사에서 조직의 염색이 감소했기 때문에 IsoLG에 대한 D11-AP의 특이성을 보여줍니다. 이러한 감소는 MSA가 아닌 IsoLG로 인한 것인데, 이는 부가되지 않은 MSA 사전 배양이 D11-AP 대조군과 유사한 염색을 초래했기 때문입니다. D11-AP로 염색한 안지오텐신 II(A) 및 Sham(B) 마우스 대동맥(녹색) 및 핵 대조 염색(자홍색), IsoLG-MSA와 함께 배양한 후 D11-AP로 염색한 Angiotensin II(C) 및 Sham(D) 마우스 대동맥, 비내전된 MSA로 배양한 후 D11-AP로 염색한 Angiotensin II(E) 및 Sham(F) 마우스 대동맥(스케일 막대 = 100μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: D11 및 관련 없는 scFv, D20으로 염색된 마우스 대동맥. 마우스 조직을 D11-AP로 염색하고 당단백질 A2에 특이적인 관련 없는 대조군 항체 D20과 비교했습니다. D11-AP(녹색) 및 핵 대조 염색(자홍색)(A)으로 조직을 염색한 결과 D20(녹색) 및 핵 대조 염색(자홍색)(B)에 비해 강력한 면역형광이 나타났으며, 이는 IsoLG에 대한 D11-AP의 특이성을 나타냅니다(스케일 바 = 100μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
D11은 질병 8,9,20에서 염증 또는 산화 스트레스에 대한 마커로서 세포 또는 조직에서 IsoLG-adducted 단백질을 검출하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 이전에는 D11에 E 태그가 포함되어 있었고 IHC 개발에는 HRP 10,20,21과 접합된 2차 항-E 태그 항체의 사용이 필요했습니다. 여기에서 당사는 E-tag 대신 알칼리성 포스파타제와 접합된 D11 항체를 사용하여 IsoLG-adducted 단백질의 검출을 위한 프로토콜을 개발하고 최적화했으며, 이는 2차 항체 배양이 필요하지 않습니다.
D11-AP의 특이성을 확인하기 위해, 4개의 음성 대조군 실험을 수행하였다. 우리는 D11의 존재 없이 프로토콜을 수행했으며 최소한의 개발만 있었습니다. 이러한 결과는 내인성 알칼리성 포스파타제가 발달에 기여하지 않으며, 관찰된 염색은 D11에 의한 것이지 다른 기여 요인이 아니라는 두 가지 징후를 가지고 있습니다. 다음으로, D11 없이 AP 링커로 슬라이드를 염색하였다. 이 실험은 거의 염색을 초래하지 않았으며, 이는 주변 세포질 추출물의 유리 AP 또는 기타 요인이 D11의 존재 하에서 관찰되는 얼룩을 일으키지 않음을 나타냅니다. IsoLG에 대한 D11의 특이성을 보장하기 위해 슬라이드를 염색하기 전에 정제된 IsoLG로 D11-AP를 사전 배양했습니다. 우리는 D11-AP가 IsoLG 단백질에 결합되어 조직에 존재하는 IsoLG에 결합하기 위해 유리 D11-AP의 양을 고갈시키는 발달의 감소를 보았습니다. 마지막으로, D11-AP가 IsoLG에 결합하고 MSA 단백질이 IsoLG에 결합하지 않도록 하기 위해 MSA만으로 D11-AP를 사전 배양했습니다. 발달에는 변화가 없었으며, 이는 D11-AP가 MSA에 결합하지 않고 IsoLG 단백질에 결합한다는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 염색 프로토콜을 개발하는 연구자들은 인간 장 조직의 고혈압 상태에 대해 눈이 멀었습니다. 고혈압 환자와 정상 혈압 환자 사이에서 관찰된 염색의 차이는 비뚤림으로 인한 것이 아니며 이전에 설명되었습니다22,23.
E-tag 대신 알칼리성 포스파타제와 접합된 D11 항체를 사용하는 IsoLG 부가물 단백질의 검출을 위한 당사의 프로토콜은 엄격하고 견고하며 2차 항체 배양의 필요성을 제거하지만 몇 가지 한계가 있습니다. 한 가지 한계는 주변세포질 추출물에 알칼리성 포스파타제와 접합된 D11을 사용했으며, 주변세포질 추출물 또는 장과 같은 특정 조직에서 내인성 알칼리성 포스파타제의 잘못된 염색이 있을 수 있다는 것입니다24. 그러나, 이 프로토콜을 개발하기 위한 첫 번째 단계는 조직25에 존재할 수 있는 내인성 알칼리성 포스파타제를 비활성화하는 것을 포함했다. 처음에는 차가운 아세트산, BME 및 Levamisole26 의 효율성을 테스트했습니다. 이들 중 어느 것도 활성 내인성 알칼리성 포스파타제의 존재를 완전히 감소시키지 않았습니다. 열은 알칼리성 포스파타제27을 비활성화하는 데 사용되었으므로 다른 완충액에서 알칼리성 포스파타제의 열 비활성화를 테스트했습니다. 우리는 구연산염 완충액에 가열 장착되고 수화된 슬라이드가 대부분의 내인성 알칼리성 포스파타제를 제거한다는 것을 발견했습니다. 슬라이드는 처음에 화학발광/형광 기질을 사용하여 개발되었지만 이 기질 없이 이미지화했을 때 많은 양의 자가형광이 있었습니다. VectorRed는 알칼리성 포스파타제가 존재할 때 발달하여 Texas Red/TRITC 채널 범위에서 시각화할 수 있는 발색원을 생성하는 기질입니다. 이 기질을 사용하여 배경 자가형광 위의 신호를 보다 쉽게 관찰할 수 있었습니다. 염색 과정에서 인공물 염색을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 수화 후 이미징까지 슬라이드에서 조직을 건조하면 발달이 빨라집니다. D11-AP는 분주하여 -20°C에서 보관해야 합니다. D11-AP로 작업할 때 여러 번의 동결-해동 주기를 피해야 합니다. 인산염 완충 식염수(PBS)는 또한 알칼리성 포스파타제의 효소 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 세척 완충액으로 사용해서는 안 된다28. 모든 항체 기반 접근법과 마찬가지로 염색이 특이적이고 신호가 과다 또는 과소 증폭되지 않도록 철저한 테스트 및 최적화를 수행해야 합니다.
결론적으로, 당사는 E-tag 대신 알칼리성 포스파타제와 접합된 D11 항체를 사용하여 IsoLG 부가물 단백질을 검출하기 위한 강력하고 엄격하며 강력한 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, D11을 알칼리성 포스파타제 융합 단백질로 사용하는 것이 더 저렴합니다. D11은 원래 상용화할 수 없고 정제 비용이 많이 드는 파지 항체 라이브러리에서 파생되었습니다. 대장균 주변 세포질 추출물의 D11은 저렴한 대안을 제공 할 수 있지만 대부분의 분석에서는 효과적이지 않았습니다. 둘째, 알칼리성 포스파타제 융합 접근법은 D11 scfv가 유용한 리포터15 (알칼리성 포스파타제)에 융합되도록 하고, 기질이 상업적으로 이용 가능하기 때문에 면역분석에 사용하기 위해 정제될 필요가 없을 것이다. 셋째, 대장균 알칼리성 포스파타제는 이량체를 형성한다29. 따라서 D11은 알칼리성 포스파타제에 융합되면 이량체를 형성하고 이는 항체의 결합력과 결합 활성을 증가시킵니다30. 마지막으로, 주변 세포질 추출물의 알칼리성 포스파타제와 접합된 D11은 Cibacron Blue Sepharose를 사용하여 쉽게 세척할 수 있습니다. D11은 높은 등전점(~9.2 pH)을 가지고 있습니다. 따라서 양전하를 띠고 파이케이션 상호작용을 통해 Cibacron Blue에 결합할 수 있습니다. 대장균 주변 세포질 추출물의 불순물 대부분은 수지에서 용출 될 수 있습니다. 알칼리성 포스파타제와 접합된 D11은 물에서 고염분(~1.5M NaCl)을 사용하여 용리될 수 있습니다. 알칼리성 포스파타제와 접합된 용출된 D11은 고염 용액에서 4-8°C에서 상당히 안정하다. 따라서 우리는 D11 항체를 저렴한 비용으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 추가 단계와 2차 항체 배양의 필요성을 제거하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 산화 스트레스 증가가 중요한 역할을 하는 여러 질병의 조직에 축적되는 IsoLG의 재현 가능한 측정을 용이하게 합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 AK에 K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 및 R03HL155041을 부여하여 지원했습니다. 시각화 및 슬라이드 스캔을 위해 Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
| 200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| 2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
| 384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
| 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
| Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
| Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
| Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
| Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
| Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
| Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
| Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
| MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
| Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
| Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
| Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
| Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
| Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
| Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |
References
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생물학 제 173 호 이소 부글 란딘 면역 형광 알칼리성 포스파타제 접합 ScFv D11 항체 및 고혈압Erratum
Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:
Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
to:
Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
