ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Bu makalede, alkalen fosfataz konjuge ScFv D11 antikoru kullanılarak immünofloresan yoluyla dokulardaki izolevuglandinlerin ölçümü için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Hem farelerde hem de insanlarda hipertansiyon modelleri, doku örneklerinde izolevuglandin ölçümü ile ilişkili adım adım prosedürleri ve temel ilkeleri açıklamak için kullanılır.
Abstract
İzolevuglandinler (IsoLG'ler), H2-izoprostanlardan lipid peroksidasyonu ve çapraz bağlantı proteinleri yoluyla oluşan, inflamasyona ve hipertansiyon dahil çeşitli hastalıklara yol açan oldukça reaktif gama ketoaldehitleridir. Dokularda IsoLG birikiminin saptanması, hastalık süreçlerine katılımlarına ışık tutmada çok önemlidir. Bununla birlikte, dokulardaki İzoLG'lerin ölçümü son derece zordur ve kütle spektrometresi analizi de dahil olmak üzere şu anda mevcut araçlar zahmetli ve son derece pahalıdır. Burada, alkalen fosfataz konjuge D11 ScFv ve immünofloresan mikroskopi ile E. coli'de üretilen rekombinant faj görüntüleme antikoru kullanılarak dokulardaki İzoLG'lerin yerinde tespiti için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Boyamayı doğrulamak için dört kontrol kullanıldı: (1) D11 ile ve D11 olmadan boyama, (2) alkalen fosfataz bağlayıcı ile bakteriyel periplazmik ekstrakt ile boyama, (3) alakasız scFV antikor boyaması ve (4) boyamadan önce IsoLG ile rekabetçi kontrol. Alkalen fosfataz konjuge D11'in hipertansiyonu olan veya olmayan hem insan hem de fare dokularında etkinliğini gösteriyoruz. Bu yöntem muhtemelen IsoLG'lerin çok çeşitli hastalık süreçlerindeki rolünü incelemek için önemli bir araç olarak hizmet edecektir.
Introduction
İzoketaller olarak da bilinen İzolevuglandinler (IsoLG'ler), lipit peroksidasyonunun ürünleri olan 4-ketoaldehit ailesinin izomerleridir ve proteinler üzerindeki birincil aminlerle reaksiyona girer ve bunlara katkıda bulunur 1,2. IsoLG'ler kardiyovasküler, Alzheimer, akciğer ve karaciğer hastalıkları ve birçok kanser türü dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir3. IsoLG'ler, Amerika Birleşik Devletleri de dahil olmak üzere küresel olarak önemli bir sağlık ve ekonomik yük olan kardiyovasküler hastalığa (CVD) katkıları konusunda en kapsamlı şekilde incelenmiştir. 92,1 milyon ABD'li yetişkinin en az bir tür CVD'ye sahip olduğu tahmin edilmektedir ve 2030 tahmini projeksiyonları ABD yetişkin nüfusunun% 43,9'una ulaşmaktadır4. Kan basıncını, kolesterolü ve sigarayı bırakmayı düşürmek, CVD olaylarının genel riskini ve oluşumunu azaltır5.
Yüksek tansiyon veya hipertansiyon, kardiyovasküler hastalık için önemli bir risk faktörüdür ve ABD nüfusunun yaklaşık yarısınıetkiler6. Önceki çalışmalar, inflamasyonun hipertansiyonun altında yatan bir neden olduğunu ve IsoLG'lerin bir rol oynadığını bulmuştur7. Anjiyotensin II, katekolaminler, aldosteron ve aşırı diyet tuzu dahil olmak üzere hipertansif uyaranlar, dendritik hücreler (DC'ler) dahil olmak üzere antijen sunan hücrelerde IsoLG birikimini indükler, bu da T hücrelerini hipertansiyona katkıda bulunan inflamatuar sitokinleri çoğaltmak ve üretmek için aktive eder 8,9.
Daha önce, IsoLG'ler immünohistokimya, kütle spektrometrisi, enzime bağlı immünosorbent testi ve akış sitometrisi10,11 ile ölçülmüştür. IsoLG'lerin ölçümünü kolaylaştırmak için, IsoLG'ler12'ye karşı tek zincirli bir fragman değişkeni (scfv) rekombinant antikoru (D11) geliştirilmiştir. Başlangıçta, bu D11 antikoru 11 amino asit E-etiketi içeriyordu ve immünohistokimya tespiti için ikincil bir antikor gerektiriyordu11. Bununla birlikte, üretici tarafından üretiminin durdurulmasından sonra E-etikete karşı güvenilir bir ikincil antikor bulmak zordu. Bu nedenle, hipertansiyonlu ve hipertansiyonsuz fare ve insan dokularında gösterdiğimiz alkalen fosfataz (D11-AP) ile konjuge edilmiş D11 kullanarak IsoLG'lerin immünofloresan boyanması için güvenilir bir protokol geliştirdik.
Protocol
Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, bu makalede açıklanan tüm prosedürleri onayladı. Fareler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak barındırılır ve bakımı yapılır. Tüm denekler, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan çalışmaya kaydolmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onay vermiştir. Tüm prosedürler Helsinki Deklarasyonu'na göre gerçekleştirildi.
1. D11-alkalen fosfataz füzyon proteini ve negatif kontrol vektörlerini kodlayan plazmidlerin hazırlanması
- pCANTAB5E plazmid13,14'ün modifiye edilmiş bir versiyonunu oluşturun, burada tek zincirli parça değişkeni (scFv) segmenti 3' ucunda bakteriyel alkalen fosfatazı (AP) kodlayan bir diziye bağlanır.
NOT: scFv dizisinin NotI kısıtlama bölgesinin hemen aşağısında, modifiye edilmiş plazmid artık E-etiketinin kodlama sırasını içermez ve bunun yerine bağlayıcı dizisi GGSGGHMGSGG'yi, ardından AP dizisini (GenBank katılım numarası AXY87039.1, T16-K464)15,16 kodlar. AP'nin aşağı akışında, plazmid 8xHis ve DYKDDDDK etiketlerini kodlayacaktır. Etiketlerin 3' sonunda, kodlama dizisi bir Amber stop kodonu ile biter. Modifiye plazmid pCANTAB5-AP olarak adlandırılır. - D11 scFv'yi (GenBank katılım numarası AAW28931.1) SfiI/NotI kısıtlama siteleriyle pCANTAB5-AP'ye klonlayın.
- D20 scFv'yi SfiI/NotI kısıtlama siteleriyle pCANTAB5-AP'ye kopyalayın.
NOT: D20 scFv, alakasız bir scFv'nin doku etkileşim paternini değerlendirmek için tasarlanmış negatif bir kontroldür. Bu scFv başlangıçta A2 olarak bilinen bir glikan grubuyla etkileşime girme kabiliyeti nedeniyle faj ekranı tarafından seçildi. - scFv kısmını plazmidden tamamen çıkararak ve yerine GGGGSGRAGSGGGGS amino asitlerinden oluşan bir "AP bağlayıcı" kodlama dizisi ile değiştirerek "boş" bir vektör oluşturun.
- Tüm plazmidleri yetkin TG1 E. coli'ye dönüştürün ve 100 μg / mL Ampisilin ve% 2 glikoz (2xYTAG) ortamı ile desteklenmiş 2xYT içeren% 0.5 agar plakaları üzerinde, 30 ° C'de bir gecede bakteri yetiştirin.
NOT: SupE genine sahip suşlar (TG1 E. coli gibi) amber stop kodonunu% 100 baskılamaz. Tahminler zamanın% 0.8 - 20'si arasında değişmektedir, bu nedenle bu deneyler için tasarlandığı gibi BAP'ın hemen aşağı akışını sonlandıran birçok ürün vardır17. TG1 E. coli esas olarak zaman ve maliyetlerin azaltılması, pCANTAB protein ekspresyon sistemi ile uyumluluğu ve laboratuarda yaygın olarak yürütülen faj gösteriminde kullanımı gibi pratik nedenlerle kullanılır. BAP'ı takip eden amber stop kodonunun aşağı akışı, gen III için bir dizidir. GeneIII füzyon proteinlerinin, faj gösteriminin amaçlandığı gibi çalışması için nadiren eksprese edilmesi gerekir, çünkü scFv-geneIII füzyon proteinleri, naif bakterileri yeniden enfekte etmek için bu belirli genIII proteinine müdahale eder. Bu nedenle, füzyonsuz genIII proteinlerinin, işleyen fajın üretimi için virion montajı sırasında var olması gerekir, yani scFv-geneIII protein ürünleri genellikle bakteri içinde nispeten nadirdir. D11-AP, D20-AP, boş vektör ve bu makalede kullanılan tüm yapılar, ara sıra genIII füzyon proteini ekspresyonundan benzer şekilde etkilenir. Bu proteinlerin nasıl davrandıkları konusunda hala gözlemlenen farklılıklar vardır. - Tek bir koloni seçin ve taze 5 mL'lik 2xYTAG kültürünü aşılayın. Bakterilerin gece boyunca 30 ° C'de büyümesine ve 150 rpm'de sallanmasına izin verin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.000 x g'de santrifüjleme ile hücreleri peletleyin. Süpernatantı atın ve peleti 2 mL'de% 85 2xYTAG ve% 15 gliserol içinde yeniden askıya alın.
- Gliserol stoklarını -80 °C dondurucuda tutun.
2. Protein ekspresyonu ve periplazmik ekstrakt üretimi
NOT: Periplazmik ekstraktın üretimi, faj gösteriminde protein ekspresyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, çünkü disülfit bağlarının oluşumu scFv ve antikor üretiminde önemlidir. Yöntem, lizat üretme ihtiyacını ortadan kaldırır (genellikle inklüzyon cisimleri içerir) ve proteinlerin uygun şekilde katlanmasını sağlar. pCANTAB, D11-BAP füzyon proteininin scFv kısmının yukarı yönünde bir gIII sinyal dizisine sahiptir. Sinyal dizisi, proteinin bakterinin periplazmik boşluğuna taşınmasını sağlar ve daha sonra sinyal dizisi bölünür. Periplazmik boşluk, disülfit köprülerinin doğru oluşumu için çok önemli olan oksitleyici bir ortam sağlar. Ozmotik şok, periplazmik ekstraktları türetmek için kullanılır, çünkü dış zarı, periplazmik proteinleri çevreleyen ortama salınacak kadar bozarken, bakteriyi sağlam tutar.
- İlgili plazmidleri içeren TG1 E. coli gliserol stoklarını, 150 rpm'de çalkalayarak gece boyunca 30 ° C'de 60 mL'lik 2xYTAG ve kültür kültürüne aşılayın.
- Protein ekspresyonunu indüklemek için, pelet bakteri kültürleri 10 dakika boyunca 3.000 x g'de , 60 mL 2xYTA ortamında yeniden askıya alınır ve kültür gece boyunca 30 ° C'de 150 rpm'de çalkalanır.
NOT: 2xTYAG'dan 2xYTA ortamına geçiş, protein ekspresyonu18'in yeterli indüksiyonuna yardımcı olur. Bakteriyel ortamda glikoz bulunduğunda, lak promotörü baskılanır, çünkü bakteriler tercihen glikoz tüketir ve glikozun işlenmesi daha az enerji harcadığı için laktozu görmezden gelir. Ortam anahtarını takiben glikoz çıkarıldığında, bakteriler 2xYT ortamı tarafından sağlanan karbonhidratlara güvenir. Maya ekstraktı (2xYT'deki Y bileşeni), aralarında laktoz bulunan karbonhidratlar içerir ve bu nedenle lak promotörü aracılığıyla protein ekspresyonunu yönlendirebilir. IPTG, pCANTAB yapısı ile gerekli değildir ve fonksiyonel olmayan proteinle sonuçlanan inklüzyon cisimleri ile birlikte aşırı protein ekspresyonuna neden olabilir. - Ozmotik şok yoluyla periplazmik ekstraktlar üretin.
- Pelet bakteri kültürleri 10 dakika boyunca 3.000 x g'de .
- 20 mL 1xTES (0.2 M Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M sakaroz) içinde tekrar askıya alın ve buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
- Pelet tekrar 10 dakika boyunca 3.000 x g'de ve 15 mL'de 0.05 M Tris, pH 7.6'da tekrar askıya alın.
- Bu süspansiyonu buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin, ardından 10 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüjleme ile netleştirin.
- Süpernatantları taze bir tüpe aktarın ve deneylerde saflaştırma veya doğrudan kullanım için gerekli olana kadar -20 ° C'de saklayın.
- Hücre lizisini, ELISA'da aktif D11-BAP varlığı ile değerlendirin. Bir mL pNPP'ye 3-5 μL periplazmik ekstrakt ekleyin, ardından önümüzdeki 10 dakika içinde bir renk değişikliği olup olmadığını gözlemleyin (renk açık sarıdan yoğun sarıya geçer).
NOT: Renk, herhangi bir lizat almamış bir pNPP tüpü veya naif TG1 bakterilerinin lizatı alan bir pNPP tüpü ile yan yana karşılaştırılabilir. 405 nm'de absorbans ile sayısallaştırın.
4. ELISA'da D11-AP titresinin karakterizasyonu
- 384 delikli polistiren plakayı gece boyunca 4 °C'de 25 μL/kuyu fosfat tamponlu salin (PBS) (1,8 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na 2 HPO4, 2,7mM KCl, 137 mM NaCl) ile 5 μg/mL fare serum albümini (MSA) (negatif kontrol) veya 5 μg/mL IsoLG/MSA (pozitif kontrol) içeren kaplayın.
- Plakayı boşaltın ve kuruya dokunun. PBS +% 0.1 Tween (PBS-T) ile bir kez yıkayın. Plakayı boşaltın ve kuruya dokunun.
- Plakayı bloke edici tampon olarak PBS-T ile doldurun (120 μL/kuyu). Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Plakayı boşaltın ve kuruya dokunun. D11-AP periplazmik ekstraktların seri 1:2 seyreltilerini 25 μL/kuyucukta uygulayın ve PBS-T'de seyreltin. Negatif kontrol olarak yalnızca PBS-T içeren bir kuyu ekleyin.
NOT: Periplazmik ekstraktlar için tipik seyreltme aralıkları 1:8 - 1:4096'dır. 25 μL'lik bir tahlil hacmi için, başlangıç "1:8" konsantrasyonunun 50 μL'si ile başlayın: 6.25 μL periplazmik ekstrakt ve 43.75 μL PBS-T. Ardından, bu çözeltinin 25 μL'sini çıkararak ve 25 μL PBS-T içeren bir sonraki kuyucuğa ekleyerek 2 kat seyreltme gerçekleştirin ve yukarı ve aşağı pipetleyin. Bu kuyu şimdi "1:16" seyreltmesini içeriyor. Açıklanan 1:2 seyreltme serisini oluşturmak için 2 katlı seyreltmeyi tekrarlamaya devam edin. - Oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin.
- Plakayı boşaltın ve kuruya dokunun. PBS-T ile 5 kez yıkayın. Boşaltın ve kuru'ya dokunun.
- 1 g pNPP'yi 1 L 930 mM dietanolamin (%98 stok çözeltisiH2O'da 1:10 seyreltilmiş), 0,5 mM MgCl2 ile çözerek ve HCl ile pH 9,5'e ayarlayarak pNPP çözeltisi hazırlayın.
- AP'yi geliştirmek için 25 μL / kuyu pNPP çözeltisi uygulayın. oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve uyumlu bir plaka okuyucu kullanarak her bir kuyucukta 405 nm'de emilimi belirleyin.
- IsoLG/MSA kuyularından üretilen sinyali MSA kuyularından üretilen gürültüyle karşılaştırın ve sinyalin gürültüden en az 5 kat daha yüksek olduğu seyreltme aralığını bulun.
- Bu D11-AP sinyal seyreltme serisini bir grafik üzerinde çizin, eğrinin doğrusal aralığını belirleyin ve sinyalin% 50'sinin gözlemlenebileceği seyreltmeyi belirleyin.
NOT: Bu seyreltme yaklaşık 1:1.000'e eşdeğerse, D11-AP çözeltisi IHC/IF'de 1:10'luk bir konsantrasyonda kullanılabilir.
5. İmmünofloresan
- Bir mikrotom kullanarak fare ve insan parafine gömülü dokuların seri bölümlerini (5 μm kalınlığında) kesin ve ılık su banyosuna (37 ° C) yerleştirin. Doku bölümlerini cam slaytlara monte edin ve gece boyunca kurumaya bırakın.
NOT: Bu çalışma için farelerden aort elde edildi. Normotansif ve hipertansif insanların kolon bölümleri Vanderbilt Kooperatif İnsan Doku Ağı'ndan elde edildi. - Dokuları deparaffize etmek için slaytları 5 dakika boyunca üç kez ksilene batırın.
- 2'deki dokuları rehidrat etmek,H2O'da% 95,% 70 ve% 50 etanolün her birini yıkar.
- Slayt tutucuyu TBST ile doldurup TBST'yi atarak slaytları %0,1 Tween20 (TBST) ile Tris tamponlu salin (TBS) içinde üç kez hızlı yıkamalarla yıkayın.
NOT: Hidratlanmış slaytlar, antijen alımından önce bir haftadan fazla olmamak üzere TBST'de 4 ° C'de saklanabilir. - Slaytların ısıya bağlı antijen alımını gerçekleştirmek için, slaytları önceden ısıtılmış (80-95 °C) sodyum sitrat tamponuna (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween 20, pH 6.0) yerleştirin ve toplam 20 dakikalık antijen geri alma süresi için yüksek basınçta 4 dakikaya ayarlanmış bir düdüklü tencerede inkübe edin.
- Kızakları düdüklü tencereden çıkarın ve oda sıcaklığına kadar 20 dakika soğumaya bırakın.
- Hızlı yıkamalarla slaytları TBST'de üç kez yıkayın.
NOT: Slaytlar, antijen alımından sonra TBST'de boyamadan önce bir haftadan fazla olmamak üzere saklanabilir. - Slaytları engellemek için TBST'de çözünmüş %2 BSA ekleyin. Slaytları bir parafin film şeridi ile örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Engelleme arabelleğini slaytlardan atın.
- Slaytlara TBST'de 200 μL 1:10 D11-AP ekleyin ve bir parafin film şeridi ile örtün.
- Oda sıcaklığında 3 saat boyunca antikor çözeltisi buharlaşmasını en aza indirmek için nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
- Slaytları TBST'de üç kez yıkayın.
- Sırasıyla immünohistokimya veya immünofloresan için kolorimetrik veya floresan alkalen fosfataz geliştiricisi ile geliştirin. Fazla geliştiriciyi gidermek ve daha fazla renk gelişimini önlemek için slaytları TBST ile bir kez yıkayın.
- İmmünofloresan için PBS'de 1 μg / mL'de Hoechst nükleer boyası ile karşı boyama slaytları. Fazla karşı lekeyi çıkarmak için slaytları TBST'de bir kez yıkayın.
- Montaj ortamını kullanarak kapak fişlerini uygulayın.
- İmmünohistokimya için ters ışık mikroskobu veya immünofloresan için konfokal floresan mikroskop altında slaytları görüntüleyin.
6. Negatif kontroller
NOT: IsoLG için D11-AP boyamanın özgüllüğünü doğrulamak için dört negatif kontrol deneyi yapılabilir. Negatif kontrol deneyleri aynı boyama setinde aynı koşullar altında yapılmalıdır.
- İlk negatif kontrol deneyinde, sadece TBST veya TBST'de seyreltilmiş D11-AP ile dokuları inkübe edin.
- TBST'de seyreltilmiş D11-AP ve TBST'de seyreltilmiş D11-AP (AP Bağlayıcı) içermeyen bakteriyel periplazmik ekstrakt ile dokuları inkübe edin.
- Daha önce açıklandığı gibi IsoLG / MSA veya adducted olmayan MSA ile rekabetçi bir tahlilgerçekleştirin 12.
- Dahaönce tarif edildiği gibi fare serum albüminine (MSA) adeklenmiş IsoLG ve IsoLG'yi, 8 IsoLG: 1 MSA (8: 1 IsoLG / MSA) molar oranında hazırlayın.
- TBST'de D11-AP 1:10 oranında seyreltin.
- Seyreltilmiş D11-AP'yi 50 μg/mL IsoLG/MSA veya katkısız MSA ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
- Boyama için dokulara IsoLG/MSA ile D11-AP veya addukte edilmemiş MSA ile D11-AP ekleyin.
- Son negatif kontrol seti için dokuları boyamak için alakasız scFv antikoru D20'yi kullanın.
Representative Results
Temsili deneylerde, bir alkalen fosfataz konjugasyonuna (D11-AP) sahip D11 scfv, normal sahte farelere kıyasla anjiyotensin II ile tedavi edilen farelerde bulunan İzoLG'leri tespit etmek için immünofloresanda kullanılmıştır. Fareler iki hafta boyunca 490 ng / kg / dak dozunda anjiyotensin II ile tedavi edildi ve hipertansiyon, sahte farelere kıyasla artmış sistolik kan basıncı ile doğrulandı10. D11-AP'nin özgüllüğünü sağlamak için, dokular D11-AP varlığı olsun veya olmasın boyandı. D11-AP boyama ile gösterildiği gibi, anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyonu olan farelerin aortu, kontrol farelerine kıyasla yüksek IsoLG konsantrasyonu göstermiştir (Şekil 1). Arka plan boyama veya otofloresan, D11-AP ile boyanmamış negatif kontrollerin gösterdiği gibi sınırlıydı.
D11-AP, hipertansiyonu (HTN) veya normotansif insanları (NTN) olan insan hastalarının bağırsak dokularında bulunan İzoLG'leri tespit etmek için kullanıldı. Hipertansiyon durumu hastane kayıtlarından sistolik kan basıncının 140'ın üzerinde ve diyastolik kan basıncının 80 mmHg'nin üzerinde olduğu tespit edildi. D11-AP için immünofloresan protokolü geliştiren araştırmacılar, insan dokularının hipertansiyon durumuna kör oldular. Kesitler, antikor özgüllüğünü sağlamak ve arka plan boyama veya otofloresan göstermek için D11-AP varlığında ve yokluğunda boyandı. Şekil 2'de gösterildiği gibi, HTN'li hastalardan alınan dokuların, NTN'li hastalara kıyasla yüksek IsoLG konsantrasyonlarına sahip olduğunu bulduk. D11-AP olmadan boyama da minimal arka plan boyama ve otofloresan gösterdi. Endojen alkalen fosfataz intestinal epitel ile eksprese edilir, bu nedenle D11-AP olmadan boyanmış dokuların sınırlı floresansı, bu protokolde kullanılan antijen geri kazanımının dokularda bulunan endojen alkalen fosfatazın inaktive edilmesinde yeterli olduğunu gösterir. Farelerdeki sonuçlarla kombinasyon halinde, bu sonuçlar aynı zamanda immünofloresan protokolünün, normotansif duruma kıyasla hipertansiyonda yüksek IsoLG'leri etkili bir şekilde gösterdiğini göstermektedir.
D11-AP izole edildi ve bakteriyel periplazmik ekstraktta depolandı. Fare ve insan dokuları, aşırı veya konjuge olmayan alkalen fosfataz gibi periplazmik ekstraktta bulunabilecek diğer faktörlerin D11-AP ile tedavi edilen dokularda gözlenen lekelenmeye katkıda bulunmadığından emin olmak için D11-AP ve D11 içermeyen AP bağlayıcısını içeren periplazmik ekstrakt ile boyandı (Şekil 3). D11-AP ile boyanan dokular, periplazmik ekstrakt ile boyanan dokulara kıyasla daha parlak boyanma ile sonuçlandı. Bu sonuçlar, D11-AP'nin dokuları boyadığını doğrulamaktadır ve boyama, periplazmik ekstraktta potansiyel olarak bulunabilen ve IsoLG'lerin yanlış boyanmasına neden olan veya arka plan boyamasına katkıda bulunabilen konjuge olmayan bakteriyel alkalen fosfatazdan kaynaklanmamaktadır.
D11-AP'nin IsoLG'ye özgüllüğünü göstermek için dokuları boyamadan önce MSA'ya veya addukte edilmemiş MSA'ya bağlı IsoLG ile D11-AP'nin ön inkübe edilmesiyle rekabetçi bir kontrol gerçekleştirildi. D11-AP IsoLG için spesifik ise, antikor IsoLG-MSA'ya bağlanır, bu da dokuları boyamak için D11-AP'nin tükenmiş bir mevcudiyetine neden olur ve addüklenmemiş MSA ile inkübe edilen D11-AP, normal D11-AP'ye benzer boyanmaya sahip olur. IsoLG rakibi ile önceden inkübe edilmiş D11-AP ile boyanmış dokularda, herhangi bir ön inkübasyon olmaksızın D11-AP ile boyanmış dokulara kıyasla azalmış lekelenme bulduk (Şekil 4). Addüksüz MSA ile preinkübe edilmiş D11-AP ile boyanmış dokularda, boyamanın D11-AP'li dokularda gözlenen boyamaya benzer olduğunu bulduk. Bu sonuçlar, D11-AP IsoLG / MSA ile önceden inkübe edildiğinde, ancak addükte edilmemiş MSA ile inkübe edildiğinde dokuların boyanmasının azalması nedeniyle D11-AP'nin IsoLG'lere özgüllüğünü göstermektedir. Son negatif kontrolde, fare dokusu D11-AP veya alakasız scFv antikoru, D20 ile boyandı. Fare aortunun D11-AP ile boyanması, hipertansif aortta D11-AP'nin IsoLG'lere özgüllüğünü gösteren D20'ye kıyasla güçlü boyanma ile sonuçlandı (Şekil 5).
Şekil 1: Hipertansif ve normotansif farelerde aortun immünofloresansı. Anjiyotensin II ve sahte infüzyonlu farelerden elde edilen arterler, IsoLG'lerin varlığını göstermek için D11-AP (D11) ile ve D11-AP (D11) olmadan boyandı. (A) D11-AP (yeşil) ve nükleer karşı leke (macenta) ile problanmış anjiyotensin II ile tedavi edilmiş bir fareden elde edilen arter, (B) D11-AP ile problanan kontrol sahte muamelesi görmüş bir fareden arter, (C) D11-AP olmadan anjiyotensin II ile tedavi edilen bir fareden arter, (D) D11-AP olmadan kontrol sahte muamelesi görmüş bir fareden arter (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hipertansif ve normotansif hastalardan insan bağırsak dokularının immünofloresansı. HTN'li hastalarda IsoLG'lerin varlığını göstermek için hipertansiyon (HTN) ve normotansif insanlardan (NTN) alınan dokular D11-AP (D11) ile ve D11-AP (D11) olmadan boyandı. (A) D11-AP (yeşil) ve nükleer karşı boya (macenta) ile boyanmış HTN dokuları, (B) D11-AP ile boyanmış NTN dokuları, (C) D11-AP olmadan boyanmış HTN dokuları, (D) D11-AP olmadan boyanmış NTN dokuları (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: D11-AP'li ve D11-AP'siz periplazmik ekstrakt ile boyanmış fare ve insan dokuları. Fare ve insan dokuları D11-AP'li ve D11-AP'siz periplazmik ekstraktlarla boyandı. Görüntüler, D11-AP olmadan periplazmik ekstrakt ile dokuların sınırlı boyandığını göstermektedir, bu da boyamanın çoğunlukla periplazmik ekstraktta bulunabilecek başka bir bileşenden ziyade D11-AP bağlanmasından kaynaklandığını göstermektedir. (A) D11-AP (yeşil) ve nükleer karşı boya (macenta) ile boyanmış Ang fare aortu, (B) periplazmik ekstre ile boyanmış Ang fare aortu, (C) D11-AP ile boyanmış sahte fare aortu, (D) Periplazmik ekstre ile boyanmış sahte fare aortu, (E) D11-AP ile boyanmış hipertansif insan bağırsak dokusu, (F) periplazmik ekstre ile boyanmış hipertansif insan bağırsak dokusu, (G) D11-AP ile boyanmış normotansif insan bağırsak dokusu, (H) periplazmik ekstrakt ile boyanmış normotansif insan bağırsak dokusu (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ang ve Sham farelerinin gemilerinde rekabetçi kontrol. Bu rekabet kontrolünde, D11-AP, IsoLG-katkılı MSA veya katkısız MSA ile önceden inkübe edildi. Herhangi bir ön inkübasyon yapılmadan D11-AP kontrol olarak kullanıldı. Bu sonuçlar, D11-AP'nin IsoLG'lere özgüllüğünü göstermektedir, çünkü D11-AP'ye kıyasla IsoLG-MSA rakibi ile dokuların boyanması azalmıştır. Bu azalma MSA'dan değil IsoLG'den kaynaklanmaktadır, çünkü adducted olmayan MSA ön inkübasyonu D11-AP kontrolüne benzer lekelenme ile sonuçlanmıştır. D11-AP (yeşil) ve nükleer karşı boya (macenta) ile boyanmış anjiyotensin II (A) ve Sham (B) fare aortları, IsoLG-MSA ile inkübe edildikten sonra D11-AP ile boyanmış Anjiyotensin II (C) ve Sham (D) fare aortları, Addüksüz MSA ile inkübe edildikten sonra D11-AP ile boyanmış Anjiyotensin II (E) ve Sham (F) fare aortu (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: D11 ve alakasız scFv, D20 ile boyanmış fare aortu. Fare dokusu D11-AP ile boyandı ve glikoprotein A2 için spesifik olan alakasız bir kontrol antikoru olan D20 ile karşılaştırıldı. Dokunun D11-AP (yeşil) ve nükleer karşı boya (macenta) (A) ile boyanması, D11-AP'nin IsoLG'lere özgüllüğünü gösteren D20 (yeşil) ve nükleer karşı boya (macenta) (B) ile karşılaştırıldığında yoğun immünofloresan ile sonuçlandı (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
D11, hücrelerde veya dokularda IsoLG-katkılı proteinleri 8,9,20 hastalığında inflamasyon veya oksidatif stres için bir belirteç olarak tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Önceden, D11 bir E etiketi içeriyordu ve IHC gelişimi, HRP10,20,21 ile konjuge edilmiş ikincil bir anti-E etiket antikorunun kullanılmasını gerektiriyordu. Burada, ikincil bir antikor inkübasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldıran E-tag yerine alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 antikoru kullanarak IsoLG-katkılı proteinlerin tespiti için protokol geliştirdik ve optimize ettik.
D11-AP'nin özgüllüğünü belirlemek için dört negatif kontrol deneyi yapıldı. Protokolü D11 olmadan uyguladık ve minimal gelişme gösterdik. Bu sonuçların iki yönlü bir endikasyonu vardır: endojen alkalen fosfataz gelişime katkıda bulunmaz ve gözlenen lekelenme D11'e bağlıdır ve başka bir katkıda bulunan faktör değildir. Ardından, slaytları D11 olmadan AP bağlayıcı ile boyadık. Bu deney, serbest AP veya periplazmik ekstrakttaki diğer faktörlerin D11 varlığında gözlemlediğimiz lekeye neden olmadığını gösteren çok az lekelenme ile sonuçlandı. D11'in IsoLG'ye özgüllüğünü sağlamak için, slaytları boyamadan önce D11-AP'yi saflaştırılmış IsoLG ile önceden inkübe ettik. D11-AP'nin IsoLG proteinine bağlı olduğunu gösteren gelişimde bir azalma gördük, böylece dokuda bulunan IsoLG'ye bağlanmak için serbest D11-AP miktarını tükettik. Son olarak, D11-AP'nin IsoLG'ye bağlandığından ve MSA proteini IsoLG'nin bağlı olmadığından emin olmak için, D11-AP'yi yalnızca MSA ile önceden inkübe ettik. D11-AP'nin MSA'ya değil, IsoLG proteinine bağlandığını gösteren gelişimde herhangi bir değişiklik olmadı. Son olarak, boyama protokolünü geliştiren araştırmacılar, insan bağırsak dokusunun hipertansif durumuna kördü. Hipertansiyonlu hastalar ile normotansiyonlu hastalar arasında gözlenen boyama farklılıkları önyargıya bağlı değildi ve daha önce22,23 olarak tanımlanmıştı.
E-tag yerine alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 antikoru kullanarak IsoLG-katkılı proteinlerin tespiti için protokolümüz titiz ve sağlam olmasına ve ikincil bir antikor inkübasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırmasına rağmen, bazı sınırlamaları vardır. Bir sınırlama, periplazmik ekstraktta alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 kullanmamız ve periplazmik ekstraktta veya bağırsak24 gibi bazı dokularda endojen alkalen fosfatazın yanlış boyanması olabilir. Bununla birlikte, bu protokolü geliştirmenin ilk adımı, dokularda bulunabilecek endojen alkalen fosfatazın devre dışı bırakılmasını içeriyordu25. Başlangıçta, soğuk asetik asit, BME ve Levamisole26 verimlilik açısından test edildi. Bunların hiçbiri aktif endojen alkalen fosfataz varlığını tamamen azaltmadı. Alkalen fosfataz27'yi devre dışı bırakmak için ısı kullanılmıştır, bu nedenle farklı tamponlarda alkalen fosfatazın ısı deaktivasyonunu test ettik. Sitrat tamponunda ısıtıma monte edilmiş ve hidratlanmış slaytların çoğu endojen alkalen fosfatazı ortadan kaldırdığını bulduk. Slaytlar başlangıçta bir Kemilüminesan / Floresan Substrat kullanılarak geliştirildi, ancak bu substrat olmadan görüntülendiğinde, yüksek miktarda otofloresan vardı. VectorRed, Texas Red / TRITC kanal aralığında görselleştirilebilen bir kromojen üretmek için alkali fosfataz varlığında gelişen bir substrattır. Bu substratı kullanarak, arka plan otofloresansının üzerindeki sinyali daha kolay gözlemleyebildik. Boyama işlemi sırasında yapay lekelenmeyi en aza indirmek için özen gösterilmelidir. Hidrasyondan sonra görüntüleme yapılana kadar slaytlardaki dokuların kurutulması, gelişimin artmasına neden olmuştur. D11-AP alikote edilmeli ve -20 °C'de saklanmalıdır. D11-AP ile çalışırken birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınılmalıdır. Fosfat tamponlu salin (PBS) ayrıca alkali fosfatazın enzimatik aktivitesini de etkileyebilir ve yıkama tamponu28 olarak kullanılmamalıdır. Herhangi bir antikor bazlı yaklaşımda olduğu gibi, boyamanın spesifik olduğundan ve sinyalin fazla veya az yükseltilmediğinden emin olmak için kapsamlı test ve optimizasyon yapılmalıdır.
Sonuç olarak, E-tag yerine alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 antikoru kullanarak IsoLG-katkılı proteinleri tespit etmek için güçlü, titiz ve sağlam bir optimize edilmiş protokol geliştirdik. Bu protokol birkaç avantaj sunar: İlk olarak, D11'i alkalen fosfataz füzyon proteini olarak kullanmak daha ucuzdur. D11 başlangıçta ticarileştirilemeyen ve saflaştırılması pahalı olan bir faj antikor kütüphanesinden türetilmiştir. E. coli periplazmik ekstraktındaki D11 ucuz bir alternatif sağlayabilmesine rağmen, çoğu tahlilde etkisizdir. İkincisi, alkalen fosfataz füzyon yaklaşımı, D11 scfv'nin kendisine kaynaşmış yararlı bir muhabir15'e (alkalen fosfataz) sahip olmasını sağlar ve substratlar ticari olarak temin edilebildiği için immünotahlillerde kullanılmak üzere saflaştırılmasına gerek kalmaz. Üçüncüsü, E. coli alkalen fosfataz dimerleroluşturur 29. Böylece D11, alkalen fosfataza kaynaştığında dimerler de oluşturur ve bu da antikorun hevesliliğini ve bağlanma aktivitesini arttırır30. Son olarak, periplazmik ekstraktta alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11, Cibacron Blue Sepharose kullanılarak kolayca temizlenebilir. D11 yüksek bir izoelektrik noktaya (~ 9.2 pH) sahiptir. Bu nedenle, pozitif yüklüdür ve pi-katyon etkileşimleri yoluyla Cibacron Blue'ya bağlanabilir. E. coli periplazmik ekstraktındaki safsızlıkların çoğu reçineden dışarı atılabilir. Alkalen fosfataz ile konjuge edilen D11 daha sonra suda yüksek tuz (~ 1.5M NaCl) kullanılarak salınabilir. Alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş elüe D11, yüksek tuz çözeltisinde 4-8 ° C'de oldukça kararlıdır. Bu nedenle, sadece D11 antikorunu düşük bir maliyetle kullanılabilir hale getirmekle kalmayıp, aynı zamanda ikincil antikor inkübasyonu için ekstra adımları ve ihtiyacı ortadan kaldıran bir protokol geliştirdik. Bu protokol, artan oksidatif stresin rol oynadığı çoklu hastalıklarda dokularda biriken IsoLG'lerin tekrarlanabilir ölçümünü kolaylaştırır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından A.K.'ye K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 ve R03HL155041 hibeleri ile desteklenmiştir. Dijital Histoloji Paylaşılan Kaynağına - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 görselleştirme ve slayt taraması için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
| 200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| 2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
| 384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
| 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
| Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
| Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
| Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
| Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
| Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
| Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
| Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
| MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
| Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
| Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
| Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
| Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
| Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
| Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |
References
- Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
- Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
- May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56 (2019).
- Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650 (2017).
- Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
- Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
- Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418 (2020).
- Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
- Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
- Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
- Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
- Shen, Z., et al.
- Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
- Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46 (2006).
- Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
- Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
- Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
- Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
- Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
- Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
- Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
- Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
- Ramos-Vara, J. A.
- Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).
Tags
Biyoloji Sayı 173 izolevuglandinler immünofloresan alkalen fosfataz konjuge ScFv D11 antikoru ve HipertansiyonErratum
Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:
Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
to:
Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
