Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direkte påvisning av isolevuglandiner i vev ved bruk av et D11 scFv-alkalisk fosfatasefusjonsprotein og immunfluorescens

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62603
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4,6, 4, 5, 3, 4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for måling av isolevuglandiner i vev ved immunfluorescens ved bruk av alkalisk fosfatase-konjugert ScFv D11-antistoff. Hypertensjonsmodeller hos både mus og mennesker brukes til å forklare trinnvise prosedyrer og grunnleggende prinsipper knyttet til isolevuglandinmåling i vevsprøver.

Abstract

Isolevuglandiner (IsoLGs) er svært reaktive gamma ketoaldehyder dannet fra H2-isoprostaner gjennom lipidperoksidasjon og kryssbindende proteiner som fører til betennelse og ulike sykdommer, inkludert hypertensjon. Deteksjon av IsoLG-akkumulering i vev er avgjørende for å kaste lys over deres involvering i sykdomsprosessene. Imidlertid er måling av IsoLG i vev ekstremt vanskelig, og for tiden tilgjengelige verktøy, inkludert massespektrometrianalyse, er arbeidskrevende og ekstremt kostbare. Her beskriver vi en ny metode for in situ påvisning av IsoLG i vev ved bruk av alkalisk fosfatase-konjugert D11 ScFv og et rekombinant-display antistoff produsert i E. coli ved immunfluorescerende mikroskopi. Fire kontroller ble brukt for å validere fargingen: (1) farging med og uten D11, (2) farging med bakterielt periplasmatisk ekstrakt med alkalisk fosfataselinker, (3) irrelevant scFV-antistofffarging og (4) konkurransedyktig kontroll med IsoLG før fargingen. Vi demonstrerer effektiviteten av alkalisk fosfatase-konjugert D11 i både humant og musvev med eller uten hypertensjon. Denne metoden vil trolig tjene som et viktig verktøy for å studere rollen til IsoLG i et bredt spekter av sykdomsprosesser.

Introduction

Isolevuglandiner (IsoLG), også kjent som isoketaler, er isomerer av 4-ketoaldehydfamilien, som er produkter av lipidperoksydasjon, og reagerer med og addukterer til primære aminer på proteiner 1,2. IsoLG har vært involvert i flere sykdommer, inkludert kardiovaskulær, Alzheimers, lunge- og leversykdommer, og mange typer kreft3. IsoLG har blitt mest omfattende studert i deres bidrag til kardiovaskulær sykdom (CVD), som er en betydelig helsemessig og økonomisk byrde globalt, inkludert USA. Det er anslått at 92.1 millioner amerikanske voksne har minst en type CVD, med 2030 estimerte anslag som når til 43.9% av den amerikanske voksne befolkningen4. Senking av blodtrykk, kolesterol og røykeslutt reduserer den totale risikoen og forekomsten av CVD-hendelser5.

Høyt blodtrykk eller hypertensjon er en viktig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom og påvirker omtrent halvparten av den amerikanske befolkningen6. Tidligere studier har funnet at betennelse er en underliggende årsak til hypertensjon, og at IsoLG spiller en rolle7. Hypertensive stimuli, inkludert angiotensin II, katekolaminer, aldosteron og overflødig diettsalt, induserer IsoLG-akkumulering i antigenpresenterende celler, inkludert dendrittiske celler (DC), som igjen aktiverer T-celler for å proliferere og produsere inflammatoriske cytokiner som bidrar til hypertensjon 8,9.

Tidligere har IsoLG blitt målt med immunhistokjemi, massespektrometri, enzymbundet immunosorbentanalyse og flowcytometri10,11. For å lette måling av IsoLG ble det utviklet et enkeltkjede fragmentvariabel (scfv) rekombinant antistoff (D11) mot IsoLG12. I utgangspunktet inneholdt dette D11-antistoffet en 11 aminosyre E-tag og krevde et sekundært antistoff for immunhistokjemi deteksjon11. Det var imidlertid vanskelig å finne et pålitelig sekundært antistoff mot E-taggen etter at produksjonen ble avsluttet av produsenten. Derfor har vi utviklet en pålitelig protokoll for immunfluorescerende farging av IsoLG ved bruk av D11 konjugert med alkalisk fosfatase (D11-AP), som vi har demonstrert i mus og humant vev med og uten hypertensjon.

Protocol

Vanderbilt University's Institutional Animal Care and Use Committee godkjente alle prosedyrer beskrevet i dette manuskriptet. Mus oppbevares og stelles i henhold til Veiledning for stell og bruk av forsøksdyr. Alle ga skriftlig informert samtykke før de meldte seg på studien som godkjent av Institutional Review Board of Vanderbilt University. Alle prosedyrer ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen.

1. Fremstilling av plasmider som koder for D11-alkalisk fosfatasefusjonsprotein og negative kontrollvektorer

  1. Konstruer en modifisert versjon av pCANTAB5E-plasmidet13,14 der enkeltkjedefragmentvariabelen (scFv) -segmentet er koblet ved sin 3' ende til en sekvenskoding av bakteriell alkalisk fosfatase (AP).
    MERK: Umiddelbart nedstrøms for scFv-sekvensens NotI-begrensningssted, inneholder det modifiserte plasmidet ikke lenger kodingssekvensen til E-taggen og koder i stedet linkersekvensen GGSGGHMGSGG, etterfulgt av sekvensen for AP (GenBank tiltredelsesnummer AXY87039.1, T16-K464) 15,16. Nedstrøms for AP vil plasmidet kode 8xHis og DYKDDDDK-tagger. På 3'-enden av taggene avsluttes kodingssekvensen med et gult stoppkodon. Det modifiserte plasmidet kalles pCANTAB5-AP.
  2. Klon D11 scFv (GenBank tiltredelsesnummer AAW28931.1) til pCANTAB5-AP med SfiI / NotI begrensningssider.
  3. Klon D20 scFv til pCANTAB5-AP med SfiI/NotI-begrensningsnettstedene.
    MERK: D20 scFv er en negativ kontroll designet for å vurdere vevsinteraksjonsmønsteret til en irrelevant scFv. Denne scFv ble opprinnelig valgt av fagskjerm for sin evne til å interagere med en glykangruppe kjent som A2.
  4. Generer en "tom" vektor ved å fjerne scFv-delen fra plasmidet helt og erstatte den med en "AP-linker" -kodesekvens bestående av aminosyrer GGGGSGRAGSGGGGS.
  5. Omdanne alle plasmider til kompetent TG1 E. coli og dyrk bakterier over natten ved 30 °C, på 0,5 % agarplater inneholdende 2xYT supplert med 100 μg/ml ampicillin og 2 % glukose (2xYTAG) medium.
    MERK: Stammer med supE-genet (som TG1 E. coli) undertrykker ikke det gule stoppkodonet 100%. Estimater varierer fra 0,8 - 20% av tiden, så det er fortsatt mye produkt som avsluttes like nedstrøms for BAP, som det er ment for disse eksperimentene17. TG1 E. coli brukes hovedsakelig av praktiske årsaker, for eksempel reduksjon av tid og kostnader, deres kompatibilitet med pCANTAB-proteinuttrykkssystemet og deres bruk i fagdisplay, som vanligvis utføres i laboratoriet. Nedstrøms for ravstoppkodonet etter BAP er en sekvens for geneIII. GeneIII-fusjonsproteiner må uttrykkes sjelden for at fagvisning skal fungere som tiltenkt fordi scFv-geneIII-fusjonsproteiner forstyrrer det bestemte genIII-proteinet for å infisere naive bakterier på nytt. Derfor må fusjonsfrie geneIII-proteiner eksistere under virionmontering for generering av fungerende, dvs. scFv-geneIII-proteinprodukter er vanligvis relativt sjeldne inne i bakterien. D11-AP, D20-AP, tom vektor og alle konstruksjoner som brukes i denne artikkelen påvirkes på samme måte av sporadisk geneIII-fusjonsproteinuttrykk. Det er fortsatt observerte forskjeller i hvordan disse proteinene oppfører seg.
  6. Velg en individuell koloni og inokuler en fersk 5 ml 2xYTAG-kultur. La bakterier vokse over natten ved 30 °C og risting ved 150 o / min.
  7. Pellet cellene ved sentrifugering ved 3000 x g i 10 min ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml 85 % 2xYTAG og 15 % glyserol.
  8. Oppbevar glyserollagrene i en fryser på -80 °C.

2. Proteinuttrykk og generering av periplasmatisk ekstrakt

MERK: Generering av det periplasmatiske ekstraktet er en vanlig metode for proteinuttrykk i fagdisplay, hovedsakelig fordi dannelsen av disulfidbindinger er viktig i scFv og antistoffgenerering. Metoden unngår behovet for å generere lysater (vanligvis inneholdende inklusjonslegemer) og sikrer at proteiner er riktig foldet. pCANTAB har en gIII-signalsekvens oppstrøms for scFv-delen av D11-BAP-fusjonsproteinet. Signalsekvensen sikrer at proteinet transporteres til bakteriens periplasmatiske rom, og deretter spaltes signalsekvensen. Det periplasmatiske rommet gir et oksiderende miljø, noe som er avgjørende for riktig dannelse av disulfidbroer. Osmotisk sjokk brukes til å utlede periplasmatiske ekstrakter fordi det forstyrrer den ytre membranen nok til å frigjøre de periplasmatiske proteinene i det omkringliggende mediet, samtidig som bakterien holdes intakt.

  1. Inokuler TG1 E. coli-glyserolbestandene som inneholder de relevante plasmidene i en 60 ml kultur av 2xYTAG og kultur over natten ved 30 °C med risting ved 150 o / min.
  2. For å indusere proteinuttrykk, pelletsbakteriekulturer ved 3000 x g i 10 minutter, resuspenderes i 60 ml 2xYTA medium og kultur over natten ved 30 °C med risting ved 150 o / min.
    MERK: Overgangen fra 2xTYAG til 2xYTA medium bidrar til tilstrekkelig induksjon av proteinuttrykk18. Når glukose er tilstede i bakteriemediet, undertrykkes lac-promotoren fordi bakterier fortrinnsvis forbruker glukose og ignorerer laktose, da glukose tar mindre energi å behandle. Når glukose fjernes etter mediumbryteren, er bakterier avhengige av karbohydrater levert av 2xYT-mediet. Gjærekstrakt (Y-komponenten i 2xYT) inneholder karbohydrater, blant annet laktose, og er derfor i stand til å drive proteinuttrykk gjennom lac-promotoren. IPTG er ikke nødvendig med pCANTAB-konstruksjonen og kan resultere i overdreven proteinuttrykk, sammen med inklusjonslegemer som resulterer i ikke-funksjonelt protein.
  3. Generer periplasmatiske ekstrakter via osmotisk sjokk.
    1. Pelletsbakteriekulturer ved 3000 x g i 10 min.
    2. Resuspender i 20 ml 1xTES (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M sukrose) og inkuber i 1 time på is.
    3. Pellet igjen ved 3000 x g i 10 min, og resuspender i 15 ml 0,05 M Tris, pH 7,6.
  4. Inkuber denne suspensjonen på is i 1 time, og avklar deretter ved sentrifugering ved 5000 x g i 10 minutter.
  5. Overfør supernatanter til en ny tube og oppbevar ved -20 °C til det er nødvendig for enten rensing eller direkte bruk i eksperimenter.
  6. Vurder cellelysen ved tilstedeværelse av aktiv D11-BAP i ELISA. Tilsett 3-5 μL av det periplasmatiske ekstraktet til en ml pNPP, og observer deretter om en fargeendring skjer i løpet av de neste 10 minuttene (fargen går fra klar gul til intens gul).
    MERK: Fargen kan sammenlignes side om side med et rør av pNPP som ikke har mottatt noe lysat eller et rør av pNPP som mottok lysat av naive TG1-bakterier. Kvantifiser med absorbans ved 405 nm.

4. Karakterisering av D11-AP-titer i ELISA

  1. Belegg en 384-brønns polystyrenplate over natten ved 4 °C med 25 μL/brønnfosfatbufret saltvann (PBS) (1,8 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na 2 HPO4, 2,7mM KCl, 137 mM NaCl) som inneholder enten 5 μg/ml museserumalbumin (MSA) (negativ kontroll) eller 5 μg/ml IsoLG/MSA (positiv kontroll).
  2. Tøm platen og trykk tørt. Vask en gang med PBS + 0,1% Tween (PBS-T). Tøm platen og trykk tørt.
  3. Fyll platen med PBS-T som blokkeringsbuffer (120 μL/brønn). Inkubere i 1 time ved romtemperatur.
  4. Tøm platen og trykk tørt. Påfør serielle 1:2-fortynninger av D11-AP periplasmatiske ekstrakter ved 25 μL/brønn og fortynnet i PBS-T. Inkluder en brønn som bare inneholder PBS-T som negativ kontroll.
    MERK: Typiske fortynningsområder for periplasmatiske ekstrakter er 1:8 - 1:4096. For et 25 μL analysevolum, start med 50 μL av startkonsentrasjonen "1: 8": 6,25 μL periplasmatisk ekstrakt og 43,75 μL PBS-T. Deretter utfører du en 2 ganger fortynning ved å fjerne 25 μL av denne løsningen og tilsette den til neste brønn som inneholder 25 μL PBS-T og pipette den opp og ned. Denne brønnen inneholder nå "1:16" fortynning. Fortsett å gjenta den 2 ganger fortynningen for å generere den beskrevne 1:2 fortynningsserien.
  5. Inkuber i 1,5 time ved romtemperatur.
  6. Tøm platen og trykk tørt. Vask 5 ganger med PBS-T. Tøm og trykk tørt.
  7. Klargjør pNPP-oppløsning ved å oppløse 1 g pNPP i 1 l 930 mM dietanolamin (98 % stamoppløsning fortynnet 1:10 iH2O), med 0,5 mM MgCl2og justert til pH 9,5 med HCl.
  8. Påfør 25 μL / brønn pNPP-løsning for å utvikle AP. Inkuber i 1 time ved romtemperatur og bestem absorbansen ved 405 nm i hver brønn ved hjelp av en kompatibel plateleser.
  9. Sammenlign signalet som genereres fra IsoLG / MSA-brønnene med støyen som genereres fra MSA-brønnene, og finn fortynningsområdet der signalet er minst 5 ganger høyere enn støyen.
  10. Plott denne D11-AP-signalfortynningsserien på en graf, bestem kurvens lineære område og fastslå fortynningen der 50% av signalet kan observeres.
    MERK: Hvis denne fortynningen tilsvarer ca. 1:1 000, kan D11-AP-oppløsningen brukes i en konsentrasjon på 1:10 i IHC/IF.

5. Immunfluorescens

  1. Skjær serielle seksjoner av vev med mus og parafin-embedded vev (5 μm tykt) ved hjelp av en mikrotome og sett i et varmt vannbad (37 °C). Monter vevseksjoner på glassglass og la det tørke over natten.
    MERK: For denne studien ble aortae hentet fra mus. Kolon seksjoner av normotensive og hypertensive mennesker ble hentet fra Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network.
  2. Fordyp lysbilder i xylen tre ganger i 5 minutter for å deparaffinisere vev.
  3. Rehydrer vev i 2 vasker hver av 95%, 70% og 50% etanol i H2O.
  4. Vask slides i Tris-bufret saltvann (TBS) med 0,1% Tween20 (TBST) tre ganger med hurtigvask ved å fylle glideholderen med TBST og deretter kaste TBST.
    MERK: Hydrerte lysbilder kan lagres i TBST ved 4 °C i ikke lenger enn en uke før antigenuthenting.
  5. For å utføre varmeindusert antigenuthenting av lysbilder, plasser lysbilder i forvarmet (80-95 °C) natriumcitratbuffer (10 mM natriumsitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) og inkuber i en trykkoker satt til 4 minutter på høyt trykk for en total antigenopphentingstid på 20 min.
  6. Fjern lysbilder fra trykkokeren og la dem avkjøles i 20 minutter til romtemperatur.
  7. Vask lysbilder i TBST tre ganger med hurtigvask.
    MERK: Lysbilder kan lagres i TBST etter antigenuthenting i ikke lenger enn en uke før farging.
  8. Legg til 2% BSA oppløst i TBST for å blokkere lysbilder. Dekk lysbilder med en stripe parafinfilm og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
  9. Forkast blokkeringsbufferen fra lysbildene.
  10. Tilsett 200 μL 1:10 D11-AP i TBST på lysbildene og dekk til med en stripe parafinfilm.
  11. Inkuber i et fuktet kammer for å minimere fordampningen av antistoffoppløsningen i 3 timer ved romtemperatur.
  12. Vask lysbilder tre ganger i TBST.
  13. Utvikle med en kolorimetrisk eller fluorescerende alkalisk fosfataseutvikler for henholdsvis immunhistokjemi eller immunfluorescens. Vask lysbilder én gang med TBST for å fjerne overflødig utvikler og forhindre videre fargeutvikling.
  14. Motflekksklier med Hoechst kjernefysisk flekk ved 1 μg/ml i PBS for immunfluorescens. Vask lysbildene én gang i TBST for å fjerne overflødig motflekk.
  15. Påfør dekkslipp med monteringsmediet.
  16. Se lysbilder under et invertert lysmikroskop for immunhistokjemi eller et konfokalfluorescerende mikroskop for immunfluorescens.

6. Negative kontroller

MERK: Fire negative kontrolleksperimenter kan utføres for å bekrefte spesifisiteten til D11-AP-farging for IsoLG. Negative kontrolleksperimenter bør utføres i samme fargesett under de samme forholdene.

  1. I det første negative kontrolleksperimentet inkuberer vev med D11-AP fortynnet i TBST eller TBST alene.
  2. Inkuber vev med fortynnet D11-AP i TBST og bakterielt periplasmatisk ekstrakt uten D11-AP (AP Linker) fortynnet i TBST.
  3. Utfør en konkurransedyktig analyse med IsoLG/MSA eller ikke-adduktert MSA som tidligere beskrevet12.
    1. Forbered IsoLG og IsoLG adduktert til musserumalbumin (MSA) som tidligere beskrevet19, i et molforhold på 8 IsoLG: 1 MSA (8: 1 IsoLG / MSA).
    2. Fortynn D11-AP 1:10 i TBST.
    3. Inkubat fortynnet D11-AP med 50 μg/ml IsoLG/MSA eller ikke-adduktert MSA i 1 time ved romtemperatur.
    4. Legg D11-AP med IsoLG / MSA eller D11-AP med ikke-adduktert MSA til vev for farging.
  4. Bruk irrelevant scFv-antistoff, D20, for å farge vev for det endelige negative kontrollsettet.

Representative Results

I representative eksperimenter ble D11 scfv med alkalisk fosfatasekonjugering (D11-AP) brukt i immunfluorescens for å oppdage isoLG tilstede i angiotensin II-behandlede mus sammenlignet med normale humbugmus og mennesker med hypertensjon sammenlignet med normotensive mennesker. Mus ble behandlet med angiotensin II i en dose på 490 ng/kg/min i to uker, og hypertensjon ble bekreftet med økt systolisk blodtrykk sammenlignet med10. For å sikre spesifisiteten til D11-AP ble vev farget med eller uten tilstedeværelse av D11-AP. Som demonstrert ved D11-AP-farging, viste aorta hos mus med angiotensin II-indusert hypertensjon forhøyet konsentrasjon av IsoLG sammenlignet med kontrollmus (figur 1). Bakgrunnsfarging eller autofluorescens var begrenset, som vist ved negative kontroller som ikke var farget med D11-AP.

D11-AP ble brukt til å oppdage isoLG tilstede i tarmvev hos humane pasienter med hypertensjon (HTN) eller normotensive mennesker (NTN). Hypertensjonsstatus ble fastsatt ut fra sykehusjournalen som systolisk blodtrykk over 140 og diastolisk blodtrykk over 80 mmHg. Forskere som utviklet immunfluorescensprotokoll for D11-AP ble blindet for hypertensjonsstatusen til humant vev. Seksjoner ble farget i nærvær og fravær av D11-AP for å sikre antistoffspesifisitet og vise bakgrunnsfarging eller autofluorescens. Som vist i figur 2 fant vi at vev fra pasienter med HTN hadde forhøyede konsentrasjoner av IsoLG sammenlignet med pasienter med NTN. Farging uten D11-AP viste også minimal bakgrunnsfarging og autofluorescens. Endogen alkalisk fosfatase uttrykkes av tarmepitel, slik at den begrensede fluorescensen av vev farget uten D11-AP viser at antigeninnhentingen som ble brukt i denne protokollen, var tilstrekkelig til å inaktivere endogen alkalisk fosfatase tilstede i vev. I kombinasjon med resultatene hos mus viser disse resultatene også at immunfluorescensprotokollen effektivt viser forhøyede IsoLG i hypertensjon sammenlignet med normotensiv status.

D11-AP ble isolert og lagret i bakterielt periplasmatisk ekstrakt. Mus og humant vev ble farget med D11-AP og periplasmatisk ekstrakt inneholdende AP-linkeren uten D11 for å sikre at andre faktorer som kan være tilstede i det periplasmatiske ekstraktet, som overskudd eller ikke-konjugert alkalisk fosfatase, ikke bidrar til fargingen observert i vev behandlet med D11-AP (figur 3). Vev farget med D11-AP resulterte i lysere farging sammenlignet med vev farget med periplasmatisk ekstrakt. Disse resultatene bekrefter at D11-AP farger vevet, og fargingen skyldes ikke ikke-konjugert bakteriell alkalisk fosfatase som potensielt kan være tilstede i det periplasmatiske ekstraktet og resultere i falsk farging av IsoLG eller bidra til bakgrunnsfarging.

En konkurransedyktig kontroll ble utført ved å pre-inkubere D11-AP med IsoLG adduktert til MSA eller ikke-adduktert MSA før farging av vev for å vise spesifisiteten til D11-AP til IsoLG. Hvis D11-AP er spesifikk for IsoLG, vil antistoffet binde seg til IsoLG-MSA, noe som resulterer i en utarmet tilgjengelighet av D11-AP for å flekke vev, og D11-AP inkubert med ikke-adduktert MSA vil ha lignende farging som normal D11-AP. I vev farget med D11-AP pre-inkubert med IsoLG-konkurrenten, fant vi redusert farging sammenlignet med vev som var farget med D11-AP uten preinkubasjon (figur 4). I vev farget med D11-AP preinkubert med ikke-adduktert MSA, fant vi farging å være lik farging observert i vev med D11-AP. Disse resultatene viser spesifisiteten til D11-AP til IsoLG på grunn av redusert farging av vev når D11-AP ble pre-inkubert med IsoLG / MSA, men ikke ikke-adduktert MSA. I den siste negative kontrollen ble musevev farget med D11-AP eller irrelevant scFv-antistoff, D20. Farging av museaorta med D11-AP resulterte i sterk farging sammenlignet med D20, noe som indikerer spesifisiteten til D11-AP til IsoLG i hypertensive aortae (figur 5).

Figure 1
Figur 1 Immunfluorescens av aorta hos hypertensive og normotensive mus. Arterier fra angiotensin II og sham infundert mus ble farget med og uten D11-AP (D11) for å vise tilstedeværelse av IsoLGs. (A) Arterie fra en angiotensin II-behandlet mus undersøkt med D11-AP (grønn) og nukleær motflekk (magenta), (B) Arterie fra en kontrollhumbugbehandlet mus undersøkt med D11-AP, (C) Arterie fra en angiotensin II-behandlet mus uten D11-AP, (D) Arterie fra en kontroll sham behandlet mus uten D11-AP (skala bar = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Immunfluorescens av humant tarmvev fra hypertensive og normotensive pasienter. Vev fra pasienter med hypertensjon (HTN) og normotensive mennesker (NTN) ble farget med og uten D11-AP (D11) for å vise tilstedeværelse av IsoLG hos pasienter med HTN. (A) HTN-vev farget med D11-AP (grønn) og kjernefysisk motflekk (magenta), (B) NTN-vev farget med D11-AP, (C) HTN-vev farget uten D11-AP, (D) NTN-vev farget uten D11-AP (skalastang = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mus og humant vev farget med periplasmatisk ekstrakt med og uten D11-AP. Mus og humant vev ble farget med periplasmatiske ekstrakter med og uten D11-AP. Bilder viser begrenset farging av vev med periplasmatisk ekstrakt uten D11-AP, som viser farging skyldes hovedsakelig D11-AP-binding i stedet for en annen komponent som kan være tilstede i periplasmatisk ekstrakt. (A) Ang mus aorta farget med D11-AP (grønn) og kjernefysisk motflekk (magenta), (B) Ang mus aorta farget med periplasmisk ekstrakt, (C) Sham mus aorta farget med D11-AP, (D) Sham mus aorta farget med periplasmatisk ekstrakt, (E) hypertensive humant tarmvev farget med D11-AP, (F) hypertensive humant tarmvev farget med periplasmatisk ekstrakt, (G) normotensive humant tarmvev farget med D11-AP, (H) normotensivt humant tarmvev farget med periplasmatisk ekstrakt (skala bar = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Konkurransedyktig kontroll i fartøy med Ang- og Sham-mus. I denne konkurransekontrollen ble D11-AP pre-inkubert med IsoLG-adduktert MSA eller ikke-adduktert MSA. D11-AP uten pre-inkubasjon ble brukt som kontroll. Disse resultatene viser spesifisiteten til D11-AP til IsoLG fordi det er redusert farging av vev med IsoLG-MSA-konkurrenten sammenlignet med D11-AP. Denne reduksjonen skyldes IsoLG og ikke MSA fordi den ikke-addukterte MSA-preinkubasjonen resulterte i farging tilsvarende D11-AP-kontroll. Angiotensin II (A) og Sham (B) mus aortae farget med D11-AP (grønn) og nukleær motflekk (magenta), angiotensin II (C) og Sham (D) mus aortae farget med D11-AP etter inkubering med IsoLG-MSA, angiotensin II (E) og Sham (F) mus aortae farget med D11-AP etter inkubering med ikke-adduktert MSA (skala bar = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Mus aortae farget med D11 og irrelevant scFv, D20. Musevev ble farget med D11-AP og sammenlignet med et irrelevant kontrollantistoff, D20, som er spesifikt for glykoprotein A2. Farging av vev med D11-AP (grønn) og nukleær motflekk (magenta) (A) resulterte i intens immunfluorescens sammenlignet med D20 (grønn) og nukleær motflekk (magenta) (B) som indikerer spesifisitet av D11-AP til IsoLG (skala bar = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

D11 har blitt brukt mye for å oppdage IsoLG-addukterte proteiner i celler eller vev som en markør for betennelse eller oksidativt stress ved sykdom 8,9,20. Tidligere inneholdt D11 en E-tag og IHC-utvikling krevde bruk av et sekundært anti-E tag antistoff konjugert med HRP10,20,21. Her har vi utviklet og optimalisert protokoll for påvisning av IsoLG-addukterte proteiner ved bruk av D11-antistoffet konjugert med alkalisk fosfatase i stedet for E-tag, noe som eliminerer behovet for en sekundær antistoffinkubasjon.

For å bestemme spesifisiteten til D11-AP ble det utført fire negative kontrolleksperimenter. Vi utførte protokollen uten tilstedeværelse av D11 og hadde minimal utvikling. Disse resultatene har en todelt indikasjon: endogen alkalisk fosfatase bidrar ikke til utvikling, og den observerte fargingen skyldes D11 og ikke en annen medvirkende faktor. Deretter farget vi lysbilder med AP-linkeren uten D11. Dette eksperimentet resulterte i lite farging, noe som indikerer at fri AP eller andre faktorer i det periplasmatiske ekstraktet ikke forårsaker flekken vi observerer i nærvær av D11. For å sikre spesifisiteten til D11 til IsoLG, preinkuberte vi D11-AP med renset IsoLG før farging av lysbilder. Vi så en nedgang i utviklingen som indikerer at D11-AP var bundet til IsoLG-proteinet, og dermed utmattet mengden fri D11-AP for å binde seg til IsoLG tilstede i vevet. Til slutt, for å sikre at D11-AP var bindende til IsoLG og ikke MSA-proteinet IsoLG var bundet til, preinkuberte vi D11-AP kun med MSA. Det var ingen endringer i utviklingen, noe som indikerer at D11-AP ikke var bindende til MSA, men IsoLG-proteinet. Til slutt var forskere som utviklet fargeprotokollen blinde for hypertensiv status for humant tarmvev. Forskjellene i farging observert mellom pasienter med hypertensjon og pasienter med normotension skyldtes ikke skjevhet og er tidligere beskrevet22,23.

Selv om vår protokoll for påvisning av IsoLG-addukterte proteiner ved bruk av D11-antistoffet konjugert med alkalisk fosfatase i stedet for E-tag er streng og robust og eliminerer behovet for en sekundær antistoffinkubasjon, har den noen begrensninger. En begrensning er at vi brukte D11 konjugert med alkalisk fosfatase i det periplasmatiske ekstraktet, og det kan være falsk farging av endogen alkalisk fosfatase i det periplasmatiske ekstraktet eller visse vev, som tarm24. Imidlertid inkluderte det første trinnet for å utvikle denne protokollen å deaktivere endogen alkalisk fosfatase som kan være tilstede i vev25. I utgangspunktet ble kaldeddiksyre, BMW og Levamisol26 testet for effektivitet. Ingen av disse reduserte fullstendig tilstedeværelsen av aktiv endogen alkalisk fosfatase. Varme har blitt brukt til å deaktivere alkalisk fosfatase27, så vi testet varmedeaktivering av alkalisk fosfatase i forskjellige buffere. Vi fant varmemonterte og hydrerte lysbilder i sitratbuffer eliminert mest endogent alkalisk fosfatase. Slides ble opprinnelig utviklet ved hjelp av et kjemiluminescerende / fluorescerende substrat, men når det ble avbildet uten dette substratet, var det en høy mengde autofluorescens. VectorRed er et substrat som utvikles i nærvær av alkalisk fosfatase for å produsere et kromogen som kan visualiseres i Texas Red / TRITC kanalområdet. Ved hjelp av dette substratet kunne vi lettere observere signal over bakgrunnsautofluorescens. Forsiktighet bør utvises under fargeprosessen for å minimere kunstig farging. Tørking av vev på skred etter hydrering inntil avbildning har resultert i økt utvikling. D11-AP skal alisiteres og oppbevares ved -20 °C. Flere fryse-tine-sykluser bør unngås ved arbeid med D11-AP. Fosfatbufret saltvann (PBS) kan også påvirke den enzymatiske aktiviteten til alkalisk fosfatase og bør ikke brukes som vaskebuffer28. Som med enhver antistoffbasert tilnærming, må grundig testing og optimalisering utføres for å sikre at fargingen er spesifikk, og at signalet ikke er over eller under forsterket.

Avslutningsvis har vi utviklet en kraftig, streng og robust optimalisert protokoll for å oppdage IsoLG-addukterte proteiner ved bruk av D11-antistoffet konjugert med alkalisk fosfatase i stedet for E-tag. Denne protokollen gir flere fordeler: For det første er det billigere å bruke D11 som et alkalisk fosfatasefusjonsprotein. D11 ble opprinnelig avledet fra et fagantistoffbibliotek som ikke kunne kommersialiseres og var dyrt å rense. Selv om D11 i E. coli periplasmatisk ekstrakt kunne gi et billig alternativ, var det ineffektivt i de fleste analyser. For det andre tillater alkalisk fosfatasefusjonstilnærming D11 scfv å ha en nyttig reporter15 (alkalisk fosfatase) smeltet til den og trenger ikke å bli renset for bruk i immunoassays da substrater er kommersielt tilgjengelige. For det tredje danner E. coli alkalisk fosfatase dimerer29. Så D11, når smeltet til alkalisk fosfatase, vil også danne dimerer, og dette øker antistoffets aviditet og bindingsaktivitet30. Endelig kan D11 konjugert med alkalisk fosfatase i periplasmatisk ekstrakt enkelt rengjøres ved hjelp av Cibacron Blue Sepharose. D11 har et høyt isoelektrisk punkt (~9,2 pH). Som sådan er den positivt ladet og kan binde seg til Cibacron Blue gjennom pi-kation-interaksjoner. De fleste urenheter i E. coli periplasmatisk ekstrakt kan elueres av harpiksen. D11 konjugert med alkalisk fosfatase kan deretter elueres ved bruk av høyt salt (~ 1.5M NaCl) i vann. Den eluerte D11 konjugert med alkalisk fosfatase er ganske stabil ved 4-8 ° C i den høye saltoppløsningen. Dermed har vi utviklet en protokoll som ikke bare gjør D11-antistoffet tilgjengelig til en lav kostnad, men eliminerer også de ekstra trinnene og behovet for sekundær antistoffinkubasjon. Denne protokollen muliggjør reproduserbar måling av IsoLG, som akkumuleres i vev i flere sykdommer der økt oksidativt stress spiller en rolle.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 og R03HL155041 til A.K. Vi takker Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 for visualisering og lysbildeskanning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) Cytiva 28953766
200 Proof Ethanol Pharmco 111000200
2xYT powder MP Biomedicals 3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates ThermoFisher (NUNC) 242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) Carbosynth EN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) Carbosynth EB09335
Ampicillin, sodium salt Research Products International (RPI) A40040
Bovine Serum Albumin RPI A30075
Chemically competent TG1 E. coli Amid Biosciences TG1-201
Diethanolamine, >98% Sigma-Aldrich D8885
EDTA Sigma-Aldrich ED
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Mouting medium
Glucose Research Products International (RPI) G32045
Glycerol Sigma-Aldrich G7893
Histoclear National Diagnostics HS-200 Xylene alternative
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals ThermoFisher MK-2624-212
Imidazole Research Products International (RPI) I52000
MgCl2 (anhydrous) Sigma-Aldrich M8266
Mouse Serum Albumin (MSA) Sigma-Aldrich/Calbiochem 126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) Carbosynth EN13587
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Pressure Cooker Cuisinart CPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml ThermoFisher 66380
Sodium chloride (NaCl) Research Products International (RPI) S23020
Sodium Citrate Sigma-Aldrich 1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Research Products International (RPI) S23100
Sucrose Research Products International (RPI) S24065
Tris base Research Products International (RPI) T60040
Tris-buffered Saline Boston Bio-Products 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HCl Research Products International (RPI) T60050
Tween20 Sigma-Aldrich P9416
Vector Red Vector Labs SK-5105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56 (2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650 (2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418 (2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46 (2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

Tags

Biologi utgave 173 isolevuglandiner immunfluorescens alkalisk fosfatase konjugert ScFv D11 antistoff og hypertensjon

Erratum

Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Direkte påvisning av isolevuglandiner i vev ved bruk av et D11 scFv-alkalisk fosfatasefusjonsprotein og immunfluorescens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic,… More

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic, L., Pitzer, A., Davies, S. S., Layer, J. H., Mernaugh, R. L., Kirabo, A. Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (173), e62603, doi:10.3791/62603 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter