Summary
Her etablerer vi en protokol til samtidig at visualisere og analysere flere SMAD-komplekser ved hjælp af nærhed ligation assay (PLA) i endotelceller udsat for patologiske og fysiologiske væskeforskydningsstress betingelser.
Abstract
Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering er stramt reguleret og afbalanceret under udvikling og homøostase i vaskulatsystemet Derfor resulterer deregulering i denne signalvej i alvorlige vaskulære patologier, såsom lungepulsåren hypertension, arvelig hæmoragisk telangiectasia og åreforkalkning. Endotelceller (ECs), som det inderste lag af blodkar, er konstant udsat for væskeforskydning stress (SS). Unormale mønstre af væske SS har vist sig at forbedre TGFβ/BMP signalering, som sammen med andre stimuli fremkalder åreogenese. I forbindelse med dette, atheroprone, lav laminar SS blev fundet at forbedre TGFβ / BMP signalering mens atheroprotective, høj laminar SS, mindsker denne signalering. For effektivt at analysere aktiveringen af disse veje designede vi en arbejdsgang for at undersøge dannelsen af transskriptionsfaktorkomplekser under lav laminar SS og høje laminar SS-forhold ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt pneumatisk pumpesystem og nærhed ligation assay (PLA).
Aktiv TGFβ/BMP-signalering kræver dannelse af trimeriske SMAD-komplekser bestående af to regulatoriske SMAD'er (R-SMAD); SMAD2/3 og SMAD1/5/8 for henholdsvis TGFβ- og BMP-signalering) med en fælles mægler SMAD (co-SMAD; SMAD4). Ved hjælp af PLA rettet mod forskellige underenheder af trimerisk SMAD-kompleks, dvs. enten R-SMAD/co-SMAD eller R-SMAD/R-SMAD, kan dannelsen af aktive SMAD transskriptionsfaktorkomplekser måles kvantitativt og rumligt ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Brugen af flow slides med 6 små parallelle kanaler, der kan tilsluttes i serier, giver mulighed for undersøgelse af transskription faktor kompleks dannelse og inddragelse af nødvendige kontroller.
Arbejdsgangen forklaret her kan let tilpasses til undersøgelser rettet mod nærheden af SMADs til andre transskription faktorer eller til transskription faktor komplekser andre end SMADs, i forskellige flydende SS betingelser. Den arbejdsgang, der præsenteres her, viser en hurtig og effektiv måde at studere den flydende SS inducerede TGFβ/BMP-signalering i ECs, både kvantitativt og rumligt.
Introduction
Proteiner af de transformerende vækstfaktorer beta (TGFβ) superfamily er pleiotropiske cytokiner med en række medlemmer, herunder TGFβs, knoglemorfogenetiske proteiner (BMB'er) og Activins1,2. Ligandbinding fremkalder dannelsen af receptor oligomerer, der fører til fosforylering og dermed aktivering af cytosolic reguleringsmæssig SMAD (R-SMAD). Afhængigt af ligandernes underfamilie aktiveres forskellige R-SMAD'er1,2. Mens TGFβs og Activins hovedsagelig fremkalder fosforylering af SMAD2/3, fremkalder BMB'er SMAD1/5/8 fosforylering. Der er imidlertid akkumulerende beviser for, at BMPs og TGFβs/Activins også aktiverer R-SMAD'er for den respektive anden underfamilie i en proces, der betegnes som »lateral signalering«3,4,5,6,7,8, og at der er blandede SMAD-komplekser bestående af både SMAD1/5 og SMAD2/3, medlemmer3,9 . To aktiverede R-SMAD'er danner efterfølgende trimeriske komplekser med den fælles mægler SMAD4. Disse transskription faktor komplekser er derefter i stand til at translokere ind i kernen og regulere transskription af mål gener. SMAD'er kan interagere med en række forskellige transskriptionskoaktiveringatorer og co-repressorer, hvilket fører til diversificering af mulighederne for at regulere målgener10. Deregulering af SMAD-signalering har alvorlige konsekvenser for en række sygdomme. I overensstemmelse med dette, ubalanceret TGFβ/BMP signalering kan føre til alvorlige vaskulære patologier, såsom lungepulsåren hypertension, arvelig hæmoragisk telangiectasia, eller åreforkalkning3,11,12,13,14.
Endotelceller (ECs) danner det inderste lag af blodkar og udsættes derfor for forskydningsstress (SS), en friktionskraft udøvet af blodets tyktflydende strøm. Interessant nok holdes ECs, der er bosiddende på de dele af vaskulaturen, som udsættes for høje niveauer af ensartet, laminar SS, i en homøostatisk og quiescent tilstand. I modsætning hertil er ECs, der oplever lav, ikke-ensartet SS, f.eks. ved bifurcations eller den mindre krumning af aortabuen, proliferative og aktiverer inflammatoriske veje15. Til gengæld er steder med dysfunktionelle ECs tilbøjelige til at udvikle åreforkalkning. Interessant nok viser ECs i disse atheroprone områder afvigende høje niveauer af aktiveret SMAD2/3 og SMAD1/516,17,18. I denne sammenhæng viste det sig, at forbedret TGFβ/BMP-signalering var en tidlig hændelse i udviklingen af aterosklerotiske læsioner19, og interferens med BMP-signalering viste sig at reducere vaskulær betændelse, ateromadannelse og tilhørende forkalkning20.
Proximity Ligation Assay (PLA) er en biokemisk teknik til at studere protein-protein interaktioner in situ21,22. Det er afhængig af specificiteten af antistoffer af forskellige arter, der kan binde målproteiner af interesse, hvilket giver mulighed for meget specifik påvisning af endogene proteininteraktioner på et enkeltcellet niveau. Her skal primære antistoffer binde sig til deres mål epitope i en afstand af mindre end 40 nm for at give mulighed for detektion23. Derfor er PLA i høj grad gavnlig i forhold til traditionelle co-immunprecipitation tilgange, hvor flere millioner celler er nødvendige for at opdage endogene protein interaktioner. I PLA binder artsspecifikke sekundære antistoffer, der er kovalent forbundet med DNA-fragmenter (såkaldte Plus- og Minus-sonder), de primære antistoffer, og hvis interesseproteinerne interagerer, kommer Plus- og Minus-sonder tæt på. DNA'et bliver ligated i det følgende trin, og den rullende cirkelforstærkning af det cirkulære DNA er muliggjort. Under forstærkning binder fluorescerende mærkede komplementære oligoukleotider sig til det syntetiserede DNA, hvilket gør det muligt at visualisere disse proteininteraktioner ved konventionel fluorescensmikroskopi.
Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt for forskere kvantitativt at sammenligne antallet af aktive SMAD transskriptionskomplekser ved atheroprotive og atheroprone SS-tilstande in vitro ved hjælp af PLA. SS genereres via et programmerbart pneumatisk pumpesystem, der er i stand til at generere laminar ensrettet strøm af definerede niveauer og tillader trinvise stigninger i flowhastigheder. Denne metode gør det muligt at påektionere interaktioner mellem SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4 samt blandede R-SMAD-komplekser. Det kan nemt udvides til at analysere interaktioner af SMADs med transskriptionelle medregulatorer eller til transskriptionsfaktorkomplekser bortset fra SMAD'er. Figur 1 viser de vigtigste trin i protokollen nedenfor.
Figur 1: Skematisk repræsentation af den beskrevne protokol. (A) Celler, der er sået i 6-kanals dias, udsættes for forskydningsstress med et pneumatisk pumpesystem. (B) Faste celler anvendes til PLA-eksperiment eller til kontrolbetingelser. (C) Billeder af PLA eksperimenter er erhvervet med en fluorescens mikroskop og analyseres ved hjælp af ImageJ analyse software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og væskeforskydningsstresseksponering
BEMÆRK: Human navlestrengeEEEE(HUVECs) blev brugt som eksempel til at studere SS induceret interaktion mellem SMAD'er. Den protokol, der er beskrevet nedenfor, kan anvendes på alle SS-responsive celletyper.
- Coat 6-kanals dias med 0,1% porcine hudgelatine i PBS i 30 min ved 37 °C.
- Frø HUVECs i præ-coatede 6-kanals dias ved en densitet på 2,5 x 106 celler pr. ML i 30 μL af M199 fuld medium.
BEMÆRK: Yderligere oplysninger om, hvordan du sår celler i flowdiaset, finder du i reference24. - Lad cellerne klæbe i 1 time ved 37 °C i en befugtet inkubator.
- Der tilsættes 60 μL forvarmet M199 fuldt medium til hvert af reservoirerne.
- Kultur i 2 dage, med en blid medium udveksling en gang om dagen, ved 37 °C i en befugtet inkubator.
- Aspirere reservoirerne helt, tilsæt 120 μL forvarmet M199 fuld medium i et af reservoirerne og aspirere fra den anden side.
- Der tilsættes 60 μL forvarmet M199 fuldt medium til begge reservoirer.
- Saml og start flowopsætningen som beskrevet i reference25.
- Monter slanger på flydende enheder. Her bruges silikonerør med en diameter på 0,8 mm og 1,6 mm til at påføre forskydningsstress på henholdsvis 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2.
BEMÆRK: Materialet og slangelængden skal forblive konstant, da ændringer kan påvirke den resulterende forskydningsstress. Generelt kan andre kombinationer af pumpesystemer og slanger anvendes, så længe den resulterende forskydningsstress er kendt, og pumpen skaber en stabil laminarstrøm. - Fyld reservoirerne med en passende mængde forvarmet M199 fuldt medium (minimum 10 mL).
- Tilslut fluidiske enheder med slangen til pumpesystemet og udfør en pre-run uden celler til at ekvilibrere mediet og fjerne eventuelle resterende air25.
- Tilslut de enkelte kanaler på 6-kanals diaset til hinanden ved hjælp af slange til seriel forbindelse. Den første og den sidste kanal på diaset vil blive tilsluttet slangen samlet i 1.6.1 (se figur 1A for en ordning). Pas på ikke at indføre luft i systemet, da dette kan skade cellerne alvorligt. Yderligere oplysninger om den serielle forbindelse kan findes i reference26.
- For eksponering af celler til høje niveauer af forskydningsstress (>20 dyn/cm2) skal du bruge en rampefase, dvs. øge forskydningsstressen trinvist med tilpasningsfaser. Trin kan indstilles i trin på 5 dyn/cm2 pr. 30 min.
- Monter slanger på flydende enheder. Her bruges silikonerør med en diameter på 0,8 mm og 1,6 mm til at påføre forskydningsstress på henholdsvis 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2.
2. Fiksering
- Tag glidende fra pumperne efter væsken SS eksponering. Brug klemmer på slangen ved afmontering, for at undgå mediumudslippet i inkubatoren.
- Straks overførsel flow dias på is, mens de resterende slanger er løsrevet sekventielt. Når slangen fjernes fra reservoirer, skal beholderen på den anden side holdes lukket med en finger for at undgå at fange luftbobler i kanalen. Dette kan forstyrre fikseringstrin.
- Hold cellerne på is, aspirer mediet omhyggeligt fra reservoirerne, men ikke fra den kanal, hvor cellerne ligger. Derefter vaskes prøver med kold steril PBS (4 °C) med tre gange kanalvolumen (90 μL). Tilsæt PBS i det ene reservoir og aspirer forsigtigt fra det andet reservoir. Gentag dette trin i hver af de 6 kanaler pr. dias.
BEMÆRK: For alle vaske- og inkubationstrin tilsættes den respektive opløsning i et af reservoirerne, hvilket fører til udveksling af løsninger i kanalen. For at muliggøre fuldstændig udskiftning af opløsninger i kanalen, suges den overskydende opløsning derefter fra det andet reservoir. Opløsningen på toppen af cellerne i kanalen fjernes ikke. Celler må ikke tørre på noget tidspunkt. Derfor er det vigtigt at vaske forsigtigt uden luftboble indsættelse i dias. - Fastgør cellerne ved at tilsætte 90 μL buffered 4% PFA-opløsning i samme reservoir, hvor PBS blev tilsat på forhånd og ligeledes aspirere væsken fra det andet reservoir. Gentag dette trin i hver kanal i hvert dias. Efter tilsætning af PFA-opløsning overføres prøverne fra is til stuetemperatur (RT) og inkuberes i 20 min.
FORSIGTIG: PFA er giftig og skal håndteres omhyggeligt. Brug handsker og arbejde under en røghætte. - Vask cellerne 3x med PBS (RT) ved at tilføje det i et reservoir og aspirere forsigtigt fra det andet reservoir. Tøm bare reservoirerne, så du ikke tørrer kanalen ud. Gentag dette trin for hver af de 6 kanaler pr. dias.
- Sluk for PFA-fikseringen ved at tilsætte 90 μL omgivende 50 mM ammoniumchlorid i PBS i et af reservoirerne. Aspirere overskydende opløsning fra det andet reservoir. Gentag for hver kanal i diaset. Inkuber prøverne i 10 min på RT.
- Vask som beskrevet i trin 2.5.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøverne opbevares ved 4 °C natten over, eller protokollen kan straks fortsættes med blokering og primær antistofinkubation (se trin 3).
3. Blokering og primær antistofinkubation
- For at gennemtrænge cellerne tilsættes 90 μL på 0,3% Triton-X-100 i PBS i et tømt reservoir og aspireres fra det andet reservoir for hver kanal. Inkuber i 10 minutter på RT.
- Vask som beskrevet i trin 2.5.
- Der tilsættes 90 μL steril PLA-blokeringsopløsning i det ene reservoir på en kanal, og aspirerer fra den anden side. Gentag dette trin for hver kanal. Blok i 1 time ved 37 °C i et befugtet kammer.
- For at lave et befugtet kammer skal du bruge en 10 cm skål med vådt væv forseglet med voksfilm og placere skålen i inkubatoren. Alternativt kan andre fugtighedskammerformater bruges, der giver en fugtig atmosfære.
BEMÆRK: Alternativt kan der anvendes selvfremdigtet blokeringsopløsning (f.eks. 3 % (w/v) BSA i PBS, sterilt filtreret).
- For at lave et befugtet kammer skal du bruge en 10 cm skål med vådt væv forseglet med voksfilm og placere skålen i inkubatoren. Alternativt kan andre fugtighedskammerformater bruges, der giver en fugtig atmosfære.
- Primære antistoffer (1:100) til tilberedes i PLA antistofluent. Opløsningen skal forberedes 30 μL pr. kanal. Tilsæt både primære antistoffer samtidigt og vortex.
BEMÆRK: Alternativt kan der anvendes selvfremfremdende antistof fortyndingsstof (f.eks. 1 % (w/v) BSA i PBS). Antistoffer, der anvendes her, er kombinationer af SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 og fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Detaljerede oplysninger kan findes i materialetabellen. - Før påføring af primære antistoffer, aspirere blokeringsopløsningen fra reservoirerne og også forsigtigt fra kanalen. Pipette 30 μL af den primære antistofopløsning straks ind i den tomme kanal ved at vippe kanalen, mens opløsningen tilføjes.
BEMÆRK: Udfør fjernelsen af blokeringsopløsningen og tilsætning af antistofopløsningen kanal for kanal for at sikre, at cellerne ikke tørrer ud imellem. - Inkuberes prøver med de primære antistoffer natten over i befugtede kamre ved 4 °C.
BEMÆRK: Inkubationen kan også udføres i 1 time ved stuetemperatur, hvis du er interesseret i at fortsætte med følgende trin på samme dag.
4. PLA sonde inkubation
BEMÆRK: For alle trin i punkt 4.1-7.3 opbevares vaskebufferen A og B ved 4 °C og skal opvarmes til RT inden brug.
- Fortynd PLA-sonder (+)-mus og (-)-kanin til 1:5 i PLA antistof fortyndingsstof (eller 1% BSA) opløsning. Klargør 30 μL pr. kanal.
- Vaskeprøverne 2x i 5 min med 90 μL af vaskebufferen A ved RT ved at tilsætte dem i et af reservoirerne og trække forsigtigt ind fra det andet reservoir. Gentag dette trin for hver af de 6 kanaler pr. dias.
- Suge vaskebufferen A forsigtigt og tilsættes 30 μL PLA-sondeopløsning (fremstillet i trin 4.1) svarende til tilsætning af primære antistoffer i trin 3.5.
- Inkuberes prøver i 1 time ved 37 °C i et befugtet kammer.
5. Ligation
- Vaskeprøver 2x i 5 min med 90 μL af vaskebufferen A ved RT, som beskrevet i 4.2.
- Forbered en 1:5 fortynding af ligationsbufferen i deioniseret vand. Brug denne buffer til at fortynde ligaseenzymet til 1:40 (på is). Brug 30 μL pr. kanal.
- Suge vaskebufferen A helt og tilsæt ligationsopløsningen som beskrevet i 3.5.
- Inkuberes prøver i 30 min ved 37 °C i et befugtet kammer.
6. Forstærkning
- Vaskeprøver 2x i 2 min med 90 μL vaskebuffer A ved RT, som beskrevet i 4.2.
- Forstærkningsbufferen forberedes ved at fortynde den 1:5 i deioniseret vand og bruge den til at fortynde polymeraseenzymet til 1:80 (på is). Beskyt mod lys. Klargør 30 μL pr. kanal.
- Suge vaskebufferen A helt og straks tilføje den forberedte forstærkningsopløsning i den tomme kanal, som beskrevet i 3.5. Inkuberes prøver i 100 min ved 37 °C i et befugtet kammer.
7. Montering
- Vaskeprøver 2x i 10 min med 90 μL vaskebuffer B ved RT som beskrevet i 4.2. Tilsæt DAPI (1:500) fra 1 mg/mL lageropløsning (i deioniseret vand) i den første vask for at plette kerner. Tør ikke kanalen.
- Vaskebuffer B fortyndes i deioniseret vand (1:10) og 1x vaskes med 90 μL 0,1x buffer B-opløsning som beskrevet i punkt 4.2.
- Aspirer vaskebufferen B helt og tilsæt straks 2-3 dråber af det flydende monteringsmedium i et reservoir. Fordel det i kanalen ved at vippe diaset. Opbevar prøver ved 4 °C i et befugtet miljø indtil billeddannelse.
8. Billedopkøb
- Få billeder ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Sørg for, at de respektive filtre, der monterer de fluorescerende PLA-sonder, er tilgængelige.
BEMÆRK: Det er gavnligt at gøre brug af et konfokalt mikroskop, hvis det er muligt, da opnåede PLA-pletter er mere definerede. Dette understøtter også yderligere billedbehandling og dataanalyse.
9. Billedanalyse og kvantificering ved hjælp af ImageJ/FIJI
- Behandl eksporterede billeder (.tiff) med et billedbehandlingsprogram, f.eks.
BEMÆRK: Alle scripts, der bruges i denne undersøgelse, og som er nødvendige for automatisk optælling af cellulære, nukleare og alle PLA-hændelser (pr. celle), kan findes i et GitHub-lager: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Udfør statistisk analyse ved hjælp af et passende program eller værktøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere brugt PLA til at opdage interaktioner af forskellige SMAD proteiner3 og analyseret forskydningsstress induceret ændringer i SMAD fosforylering28.
Her blev begge metoder kombineret med den protokol, der er beskrevet ovenfor. HUVECs blev udsat for forskydningsstress på 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 og analyseret for interaktioner af SMAD transskriptionsfaktorer. Vi viser, at sammenlignet med den høje forskydningsstress (30 dyn/cm2) fører den lave forskydningsstress (1 dyn/cm2) til en betydelig stigning i SMAD1-SMAD2/3 interaktioner, de såkaldte mixed-SMAD-komplekser i både cytosolen og kernerne af analyserede celler (Figur 2A, lavere panel). PLA-hændelser er synlige som forskellige pletter i begge prøver, og man kan skelne mellem cytosolic og nukleare begivenheder med henvisning til DAPI farvning (Figur 2A, øverste panel). I modsætning hertil viste antistofkontroller, hvor kun et af begge primære antistoffer, men stadig begge PLA-sonder blev inkuberet, ubetydeligt antal PLA-signaler (Figur 2B). Det kan således konkluderes, at eksperimentet var vellykket.
Figur 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA sammenligner forskellige antistofkoncentrationer. (A) Konfokale fluorescensbilleder og kvantificering af SMAD2/3-SMAD1-PLA i HUVECs udsat for 24 timer af de angivne SS-niveauer. Forholdet mellem antistoffer: 1:100. (B) Confocal-billeder af enkeltantistofkontroller for PLA i A. (C) Konfokal fluorescensbilleder og kvantificering af SMAD2/3-SMAD1-PLA i HUVECs, der er eksponeret for 24 timer af de angivne SS-niveauer. Forholdet mellem antistoffer: 1:50. Skalastænger til A-C: 20 μm og 10 μm i zoom ind. Dyne er lig med dyn/cm2. De anvendte antistoffer var kanin anti-SMAD2/3 og mus anti-SMAD1 (se Tabel over materialer). For hver betingelse 5 tilfældige områder langs midten af flowkanalen blev brugt til billedopsamling. N=1 biologisk replikation. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at vise, hvordan forskellige koncentrationer af antistoffer ændrer PLA-resultaterne, blev det samme eksperiment udført med en 1:50 i stedet for en 1:100 fortynding af antistoffer. Under disse forhold resulterer dobbelt så meget antistof i mere end fire gange højere PLA-signaler pr. celle (sammenlign figur 2A og figur 2C). Forskellen i signaler mellem 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 falder, når der anvendes en højere antistofkoncentration, og der går statistisk signifikans tabt for de samlede og cytosolic PLA-hændelser (Figur 2A, lavere panel; Figur 2C, nederste panel). Dette kan skyldes signalet sammenhold og problemer med at skelne PLA begivenheder. Hvis en sådan ophobning af signaler opstår, bør antistofkoncentrationerne reduceres.
Derudover viste vi, at selvfremstillede buffere til blokering og antistoffortynding kan bruges som et alternativ til kommercielle buffere inkluderet i situ PLA-kits. PLA-hændelser pr. celle blev sammenlignet for SMAD1-SMAD2/3 (figur 3A versus figur 3D), SMAD2/3-SMAD4 (figur 3B versus figur 3E) og pSMAD1/5-SMAD4 (figur 3C versus figur 3F) komplekser under 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 ved hjælp af enten kommercielle løsninger (figur 3A-C) eller selvfremstillede BSA/PBS-baserede løsninger (figur 3D-F ). Kvantificeringer for både kommercielle og selvfremstillede fortyndings- og blokeringsløsninger viser den samme tendens i PLA-signaler i cytosolic og nukleare områder. Det samlede antal PLA-hændelser pr. celle er dog højere, når der bruger kommercielle løsninger (figur 3A-C, lavere paneler versus figur 3D-F, lavere paneler).
Figur 3: PLA-eksperiment, der sammenligner kommercielle og selvfremstillede antistofbuffere. Confocal billeder (øverste del af hvert panel) og kvantificering (nederste del af hvert panel) af forskellige SMAD-SMAD PLAs i HUVECs udsat for 24 timers angivet forskydning stressniveauer. (A-C) Kommercielle buffere (se Materialetabel). (D-F) Selvfremstillede buffere (3 % BSA i PBS til blokering, 1 % BSA i PBS for antistoffortynding). Alle primære antistoffer blev fortyndet 1:100. Vægtstang, 20 μM (10 μM for zoom ind). Statistisk signifikans blev beregnet med tosidet t-test. ns - ikke-signifikant, * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001. Værdier er afbildet som middelværdi + SEM. Dyne er lig dyn/cm2. De anvendte antistoffer var kanin anti-SMAD2/3, musefjendtmad1, kanin antiphospho SMAD1/5 og musefjendtmad4 (se Materialetabel). For hver betingelse 5 tilfældige områder langs midten af flowkanalen blev brugt til billedopsamling. N=1 biologisk replikation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vi har også medtaget et eksempel på en mislykket PLA eksperiment. Her blev der anvendt en kombination af SMAD2/3-SMAD4 antistoffer, hvor SMAD4-antistoffet ikke var egnet til at udføre immunfluorescenceforsøg. Sammenlignet med enkelt antistofkontroller blev der ikke observeret nogen stigning i pletter i hverken 1 dyn/cm2- eller 30 dyn/cm2-prøverne (figur 4A versus figur 4B). Da dannelsen af SMAD2/3-SMAD4-komplekser er forårsaget af forskydningsstress (se figur 3B,E), kan det konkluderes, at dette PLA-eksperiment ikke lykkedes. Dette understreger vigtigheden af at vælge de korrekte antistofkombinationer til at opdage PLA-hændelser, da orientering og afstand af bundne antistoffer kan være afgørende for en vellykket udglødning af oligonuleotidsonderne.
Figur 4: Eksempel for mislykkede PLA eksperiment. Konfokale billeder, skalabjælke: 20 μm og 10 μm i zoom ind. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. B) Kontrol med et enkelt antistof. De anvendte antistoffer var museanti-SMAD2/3 og kanin anti-SMAD4 (se Materialetabel). Dyne er lig med dyn/cm2. For hver betingelse 5 tilfældige områder langs midten af flowkanalen blev brugt til billedopsamling. N=1 biologisk replikation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den PLA-baserede protokol, der er beskrevet her, tilbyder en effektiv måde at bestemme nærheden af to proteiner (f.eks. deres direkte interaktion) i ECs udsat for forskydningsstress med kvantitativ og rumlig opløsning. Ved at bruge flow slides med flere parallelle kanaler, flere forskellige protein interaktioner kan undersøges på samme tid i celler under identiske mekaniske forhold. I modsætning hertil gør specialbyggede flowkammersystemer ofte brug af en enkelt kanal, der er bygget op omkring en glasdækslede, hvilket kun ville tillade et enkelt PLA-eksperiment uden de nødvendige kontroller pr. dias og pumpe. Selvom denne protokol fokuserer på påvisning af SMAD-interaktioner, kan den tilpasses til at opdage andre proteininteraktioner. Men analyse af resultater skal gøres omhyggeligt, da to proteiner også kan opholde sig i nærheden uden at danne komplekser. Hvis der ønskes bestemte udsagn om interaktioner mellem proteiner, bør PLA-eksperimenter suppleres med yderligere metoder såsom co-immunpræcitationer. Derudover kan PLA ikke bruges til at detektere samspillet mellem protein og protein i levende celler, da prøver skal fastsættes til efterfølgende antistofbindings- og DNA-forstærkningstrin.
For at pla kan påvise proteininteraktioner på et vellykket påvisning af proteininteraktioner, er det mest kritiske skridt at vælge en kombination af primære antistoffer, der opfylder flere kriterier: (1) Antistofferne, der påektionerer de enkelte proteinpartnere, skal genereres hos forskellige arter (f.eks. mus eller kanin), da de sekundære antistoffer er artsspecifikke; ideelt set blev antistoffer allerede med succes testet ved konventionel immunfluorescencemikroskopi; 2) afstanden mellem epitopbundne antistoffer skal være <40 nm23 (3) da affiniteterne for antistof-epitopbinding kan variere, skal den endelige koncentration af anvendte antistoffer justeres for hver forsøgsindstilling, som vist her (Figur 2A, lavere panel versus figur 2C, lavere panel). Derfor, hvis meget få, men specifikke PLA-hændelser opdages, kan det være værd at øge mængden af antistof, der anvendes. Dette skal dog omhyggeligt titreres for at undgå overmætning og uspecifikke bindende hændelser. Antistofkoncentrationen, der anvendes i kontrolprøverne, skal også svare til den koncentration, der anvendes i PLA-prøverne.
Hvad angår enhver anden biokemisk analyse, er passende kontroller uundværlige i PLA. Uspecifik binding af de anvendte antistoffer kan f.eks. føre til PLA-signaler, der kun stammer fra ét primært antistof. Derfor bør væsentlige antistofkontroller for PLA-eksperimenter kun omfatte tilsætning af et af de to primære antistoffer, men begge PLA Probes (Plus og Minus). Desuden kan kontrolforanstaltninger uden tilsat antistoffer anvendes til at bestemme uspecifik binding af PLA-sonderne til prøven. Generelt bør disse tekniske kontroller ikke give et nej til meget få PLA-signaler. Hvis der observeres flere signaler, bør koncentrationen af det anvendte primære antistof, og dets specificitet genovervejes. Derudover er det nyttigt at inkludere en positiv biologisk kontrol, hvis det er muligt. I den ovenfor beskrevne protokol kan dette være stimulering med en BMP ligand, der er kendt for at fremkalde fosforylering af SMAD'er og derfor trimerisk kompleks dannelse med SMAD4.
Til PLA-eksperimenter anbefales det normalt at bruge celler, der er 50-70% sammenløb, da dette forenkler indtrængning af reagenser. Men når vi udfører eksperimenter med ECs, vil vi strengt argumentere imod dette, undtagen hvis semi-sammenløb er en del af den eksperimentelle set-up. In vivo ECs danner monolag med stramme celle-til-celle vejkryds, som er afgørende for EF homøostase og mechano-transduktion29. Derfor kan forsøg med ikke-sammenflydende ECs give anledning til falske resultater. Desuden er ikke-sammenflydende celler mere tilbøjelige til at løsne sig fra flowkanalslids, hvis der anvendes høje niveauer af forskydningsstress under eksperimentet. Vi anbefaler at så celler (2-2,5 x 106 celler / mL, se protokol trin 1.2) to til tre dage før eksperimentel start som EF monolayers har brug for tid til at danne og udvikle modne vejkryds. Derfor vil vi ikke anbefale såning af et højere antal celler (>2,5 x 106 celler / mL) i flowkanaler blot en dag før eksperimentet for at opnå en sammenflydende monolag.
Selvom forskellige flydende monteringsmedier, der indeholder DAPI, findes, er det værd at inkludere et separat DAPI-farvningstrin og montere cellerne med flydende monteringsmedium uden DAPI, i det mindste hvis polymerbaserede flow slides anvendes. Dette forhindrer tunge baggrundssignaler under billedopsamling. Billeder bør erhverves fra positioner i kanalcentret snarere end kanterne, da forskydningsstress er inhomogeneous på kanalvæggene. Vi anbefaler at tage mindst 5-10 billeder pr. biologisk replikation og tilstand af tilfældige områder langs centerregionen. 3 eller flere biologiske kopier anvendes normalt til at opnå statistisk relevans. Til billedanalyse anbefaler vi at bruge Macrofunktionen ImageJ/FIJI. I protokollen ovenfor nævnte vi en ImageJ makro, der er egnet til at tælle cytosolic og nukleare PLA begivenheder baseret på DAPI farvning. Brugerne skal være opmærksomme på, at parametre som partikelstørrelse skal justeres afhængigt af nuklear størrelse eller større/mindre PLA-prikker. Makroen gemmer tærsklen PLA billeder og masker, der skal sammenlignes med rå billeder til at evaluere specificiteten af PLA signal afsløring.
Afslutningsvis giver den metode, der præsenteres her, mulighed for hurtig og effektiv rumlig og kvantitativ analyse af transskriptionsfaktorkompleks dannelse ved atheroprotive og atheroprone SS-forhold. Det vil gøre det muligt for forskere at yderligere dechifrere virkningen af SMAD kompleks dannelse i aterogenese og vaskulær sygdom i almindelighed. Det kan desuden tilpasses til at undersøge konsekvenserne af nærhed af forskellige proteiner i disse vaskulære patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Maria Reichenbach og Dr. Christian Hiepen for deres støtte på flow-oprettet system og Eleanor Fox og Yunyun Xiao for kritisk at læse manuskriptet. P-L.M. blev finansieret af den internationale Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK modtog støtte fra DFG-SFB1444. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
| Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
| Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
| Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
| Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
| FIJI | Image Analysis software | ||
| Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
| HUVECs | |||
| ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
| ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
| Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
| mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
| mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
| mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
| Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
| Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
| Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
| rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
| Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
References
- Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
- Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
- Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
- Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
- Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
- Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
- Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).
- Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
- Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P.
- Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
- MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
- Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
- Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
- van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
- Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Alam, M. S.
- Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012).
- Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019).
- ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
- Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).
