Summary
Her etablerer vi en protokoll for samtidig å visualisere og analysere flere SMAD-komplekser ved hjelp av nærhetsligasjonsanalyse (PLA) i endotelceller utsatt for patologiske og fysiologiske væskeskjærstressforhold.
Abstract
Transformerende vekstfaktor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering er tett regulert og balansert under utvikling og homeostase av vaskulatursystemet Derfor resulterer deregulering i denne signalveien i alvorlige vaskulære patologier, som lungearterie hypertensjon, arvelig hemorragisk telangiectasia og aterosklerose. Endotelceller (ECs), som det innerste laget av blodkar, blir stadig utsatt for væskeskjærspenning (SS). Unormale mønstre av flytende SS har vist seg å forbedre TGFβ / BMP-signalering, som sammen med andre stimuli induserer aterogenese. I forhold til dette ble det funnet ateropron, lav laminær SS for å forbedre TGFβ / BMP-signalering mens ateroprotektive, høy laminære SS, reduserer denne signalingen. For effektivt å analysere aktiveringen av disse veiene, designet vi en arbeidsflyt for å undersøke dannelsen av transkripsjonsfaktorkomplekser under lav laminær SS og høye laminære SS-forhold ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig pneumatisk pumpesystem og nærhetsligasjonsanalyse (PLA).
Aktiv TGFβ/BMP-signalering krever dannelse av trimeriske SMAD-komplekser som består av to regulatoriske SMADer (R-SMAD); SMAD2/3 og SMAD1/5/8 for TGFβ- og BMP-signalering) med en felles mellommann SMAD (co-SMAD; SMAD4). Ved hjelp av PLA rettet mot ulike underenheter av det trimeriske SMAD-komplekset, det vil si enten R-SMAD/co-SMAD eller R-SMAD/R-SMAD, kan dannelsen av aktive SMAD-transkripsjonsfaktorkomplekser måles kvantitativt og romlig ved hjelp av fluorescensmikroskopi.
Bruken av strømningslysbilder med 6 små parallelle kanaler, som kan kobles i serie, muliggjør undersøkelse av transkripsjonsfaktorkompleksdannelsen og inkludering av nødvendige kontroller.
Arbeidsflyten som forklares her, kan enkelt tilpasses for studier rettet mot nærhet av SMADer til andre transkripsjonsfaktorer eller til transkripsjonsfaktorkomplekser annet enn SMADs, under forskjellige flytende SS-forhold. Arbeidsflyten som presenteres her viser en rask og effektiv måte å studere den flytende SS-induserte TGFβ / BMP-signalisering i ECs, både kvantitativt og romlig.
Introduction
Proteiner av de transformerende vekstfaktorene beta (TGFβ) superfamilie er pleiotrope cytokiner med en rekke medlemmer, inkludert TGFβs, benmorfogenetiske proteiner (BMPer) og Activins1,2. Ligandbinding induserer dannelsen av reseptor oligomerer som fører til fosforylering og dermed aktivering av cytosolisk regulatorisk SMAD (R-SMAD). Avhengig av underfamilien av ligander, aktiveres forskjellige R-SMADer1,2. Mens TGFβs og Activins hovedsakelig induserer fosforylering av SMAD2/3, induserer BMPer SMAD1/5/8 fosforylering. Imidlertid er det akkumulerende bevis for at BMPer og TGFβs / Activins også aktiverer R-SMADs av de respektive andre underfamiliene, i en prosess som betegnes som 'lateral signalering'3,4,5,6,7,8 og at det er blandede SMAD-komplekser som består av begge deler, SMAD1/5 og SMAD2/3, medlemmer3,9 . To aktiverte R-SMADer danner deretter trimeriske komplekser med den vanlige megleren SMAD4. Disse transkripsjonsfaktorkompleksene er da i stand til å omfordele seg til kjernen og regulere transkripsjonen av målgener. SMAD-er kan samhandle med en rekke forskjellige transkripsjonelle medaktivatorer og medundertrykkere, noe som fører til diversifisering av mulighetene for å regulere målgener10. Deregulering av SMAD-signalering har alvorlige implikasjoner ved en rekke sykdommer. I tråd med dette kan ubalansert TGFβ/BMP-signalering føre til alvorlige vaskulære patologier, som pulmonal arterie hypertensjon, arvelig hemorragisk telangiectasia, eller aterosklerose3,11,12,13,14.
Endotelceller (ECs) danner det innerste laget av blodkar og er derfor utsatt for skjærspenning (SS), en friksjonskraft som utøves av blodets viskøse strøm. Interessant nok holdes ECer som bor i de delene av vaskulaturen, som er utsatt for høye nivåer av uniform, laminær SS, i en homeostatisk og passiv tilstand. Derimot er ECer som opplever lav, ikke-ensartet SS, for eksempel ved bifurkasjoner eller den mindre krumningen i aortabuen, proliferative og aktiverer inflammatoriske veier15. I sin tur er steder med dysfunksjonelle ECer tilbøyelige til å utvikle aterosklerose. Interessant nok viser ECer i disse ateropronområdene avvikende høye nivåer av aktivert SMAD2/3 og SMAD1/516,17,18. I denne sammenhengen ble forbedret TGFβ/BMP-signalering funnet å være en tidlig hendelse i utviklingen av aterosklerotiske lesjoner19, og forstyrrelser med BMP-signalering ble funnet å redusere vaskulær betennelse, ateromadannelse og tilhørende forkalkning20.
Proximity Ligation Assay (PLA) er en biokjemisk teknikk for å studere proteinproteininteraksjoner i situ21,22. Det er avhengig av spesifisiteten av antistoffer av forskjellige arter som kan binde målproteiner av interesse, noe som tillater svært spesifikk påvisning av endogene proteininteraksjoner på et enkeltcellet nivå. Her må primære antistoffer binde seg til målepilotopen i en avstand på mindre enn 40 nm for å tillate deteksjon23. Derfor er PLA svært gunstig i forhold til tradisjonelle co-immunoprecipitation tilnærminger, hvor flere millioner celler er nødvendig for å oppdage endogene proteininteraksjoner. I PLA binder artsspesifikke sekundære antistoffer, kovalent knyttet til DNA-fragmenter (kalt Plus- og Minus-sonder), de primære antistoffene, og hvis proteinene av interesse samhandler, kommer Plus- og Minus-sonder i nærheten. DNA-et blir ligatert i følgende trinn, og den rullende sirkelforsterkningen av det sirkulære DNA-et er muliggjort. Under forsterkning binder fluorescerende merket komplementære oligonukleotider seg til det syntetiserte DNA-et, slik at disse proteininteraksjonene kan visualiseres ved konvensjonell fluorescensmikroskopi.
Protokollen beskrevet her gjør det mulig for forskere å kvantitativt sammenligne antall aktive SMAD-transkripsjonskomplekser ved ateroprotektive og atheroprone SS-forhold in vitro ved hjelp av PLA. SS genereres via et programmerbart pneumatisk pumpesystem som er i stand til å generere laminær enveisstrøm av definerte nivåer og tillater trinnvise økninger av strømningshastigheter. Denne metoden gjør det mulig å oppdage interaksjoner mellom SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4, samt blandede R-SMAD-komplekser. Det kan enkelt utvides for å analysere interaksjoner mellom SMADer med transkripsjonelle medregulatorer eller til andre transkripsjonsfaktorkomplekser enn SMADer. Figur 1 viser hovedtrinnene i protokollen som presenteres nedenfor.
Figur 1: Skjematisk representasjon av protokollen som er beskrevet. (A) Celler frøet i 6-kanals lysbilder er utsatt for skjærspenning med et pneumatisk pumpesystem. (B) Faste celler brukes til PLA-eksperiment eller for kontrollforhold. (C) Bilder av PLA-eksperimenter er anskaffet med et fluorescensmikroskop og analyseres ved hjelp av ImageJ analyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og væskeskjær stresseksponering
MERK: Humane navlestrenger (HUVECs) ble brukt som et eksempel for å studere SS indusert interaksjon av SMADs. Protokollen beskrevet nedenfor kan brukes på alle SS responsive celletyper.
- Frakk 6-kanals lysbilde med 0,1% porcin hud gelatin i PBS i 30 min ved 37 °C.
- Frø HUVECer i forhåndsbelagte 6-kanals lysbilder med en tetthet på 2,5 x 106 celler per ml i 30 μL M199 fullt medium.
MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om hvordan du sår celler i strømningsskuffen, kan du se referanse24. - La cellene holde seg i 1 time ved 37 °C i en fuktet inkubator.
- Tilsett 60 μL forvarmet M199 fullt medium til hvert reservoar.
- Kultur i 2 dager, med en mild middels utveksling en gang om dagen, ved 37 °C i en fuktet inkubator.
- Aspirer reservoarene helt, tilsett 120 μL forvarmet M199 fullt medium i et av reservoarene, og aspirer fra den andre siden.
- Tilsett 60 μL forvarmet M199 fullt medium til begge reservoarene.
- Monter og start flytoppsettet som beskrevet i referansen25.
- Monter slangen på fluidiske enheter. Her brukes silikonrør med en diameter på henholdsvis 0,8 mm og 1,6 mm til å påføre skjærspenning på henholdsvis 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2.
MERK: Materialet og slangelengden skal forbli konstant, da endringer kan påvirke det resulterende skjærspenningen. Generelt kan andre kombinasjoner av pumpesystemer og rør brukes, så lenge det resulterende skjærspenningen er kjent, og pumpen skaper en jevn laminær strømning. - Fyll reservoarene med en passende mengde forvarmet M199 fullt medium (minimum 10 ml).
- Koble fluidiske enheter med slangen til pumpesystemet og utfør en forløp uten celler for å likevekte mediet og for å fjerne eventuell gjenværende luft25.
- Koble enkeltkanalene på 6-kanals skyvesklien til hverandre serielt ved hjelp av seriell tilkoblingsrør. Den første og siste kanalen på lysbildet kobles til slangen som er montert i 1.6.1 (se figur 1A for en ordning). Vær forsiktig så du ikke introduserer luft i systemet, da dette kan skade cellene alvorlig. Du finner mer informasjon om den serielle tilkoblingen i referanse26.
- For eksponering av celler for høye nivåer av skjærspenning (>20 dyn/cm2), bruk en rampefase, det vil si øke skjærspenningen trinnvis med tilpasningsfaser. Trinn kan stilles inn i trinn på 5 dyn/cm2 per 30 min.
- Monter slangen på fluidiske enheter. Her brukes silikonrør med en diameter på henholdsvis 0,8 mm og 1,6 mm til å påføre skjærspenning på henholdsvis 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2.
2. Fiksering
- Løsne lysbilder fra pumpene etter væske SS-eksponeringen. Bruk klemmer på slangen når du løsner, for å unngå middels søl i inkubatoren.
- Overfør straks strømningsskred på is, mens de resterende slangene løsnes sekvensielt. Når du fjerner slangen fra reservoarene, bør reservoaret på den andre siden holdes lukket med en finger for å unngå å fange luftbobler i kanalen. Dette kan forstyrre fikseringstrinnene.
- Hold cellene på is, aspirer mediet forsiktig fra reservoarene, men ikke fra kanalen der cellene ligger. Vask deretter prøver med kaldsteril PBS (4 °C) med tre ganger kanalvolumet (90 μL). Tilsett PBS i ett reservoar og aspirer forsiktig fra det andre reservoaret. Gjenta dette trinnet i hver av de 6 kanalene per lysbilde.
MERK: For alle vaske- og inkubasjonstrinn legges den respektive løsningen i et av reservoarene som fører til utveksling av løsninger i kanalen. For å muliggjøre fullstendig utskifting av løsninger i kanalen, aspireres den overskytende løsningen fra det andre reservoaret. Løsning på toppen av cellene i kanalen fjernes ikke. Celler bør ikke tørke når som helst. Derfor er det viktig å vaske forsiktig uten innsetting av luftbobler i lysbildene. - Fest cellene ved å tilsette 90 μL bufret 4% PFA-løsning i samme reservoar der PBS ble tilsatt på forhånd og tilsvarende aspirere væsken fra det andre reservoaret. Gjenta dette trinnet i hver kanal i hvert lysbilde. Etter tilsetning av PFA-løsning, overfør prøvene fra is til romtemperatur (RT) og inkuber i 20 min.
FORSIKTIG: PFA er giftig og bør håndteres nøye. Bruk hansker og arbeid under en avtrekkshette. - Vask cellene 3x med PBS (RT) ved å legge den i ett reservoar og aspirere forsiktig fra det andre reservoaret. Tøm bare reservoarene, og sørg for ikke å tørke ut kanalen. Gjenta dette trinnet for hver av de 6 kanalene per lysbilde.
- Slukk PFA-fikseringen ved å tilsette 90 μL omgivende 50 mM ammoniumklorid i PBS i et av reservoarene. Aspirer overflødig løsning fra det andre reservoaret. Gjenta dette for hver kanal i lysbildet. Inkuber prøvene i 10 min ved RT.
- Vask som beskrevet i trinn 2.5.
MERK: På dette tidspunktet kan prøvene oppbevares ved 4 °C over natten, eller protokollen kan umiddelbart fortsette med blokkering og primær antistoffinkubasjon (se trinn 3).
3. Blokkering og primær antistoffinkubasjon
- For å permeabilisere cellene, tilsett 90 μL 0,3% Triton-X-100 i PBS i et tømt reservoar, og aspirer fra det andre reservoaret for hver kanal. Inkuber i 10 min på RT.
- Vask som beskrevet i trinn 2.5.
- Tilsett 90 μL steril PLA-blokkeringsløsning i ett reservoar av en kanal og aspirer fra den andre siden. Gjenta dette trinnet for hver kanal. Blokker i 1 time ved 37 °C i et fuktet kammer.
- For å lage et fuktet kammer, bruk en 10 cm tallerken med vått vev forseglet med voksfilm og legg parabolen i inkubatoren. Alternativt kan andre fuktighetskammerformater brukes som gir en fuktig atmosfære.
MERK: Alternativt kan selvfremstillet blokkeringsløsning brukes (f.eks. 3 % (m/v) BSA i PBS, sterilt filtrert).
- For å lage et fuktet kammer, bruk en 10 cm tallerken med vått vev forseglet med voksfilm og legg parabolen i inkubatoren. Alternativt kan andre fuktighetskammerformater brukes som gir en fuktig atmosfære.
- Forbered primære antistoffer (1:100) i PLA antistoff fortynningsmiddel. Forbered 30 μL av løsningen per kanal. Tilsett både primære antistoffer samtidig og virvel.
MERK: Alternativt kan selvfremstillet antistoffdynningsmiddel brukes (f.eks. 1 % (w/v) BSA i PBS). Antistoffer som brukes her er kombinasjoner av SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 og fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Detaljert informasjon finner du i Materiallisten. - Før påføring av primære antistoffer, aspirer blokkeringsløsningen fra reservoarene og også forsiktig fra kanalen. Pipette 30 μL av den primære antistoffløsningen umiddelbart inn i den tomme kanalen ved å vippe kanalen mens du legger til løsningen.
MERK: Utfør fjerning av blokkeringsløsningen og tilsetningen av antistoffløsningen kanal for kanal for å sikre at cellene ikke tørker ut i mellom. - Inkuber prøver med de primære antistoffene over natten i fuktede kamre ved 4 °C.
MERK: Inkubasjonen kan også utføres i 1 time ved romtemperatur, hvis du er interessert i å fortsette med følgende trinn på samme dag.
4. PLA-sonde inkubasjon
MERK: For alle trinn i pkt. 4.1-7.3 lagres vaskebufferne A og B ved 4 °C og må varmes opp til RT før bruk.
- Fortynn PLA-sonder (+)-mus og (-)-kanin til 1:5 i PLA antistoff fortynningsmiddel (eller 1% BSA) oppløsning. Forbered 30 μL per kanal.
- Vask prøvene 2x i 5 minutter ved hjelp av 90 μL av vaskebufferen A ved RT ved å legge den til i et av reservoarene og aspirere forsiktig fra det andre reservoaret. Gjenta dette trinnet for hver av de 6 kanalene per lysbilde.
- Aspirer vaskebufferen A forsiktig og tilsett 30 μL PLA-sondeoppløsning (fremstilt i trinn 4.1), som ligner på tilsetning av primære antistoffer i trinn 3.5.
- Inkuber prøver i 1 time ved 37 °C i et fuktet kammer.
5. Ligasjon
- Vask prøvene 2x i 5 minutter ved hjelp av 90 μL av vaskebufferen A ved RT, som beskrevet i 4.2.
- Forbered en 1:5 fortynning av ligasjonsbufferen i deionisert vann. Bruk denne bufferen til å fortynne ligase enzymet til 1:40 (på is). Bruk 30 μL per kanal.
- Aspirer vaskebufferen A helt og tilsett ligasjonsløsningen som beskrevet i 3.5.
- Inkuber prøver i 30 min ved 37 °C i et fuktet kammer.
6. Forsterkning
- Vask prøvene 2x i 2 minutter ved hjelp av 90 μL vaskebuffer A ved RT, som beskrevet i 4.2.
- Forbered forsterkningsbufferen ved å fortynne den 1:5 i deionisert vann og bruk den til å fortynne polymeraseenzymet til 1:80 (på is). Beskyttes mot lys. Forbered 30 μL per kanal.
- Aspirer vaskebufferen A helt og tilsett straks den forberedte forsterkningsløsningen i den tomme kanalen, som beskrevet i 3.5. Inkuber prøver i 100 min ved 37 °C i et fuktet kammer.
7. Montering
- Vask prøvene 2x i 10 min ved hjelp av 90 μL vaskebuffer B ved RT som beskrevet i 4.2. Tilsett DAPI (1:500) fra 1 mg/ml lageroppløsning (i deionisert vann) i den første vasken for å flekke kjerner. Ikke tørk kanalen.
- Fortynn vaskebufferen B i deionisert vann (1:10) og vask 1x med 90 μL 0,1x buffer B-oppløsning som beskrevet i 4.2.
- Aspirer vaskebufferen B helt og tilsett umiddelbart 2-3 dråper flytende monteringsmedium i ett reservoar. Fordel den i kanalen ved å vippe lysbildet. Oppbevar prøver ved 4 °C i fuktige omgivelser frem til avbildning.
8. Bildeoppkjøp
- Skaff bilder ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Kontroller at de respektive filtrene som monterer de fluorescerende PLA-sondene er tilgjengelige.
MERK: Det er gunstig å benytte seg av et konfokalt mikroskop, om mulig, da oppnådde PLA-flekker er mer definert. Dette støtter også videre bildebehandling og dataanalyse.
9. Bildeanalyse og kvantifisering ved hjelp av ImageJ/FIJI
- Behandle eksporterte bilder (.tiff) med et bildebehandlingsprogram, for eksempel ImageJ27.
MERK: Alle skript som brukes i denne studien, og som er nødvendige for automatisk telling av cellulære, kjernefysiske og alle PLA-hendelser (per celle) finnes i et GitHub-repositorium: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Utfør statistisk analyse ved hjelp av et passende program eller verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere brukt PLA til å oppdage interaksjoner mellom ulike SMAD-proteiner3 og analysert skjærspenning induserte endringer i SMAD fosforylering28.
Her ble begge metodene kombinert med protokollen beskrevet ovenfor. HUVEC ble utsatt for skjærspenning på 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 og analysert for interaksjoner mellom SMAD-transkripsjonsfaktorer. Vi viser at sammenlignet med høy skjærspenning (30 dyn/cm2), fører det lave skjærspenninget (1 dyn/cm2) til en betydelig økning i SMAD1-SMAD2/3 interaksjoner, de såkalte mixed-SMAD-kompleksene i begge, cytosolen og kjernene i analyserte celler (figur 2A, nedre panel). PLA-hendelser er synlige som distinkte flekker i begge prøvene, og man kan skille mellom cytosoliske og kjernefysiske hendelser med referanse til DAPI-farging (figur 2A, øvre panel). Antistoffkontroller, der bare ett av begge de primære antistoffene, men likevel begge PLA-sondene, ble inkubert, viste derimot ubetydelig antall PLA-signaler (figur 2B). Dermed kan det konkluderes med at eksperimentet var vellykket.
Figur 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA som sammenligner ulike antistoffkonsentrasjoner. (A) Konfokale fluorescensbilder og kvantifisering av SMAD2/3-SMAD1-PLA i HUVECer eksponert for 24 timer indikerte SS-nivåer. Antistoffer fortynningsforhold: 1:100. (B) Konfokale bilder av enkle antistoffkontroller for PLA i A. (C) Konfokale fluorescensbilder og kvantifisering av SMAD2/3-SMAD1-PLA i HUVEC eksponert for 24 timer indikerte SS-nivåer. Antistoffer fortynningsforhold: 1:50. Skalastolper for A-C: 20 μm og 10 μm i zoom inn. Dyne er lik dyn/cm2. Antistoffer som ble brukt var kanin anti-SMAD2/3 og mus anti-SMAD1 (se Materialfortegnelser). For hver betingelse ble 5 tilfeldige områder langs midten av strømningskanalen brukt til bildeanskaffelse. N=1 biologisk replikering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å vise hvordan forskjellige konsentrasjoner av antistoffer endrer PLA-resultater, ble det samme eksperimentet utført med en 1:50 i stedet for en 1:100 fortynning av antistoffer. Under disse forholdene resulterer dobbelt så mye antistoff i mer enn fire ganger høyere PLA-signaler per celle (sammenlign figur 2A og figur 2C). Forskjellen i signaler mellom 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 reduseres når en høyere antistoffkonsentrasjon brukes og statistisk signifikans går tapt for de totale og cytosoliske PLA-hendelsene (figur 2A, nedre panel; Figur 2C, nedre panel). Dette kan skyldes signalsamlingen og problemene med å skille PLA-hendelser. Hvis slik opphopning av signaler oppstår, bør antistoffkonsentrasjonene reduseres.
Videre viste vi at selvlagde buffere for blokkering og antistofffortynning kan brukes som et alternativ for kommersielle buffere inkludert i in situ PLA-sett. PLA-hendelser per celle ble sammenlignet for SMAD1-SMAD2/3 (figur 3A versus figur 3D), SMAD2/3-SMAD4 (figur 3B versus figur 3E) og pSMAD1/5-SMAD4 (Figur 3C versus figur 3F) komplekser under 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 ved hjelp av enten kommersielle løsninger (figur 3A-C) eller selvlagde BSA/PBS-baserte løsninger (figur 3D-F ). Kvantifiseringer for både kommersielle og selvlagde fortynnings-/blokkeringsløsninger viser samme trend med PLA-signaler i cytosoliske og kjernefysiske områder. Det totale antallet PLA-hendelser per celle er imidlertid høyere ved bruk av kommersielle løsninger (figur 3A-C, lavere paneler i forhold til figur 3D-F, nedre paneler).
Figur 3: PLA-eksperiment som sammenligner kommersielle og selvlagde antistoffbuffere. Forvekslelige bilder (øvre del av hvert panel) og kvantifisering (nedre del av hvert panel) av forskjellige SMAD-SMAD PLAer i HUVECer utsatt for 24 timer med indikerte skjærstressnivåer. (A-C) Kommersielle buffere (se Materialliste). (D-F) Selvlagde buffere (3 % BSA i PBS for blokkering, 1 % BSA i PBS for antistofffortynning). Alle primære antistoffer ble fortynnet 1:100. Skalalinje, 20 μM (10 μM for zoom inn). Statistisk signifikans ble beregnet med tosidig t-test. ns - ikke signifikant, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Verdiene er avbildet som middelverdi + SEM. Dyne er lik dyn/cm2. Antistoffer som ble brukt var kanin anti-SMAD2/3, mus anti-SMAD1, kanin anti-fosfo SMAD1/5 og mus anti-SMAD4 (se Tabell over materialer). For hver betingelse ble 5 tilfeldige områder langs midten av strømningskanalen brukt til bildeanskaffelse. N=1 biologisk replikering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vi inkluderte også et eksempel for et mislykket PLA-eksperiment. Her ble det brukt en kombinasjon av SMAD2/3-SMAD4 antistoffer der SMAD4-antistoffet ikke var egnet til å utføre immunfluorescenseksperimenter. Sammenlignet med enkle antistoffkontroller ble det ikke observert noen økning i flekker i verken 1 dyn/cm2- eller 30 dyn/cm2-prøvene (figur 4A versus figur 4B). Ettersom dannelsen av SMAD2/3-SMAD4-komplekser induseres av skjærspenning (se figur 3B,E), kan det konkluderes med at dette PLA-eksperimentet ikke lyktes. Dette understreker viktigheten av å velge de riktige antistoffkombinasjonene for å oppdage PLA-hendelser, da orientering og avstand til bundne antistoffer kan være avgjørende for vellykket gløding av oligonukleotidsondene.
Figur 4: Eksempel på mislykket PLA-eksperiment. Konfokale bilder, skalalinje: 20 μm og 10 μm i zoom inn. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Enkle antistoffkontroller. Antistoffer som ble brukt var mus anti-SMAD2/3 og kanin anti-SMAD4 (se materialfortegnende tabell). Dyne er lik dyn/cm2. For hver betingelse ble 5 tilfeldige områder langs midten av strømningskanalen brukt til bildeanskaffelse. N=1 biologisk replikering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den PLA-baserte protokollen som er beskrevet her, gir en effektiv måte å bestemme nærhet til to proteiner (f.eks. deres direkte interaksjon) i ES utsatt for skjærspenning med kvantitativ og romlig oppløsning. Ved å bruke strømningslysbilder med flere parallelle kanaler, kan flere forskjellige proteininteraksjoner undersøkes samtidig i celler under identiske mekaniske forhold. I motsetning benytter spesialbygde strømningskammersystemer ofte en enkelt kanal som er bygget rundt en glassdekslelip, noe som bare vil tillate et enkelt PLA-eksperiment uten de nødvendige kontrollene per lysbilde og pumpe. Selv om denne protokollen fokuserer på påvisning av SMAD-interaksjoner, kan den tilpasses for å oppdage andre proteininteraksjoner. Imidlertid må analyse av resultatene gjøres nøye, da to proteiner også kan ligge i nærheten uten å danne komplekser. Hvis bestemte utsagn om interaksjoner av proteiner ønskes, bør PLA-eksperimenter suppleres med ytterligere metoder som co-immunoprecipitations. I tillegg kan PLA ikke brukes til å oppdage proteinproteininteraksjonen i levende celler siden prøver må fikses for påfølgende antistoffbinding og DNA-forsterkningstrinn.
For vellykket påvisning av proteininteraksjoner av PLA, er det mest kritiske trinnet å velge en kombinasjon av primære antistoffer som oppfyller flere kriterier: (1) Antistoffene som oppdager de enkelte proteinpartnerne, må genereres i forskjellige arter (f.eks. mus eller kanin) da de sekundære antistoffene er artsspesifikke; ideelt sett ble antistoffer allerede vellykket testet av konvensjonell immunfluorescensmikroskopi; (2) avstanden mellom epitopbundne antistoffer skal være <40 nm23; (3) ettersom affinitetene for antistoff-epitopbinding kan variere, må den endelige konsentrasjonen av brukte antistoffer justeres for hver eksperimentelle innstilling, som vist her (figur 2A, nedre panel versus figur 2C, nedre panel). Derfor, hvis svært få, men spesifikke PLA-hendelser oppdages, kan det være verdt å øke mengden antistoff som brukes. Dette må imidlertid titreres nøye for å unngå overmetning og uspesifiserte bindingshendelser. Også antistoffkonsentrasjon som brukes i kontrollprøver må samsvare med konsentrasjonen som brukes i PLA-prøvene.
Når det gjelder andre biokjemiske analyser, er egnede kontroller uunnværlige i PLA. Uspesifisert binding av de brukte antistoffene kan for eksempel føre til PLA-signaler som stammer fra bare ett primært antistoff. Derfor bør essensielle antistoffkontroller for PLA-eksperimenter bare omfatte tilsetning av ett av de to primære antistoffene, men begge PLA-sondene (Plus og Minus). Videre kan kontroller uten antistoffer tilsatt brukes til å bestemme uspesifisert binding av PLA-sondene til prøven. Generelt bør disse tekniske kontrollene gi nei til svært få PLA-signaler. Hvis flere signaler observeres, bør konsentrasjonen av det primære antistoffet som brukes, og dets spesifisitet revurderes. I tillegg er det nyttig å inkludere en positiv biologisk kontroll, om mulig. I protokollen beskrevet ovenfor kan dette være stimulering med en BMP-ligand som er kjent for å indusere fosforylering av SMADs og derfor trimerisk kompleks formasjon med SMAD4.
For PLA-eksperimenter anbefales det normalt å bruke celler som er 50-70% sammenfallende, siden dette forenkler penetrasjon av reagenser. Men når vi utfører eksperimenter med ECs, vil vi strengt argumentere mot dette, bortsett fra hvis halvsamtid er en del av det eksperimentelle oppsettet. In vivo ECer danner monolayers med tette celle-til-celle-koblinger, som er avgjørende for EC homeostase og mechano-transduksjon29. Derfor kan eksperimenter på ikke-sammenfallende ECer gi opphav til falske resultater. Videre er ikke-konfluente celler mer tilbøyelige til å løsne fra strømningskanallysbilder hvis høye nivåer av skjærspenning brukes under eksperimentet. Vi anbefaler frøceller (2-2,5 x 106 celler / ml, se protokolltrinn 1.2) to til tre dager før eksperimentell start da EC monolayers trenger tid til å danne og utvikle modne veikryss. Derfor vil vi ikke anbefale å så et høyere antall celler (>2,5 x 106 celler / ml) i strømningskanaler bare en dag før eksperimentet for å oppnå en konfluent monolayer.
Selv om ulike flytende monteringsmedier som inneholder DAPI eksisterer, er det verdt å inkludere et eget DAPI-fargingstrinn og montere cellene med flytende monteringsmedium uten DAPI, i det minste hvis polymerbaserte strømningsskred brukes. Dette forhindrer tunge bakgrunnssignaler under bildeanskaffelse. Bilder bør anskaffes fra posisjoner i kanalsenteret i stedet for kantene siden skjærspenningen er inhomogen på kanalveggene. Vi anbefaler å ta minst 5-10 bilder per biologiske replikering og tilstand av tilfeldige områder langs midtområdet. 3 eller flere biologiske replikeringer brukes vanligvis til å få statistisk relevans. For bildeanalyse anbefaler vi at du bruker makrofunksjonen ImageJ/FIJI. I protokollen ovenfor nevnte vi en ImageJ-makro som er egnet til å telle cytosoliske og kjernefysiske PLA-hendelser basert på DAPI-farging. Brukere bør være klar over at parametere som partikkelstørrelse må justeres avhengig av kjernefysisk størrelse eller større / mindre PLA-prikker. Makroen lagrer terskel-PLA-bilder og -masker som skal sammenlignes med RAW-bilder for å evaluere spesifisiteten til PLA-signaldeteksjon.
Til slutt tillater metoden som presenteres her rask og effektiv romlig og kvantitativ analyse av transkripsjonsfaktorkompleksdannelse ved ateroprotektive og ateroprone SS-forhold. Det vil tillate forskere å ytterligere dechiffrere virkningen av SMAD kompleks dannelse i aterogenese og vaskulær sykdom generelt. Det kan videre tilpasses for å undersøke konsekvensene av nærhet av forskjellige proteiner i de vaskulære patologiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Maria Reichenbach og Dr. Christian Hiepen for deres støtte til flytoppsettsystemet og Eleanor Fox og Yunyun Xiao for kritisk lesing av manuskriptet. P-L.M. ble finansiert av den internasjonale Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK fikk støtte av DFG-SFB1444. Figur 1 ble opprettet ved hjelp av BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
| Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
| Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
| Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
| Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
| FIJI | Image Analysis software | ||
| Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
| HUVECs | |||
| ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
| ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
| Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
| mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
| mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
| mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
| Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
| Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
| Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
| rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
| Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
References
- Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
- Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
- Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
- Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
- Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
- Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
- Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).
- Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
- Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P.
- Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
- MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
- Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
- Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
- van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
- Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Alam, M. S.
- Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012).
- Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019).
- ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
- Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).
