Summary
Описан способ генерации ретинобластомы человека (RB) путем введения биаллелевых мутаций RB1 в эмбриональные стволовые клетки человека (hESC). Клеточные линии RB также могут быть успешно культивированы с использованием изолированного RB в чашке.
Abstract
RB человека - это детский рак, который смертелен, если лечение не проводится. Поскольку RB происходит из конусных предшественников, что относительно редко встречается в моделях грызунов, между тем, что касается межвидовых различий между людьми и грызунами, модель заболевания, полученная от людей, более полезна для раскрытия механизмов РБ человека и поиска целей терапии. В настоящем документе описывается генерация двух генетически отредактированных линий hESC с биаллельной точечной мутацией RB1 (RB1Mut/Mut) и мутацией нокаута RB1 (RB1-/-), соответственно. В процессе развития сетчатки наблюдается образование РБ. Клеточные линии RB также устанавливаются путем отделения от органоидов RB. В целом, дифференцируя генетически отредактированные линии hESC в органоиды сетчатки с использованием 2D и 3D комбинированного протокола дифференцировки, мы успешно реконструировали человеческий RB в чашке и идентифицировали его конусно-предшественниковое происхождение. Это обеспечит полезную модель заболевания для наблюдения за генезисомой ретинобластомы, пролиферации и роста, а также для дальнейшей разработки новых терапевтических агентов.
Introduction
Ретинобластома человека (РБ) является редкой, смертельной опухолью, полученной из конуса сетчатки-предшественников 1,2,3, является наиболее распространенным типом внутриглазной злокачественной опухоли в детском возрасте4. Гомозиготная инактивация гена RB1 является инициирующим генетическим поражением в RB5. Однако мыши с мутациями RB1 не могут сформировать опухоль сетчатки2. Хотя опухоли мышей могут быть сгенерированы с помощью комбинации мутаций Rb1 и других генетических модификаций, им все еще не хватает особенностей ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО RB6. Благодаря развитию дифференцировки органоидов сетчатки удалось получить РБ, полученный из hESC, отображающий признаки ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО RB1.
За последнее десятилетие были созданы многочисленные протоколы дифференциации органоидов сетчатки, включая 2D7, 3D8 и комбинацию 2D и 3D9. Метод, используемый здесь для создания человеческого РБ, - это консолидация адгезивной культуры и плавающей культуры9. Дифференцируя RB1 мутировавший hESC в органоиды сетчатки, образование RB обнаруживается примерно на 45-й день, а затем он быстро размножается примерно на 60-й день. На 90-й день возможна изоляция RB и генерация клеточной линии RB; кроме того, RB окружает почти все органоиды сетчатки на 120-й день.
RB, полученный из hESC, является инновационной моделью для изучения происхождения, опухолевого генеза и лечения RB. В этом протоколе подробно описаны генерация hESC для редактирования генов, дифференциация RB и характеристика для RB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование одобрено институциональным комитетом по этике Пекинской больницы Тунжэнь, Столичного медицинского университета. H9 hESCs получены из Научно-исследовательского института WiCell.
1. Генерация RB1 мутированных hESC
- Вектор наведения CRISPR/Cas9 для нокаута (KO) RB1.
- Разработайте пару сгРНК. Для абляции RB1 нацеливайтесь на первый экзон этого гена. Прямая последовательность праймера — CACCGCGGTGGCGCGCGCGTTTCGG, а обратная последовательность праймеров — AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для конкретной мутации RB1 также требуется восстановленный шаблон. В этом протоколе в качестве примера используется клеточная линия RB1-KO. - Переварить 1 мкг pX330-U6-химерного BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro с ферментами рестрикции BbsI (см. Таблицу материалов) в течение 30 мин при 37 °C, следуя инструкциям производителя.
- Очистите переваренные плазмиды с помощью очистительного набора в соответствии с инструкциями производителей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативные реакции могут быть непосредственно очищены без агарозного геля с помощью набора для очистки (см. Таблицу материалов). - Фосфорилируют и отжигают каждую пару олиго с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (PNK) (Таблица материалов) с реакцией, включающей 1 мкл олиго1 (100 мкМ), 1 мкл олиго2 (100 мкМ), 1 мкл 10x T4 лигационного буфера, 6,5 мкл ddH2O и 0,5 мкл T4 PNK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прямая и обратная праймеры на этапе 1.1.1 представляют собой пару олиго. Фосфорилат и отжиг олиго в термоциклере используют следующие параметры: 37 °C в течение 30 мин; 95 °C в течение 5 мин; снижение до 25 °C при 5 °C в минуту. - Разбавьте фосфорилированные и отожженные олиго 200 раз, добавив 1 мкл олигореагента к 199 мкл воды без нуклеазы при комнатной температуре (RT).
- Настройте реакцию лигирования и инкубируйте на RT в течение 10 мин, смешивая следующее: 50 нг переваренной плазмиды Bbs1 со стадии 1.1.3, 1 мкл олигодуплекса со стадии 1.1.5, 5 мкл 2x лигационного буфера, 1 мкл лигазы и долить до 10 мкл с использованием воды без нуклеазы.
- Преобразуйте лигационную смесь и упорядочите положительные колонии для следующего шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте U6 прямой или обратный праймер для секвенирования.- Разморозьте компетентные ячейки на льду.
- Возьмите 50 мкл компетентных клеток в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
- Добавить 1 мкл лигированной смеси со стадии 1.1.6 в компетентные ячейки.
- Аккуратно перемешайте, трижды пипеткой вверх и вниз по трубке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихрь. - Выложить смесь на лед на 30 мин.
- Тепловой удар смеси при 42 °C в течение 90 с.
- Добавьте в пробирку 950 мкл бульона Лурия-Бертани (LB) комнатной температуры без антибиотика.
- Поместите трубку в шейкер при 300 об/мин при 37 °C в течение 60 мин.
- Прогрейте пластины LB (пептон, пептон из казеина, хлорида натрия, агар-агара и ампициллина) до 37 °C заранее.
- Выкладываем 50-100 мкл клеток и перевязочной смеси на пластины при РТ.
- Инкубировать пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
- Подберите из пластины 12 колоний и переложите их в среду LB с ампициллином. Поместите среду на шейкер со скоростью 300 об/мин в течение 60 мин.
- Используйте 1 мкл раствора бактерий (из шага 1.1.7.12) в качестве шаблона для ПЦР и выберите положительные колонии.
- Секвенируйте положительные колонии праймерами U6, используйте колонию с разработанными последовательностями sgRNA на следующем этапе.
- Извлеките плазмиду с помощью набора midi (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Качество и количество плазмиды с использованием мини-комплекта недостаточно для следующего эксперимента по нуклеофекции. Midi или maxi kit больше подходит, чем мини-комплект.
- Разработайте пару сгРНК. Для абляции RB1 нацеливайтесь на первый экзон этого гена. Прямая последовательность праймера — CACCGCGGTGGCGCGCGCGTTTCGG, а обратная последовательность праймеров — AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
- Культура и нуклеофекция HESC.
ПРИМЕЧАНИЕ: До прогрева все реагенты к RT.- Разморозьте 1 x 106 H9 клеток в предварительно покрытую 6-луночную пластину с 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK) и 2 мл свежей питательной среды ncEpic-hiPSC/hESC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрывайте 6-луночную пластину матрицей с пониженным коэффициентом роста 1% в течение не менее 30 мин при 37 °C перед использованием. - На следующий день удалите супернатант, промойте клетки 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (DPBS), а затем добавьте 2 мл свежей питательной среды ncEpic-hiPSC / hESC.
- Меняйте среду каждый день с 2 мл свежей культуральной среды ncEpic-hiPSC / hESC в течение следующих 3-5 дней, пока клетки не вырастут примерно до 80% слияния.
- Проход один или два раза для регулировки состояния hESC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самым простым способом определения состояния hESC является морфология. - Культивируйте недифференцированные клетки H9 в 6-луночной пластине до тех пор, пока они не достигнут 80% слияния.
- Изменяют среду за 2 ч до нуклеофекции 2 мл свежей культуральной среды ncEpic-hiPSC/hESC, смешанной с 10 мкМ Y-27632, и предварительно покрывают одну лунку 12-луночной пластины с использованием 1% фактора роста восстановленной базальной мембранной матрицы.
- Аспирировать среду и промыть 1 мл предварительно расплавленного DPBS.
- Удаляют DPBS и инкубируют с 1 мл фермента диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) в течение 3,5 мин при 37 °C.
- Добавьте 1 мл свежей культуральной среды ncEpic-hiPSC/hESC к клеткам и пипетке дважды, чтобы превратить клетки H9 в одноклеточную суспензию.
- Извлеките 100 мкл смеси для подсчета клеток и перенесите оставшуюся часть в центрифужную трубку объемом 15 мл, содержащую еще 2 мл культуральной среды ncEpic-hiPSC/hESC внутри.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте около 2 х 106 клеток в реакционный объем 100 мкл. Согласно протоколу производителя, оптимизируйте объем для клеток, плазмид, нуклеофектора и условий реакции. См. Таблицу материалов для системы нуклеофекции, используемой в этом протоколе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, пузырьки не допускаются во время нуклеофекции. - После трансфекции переложите клетки на предварительно покрытую 12-луночную пластину, добавьте 1,5 мл культуральной среды ncEpic-hiPSC/hESC и 10 мкМ Y-27632, а затем культивируйте клетки в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 .
- Меняйте среду ежедневно. Через 48 ч добавляют 2 мкг/мл пуромицина для отбора клеток примерно через неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многочисленные клетки умирают в течение первых 3 дней. Остальные клетки могут размножаться и образовываться в колонии на следующей неделе после отбора пуромицина. В селекционную неделю убедитесь, что среда всегда содержит 2 мкг/мл пуромицина. - Выберите колонии вручную под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология колонии такая же, как и у колонии hES. Разрежьте колонии на куски (по 2-6 штук на колонию) с белым/нормальным кончиком пипетки объемом 10 мкл в среде и переложите одну колонию в одну предварительно покрытую лунку из 12-луночной пластины. - Во-первых, определите мутации RB1 и нецелевые ситуации (таблица 1), а затем плюрипотентность, чтобы охарактеризовать нокаутную клеточную линию RB1 H9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение мутаций RB1 и нецелевых ситуаций с помощью ПЦР и секвенирования сэнгера. Выявить маркеры плюрипотентности методом ОТ-ПЦР и иммунофлуоресценции.
- Разморозьте 1 x 106 H9 клеток в предварительно покрытую 6-луночную пластину с 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK) и 2 мл свежей питательной среды ncEpic-hiPSC/hESC.
2. Генерация ретинобластомы человека
- Техническое обслуживание RB1-KO hESC.
- Культивируйте генетически отредактированные клетки H9 в матрице с пониженным фактором роста базальной мембраны, покрытой 6-луночной пластиной с 2 мл питательной среды ncEpic-hiPSC/hESC и меняйте среду каждый день.
- Прохождение с использованием буфера ЭДТА в течение 3,5 мин при 37 °C или 5 мин при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер ЭДТА представляет собой смесь 1x DPBS, 5 мМ ЭДТА и 0,9 мг/мл NaCl.
- Дифференцировка клеток сетчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте медиум I перед дифференциацией. Чтобы приготовить среду I, смешайте 24,5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM)/питательной смеси F-12(F12)-глутамина (1x), 24,5 мл базальной среды Neuronal, 250 мкл 100x добавки A, 500 мкл 50x добавки B, 0,1 мМ ß-меркаптоэтанола и 250 мкл 100x L-глутамина. Перед прогреванием все смеси до РТ перед употреблением.- Вырастите RB1-KO hESC до 80% слияния в одной скважине 6-луночной плиты.
- Удалите среду и промойте ячейки 1 мл 1x DPBS.
- Поднимите колонии клеток, используя 1 мл буфера диспазы (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте колонии клеток под микроскопом. Обычно требуется 5 минут, чтобы край колоний выкатился. - Аспирировать буфер диспазы и осторожно промыть клетки один раз 1 мл 1x DPBS.
- Добавьте в колодец 1 мл Medium I.
- Нарежьте колонии на куски (по 6-9 штук на колонию) с белым/нормальным кончиком пипетки объемом 10 мкл в среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, около 60%-70% клеток отделяются от лунки. Используйте скребок для клеток, чтобы соскоблить оставшиеся ячейки в среде. - Соберите все клетки путем центрифугирования в пробирке 15 мл при 200 х г в течение 5 мин.
- Оставьте около 50 мкл супернатанта для диспергирования клеток в среде, а затем смешайте клетки с 250 мкл восстановленной базальной мембранной матрицей фактора роста путем мягкого перемешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием держите матрицу базальной мембраны с пониженным коэффициентом роста либо при 4 °C, либо на льду. Если он аликвотирован и хранится при -20 °C, поместите его при 4 °C на ночь или не менее чем за 1 ч до использования. - Держите трубку 15 мл с взвешенными клетками в инкубаторе с температурой 37 °C в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки и матрица базальной мембраны с пониженным фактором роста образуют затвердевший гель. - Добавьте 1 мл Medium I в пробирку объемом 15 мл, а затем слегка пипетируйте затвердевший гель два-три раза, чтобы рассеять комок пипеткой 1 мл.
- Добавьте 9 мл Medium I и переложите клеточную суспензию в чашку для культивирования клеток размером 10 см.
- Переместите блюдо в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 и установите день как день 0.
- Исследуйте клетки с помощью микроскопа на 1-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тысячи полых кист можно было наблюдать в чашке. В среднем в одном куске геля наблюдается от 3 до 4 кист. - Смените среду на 5-й день. Соберите супернатант в трубку объемом 15 мл, подождите, пока кисты осядут на дно, а затем удалите среду и замените ее свежим Medium I.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда становится желтой на 4-й день, измените среду на 4-й день, в противном случае на 5-й день. Добавьте 10 мл свежего Medium I в исходное блюдо. Сотни цист уже прикрепились к поверхности культуры; держите их там. - Рассейте кисты в трубке на две тарелки по 10 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в блюде находится не менее 300 кист. Если кисты не сливаются, не разделяйте кисты на другие блюда; верните их в исходное блюдо размером 10 см. - На 7-й день большинство кист (выше 95%) прикрепляются к блюду, распространяются и образуют прилипшие колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уже на 3-й день можно наблюдать прилипшие колонии. - На 10-й день замените среду на свежую Medium I. Убедитесь, что все кисты прикреплены к блюду.
- Подготовьте Medium II перед следующим этапом, смешивая следующее: 36 мл DMEM, 12 мл F12, 2% добавки B (v/v), 0,1 мМ MEM раствор заменимых аминокислот (NEAA).
- Убедитесь, что клетки распределены к 13-17 дню. Выполните следующий шаг на 15-й день, когда клетки рассредоточены, но не взаимодействуют с соседними колониями.
- Промыть клетки один раз 1 мл DPBS и добавить 1 мл раствора диспазы в течение 5 мин при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 5 мин края клеток поднимаются. - Удалите буфер диспазы и осторожно промойте культуры 1 мл 1x DPBS.
- Добавьте 10 мл Medium II на каждую посуду размером 10 см и культуру в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 .
- Адгезивные культуры спонтанно отделяются через 24 ч и собираются в органоиды сетчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многочисленные клетки, которые не образуют органоидов, умрут в течение следующих 2 дней. - Через три дня после отслоения соберите клетки из чашки для клеточной культуры и дайте органоидам осесть в трубке объемом 15 мл.
- Удалите супернатант из трубки и перенесите органоиды в новую неадгезивную чашку (чашку Петри) с 10 мл Medium II в течение следующих четырех дней.
- Приготовьте среду III путем смешивания DMEM: F12 в соотношении 3:1 (v/v), 2% добавки B (v/v), 0,1 мМ MEM раствора заменимых аминокислот (NEAA), 8% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (v/v), 100 мкМ таурина и 2 мМ глутамина.
- Через неделю после отслойки измените средний на Medium III.
- С этого дня культивируйте органоиды в Medium III и обновляйте среду два раза в неделю.
- Создание клеточной линии RB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты предварительно расплавлены в RT.- На 90-й день RB (80%-90%) охватывают органоиды сетчатки. Поэтому выбирайте 90-дневные органоиды RB для генерации клеточной линии RB.
- Подготовьте среду 1640, смешав среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 с 10% FBS.
- Разрежьте РБ на куски (по 20-25 штук на РБ) микрохирургическим ножом под микроскопом в среде RPMI-1640.
- Удалите среду RPMI-1640 и обработайте кусочки 0,25% трипсина/ЭДТА в течение 10 мин при 37 °C.
- Добавьте среду RPMI-1640, чтобы закончить реакцию и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в среде 1640 в неприлипшей посуде.
- Клеточная линия RB представляет собой плавающую культуру. Меняйте среду два раза в неделю и проходите клетки RB в течение 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость пролиферации первичных клеток RB довольно медленная.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедура генерации RB освещена на рисунке 1, который сочетает в себе адгезивную и плавающую культуру. Удалось извлечь человеческий RB из RB1-KO hESC и получить клеточную линию RB путем выделения органоидов RB.
Здесь протокол предоставляет подробную информацию о дифференциации на разных этапах (рисунок 2). В первые 3 дня образуются полые сферы, которые прикрепляются к поверхности культуры, а затем расширяются (рисунок 2A-E). С 15-го дня клетки приподнимают и культивируют в суспензии (рисунок 2F). На следующий день после отслоения формируются органоиды сетчатки, и видны яркие ободки (рисунок 2G, черные стрелки). Более того, те клетки, которые находятся за пределами органоидов, вероятно, умрут на следующей неделе (рисунок 2G, оранжевые стрелки). На 27-й день очевидна архитектура оптических пузырьков, и около 90% органоидов демонстрируют эту структуру (рисунок 2H); органоиды без этой структуры могут быть выброшены. Первое обнаружение РБ происходит на 45 день, а затем оно становится ощутимым на 50 день (рисунок 2I). Когда он растет до 90-го дня, оптические везикулярные структуры в основном сворачиваются RB (рисунок 2J). Между тем, RB может быть выделен как клеточная линия RB для дальнейшей культуры (рисунок 2K). Органоиды сетчатки, превышающие 80%, будут полностью окутаны RB на 105-й день (рисунок 2L). Они высоко демонстрируют экспрессию Ki67 (маркер пролиферации) и SYK (маркер онкогена) по сравнению с органоидами сетчатки, полученными из H9, что указывает на опухолевый генез в органоидах RB (рисунок 2M, N). Кроме того, высокая экспрессия ARR3 (производитель конусных предшественников) и CRX (маркер предшественника фоторецептора) в органоидах RB демонстрирует, что они происходят из клеток-предшественников конуса (рисунок 2O, P).
Процедура генерации РБ в основном проходит три этапа с изменениями морфологии до образования РБ; здесь исследование дает худшие и превосходные результаты на этих этапах (рисунок 3). Дифференцированный и недифференцированный hESC (рисунок 3A,B) легко отличить от морфологии, а для формирования RB выбран недифференцированный hESC. На 5-й день должна образовываться полая сфера (рисунок 3D), а не твердая (рисунок 3C). RB получен из органоидов сетчатки, которые отображают архитектуру оптических пузырьков (рисунок 3F). Не существует RB, который бы генерировался в нижних органоидах (рисунок 3E).
Рисунок 1: Схематическое представление дифференциации органоидов RB. День 0-день 15, клетки проходят 2D культуру в среде I, а после 15 дня клетки являются суспензионной культурой. RB формируется примерно на 45-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Генерация и характеристика RB. (A-C) Процедура ранней стадии, hESC повышен до образования кист. Черные стрелки в (B) показывают свернутые края hESC после обработки диспазом. (Д,Д) Кисты прикрепляются к пластинам (D), а затем расширяются (E). (F) Адгезивные клетки повышены с образованием органоидов сетчатки. Черными стрелками обозначены свернутые края после обработки рассасывания. (Г,Ч) Ранние дни органоидов сетчатки без RB. (I, J) Органоиды сетчатки с RB на день 50 (I) и день 90 (J), зеленые круги свидетельствуют о частях RB. (K) Изолированная клеточная линия RB из 90-дневных органоидов сетчатки. (L) Органоиды RB на 105-й день. (М-) Иммунофлуоресцентные изображения для онкогенных маркеров (M,N) и фоторецепторных маркеров (O,P). В A-L шкала стержней = 200 мкм; в M-P шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение отрицательных и положительных результатов. Нижние и высшие изображения для дифференциации на день 0 (A,B), день 5 (C,D) и день 30 (E,F). Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ретинобластома человека (RB) вызвана инактивацией RB1 и дисфункцией белка Rb. В этом протоколе RB1-KO hESC является ключевым шагом для генерации RB в тарелке. Хотя даже при RB1-/- hESC возможно, что образование RB отсутствует благодаря методам дифференцировки органоидов сетчатки10. В этом протоколе переход от адептской культуры к плавающей культуре имеет важное значение в процессе дифференциации. Плотность кист, типы плюрипотентных стволовых клеток и скорость пролиферации — все это переменные, которые будут влиять на сроки отслоения. Клетки желательно отделять, когда они расширяются, но не взаимодействуют соседние колонии9. Если колонии примыкают, это приведет к смежным органоидам сетчатки, а затем снизит эффективность дифференцировки.
Следуя шагам критически, было бы без проблем собирать урожай РБ. Однако этот метод мог моделировать RB только с биаллельной инактивацией RB1. Для унаследованных пациентов RB, у которых была гетерозиготная мутация RB1, он не может имитировать процесс опухолевого генеза с гетерозиготной мутацией RB1 11. Тем не менее, это по-прежнему оптимальная модель RB, поскольку в настоящее время она наиболее близка к фактическому опухолевому генезу RB у пациентов1. Он имеет то же происхождение с первичным RB 3,12 и преодолевает видовое различие моделей мышей или упрощенную двумерную среду увековеченных линий раковых клеток 3,12,13.
Человеческий RB устанавливается в чашке, полученной из человеческого ESC с использованием описанного метода, и он демонстрирует большое сходство с человеческим первичным RB. Таким образом, он обеспечил бы идеальную платформу для выяснения молекулярной патологии РБ человека и скрининга фармакологических агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам не известно о каких-либо связях, членстве, финансировании или финансовых активах, которые могли бы повлиять на объективность этого исследования.
Acknowledgments
Мы благодарим команду 502 за всю помощь. Эта работа частично поддерживается Пекинским муниципальным фондом естественных наук (Z200014) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E.
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
